Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Metoder til opdræt af Parasitoid Ganaspis brasiliensis, et lovende biologisk bekæmpelsesmiddel til den invasive Drosophila suzukii

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63898
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3, 4, 5, 4, 6, 1,3, 2
1Research and Innovation Centre, Fondazione Edmund Mach, 2Beneficial Insects Introduction Research Unit, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 3Center for Agriculture, Food and Environment, University of Trento, 4Department of Environmental Science, Policy and Management, University of California Berkeley, 5Department of Agriculture, Food and Environment, University of Catania, 6Systematic Entomology Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

Summary

Ganaspis brasiliensis - en larveparasitoid af Drosophila suzukii (en global invasiv frugtafgrøde skadedyr) - er blevet godkendt eller overvejes til introduktion i Europa og USA til biologisk bekæmpelse af dette skadedyr. Denne artikel indeholder protokoller til både småskala og storskala opdræt af denne parasitoid.

Abstract

Indfødt i Østasien har den plettede vinge drosophila, Drosophila suzukii (Matsumura) (Diptera: Drosophilidae), etableret sig bredt i Amerika, Europa og dele af Afrika i løbet af det sidste årti og er blevet et ødelæggende skadedyr af forskellige blødhudede frugter i sine invaderede regioner. Biologisk bekæmpelse, især ved hjælp af selvforstærkende og specialiserede parasitoider, forventes at være en levedygtig mulighed for bæredygtig områdedækkende forvaltning af dette meget mobile og polyfagiske skadedyr. Ganaspis brasiliensis Ihering (Hymenoptera: Figitidae) er en larveparasitoid, der er bredt udbredt i Østasien, og har vist sig at være en af de mest effektive parasitoider af D. suzukii.

Efter strenge evalueringer før introduktion af dens effektivitet og potentielle ikke-målrisici er en af de mere værtsspecifikke genetiske grupper af denne art (G1 G. brasiliensis) for nylig blevet godkendt til introduktion og feltudsætning i USA og Italien. En anden genetisk gruppe (G3 G. brasiliensis), som også almindeligvis blev fundet at angribe D. suzukii i Østasien, kan overvejes til introduktion i den nærmeste fremtid. Der er i øjeblikket enorm interesse for at opdrætte G. brasiliensis til forskning eller i masseproduktion til feltudsætning mod D. suzukii. Denne protokol og tilhørende videoartikel beskriver effektive opdrætsmetoder for denne parasitoid, både i lille skala til forskning og i stor skala til masseproduktion og feltfrigivelse. Disse metoder kan gavne yderligere langsigtet forskning og anvendelse af denne asiatisk-indfødte parasitoid som et lovende biologisk bekæmpelsesmiddel til dette globale invasive skadedyr.

Introduction

Hjemmehørende i Østasien har den plettede vinge drosophila, Drosophila suzukii (Matsumura) (Diptera: Drosophilidae), etableret sig bredt i Amerika, Europa og dele af Afrika 1,2. Fluen er ekstremt polyfagisk og er i stand til at udnytte forskellige dyrkede og vilde frugter med bløde og tynde skind i sine oprindelige og invaderede regioner 1,2,3. Nuværende forvaltningsstrategier for dette skadedyr er stærkt afhængige af den hyppige anvendelse af insekticider, der er målrettet mod voksne fluer i afgrødemarker, når modtagelig frugt modnes. Gentagne sprøjtemidler anvendes ofte, muligvis på grund af konsekvent afsmitning af reservoirfluepopulationer fra ikke-afgrødehabitater og mangel på effektive naturlige fjender, der er bosiddende i de invaderede regioner 1,4. Biologisk bekæmpelse, især ved hjælp af selvforstærkende specialiserede parasitoider, kan bidrage til at undertrykke fluepopulationer på landskabsniveau og spille en afgørende rolle for bæredygtig forvaltning af dette meget mobile og polyfagiske skadedyr i hele området 4,5,6.

I løbet af det sidste årti har forskere fokuseret indsatsen for at opdage co-udviklede parasitoider af Drosophila suzukii i fluens indfødte områder i Østasien 7,8,9 samt effektive, men nyligt associerede parasitoider i fluens invaderede regioner i Amerika og Europa 4,5,6. I fluens nyligt invaderede regioner er almindeligt forekommende larve Drosophila parasitoider, såsom Asobara c.f. tabida (Nees) (Hymenoptera: Braconidae), Leptopilina boulardi (Barbotin et al.) og L. heterotoma (Thompson) (Hymenoptera: Figitidae), ude af stand til at udvikle sig fra eller have lave parasitismeniveauer på D. suzukii på grund af fluens stærke immunresistens10. Kun nogle kosmopolitiske og generalistiske pupalparasitoider som Pachycrepoideus vindemiae (Rondani) (Hymenoptera: Pteromalidae) og Trichopria drosophilae (Perkins) (Hymenoptera: Diapriidae) i Nordamerika og Europa og Trichopria anastrephae Lima i Sydamerika kan let udvikle sig fra denne flue4. I modsætning hertil har udforskninger i Østasien opdaget en række larveparasitoider fra D. suzukii 4,5,6. Blandt dem er Asobara japonica Belokobylskij, Ganaspis brasiliensis Ihering og Leptopilina japonica Novković &Kimura de dominerende larveparasitoider 7,8,9,11. Især var de to figitider (L. japonica og G. brasiliensis) de vigtigste parasitoider, der overvejende findes i friske frugter angrebet af D. suzukii og / eller andre nært beslægtede drosofilider i naturlig vegetation 7,8,9. Disse tre asiatiske larveparasitoider blev importeret til karantænefaciliteter i USA og Europa og evalueret for deres relative effektivitet 12,13,14,15,16,17, klimatisk tilpasningsevne18, potentielle interspecifikke konkurrenceinteraktioner19 og vigtigst af alt værtsspecificitet 8,20,21 ,22.

Karantæneevalueringer viste, at Ganaspis brasiliensis var mere værtsspecifik for Drosophila suzukii end andre testede asiatiske larveparasitoider, selvom den sandsynligvis består af forskellige biotyper eller kryptiske arter med varierende værtsspecificitet 8,21,22,23,24. Nomano et al.22 grupperede Ganaspis-individer fra forskellige geografiske regioner i fem genetiske grupper (navngivet som G1-G5) baseret på molekylære analyser af mitokondrie cytokromoxidase I-genfragmentet. G2- og G4-grupperne rapporteres kun fra nogle få sydasiatiske tropiske steder, og G5-gruppen blev rapporteret fra Asien og andre regioner (f.eks. Argentina, Brasilien, Hawaii og Mexico) fra ukendte værter (Buffington, personlig observation). Feltsamlinger af vilde frugter inficeret af D. suzukii i Sydkorea7, Kina8 og Japan 9,23,25 fandt G1 alene eller en blanding af prøver, der repræsenterer gruppe G1 og G3. De to grupper synes at være sympatriske og sameksisterer på de samme værtsplanter beboet af D. suzukii og andre nært beslægtede værtsfluer. Ikke desto mindre er der observeret nogle forskelle mellem de to grupper, hvor G1 tilsyneladende har en højere grad af værts- eller værtshabitat-specificitet for D. suzukii end G3, selvom de begge angriber en række nært beslægtede arter i karantænetestene21,22. Yderligere detaljerede molekylære analyser kan hjælpe med at bestemme artsstatus, især for G1- og G3-grupperne. Denne undersøgelse refererer til dem som G1 G. brasiliensis og G3 G. brasiliensis. Nogle tidlige undersøgelser navngav også G1 G. brasiliensis som G. jf. brasiliensis 14,21,22. G1 G. brasiliensis er for nylig blevet godkendt til feltfrigivelse mod D. suzukii i USA og Italien (flere andre europæiske lande overvejer også i øjeblikket at indføre det), mens G3 G. brasiliensis kan overvejes til feltfrigivelse i den nærmeste fremtid. Nylige undersøgelser fandt også adventive populationer af både L. japonica og G1 G. brasiliensis i British Columbia, Canada26 og Washington State, USA (Beers et al., upublicerede data) og adventive L. japonica populationer i Trento-provinsen, Italien27.

I betragtning af den betydelige interesse i udviklingen af biologiske bekæmpelsesprogrammer for Drosophila suzukii-forvaltning og det betydelige biologiske bekæmpelsespotentiale ved adventive og bevidste introduktioner af Ganaspis brasiliensis er der behov for at udvikle effektive opdrætsmetoder til dette larveparasitoid til fremtidig langsigtet forskning og / eller feltudsætning. Denne protokol og tilhørende videoartikel beskriver to sæt opdrætsmetoder til denne parasitoid: (1) laboratorieopdræt i småskala i kolber ved hjælp af en blanding af værtsfrugt (blåbær) og kunstig kost til dyrkning af D. suzukii. Metoderne blev udviklet ved hjælp af G3-materiale oprindeligt indsamlet fra Kunming, Kina8. (2) Masseopdræt med henblik på udsætning på marken i store bure med værtsfrugt (blåbær) til dyrkning af D. suzukii. Den genetiske gruppe, der blev anvendt til den store opdræt, var G1-bestand med oprindelse i Tokyo, Japan 9,22. Andre skalaer af opdrætsmetoder, såsom brug af hætteglas eller små beholdere til begge grupper, diskuteres også kort.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Metoder til småskala laboratorieopdræt af G3 Ganaspis brasiliensis

  1. Forbered værtsdiæt.
    1. Tilsæt 600 ml destilleret vand til en 1.500 ml glasbeholder, og opvarm vandet på en kogeplade.
    2. Der tilsættes 88,6 g kommercielt tilgængelig tørfoder (lavet af agar, ølgær, majsmel, methylparaben og saccharose) eller tilbered kost ved hjælp af formlen offentliggjort af Dalton et al.28 (se trin 2.1.2).
    3. Tilsæt 300 ml destilleret vand i tørfoderet og rør diætblandingen grundigt.
    4. Tilsæt blandingen til kogende vand.
    5. Lad den flydende diæt på kogepladen koge i 10 minutter, mens blandingen omrøres med jævne mellemrum for at forhindre, at den brænder.
    6. Lad kosten afkøle ved stuetemperatur i 30 minutter, mens du omrører den lejlighedsvis for at fordele frigivelsen af varme jævnt og forhindre kosten i at størkne på overfladen.
    7. Mål 6,7 ml 95% EtOH i en beholder og 3,5 ml 1 M propionsyreopløsning i en anden beholder.
    8. Når kosten er afkølet, tilsættes EtOH og derefter propionsyreopløsningen under omrøring grundigt efter hver tilsætning.
    9. Forbered blåbær (købt fra det lokale marked) ved at skylle dem i koldt vand, derefter i en natriumhypochloritblegemiddelopløsning (fortyndet til 5%) og koldt vand igen.
    10. Tør frugten med et papirhåndklæde og mos dem manuelt, indtil huden på hver frugt er brudt, og frugtens saft og kød er udsat.
    11. Tilsæt 25-30 g mosede blåbær til hver 250 ml kolbe. Tryk på kolbens sider for at sikre, at kolbens indre bund er dækket af et jævnt lag mosede blåbær.
    12. Hæld den tilberedte kost i hver kolbe, så den kun dækker toppen af de mosede blåbær.
    13. Der tilsættes skumpropper til kolbernes hals, og lad kosten størkne ved stuetemperatur (figur 1).
    14. Når kosten er størknet, skal du bruge den med det samme eller opbevares ved 5 °C i op til 3 uger.
  2. Bageste vært Drosophila suzukii.
    1. Fjern den opbevarede kost fra køleskabet, og lad den balancere til den omgivende stuetemperatur, eller brug frisklavet kost.
    2. Skær et stykke absorberende køkkenrulle (f.eks. 5 cm x 20 cm) og drej det i midten. Anbring den snoede midtersektion af køkkenrullen i kolben (figur 1).
    3. Våd papirhåndklædet og overfladen af kosten med destilleret vand for at bevare fugt.
    4. Overfør kønsmodne voksne fluer fra de nuværende kolonifluekolber til en ny foderkolbe ved forsigtigt at fjerne proppen på den gamle kolbe og hurtigt vende kolben og tilpasse åbningen af den gamle kolbe med den nye kolbe.
    5. Bank forsigtigt på siden af den gamle kolbe for at få fluerne til at falde ned i den nye kolbe. Sørg for, at der er ~25-30 parringspar af D. suzukii i den nye kolbe. Når der er fluer nok i den nye kolbe, skal du hurtigt vende den gamle kolbe lodret og udskifte propperne på begge kolber.
    6. Gentag overførslerne af fluer, indtil der ikke er nogen fluer tilbage i de gamle kolber. Om nødvendigt kombineres eller samles fluer fra mere end én gammel kolbe i en ny kolbe for at sikre, at der er fluer nok (20-30 par) pr. kolbe.
    7. Hold de nye kolber efter en uges eksponering for voksne fluer under passende forhold (21 °C, 16 L: 8 D fotoperiode, 60%-80% relativ luftfugtighed [RH%]) i et miljøkammer i 3 uger for fluefremkomst.
  3. Udsæt værtslarver for parasitoider.
    1. Der udtages en kolbe (se trin 1.2.7) indeholdende flueæg og larver, når eventuelle voksne fluer og det snoede køkkenrulle er fjernet fra kolben.
    2. Fold et stykke absorberende papirhåndklæde i halvdelen og læg det i kolben som et hvalpesubstrat til parasiterede larver.
    3. Aspirere seks kvindelige og mandlige par af G3 G. brasiliensis i hver kolbe (figur 1). Stribe et tyndt lag honning på bunden af skumproppen.
    4. Lad parasitoiderne stå i kolben i 5 dage.
    5. Efter 5 dages eksponering fjernes parasitoiderne, og kolberne opbevares under de ovenfor beskrevne betingelser i et miljøkammer i 35 dage, indtil hvepsen forventes at dukke op.
  4. Indsamle og opbevare voksne parasitoider.
    1. I løbet af den anden og tredje uge af inkubation skal du kontrollere kolberne ugentligt for tidlig værtsfremkomst og fjerne de voksne fluer.
    2. Når voksne parasitoider begynder at dukke op, skal du aspirere dem tre gange om ugen og holde dem i drosophila hætteglas (f.eks. 2,5 cm x 9,5 cm) (figur 1).
    3. Læg et lille stykke køkkenrulle fugtet, men ikke mættet, med destilleret vand i bunden af hætteglasset.
    4. Tilsæt ~ 60 parasitoider til hvert hætteglas og mærk hætteglasset med fremkomstdatoerne. Stribe et tyndt lag honning på bunden af skumproppen to gange om ugen. Opbevar hætteglassene med voksne parasitoider under de ovenfor beskrevne betingelser i miljøkammeret i op til en måned, hvis de ikke bruges tidligere.
    5. Remoisten papiret i hætteglasset en gang hver 4-7 dage eller udskift papirhåndklædet, hvis der er tegn på skimmel.

2. Metoder til opdræt i stor skala af G1 Ganaspis brasiliensis

  1. Implementere en storstilet opdræt af vært Drosophila suzukii.
    1. Bag D . suzukii i store, strikkede maskedækkede bure (f.eks. 50 cm x 50 cm x 100 cm), der hver indeholder 1.500-2.000 kønsmodne voksne fluer (kønsforhold 50:50) (figur 2).
    2. Forbered Standard Drosophila Medium (SDM) ved at koge alle ingredienserne (6 g bakteriologisk agar, 75 g majsmel, 17 g ernæringsgær, 15 g saccharose, 10 g sojabønnemel, 10 ml propionsyre) i 1 liter destilleret vand i 10 minutter under periodisk omrøring af blandingen for at forhindre, at den brænder28.
    3. Lad blandingen køle af i 5 minutter og tilsæt 5 g ascorbinsyre.
    4. Hæld den friskkogte SDM i 9 cm petriskåle, og lad mediet størkne ved stuetemperatur, inden pladerne lukkes.
    5. Stak SDM Petriskålene op, pak stakken ind med aluminiumsfolie, og opbevar fadene ved 4 °C i op til 2 uger.
    6. Inden for hvert opdrætsbur anbringes en tallerken med vandvædet bomuld og fire til seks petriskåle med SDM (figur 2).
    7. Udskift to gange om ugen de inficerede SDM Petri-retter med friske.
    8. Anbring de angrebne SDM petriskåle uden låg individuelt i plastikkopper (13,3 cm i diameter eller 800 ml), luk hver kop med et dække af fint net (<0,5 mm), og inkuber i 12-15 dage ved 23 ° C og 75% RH (figur 2).
    9. Overfør de nyklækkede D. suzukii voksne fra plastikkopperne til opdrætsburene.
  2. Forbered værtslarver.
    1. Skyl blåbærene i koldt vand i 1 min, og blød frugterne i et bassin fyldt med en blegemiddelopløsning (fortyndet til 5%) i 3 min.
    2. Tøm blegemiddelopløsningen og fyld bassinet med koldt vand for at skylle blåbærene. Bland forsigtigt i hånden i mindst 30 s.
    3. Trin 2.2.2 gentages med ferskvand mindst tre gange for at fjerne blegemiddelrester og andre leddyr (f.eks. mider, thrips), der kan være til stede på frugten.
    4. Læg frugten på en bakke med flere lag absorberende papirhåndklæder og vip forsigtigt bakken frem og tilbage, rul bærene rundt for at tørre dem.
    5. Forbered flere 9 cm petriskåle (enten den øverste eller den nederste halvdel, opad) og fyld hver enkelt med de vaskede blåbær (15-25 frugter pr. Plade afhængigt af frugtstørrelsen).
    6. I de sene eftermiddagstimer udsættes petriskålene for kønsmodne voksne fluer i værtsburene (se trin 2.1) og efterlades natten over.
    7. Næste morgen fjernes petriskålene fra værtsburene ved forsigtigt at blæse eller banke på dem for at løsne fluerne på frugterne og bruge den angrebne frugt til opdræt af parasitoider (se trin 2.4).
  3. Implementer en storstilet parasitoid opdræt.
    1. Brug to typer bur til at opdrætte parasitoidet: en til parasitisme og en anden til hveps fremkomst.
    2. Sørg for, at parasitismeburet er kubisk (f.eks. 45 cm hver side) med et klart plastpanel på forsiden til observation af insektaktivitet, to 18 cm ærmeåbninger i frontpanelet til tilsætning eller fjernelse af insekter og udskiftning af fødevaremateriale og fint polyesternet (f.eks. 96 x 26 mesh) på toppen og siderne til ventilation.
    3. Gør fremspiringsburet mindre (f.eks. 30 cm på hver side) med en enkelt ærmeåbning på to modsatte sider og et klart plastpanel på forsiden for synlighed (figur 2).
    4. Sørg for, at begge burtyper har en tynd snor, der hænger under loftet, hvorfra man kan suspendere en til flere fødefodere (figur 2).
      BEMÆRK: En feeder består af en stor cylindrisk skumprop (9 cm diameter) dækket med spredte honningdråber og kan placeres på burgulvet eller hænges fra burloftet (figur 2).
    5. Inden for hvert bur skal der leveres vand i et ligevægs drosophila hætteglas (2,5 cm x 9,5 cm) forseglet med et celluloseacetatstik (2,5 cm diameter) hver 5-7 dage afhængigt af RH. Hæng hætteglasset på hovedet fra burloftet (figur 2).
  4. Udsæt værtslarverne for parasitoiderne.
    1. Udsæt den værtsbefængte frugt i petriskålene for G1 G. brasiliensis umiddelbart efter D. suzukii natten over angreb (se trin 2.2.7).
    2. Lad de 10-15 petriskåle med angrebet frugt stå i snylteburet indeholdende 1.500-2.000 hvepse i 2-3 dage.
    3. Brug plastikkopper (13,3 cm diameter eller 800 ml) med lag absorberende papir på bunden for at opsamle frugten indeholdende de parasiterede værter (figur 2).
    4. De åbne kopper anbringes i eclosionburet og inkuberes i mindst 28 dage ved 21 °C og 65 % RH (figur 2).
    5. I løbet af den anden og tredje uge af inkubation skal du kontrollere buret ugentligt for tidlig værtseklosion og fjerne de voksne fluer for at lette den successive indsamling af parasitoider.
    6. I slutningen af den fjerde uge af inkubation tilsættes en feeder og en vandkilde til buret.
  5. Saml og opbevar de voksne parasitoider.
    1. Når parasitoid fremkomsten starter, skal du samle en del (10% -15%) af de voksne og overføre dem tilbage til parasitismeburet for at erstatte gamle uproduktive individer.
    2. Saml og opbevar de resterende parasitoider i plastikkopper (13,3 cm diameter eller 800 ml) (figur 3A).
    3. Placer et rør (2 ml) fyldt med vand og forseglet med en tandbomuldrulle (1 cm x 3,8 cm) i bunden af koppen (figur 3A).
    4. Luk koppen med et modificeret låg forsynet med en aftagelig skumprop (3,5 cm i diameter) som fødeunderlag og et maskedækket hul til ventilation (figur 3B).
    5. Tilsæt op til 700 voksne til hver kop (kønsforhold 50:50), mærk koppen med fremkomstdatoen, og opbevar den i et miljøkammer (17 ° C; 65% RH), indtil den bruges, eller i op til 1 måned (figur 3B).
  6. Send de voksne parasitoider.
    1. Brug koniske rør (50 ml) til at sende de voksne parasitoider.
    2. Gennembor et ventilationshul (8 mm diameter) på hætten og dæk det med et fintmasket net (figur 3C).
    3. Der tilsættes en celluloseacetatfodring på indersiden af hætten (figur 3C).
    4. Forbered en mættet saccharoseopløsning ved hjælp af destilleret vand, påfør et par dråber på føderingen, og lad den absorbere væsken.
    5. Anbring et blæserformet stykke absorberende køkkenrulle i røret (figur 3D).
    6. Tilsæt ~ 200 voksne parasitoider til hvert rør, og læg rørene i en isoleret forsendelsesbeholder sammen med ispakker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 4 viser repræsentative resultater af den lille laboratorieopdræt af G3 Ganaspis brasiliensis ved hjælp af to forskellige parasitoidtætheder (seks eller 10 par) og to forskellige eksponeringstider (5 eller 10 dage) på karantænefaciliteten i USDA-ARS Beneficial Insects Introduction Unit (Newark, Delaware). Der var 14 replikater for hver kombination af parasitoidtæthed og eksponeringstid. I alt producerede de 64 kolber 4.018 hvepse (71,7 ± 4,9 afkom pr. Kolbe) med 49,5% ± 1,9% kvindelige afkom. Ved 21 °C opstod voksne parasitoider ca. 30-35 dage efter oviposition. Parasitoidtætheden og eksponeringstiden påvirkede ikke signifikant det samlede antal afkom, der blev produceret pr. replikat (kolbe) (envejs ANOVA, F3,52 = 0,379, P = 0,769) og havde kun en marginal effekt på procentdelen af kvindelige afkom (envejs ANOVA, data blev logittransformeret inden analysen efter behov for at stabilisere variationen, F3,52 = 2,796, P = 0,049), selv om produktionseffektiviteten pr. indbygger kvinde (envejs ANOVA, F3,52 = 3,576, P = 0,020) faldt ved den høje parasitoidtæthed. Eksponeringstiden på mere end 5 dage syntes ikke at øge produktiviteten. Øget parasitoidtæthed syntes heller ikke at øge produktiviteten. Derfor synes kombinationen af seks par og 5-dages eksponeringstider at være bedst egnet til laboratorieopdræt.

Figur 5 viser en 6-måneders produktivitetstendens for den store opdræt af G1 Ganaspis brasiliensis på karantænefaciliteten for Edmund Mach Foundation (Trento, Italien) i 2021. Opdrætningen blev startet med 150 tre dage gamle, parrede hunhvepse, der stammer fra en lille opdræt på karantænelaboratoriet hos CABI i Delémont, Schweiz. Flere hvepse fra opdræt blev gradvist tilføjet til parasitismeburet, indtil de nåede 1.500-2.000 individer (kønsforhold 50:50) i uge 5. Parasitburets belægning blev derefter opretholdt på samme niveau ved at tilføje nye hvepse produceret i selve den store opdræt. I hele perioden blev parasiteringsburet forsynet med friskinficeret frugt hver 2-3 dage. Frugten (blåbær) blev tilbudt G1 G. brasiliensis umiddelbart efter nattens eksponering for Drosophila suzukii. Parasitoidproduktionen startede 5 uger efter den første værtseksponering (figur 5A). Fra uge 8 til uge 22 var parasitoidproduktionen proportional med mængden af eksponeret frugt, i gennemsnit 0,44 ± 0,03 g / parasitoid (gennemsnitlig ± SE; Figur 5B). I alt 53.736 parasitoider blev indsamlet med et gennemsnitligt kvindeligt afkom på 45,9% (interval: 32,4% -79,0%).

Figure 1
Figur 1: Et rutediagram for småskala laboratorieopdrætsprocedurer for Drosophila suzukii og G3 Ganaspis brasiliensis. Venstre side viser værtsflueopdrætsprocedurerne, mens højre side illustrerer den parasitoide opdrætscyklus. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Et rutediagram for de store opdrætsprocedurer for Drosophila suzukii og G1 Ganaspis brasiliensis. Venstre side viser værtsflueopdrætsprocedurerne, mens højre side illustrerer den parasitoide opdrætscyklus. Forkortelse: SDM = standard Drosophila medium. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Containere og rør, der anvendes til opbevaring og forsendelse af G1 Ganaspis brasiliensis fra stordrift. (A) Et vandret billede af opbevaringsbeholderen, der viser et vandrør inde i beholderen, (B) et lodret billede af beholderen, der viser et ventileret låg og en skumprop, og (C) et ventileret låg og et stykke absorberende papir til (D) forsendelsesrøret. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Repræsentativt eksempel for småskala laboratorieopdræt af G3 Ganaspis brasiliensis. (A) Antal producerede afkom pr. kolbe, (B) antal afkom produceret pr. hunhveps og (C) procentdel af hunafkom under to forskellige parasitoidtætheder og eksponeringstider. Værdier er middelværdier ± SE, og søjler med forskellige bogstaver er signifikant forskellige (ANOVA, Tukeys HSD, P < 0,05). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Produktivitetsudviklingen for storopdræt fra starten til og med uge 23. (A) Søjler angiver antallet af G1 Ganaspis brasiliensis-afkom , der indsamles ugentligt fra eclosionburene for at erstatte gamle individer i parasitburet (mørkegrøn) og skal opbevares eller sendes (lysegrøn). Den orange linje angiver mængden af værtsinficeret frugt (kg blåbær), der leveres hver uge til parasitoiderne i parasitismeburet. (B) Ugentligt forhold mellem vægten af værtsinficeret frugt og antallet af parasitoide afkom produceret 5 uger efter eksponering (dvs. gram frugt, der kræves for at producere en enkelt voksen parasitoid). Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Langsigtet forskning og efterfølgende feltudsætninger af et biologisk bekæmpelsesmiddel afhænger af tilgængeligheden af effektive og økonomiske opdrætsteknikker. De beskrevne metoder i denne undersøgelse har vist sig at være effektive protokoller til både småskala og storskala opdræt af Ganaspis brasiliensis. Den lille opdrætsprotokol er udviklet over flere år for at optimere mængden af arbejdskraft og reducere specialudstyr, der er nødvendigt for at opretholde parasitoid- og værtskolonierne samtidigt. Det er velegnet til at opretholde en koloni til laboratorieforskning eller bioassays. Lignende metoder er blevet brugt af forfatterne til at opdrætte denne parasitoid til karantæneevalueringer af denne parasitoid. Den store opdrætsprotokol vil gøre det muligt at producere et stort antal hvepse til feltudsætning, som det for nylig blev gennemført i Italien. Disse teknologier kan let overføres til andre laboratorier, producenter eller virksomheder til opdræt i stor skala i den nærmeste fremtid samt tjene som grundlag for yderligere forbedringer af metoder.

Disse protokoller kan også bruges til at opdrætte Leptopilina japonica, da både Ganaspis brasiliensis og L. japonica er ens med hensyn til deres værtshabitatpræference 7,8, værtsstadiepræference eller reproduktiv biologi15, termisk ydeevne18 og fodereffektivitet i laboratoriebioassays13,15 samt adfærdsmæssige reaktioner over for værtsassocierede signaler12, bortset fra at L. japonica synes at have et bredere værtsområde end selv G3 G. brasiliensis20. Begge parasitoider er opdrættet ved hjælp af lignende metoder som beskrevet heri. Til små opdræt kan begge parasitoider også opdrættes i drosophila hætteglas, typisk ved at overføre 20 unge (1-2 dage gamle) Drosophila suzukii larver til et drosophila hætteglas fyldt med 2 cm kunstig kost eller placere to inficerede frugter, der hver indeholder 5-10 unge D. suzukii larver, og udsætte dem for to parrede kvindelige hveps i 2-3 dage, begge producerer ~ 10 afkom pr. hætteglas 13,15,22.

Som diskuteret ovenfor kan G1 og G3 Ganaspis brasiliensis, der anvendes i denne protokol, afvige lidt i nogle værtssøgningsadfærd og værtsspecificitet21,22. Girod et al.21 rapporterer, at den japanske G1 G. brasiliensis var mere strengt specifik for Drosophila suzukii og ikke syntes at klare sig godt i ren kunstig kost i hætteglas sammenlignet med dens ydeevne på værtsfrugt. Matsuura et al.25 rapporterede også, at G1 G. brasiliensis populationer indsamlet fra D. suzukii-inficerede kirsebær i Japan specialiserer sig på D. suzukii. Den lille opdrætsmetode ved hjælp af diæt blandet med blåbær blev oprindeligt udviklet til opdræt af G3 G. brasiliensis, fordi G1 G. brasiliensis ikke var tilgængelig på det tidspunkt. Senere viste det sig, at denne metode ikke fungerede godt til opdræt af G1 G. brasiliensis (Wang et al. upublicerede data).

For småskala opdræt af G1 G. brasiliensis foreslås det derfor at ændre værtssubstratet ved (1) at udsætte fluerne direkte for blåbær (eller anden værtsfrugt) for at samle værtslarver i frugten og (2) overføre eksponeret frugt til et standard Drosophila-kulturmedium , så larverne kan udvikle sig i et miljø med lav konkurrence ved at placere de angrebne frugter indeholdende værtslarverne på kosten i kolberne for eksponering for parasitoiderne. Dette vil gøre det muligt for de parasiterede larver at fodre på kosten, især ved høje værtstætheder, og de parasiterede værtspupper, der skal opsamles fra papirhåndklædet. Alternativt kan G1 G. brasiliensis opdrættes på frugt direkte i plastbeholdere (forskellige størrelser) ved at udsætte 5-10 kvindelige hvepse for 10-20 inficerede blåbær i 4-5 dage, hvilket producerede op til 80 afkom pr. Beholder afhængigt af værtstætheden (Wang et al., upublicerede data). Til denne metode anbefales det at placere den angrebne frugt på et hævet metalnet ("hardware klud") for at give parasitoiderne adgang til den inficerede frugt fra alle retninger, især hvis for mange frugter placeres i en beholder. Ideelt set bør et eller to lag inficeret frugt placeres i hver beholder til denne opdrætsmetode. Disse alternative småskala metoder bør også fungere godt til opdræt af G3 G. brasiliensis.

Uanset opdrætsmetoder og skalaer (hætteglas, kolbe, beholder eller bur) er det afgørende at opretholde passende temperatur, fugtighed samt kontrolværts eller hunhveps alder, densitet og eksponeringstid for opdræt af både G1 Ganaspis brasiliensis og G3 G. brasiliensis. Drosophila suzukii larver udviklet på ca. 1 uge under normale laboratorieforhold (f.eks. 22 ± 2 °C) 15. Kvindelig g. brasiliensis foretrak at angribe yngre (1-2 dage gamle) end ældre (3-4 dage gamle) værtslarver, selvom forskellige aldre af værtslarver kunne angribes15. Ved 22 ± 2 °C opstod G. brasiliensis hunner med en væsentlig høj andel (~ 50%) af deres levetidskomplement af modne æg, og den modne ægbelastning nåede et højdepunkt efter 2-3 dage15. Voksne kvinder overlevede ~ 20 dage, når de fik ubegrænset adgang til værter og begyndte oviposition inden for 2 dage efter fremkomsten, nåede et højdepunkt af oviposition inden for 5-10 dage og derefter gradvist reducerede oviposition15. Derfor bør unge (<10 dage gamle) hunhvepse bruges i opdræt, men hunhvepse kunne genbruges til opdræt, når de er en mangelvare. Parasitoidet kunne let udvikle sig ved 21-25 °C, men temperaturer under 17,2 °C syntes at udløse en fakultativ diapause17. Det anbefales derfor at anvende et temperaturområde på 21-25 °C for optimal udvikling af både fluen og parasitoidet.

Endvidere vil eksponeringstiden på mere end 5 dage sandsynligvis ikke øge produktiviteten af parasitoidet. Øget parasitoidtæthed baseret på den lille opdræt for G3 G. brasiliensis synes ikke at øge produktiviteten, muligvis på grund af gensidig interferens blandt fouragerende hunhvepse. Seks han-hun par og en 5-dages eksponeringstid synes at være en ideel kombination for laboratoriets småopdræt, selvom opdrætsmetoderne kan forbedres i fremtiden ved yderligere at optimere forholdet mellem vært og parasitoid. En væsentlig dødelighedsfaktor for parasitoid synes at være relateret til lav luftfugtighed, da mange parasitoider blev observeret for ikke at være i stand til at eclose med tørre substratforhold. Tilføjelse af et stykke absorberende papirhåndklæde under frugten absorberer ikke kun saft, når frugten nedbrydes, men giver også et substrat, der kan dæmpes for at øge fugtigheden eller give et hvalpesubstrat til fluen.

Til småskala opdræt kan en kolbe opretholde fugtighed bedre end et hætteglas, fordi førstnævnte har en smal hals. Det blev også fundet i denne undersøgelse, at friske blåbær belagt med en støvning af aktiv tørgær hjalp med at forhindre dannelse af skimmel og forbedrede frugtens tiltrækning til fluerne. Andre aspekter af parasitoidopdræt, der stadig skal undersøges, omfatter (1) muligheden for at opdrætte denne parasitoid på alternative værter eller værtsfrugter, og hvordan alternative værter eller værtsfrugter ville påvirke parasiteoidens effektivitet, (2) faktorer, der påvirker parasitoidens afkoms egnethed og kønsforhold, (3) denne parasitoides evne (både G1 og G3) til at tilpasse sig kunstige diætforhold, og (4) de genetiske eller adfærdsmæssige ændringer, der kan forekomme med tilpasning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Lukas Seehausen og Marc Kenis (CABI, Schweiz) for venligt at have leveret G1 G. brasiliensis. Finansiering i Italien blev ydet af Provincia Autonoma di Trento, Trento, Italien og i USA af National Institute of Food and Agriculture, USDA Specialty Crops Research Initiative award (# 2020-5118-32140), USDA Animal and Plant Health Inspection Service (Farm Bill, fond 14-8130-0463) og USDA ARS CRIS basefonde (projekt 8010-22000-033-00D). USDA er en ligestillingsudbyder og arbejdsgiver og støtter ikke produkter, der er nævnt i denne publikation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Active dry yeast Fleischmanns Yeast, Cincinatti, OH, USA None Used to cover fruit to reduce mold growth and enhance the frui attraction to the flies
Bacteriological agar Merk Life Science S.r.l., Milan, Italy A1296 - 5KG Used to prepare the Standard Drosophila Medium
Bleach solution Clorox Company, Oakland, CA, USA None Used to disinfect flesh fruit
Blue stopper Azer Scientific, Morgantown, PA, USA ES3837 Used for sealing the tube while allowing ventilation for insects
Blueberries Grocery Store, Newark, DE, USA None Provided as host fruit for the flies (various other fruit can also be used)
BugDorm insect rearing cage (W24.5 x D24.5 x H63.0 cm) Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan 4E3030 Used for rearing parasitoids (parasitism cage)
BugDorm insect rearing cage (W32.5 x D32.5 x H32.5 cm) Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan 4E4590 Used for rearing flies
BugDorm insect rearing cage (W32.5 x D32.5 x H32.5 cm) Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan 4E4545 Used for rearing parasitoids (eclosion cage)
Chicken wire (0.64 cm, 19 gauge) Everbilt, OH, USA 308231EB Used to lift up the fruit to allow maximum parasitoid oviposition
Cornmeal Grocery Store, Trento, TN, Italy None Used to prepare the Standard Drosophila Medium
Dental cotton roll (1 x 3.8 cm) Gima S.p.A., Gessate, MI, Italy 35000 Used for providing water to the parasitoids within the storage container
Drosophila diet Frontier Scientific, Newark, DE, USA TF1003 Custom diet used to rear flies
Drosophila vial narrow, Polystirene (2.5 x 9.5 cm) VWR International, LLC., Radnor, PA, US 75813-160 Used for providing water to the parasitoids within the cage
Drosophila vial plugs, Cellulose acetate (2.5 cm) VWR International, LLC., Radnor, PA, US 89168-886 Used for providing water to the parasitoids within the cage
Erlenmeyer flask (250 mL) Carolina Biological, Burlington, NC, USA 731029 Used for rearing flies and parasitoids
Falcon-style centrifuge tube (50 mL) VWR International, LLC., Radnor, PA, US VWRI525-0611 Modified to ship adult parasitoids
Foam stopper Jaece Industries, North Tanawanda, NY, USA L800-C Used for sealing the flasks while allowing ventilation for insects
Honey Grocery Store, Newark, DE, USA None Provided as food for parasitoids
Identi-Plug plastic foam stopper Fisher Scientific Company, L.L.C., Pittsburg, PA, US 14-127-40E Used as feeder for parasitoids and to seal the storage container
Industrial paper towel Grocery Store, Newark, DE, USA None Provided as a pupation substrate for pupae and mitigated moisture
Micron mesh fabric (250 mL) Industrial Netting, Maple Grove, MN, USA WN0250-72 Used to make ventilation lid for insects
Nutritional yeast (flakes) Grocery Store, Trento, TN, Italy None Used to prepare the Standard Drosophila Medium
Paper coaster (10.2 cm) Hoffmaster, WI, USA 35NG26 Porvided as pupation substrate for flies and parsitized pupae
Plastic cup (Ø 13.3 cm, 800 mL) Berry Superfos, Taastrup, Denmark Unipak 5134 Modified to store adult parasitoids
Plastic lid (Ø 13.3 cm) Berry Superfos, Taastrup, Denmark PP 2830 Modified to store adult parasitoids
Propionic acid Merk Life Science S.r.l., Milan, Italy P1386 - 1L Used to prepare the Standard Drosophila Medium
Saccharose Grocery Store, Trento, TN, Italy None Used to prepare the Standard Drosophila Medium
Soup cup with lid (475 mL) StackMan, Vietnam DC1648 Used for parasitized larvae to pupate
Soybean flour Grocery Store, Trento, TN, Italy None Used to prepare the Standard Drosophila Medium
White felt washer (0.64 cm thick, 5 mm ID x 20 mm OD) Quiklok, Lincoln, NH, US WFW/.25 x 5 x 20 mm Used as feeding ring for parasitoids

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Asplen, M. K., et al. Invasion biology of spotted wing drosophila (Drosophila suzukii): a global perspective and future priorities. Journal of Pest Science. 88 (3), 469-494 (2015).
  2. Tait, G., et al. Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae): A decade of research towards a sustainable integrated pest management program. Journal of Economic Entomology. 114 (5), 1950-1974 (2021).
  3. Kirschbaum, D. S., Funes, C. F., Buonocore-Biancheri, M. J., Suárez, L., Ovruski, S. M. The biology and ecology of Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae). Drosophila suzukii management. Garcia, F. R. M. , Springer. Cham. 41-92 (2020).
  4. Wang, X. G., Lee, J. C., Daane, K. M., Buffington, M. L., Hoelmer, K. A. Biological control of Drosophila suzukii. CAB Reviews. 15, 054 (2020).
  5. Lee, J. C., et al. Biological control of spotted-wing drosophila (Diptera: Drosophilidae): Current and pending tactics. Journal of Integreated Pest Management. 10 (1), 13 (2019).
  6. Wang, X. G., Lee, J. C., Daane, K. M., Hoelmer, K. A. Biological control of spotted-wing drosophila: An update on promising agents. Drosophilia suzukii management. Garcia, F. R. M. , Springer. Cham. 143-167 (2020).
  7. Daane, K. M., et al. First exploration of parasitoids of Drosophila suzukii in South Korea as potential classical biological agents. Journal of Pest Science. 89 (3), 823-835 (2016).
  8. Giorgini, M., et al. Exploration for native parasitoids of Drosophila suzukii in China reveals a diversity of parasitoid species and narrow host range of the dominant parasitoid. Journal of Pest Science. 92 (2), 509-522 (2019).
  9. Girod, P., et al. The parasitoid complex of D. suzukii and other fruit feeding Drosophila species in Asia. Scientific Reports. 8 (1), 11839 (2018).
  10. Kacsoh, B. Z., Schlenke, T. A. High hemocyte load is associated with increased resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D. melanogaster. PLoS ONE. 7 (4), 34721 (2012).
  11. Buffington, M. L., Forshage, M. Redescription of Ganaspis brasiliensis (Ihering, 1905), new combination (Hymenoptera: Figitidae), a natural enemy of the invasive Drosophila suzukii (Matsumura, 1931)(Diptera: Drosophilidae). Procedings of the Entomoogical Society of Washington. 118 (1), 1-13 (2016).
  12. Biondi, A., et al. Innate olfactory responses of Asobara japonica (Hymenoptera: Braconidae)towards fruits infested by the invasive spotted wing drosophila. Journal of Insect Behavior. 30 (5), 495-506 (2017).
  13. Biondi, A., Wang, X. G., Daane, K. M. Host preference of three Asian larval parasitoids to closely related Drosophila species: implications for biological control of Drosophila suzukii. Journal of Pest Science. 94 (2), 273-283 (2021).
  14. Girod, P., Rossignaud, L., Haye, T., Turlings, T. C. J., Kenis, M. Development of Asian parasitoids in larvae of Drosophila suzukii feeding on blueberry and artificial diet. Journal of Applied Entomology. 142 (5), 483-494 (2018).
  15. Wang, X. G., Nance, A. H., Jones, J. M. L., Hoelmer, K. A., Daane, K. M. Aspects of the biology and reproductive strategy of two Asian larval parasitoids evaluated for classical biological control of Drosophila suzukii. Biological Control. 121, 58-65 (2018).
  16. Wang, X. G., Biondi, A., Daane, K. M. Functional responses of three candidate Asian larval parasitoids evaluated for classical biological control of Drosophila suzukii. Journal of Economic Entomology. 113 (1), 73-80 (2020).
  17. Wang, X. G., et al. Assessment of Asobara japonica as a potential biological control agent for the spotted wing drosophila, Drosophila suzukii. Entomologia Generalis. 41, 1-12 (2021).
  18. Hougardy, E., Hogg, B. N., Wang, X. G., Daane, K. M. Comparison of thermal performances of two Asian larval parasitoids of Drosophila suzukii. Biological Control. 136, 104000 (2019).
  19. Wang, X. G., Hogg, B. N., Hougardy, E., Nance, A. H., Daane, K. M. Potential competitive outcomes among three solitary larval endoparasitoids as candidate agents for classical biological control of Drosophila suzukii. Biological Control. 130, 18-26 (2019).
  20. Daane, K. M., Biondi, A., Wang, X. G., Hogg, B. A. Potential host ranges of three Asian larval parasitoids of Drosophila suzukii. Journal of Pest Science. 94 (4), 1171-1182 (2021).
  21. Girod, P., et al. Host specificity of Asian parasitoids for potential classical biological control of Drosophila suzukii. Journal of Pest Science. 91 (4), 1241-1250 (2018).
  22. Seehausen, M. L., et al. Evidence for a cryptic parasitoid species reveals its suitability as a biological control agent. Scientific Reports. 10 (1), 19096 (2020).
  23. Nomano, F. Y., et al. Genetic differentiation of Ganaspis brasiliensis (Hymenoptera: Figitidae) from East and Southeast Asia. Applied Entomology and Zoology. 52 (3), 429-437 (2017).
  24. Kasuya, N., Mitsui, H., Ideo, S., Watada, M., Kimura, M. T. Ecological, morphological and molecular studies on Ganaspis individuals (Hymenoptera: Figitidae) attacking Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae). Applied Entomology and Zoology. 48 (1), 87-92 (2013).
  25. Matsuura, A., Mitsui, H., Kimura, M. T. A preliminary study on distributions and oviposition sites of Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae) and its parasitoids on wild cherry tree in Tokyo, central Japan. Applied Entomology and Zoology. 53 (1), 47-53 (2018).
  26. Abram, P. K., et al. New records of Leptopilina, Ganaspis, and Asobara species associated with Drosophila suzukii in North America, including detections of L. japonica and G. brasiliensis. Journal of Hymenoptera Research. 78, 1-17 (2020).
  27. Puppato, S., Grassi, A., Pedrazzoli, F., De Cristofaro, A., Ioriatti, C. First report of Leptopilina japonica in Europe. Insects. 11 (9), 611 (2020).
  28. Dalton, D. T., et al. Laboratory survival of Drosophila suzukii under simulated winter conditions of the Pacific Northwest and seasonal field trapping in five primary regions of small and stone fruit production in the United States. Pest Managagement Science. 67 (11), 1368-1374 (2011).

Tags

Biologi udgave 184 biologisk bekæmpelse Figitidae invasiv skadedyr parasitoid opdræt plettet vinge drosophila
Metoder til opdræt af Parasitoid <em>Ganaspis brasiliensis</em>, et lovende biologisk bekæmpelsesmiddel til den invasive <em>Drosophila suzukii</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rossi-Stacconi, M. V., Wang, X.,… More

Rossi-Stacconi, M. V., Wang, X., Stout, A., Fellin, L., Daane, K. M., Biondi, A., Stahl, J. M., Buffington, M. L., Anfora, G., Hoelmer, K. A. Methods for Rearing the Parasitoid Ganaspis brasiliensis, a Promising Biological Control Agent for the Invasive Drosophila suzukii. J. Vis. Exp. (184), e63898, doi:10.3791/63898 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter