Summary
Ganaspis brasiliensis, un parasitoide larvario de Drosophila suzukii (una plaga mundial de cultivos frutales invasores), ha sido aprobado o se considera para su introducción en Europa y los Estados Unidos para el control biológico de esta plaga. Este artículo proporciona protocolos para la cría a pequeña y gran escala de este parasitoide.
Abstract
Originaria del este de Asia, la drosophila de alas manchadas, Drosophila suzukii (Matsumura) (Diptera: Drosophilidae), se ha establecido ampliamente en las Américas, Europa y partes de África durante la última década, convirtiéndose en una plaga devastadora de varias frutas de piel blanda en sus regiones invadidas. Se espera que el control biológico, especialmente por medio de parasitoides especializados y autoperpetuantes, sea una opción viable para el manejo sostenible en toda el área de esta plaga altamente móvil y polífaga. Ganaspis brasiliensis Hymenoptera: Figitidae es un parasitoide larvario que se distribuye ampliamente en el este de Asia, y se ha encontrado que es uno de los parasitoides más efectivos de D. suzukii.
Después de rigurosas evaluaciones previas a la introducción de su eficacia y posibles riesgos no objetivo, uno de los grupos genéticos más específicos del huésped de esta especie (G1 G. brasiliensis) ha sido aprobado recientemente para su introducción y liberación en el campo en los Estados Unidos e Italia. Otro grupo genético (G3 G. brasiliensis), que también se encontró comúnmente para atacar a D. suzukii en el este de Asia, puede ser considerado para su introducción en el futuro cercano. Actualmente existe un enorme interés en la cría de G. brasiliensis para la investigación o en la producción en masa para la liberación en campo contra D. suzukii. Este protocolo y el artículo de video asociado describen métodos de cría efectivos para este parasitoide, tanto a pequeña escala para la investigación como a gran escala para la producción en masa y la liberación en el campo. Estos métodos pueden beneficiar una mayor investigación y uso a largo plazo de este parasitoide nativo de Asia como un agente de control biológico prometedor para esta plaga invasora global.
Introduction
Originaria del este de Asia, la drosophila de alas manchadas, Drosophila suzukii (Matsumura) (Diptera: Drosophilidae), se ha establecido ampliamente en las Américas, Europa y partes de África 1,2. La mosca es extremadamente polífaga, siendo capaz de utilizar diversos frutos cultivados y silvestres con pieles suaves y finas en sus regiones nativas e invadidas 1,2,3. Las estrategias actuales de manejo de esta plaga dependen en gran medida del uso frecuente de insecticidas que se dirigen a las moscas adultas en los campos de cultivo cuando la fruta susceptible está madurando. A menudo se utilizan pulverizaciones repetidas, posiblemente debido al derrame constante de las poblaciones de moscas de los embalses de hábitats no agrícolas y la falta de enemigos naturales efectivos residentes en las regiones invadidas 1,4. El control biológico, especialmente mediante parasitoides especializados autoperpetuantes, puede ayudar a suprimir las poblaciones de moscas a nivel de paisaje y desempeñar un papel fundamental para la gestión sostenible en toda el área de esta plaga altamente móvil y polífaga 4,5,6.
Durante la última década, los investigadores han centrado sus esfuerzos en descubrir parasitoides coevolucionados de Drosophila suzukii en los rangos nativos de la mosca en el este de Asia 7,8,9, así como parasitoides efectivos pero recientemente asociados en las regiones invadidas de la mosca en las Américas y Europa 4,5,6. En las regiones recién invadidas de la mosca, los parasitoides larvales de Drosophila que ocurren comúnmente, como Asobara c.f. tabida (Nees) (Hymenoptera: Braconidae), Leptopilina boulardi (Barbotin et al.) y L. heterotoma (Thompson) (Hymenoptera: Figitidae), no pueden desarrollarse o tener niveles bajos de parasitismo en D. suzukii debido a la fuerte resistencia inmune de la mosca10. Solo algunos parasitoides pupales cosmopolitas y generalistas como Pachycrepoideus vindemiae (Rondani) (Hymenoptera: Pteromalidae) y Trichopria drosophilae (Perkins) (Hymenoptera: Diapriidae) en América del Norte y Europa, y Trichopria anastrephae Lima en América del Sur pueden desarrollarse fácilmente a partir de esta mosca4. En contraste, las exploraciones en el este de Asia han descubierto una serie de parasitoides larvales de D. suzukii 4,5,6. Entre ellos, Asobara japonica Belokobylskij, Ganaspis brasiliensis Ihering y Leptopilina japonica Novković & Kimura son los parasitoides larvales dominantes 7,8,9,11. En particular, los dos figitíidos (L. japonica y G. brasiliensis) fueron los principales parasitoides que se encuentran predominantemente en frutas frescas infestadas por D. suzukii y / u otros drosófilos estrechamente relacionados en la vegetación natural 7,8,9. Estos tres parasitoides larvales asiáticos fueron importados a instalaciones de cuarentena en los Estados Unidos y Europa, y evaluados por su eficiencia relativa 12,13,14,15,16,17, adaptabilidad climática18, posibles interacciones competitivas interespecíficas19 y, lo más importante, especificidad del huésped 8,20,21 ,22.
Las evaluaciones de cuarentena mostraron que Ganaspis brasiliensis era más específico del huésped de Drosophila suzukii que otros parasitoides larvales asiáticos probados, aunque probablemente consiste en diferentes biotipos o especies crípticas con especificidad variable del huésped 8,21,22,23,24. Nomano et al.22 agruparon individuos de Ganaspis de diferentes regiones geográficas en cinco grupos genéticos (denominados G1-G5) basados en análisis moleculares del fragmento del gen de la citocromo oxidasa I mitocondrial. Los grupos G2 y G4 se informan solo en unos pocos lugares tropicales del sur de Asia, y el grupo G5 se informó desde Asia y otras regiones (por ejemplo, Argentina, Brasil, Hawai y México) desde huéspedes desconocidos (Buffington, observación personal). Las colecciones de campo de frutas silvestres infestadas por D. suzukii en Corea del Sur7, China8 y Japón 9,23,25 encontraron G1 solo o una mezcla de especímenes que representan los grupos G1 y G3. Los dos grupos parecen ser simpátricos y coexisten en las mismas plantas huésped habitadas por D. suzukii y otras moscas huésped estrechamente relacionadas. No obstante, se han observado algunas diferencias entre los dos grupos, con G1 aparentemente teniendo un mayor grado de especificidad del hábitat del huésped o huésped a D. suzukii que G3, aunque ambos atacan a varias especies estrechamente relacionadas en las pruebas de cuarentena21,22. Los análisis moleculares más detallados pueden ayudar a determinar el estado de la especie, especialmente para los grupos G1 y G3. Este estudio se refiere a ellos como G1 G. brasiliensis y G3 G. brasiliensis. Algunos estudios tempranos también nombraron al G1 G. brasiliensis como G. cf. brasiliensis 14,21,22. El G1 G. brasiliensis ha sido aprobado recientemente para su liberación en campo contra D. suzukii en los Estados Unidos e Italia (varios otros países europeos también están considerando actualmente su introducción), mientras que el G3 G. brasiliensis puede ser considerado para su liberación en campo en un futuro próximo. Encuestas recientes también encontraron poblaciones adventivas de L. japonica y G1 G. brasiliensis en Columbia Británica, Canadá26, y el estado de Washington, EE.UU. (Beers et al., datos no publicados), y poblaciones adventivas de L. japonica en la provincia de Trento, Italia27.
Dado el interés significativo en el desarrollo de programas de control biológico para el manejo de Drosophila suzukii y el potencial sustancial de control biológico de las introducciones adventivas y deliberadas de Ganaspis brasiliensis, existe la necesidad de desarrollar métodos de cría eficientes para este parasitoide larvario para futuras investigaciones a largo plazo y / o liberación de campo. Este protocolo y el artículo de video asociado describen dos conjuntos de métodos de cría para este parasitoide: (1) cría de laboratorio a pequeña escala en frascos utilizando una mezcla de fruta huésped (arándano) y dieta artificial para el cultivo de D. suzukii. Los métodos se desarrollaron utilizando material G3 recolectado originalmente de Kunming, China8. (2) Cría en masa para la liberación en campo en jaulas grandes utilizando fruta huésped (arándano) para el cultivo de D. suzukii. El grupo genético utilizado para la cría a gran escala fue el stock G1 originario de Tokio, Japón 9,22. También se discuten brevemente otras escalas de métodos de cría, como el uso de viales o recipientes pequeños para ambos grupos.
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Protocol
1. Métodos para la cría en laboratorio a pequeña escala de G3 Ganaspis brasiliensis
- Prepare la dieta del anfitrión.
- Agregue 600 ml de agua destilada a un recipiente de vidrio de 1,500 ml y caliente el agua en una placa caliente.
- Añadir 88,6 g de dieta seca disponible comercialmente (a base de agar, levadura de cerveza, harina de maíz, metilparabeno y sacarosa) o preparar la dieta utilizando la fórmula publicada por Dalton et al.28 (véase el paso 2.1.2).
- Agregue 300 ml de agua destilada a la dieta seca y revuelva bien la mezcla de la dieta.
- Agregue la mezcla al agua hirviendo.
- Deje que la dieta líquida en la placa caliente hierva durante 10 minutos mientras agita periódicamente la mezcla para evitar que se queme.
- Deje que la dieta se enfríe a temperatura ambiente durante 30 minutos mientras la agita ocasionalmente para distribuir la liberación de calor de manera uniforme y evitar que la dieta se solidifique en la superficie.
- Mida 6,7 ml de EtOH al 95% en un recipiente y 3,5 ml de solución de ácido propiónico al 1 M en otro recipiente.
- Una vez que la dieta se haya enfriado, agregue el EtOH y luego la solución de ácido propiónico, revolviendo bien después de cada adición.
- Prepare los arándanos (comprados en el mercado local) enjuagándolos en agua fría, luego en una solución de blanqueador de hipoclorito de sodio (diluido al 5%) y agua fría nuevamente.
- Seque la fruta con una toalla de papel y macháquela manualmente hasta que la piel de cada fruta se rompa y los jugos y la pulpa de la fruta queden expuestos.
- Agregue 25-30 g de puré de arándanos a cada matraz de 250 ml. Toque los lados del matraz para asegurarse de que la parte inferior interior del matraz esté cubierta con una capa uniforme de puré de arándanos.
- Vierta la dieta preparada en cada matraz para que solo cubra la parte superior del puré de arándanos.
- Agregue tapones de espuma a los cuellos de los matraces y permita que la dieta se solidifique a temperatura ambiente (Figura 1).
- Una vez que la dieta se haya solidificado, úselo inmediatamente o guárdelo a 5 ° C durante un máximo de 3 semanas.
- Anfitrión trasero Drosophila suzukii.
- Retire la dieta almacenada del refrigerador y permita que se equilibre a la temperatura ambiente, o use una dieta recién hecha.
- Corta un trozo de toalla de papel absorbente (por ejemplo, 5 cm x 20 cm) y górtalo en el centro. Coloque la sección central retorcida de la toalla de papel en el matraz (Figura 1).
- Humedezca la toalla de papel y la superficie de la dieta con agua destilada para retener la humedad.
- Transfiera las moscas adultas sexualmente maduras de los matraces de mosca de la colonia actual a un nuevo matraz de dieta retirando cuidadosamente el tapón del matraz viejo e invirtiendo rápidamente el matraz y alineando la abertura del matraz viejo con el nuevo matraz.
- Toque suavemente el lado del matraz viejo para inducir a las moscas a caer en el nuevo matraz. Asegúrese de que haya ~ 25-30 pares de apareamiento de D. suzukii en el nuevo matraz. Una vez que haya suficientes moscas en el nuevo matraz, voltee rápidamente el matraz viejo en posición vertical y reemplace los tapones en ambos matrazs.
- Repita las transferencias de moscas hasta que no queden moscas en los frascos viejos. Si es necesario, combine o recoja moscas de más de un matraz viejo en un matraz nuevo para asegurarse de que haya suficientes moscas (20-30 pares) por matraz.
- Mantenga los nuevos matraces después de una semana de exposición a moscas adultas en condiciones adecuadas (21 ° C, 16 L: fotoperíodo 8 D, 60% -80% de humedad relativa [RH%]) en una cámara ambiental durante 3 semanas para la emergencia de moscas.
- Exponer las larvas del huésped a los parasitoides.
- Tome un matraz (ver paso 1.2.7) que contenga huevos de mosca y larvas después de retirar las moscas adultas y la toalla de papel retorcida del matraz.
- Doble un trozo de toalla de papel absorbente por la mitad y colóquelo en el matraz como sustrato de pupación para las larvas parasitadas.
- Aspirar seis pares femeninos y masculinos de G3 G. brasiliensis en cada matraz (Figura 1). Raye una capa delgada de miel en la parte inferior del tapón de espuma.
- Deje los parasitoides en el matraz durante 5 días.
- Después de una exposición de 5 días, retire los parasitoides y mantenga los matraces en las condiciones descritas anteriormente en una cámara ambiental durante 35 días hasta la emergencia esperada de la avispa.
- Recolectar y almacenar parasitoides adultos.
- Durante la segunda y tercera semana de incubación, revise los matraces semanalmente para detectar la emergencia temprana del huésped y retire las moscas adultas.
- Una vez que los parasitoides adultos comienzan a emerger, aspirarlos tres veces por semana y mantenerlos en viales de drosophila (por ejemplo, 2,5 cm x 9,5 cm) (Figura 1).
- Coloque un pequeño trozo de toalla de papel humedecido, pero no saturado, con agua destilada en la parte inferior del vial.
- Agregue ~ 60 parasitoides a cada vial y etiquete el vial con las fechas de emergencia. Raye una capa delgada de miel en la parte inferior del tapón de espuma, dos veces por semana. Guarde los viales con parasitoides adultos en las condiciones descritas anteriormente en la cámara ambiental hasta por un mes si no se usa antes.
- Vuelva a colocar el papel en el vial una vez cada 4-7 días o reemplace la toalla de papel si hay signos de moho.
2. Métodos para la cría a gran escala de G1 Ganaspis brasiliensis
- Implementar una cría a gran escala del huésped Drosophila suzukii.
- Trasera D. suzukii dentro de jaulas grandes cubiertas de malla de punto (por ejemplo, 50 cm x 50 cm x 100 cm) cada una conteniendo 1.500-2.000 moscas adultas sexualmente maduras (proporción de sexos 50:50) (Figura 2).
- Prepare el Drosophila Medium estándar (SDM) hirviendo todos los ingredientes (6 g de agar bacteriológico, 75 g de harina de maíz, 17 g de levadura nutricional, 15 g de sacarosa, 10 g de harina de soja, 10 ml de ácido propiónico) en 1 L de agua destilada durante 10 min mientras agita periódicamente la mezcla para evitar que se queme28.
- Deje que la mezcla se enfríe durante 5 minutos y agregue 5 g de ácido ascórbico.
- Vierta el SDM recién cocido en placas de Petri de 9 cm y deje que el medio se solidifique a temperatura ambiente antes de cerrar los platos.
- Apilar las placas de Petri SDM, envolver la pila con papel de aluminio y almacenar los platos a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
- Dentro de cada jaula de cría, coloque un plato con algodón empapado en agua y de cuatro a seis placas de Petri con SDM (Figura 2).
- Dos veces por semana, reemplace las placas de Petri SDM infestadas por otras frescas.
- Coloque las placas de Petri SDM infestadas sin tapas individualmente en vasos de plástico (13,3 cm de diámetro o 800 ml), cierre cada taza con una cubierta de malla fina (<0,5 mm) e incube durante 12-15 días a 23 ° C y 75% HR (Figura 2).
- Transfiera a los adultos D. suzukii recién nacidos de los vasos de plástico a las jaulas de cría.
- Prepare las larvas del huésped.
- Enjuague los arándanos en agua fría durante 1 minuto y remoje las frutas en un recipiente lleno de una solución de lejía (diluida al 5%) durante 3 minutos.
- Escurra la solución de lejía y llene el recipiente con agua fría para enjuagar los arándanos. Mezclar suavemente a mano durante al menos 30 s.
- Repita el paso 2.2.2 con agua dulce al menos tres veces para eliminar los residuos de lejía y otros artrópodos (por ejemplo, ácaros, trips) que puedan estar presentes en la fruta.
- Coloque la fruta en una bandeja con varias capas de toallas de papel absorbentes e incline cuidadosamente la bandeja hacia adelante y hacia atrás, enrollando las bayas para secarlas.
- Preparar varias placas de Petri de 9 cm (ya sea la mitad superior o inferior, boca arriba) y rellenar cada una con los arándanos lavados (15-25 frutas por plato dependiendo del tamaño de la fruta).
- Durante las últimas horas de la tarde, exponga las placas de Petri a las moscas adultas sexualmente maduras dentro de las jaulas de cría del huésped (consulte el paso 2.1) y déjelas durante la noche.
- A la mañana siguiente, retire las placas de Petri de las jaulas de cría del huésped soplándolas suavemente o golpeándolas para desalojar las moscas de las frutas y use la fruta infestada para la cría de parasitoides (ver paso 2.4).
- Implementar una cría de parasitoides a gran escala.
- Use dos tipos de jaulas para criar el parasitoide: una para el parasitismo y otra para la emergencia de avispas.
- Asegúrese de que la jaula de parasitismo sea cúbica (por ejemplo, 45 cm cada lado) con un panel de plástico transparente en la parte frontal para observar la actividad de los insectos, dos aberturas de manga de 18 cm en el panel frontal para la adición o eliminación de insectos y el reemplazo de material alimenticio, y redes finas de poliéster (por ejemplo, malla de 96 x 26) en la parte superior y los lados para la ventilación.
- Haga que la jaula de emergencia sea más pequeña (por ejemplo, 30 cm cada lado), con una sola abertura de manga en dos lados opuestos y un panel de plástico transparente en la parte frontal para mayor visibilidad (Figura 2).
- Asegúrese de que ambos tipos de jaulas tengan una cuerda delgada que cuelgue debajo del techo desde la cual suspender de uno a varios comederos (Figura 2).
NOTA: Un alimentador consiste en un gran tapón de espuma cilíndrico (9 cm de diámetro) cubierto con gotas de miel dispersas, y se puede colocar en el piso de la jaula o colgar del techo de la jaula (Figura 2). - Dentro de cada jaula, proporcione agua en un vial de drosophila de pared recta (2,5 cm x 9,5 cm) sellado con un tapón de acetato de celulosa (2,5 cm de diámetro) cada 5-7 días, dependiendo de la HR. Cuelgue el vial boca abajo del techo de la jaula (Figura 2).
- Exponga las larvas huésped a los parasitoides.
- Exponga la fruta infestada de huéspedes dentro de las placas de Petri a G1 G. brasiliensis inmediatamente después de la infestación nocturna de D. suzukii (ver paso 2.2.7).
- Deje las 10-15 placas de Petri de fruta infestada en la jaula de parasitación que contiene 1,500-2,000 avispas durante 2-3 días.
- Use vasos de plástico (13,3 cm de diámetro u 800 ml) con capas de papel absorbente en la parte inferior para recoger la fruta que contiene los huéspedes parasitados (Figura 2).
- Coloque las copas abiertas en la jaula de eclosión e incube durante al menos 28 días a 21 °C y 65% de HR (Figura 2).
- Durante la segunda y tercera semana de incubación, revise la jaula semanalmente para detectar la eclosión temprana del huésped y retire las moscas adultas para facilitar la recolección sucesiva de parasitoides.
- Al final de la cuarta semana de incubación, agregue un comedero y una fuente de agua a la jaula.
- Recolecte y almacene los parasitoides adultos.
- Una vez que comience la emergencia parasitoide, recoja una porción (10% -15%) de los adultos y transfiéralos de nuevo a la jaula de parasitismo para reemplazar a los viejos individuos improductivos.
- Recoger y almacenar los parasitoides restantes en vasos de plástico (13,3 cm de diámetro o 800 ml) (Figura 3A).
- Coloque un tubo (2 ml) lleno de agua y sellado con un rollo de algodón dental (1 cm x 3,8 cm) en la parte inferior de la taza (Figura 3A).
- Cierre la taza con una tapa modificada equipada con un tapón de espuma extraíble (3,5 cm de diámetro) como sustrato alimentador y un orificio cubierto de malla para la ventilación (Figura 3B).
- Agregue hasta 700 adultos a cada taza (proporción de sexos 50:50), etiquete la taza con la fecha de emergencia y guárdela en una cámara ambiental (17 ° C; 65% HR) hasta que se use, o hasta por 1 mes (Figura 3B).
- Envía los parasitoides adultos.
- Use tubos cónicos (50 ml) para enviar los parasitoides adultos.
- Perfore un orificio de ventilación (8 mm de diámetro) en la tapa y cúbralo con una red de malla fina (Figura 3C).
- Agregue un anillo de alimentación de acetato de celulosa en el interior de la tapa (Figura 3C).
- Prepare una solución de sacarosa saturada con agua destilada, aplique unas gotas en el anillo de alimentación y deje que absorba el líquido.
- Coloque un trozo de toalla de papel absorbente en forma de abanico dentro del tubo (Figura 3D).
- Agregue ~ 200 parasitoides adultos a cada tubo y coloque los tubos en un contenedor de envío aislado junto con bolsas de hielo.
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Representative Results
La Figura 4 muestra resultados representativos de la cría en laboratorio a pequeña escala de G3 Ganaspis brasiliensis utilizando dos densidades parasitoides diferentes (seis o 10 pares) y dos tiempos de exposición diferentes (5 o 10 días) en la instalación de cuarentena de la Unidad de Introducción de Insectos Beneficiosos del USDA-ARS (Newark, Delaware). Hubo 14 réplicas para cada combinación de densidad parasitoide y tiempo de exposición. En total, los 64 matraces produjeron 4.018 avispas (71,7 ± 4,9 crías por matraz) con un 49,5% ± un 1,9% de descendencia femenina. A 21 °C, los parasitoides adultos emergieron aproximadamente 30-35 días después de la oviposición. La densidad de parasitoides y el tiempo de exposición no afectaron significativamente el número total de descendientes producidos por réplica (matraz) (ANOVA unidireccional, F3,52 = 0,379, P = 0,769) y solo tuvieron un efecto marginal en el porcentaje de descendientes femeninos (ANOVA unidireccional, los datos se transformaron de forma logit antes del análisis según fuera necesario para estabilizar la variación, F3,52 = 2,796, P = 0,049), aunque la eficiencia de producción per cápita femenina (ANOVA unidireccional, F3,52 = 3,576, P = 0,020) disminuyó en la alta densidad parasitoide. El tiempo de exposición de más de 5 días no pareció aumentar la productividad. El aumento de la densidad parasitoide tampoco pareció aumentar la productividad. Por lo tanto, la combinación de seis pares y tiempos de exposición de 5 días parece ser la más adecuada para la cría en laboratorio.
La Figura 5 muestra una tendencia de productividad de 6 meses de la cría a gran escala de G1 Ganaspis brasiliensis en la instalación de cuarentena de la Fundación Edmund Mach (Trento, Italia) en 2021. La cría se inició utilizando 150 avispas hembra apareadas de tres días de edad derivadas de una cría a pequeña escala en el laboratorio de cuarentena de CABI en Delémont, Suiza. Más avispas de la cría se agregaron gradualmente a la jaula de parasitismo, hasta llegar a 1.500-2.000 individuos (proporción de sexos 50:50) en la semana 5. La ocupación de la jaula de parasitismo se mantuvo a partir de entonces al mismo nivel mediante la adición de nuevas avispas producidas en la propia cría a gran escala. Durante todo el período, la jaula de parasitismo se proporcionó con fruta recién infestada cada 2-3 días. La fruta (arándanos) se ofreció a G1 G. brasiliensis inmediatamente después de la exposición nocturna a Drosophila suzukii. La producción de parasitoides comenzó 5 semanas después de la exposición inicial del huésped (Figura 5A). Desde la semana 8 hasta la semana 22, la producción de parasitoide fue proporcional a la cantidad de fruta expuesta, promediando 0,44 ± 0,03 g/parasitoide (media ± SE; Figura 5B). Se recolectaron un total de 53.736 parasitoides, con una progenie femenina promedio del 45,9% (rango: 32,4%-79,0%).
Figura 1: Diagrama de flujo para procedimientos de cría en laboratorio a pequeña escala de Drosophila suzukii y G3 Ganaspis brasiliensis. El lado izquierdo muestra los procedimientos de cría de moscas anfitrionas, mientras que el lado derecho ilustra el ciclo de cría de parasitoides. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diagrama de flujo para los procedimientos de cría a gran escala de Drosophila suzukii y G1 Ganaspis brasiliensis. El lado izquierdo muestra los procedimientos de cría de moscas anfitrionas, mientras que el lado derecho ilustra el ciclo de cría de parasitoides. Abreviatura: SDM = medio estándar de Drosophila. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Contenedores y tubos utilizados para almacenar y enviar G1 Ganaspis brasiliensis desde la cría a gran escala. (A) Una vista horizontal del contenedor de almacenamiento que muestre un tubo de agua dentro del contenedor, (B) una vista vertical del contenedor que muestre una tapa ventilada y un tapón de espuma, y (C) una tapa ventilada y un trozo de papel absorbente para (D) el tubo de envío. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ejemplo representativo para la cría en laboratorio a pequeña escala de G3 Ganaspis brasiliensis. (A) Número de crías producidas por matraz, (B) número de crías producidas por avispa hembra, y (C) porcentaje de crías hembras, bajo dos densidades parasitoides y tiempos de exposición diferentes. Los valores son medios ± SE, y las barras con diferentes letras son significativamente diferentes (ANOVA, HSD de Tukey, P < 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Tendencia de la productividad de la cría a gran escala desde su inicio hasta la semana 23. (A) Las barras indican el número de crías de G1 Ganaspis brasiliensis recolectadas semanalmente de las jaulas de eclosión para reemplazar a los individuos viejos en la jaula de parasitismo (verde oscuro) y para ser almacenadas o enviadas (verde claro). La línea naranja indica la cantidad de fruta infestada del huésped (kg de arándanos) proporcionada cada semana a los parasitoides dentro de la jaula de parasitismo. (B) Relación semanal entre el peso de la fruta infestada por el huésped y el número de descendientes parasitoides producidos 5 semanas después de la exposición (es decir, gramos de fruta necesarios para producir un solo parasitoide adulto). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La investigación a largo plazo y las posteriores liberaciones de campo de un agente de control biológico dependen de la disponibilidad de técnicas de cría eficaces y económicas. Los métodos descritos en este estudio han demostrado ser protocolos eficientes para la cría a pequeña y gran escala de Ganaspis brasiliensis. El protocolo de cría a pequeña escala se ha desarrollado durante varios años para optimizar la cantidad de mano de obra y reducir el equipo especializado necesario para mantener las colonias parasitoides y huéspedes simultáneamente. Es adecuado para mantener una colonia para investigación de laboratorio o bioensayos. Los autores han utilizado métodos similares para criar este parasitoide para las evaluaciones de cuarentena de este parasitoide. El protocolo de cría a gran escala permitirá producir un gran número de avispas para su liberación en el campo, como se llevó a cabo recientemente en Italia. Estas tecnologías pueden transferirse fácilmente a otros laboratorios, productores o empresas para la cría a gran escala en un futuro próximo, además de servir de base para nuevas mejoras en las metodologías.
Estos protocolos también se pueden utilizar para criar Leptopilina japonica, ya que tanto Ganaspis brasiliensis como L. japonica son similares en términos de su preferencia de hábitat del huésped 7,8, preferencia de etapa del huésped o biología reproductiva15, rendimiento térmico18 y eficiencia de forrajeo en bioensayos de laboratorio13,15, así como respuestas conductuales hacia las señales asociadas al huésped12, excepto que L. japonica parece tener un rango de huéspedes más amplio que el de incluso G3 G. brasiliensis20. Ambos parasitoides se han criado utilizando métodos similares a los descritos en este documento. Para la cría a pequeña escala, ambos parasitoides también se pueden criar en viales de drosophila, generalmente transfiriendo 20 larvas jóvenes (1-2 días de edad) de Drosophila suzukii a un vial de drosophila lleno de 2 cm de dieta artificial, o colocando dos frutas infestadas, cada una con 5-10 larvas jóvenes de D. suzukii, y exponiéndolas a dos avispas hembras apareadas durante 2-3 días, ambos produciendo ~10 descendientes por vial 13,15,22.
Como se discutió anteriormente, el G1 y G3 Ganaspis brasiliensis utilizado en este protocolo puede diferir ligeramente en algunos comportamientos de búsqueda de host y la especificidad del huésped21,22. Girod et al.21 informan que el G1 G. brasiliensis japonés era más estrictamente específico de Drosophila suzukii, y no parecía tener un buen desempeño en la dieta artificial pura en viales en comparación con su rendimiento en la fruta huésped. Matsuura et al.25 también informaron que las poblaciones de G1 G. brasiliensis recolectadas de cerezas infestadas de D. suzukii en Japón se especializan en D. suzukii. El método de cría a pequeña escala utilizando una dieta mezclada con arándanos se desarrolló inicialmente para la cría de G3 G. brasiliensis porque G1 G. brasiliensis no estaba disponible en ese momento. Más tarde, se descubrió que este método no funcionaba bien para la cría de G1 G. brasiliensis (wang et al. datos no publicados).
Por lo tanto, para la cría a pequeña escala de G1 G. brasiliensis, se sugiere modificar el sustrato del huésped (1) exponiendo las moscas directamente a los arándanos (u otra fruta huésped) para recolectar larvas huésped en la fruta, y (2) transfiriendo la fruta expuesta a un medio de cultivo estándar de Drosophila para que las larvas se desarrollen en un ambiente de baja competencia colocando las frutas infestadas que contienen las larvas huésped en la dieta en los matraces para la exposición a los parasitoides. Esto permitirá que las larvas parasitadas se alimenten de la dieta, especialmente a altas densidades del huésped, y que las pupas huésped parasitadas se recojan de la toalla de papel. Alternativamente, G1 G. brasiliensis se puede criar en frutas directamente en recipientes de plástico (varios tamaños) exponiendo 5-10 avispas hembras a 10-20 arándanos infestados durante 4-5 días, lo que produjo hasta 80 crías por contenedor, dependiendo de la densidad del huésped (Wang et al., datos no publicados). Para este método, se recomienda colocar la fruta infestada en una malla metálica elevada ("tela de hardware") para permitir que los parasitoides accedan a la fruta infestada desde todas las direcciones, especialmente si se colocan demasiadas frutas en un recipiente. Idealmente, se deben colocar una o dos capas de fruta infestada en cada recipiente para este método de cría. Estos métodos alternativos a pequeña escala también deberían funcionar bien para la cría de G3 G. brasiliensis.
Independientemente de los métodos y escalas de cría (vial, matraz, recipiente o jaula), es fundamental mantener la temperatura, la humedad y el control adecuados de la edad, la densidad y el tiempo de exposición de las avispas huéspedas o hembras para la cría de G1 Ganaspis brasiliensis y G3 G. brasiliensis. Las larvas de Drosophila suzukii se desarrollaron en aproximadamente 1 semana en condiciones normales de laboratorio (por ejemplo, 22 ± 2 °C) 15. La hembra G. brasiliensis prefirió atacar a las larvas huésped más jóvenes (1-2 días de edad) que a las más viejas (3-4 días de edad), aunque varias edades de larvas huésped podrían ser atacadas15. A 22 ± 2 ° C, las hembras de G. brasiliensis emergieron con una proporción sustancialmente alta (~ 50%) de su complemento de por vida de huevos maduros, y la carga de huevos maduros alcanzó un pico después de 2-3 días15. Las hembras adultas sobrevivieron ~ 20 días cuando se les proporcionó acceso ilimitado a los huéspedes y comenzaron la oviposición dentro de los 2 días posteriores a la emergencia, alcanzando un pico de oviposición dentro de los 5-10 días y luego reduciendo gradualmente la oviposición15. Por lo tanto, las avispas hembras jóvenes (<10 días de edad) deben usarse en la cría, pero las avispas hembra podrían reutilizarse para la cría cuando escasean. El parasitoide podría desarrollarse fácilmente a 21-25 ° C, pero las temperaturas por debajo de 17.2 ° C parecieron desencadenar una diapausa facultativa17. Por lo tanto, se recomienda utilizar un rango de temperatura de 21-25 ° C para un desarrollo óptimo tanto de la mosca como del parasitoide.
Además, el tiempo de exposición de más de 5 días probablemente no aumentará la productividad del parasitoide. El aumento de la densidad de parasitoides basado en la cría a pequeña escala para G3 G. brasiliensis parece no aumentar la productividad, posiblemente debido a la interferencia mutua entre las avispas hembra forrajeras. Seis parejas macho-hembra y un tiempo de exposición de 5 días parecen ser una combinación ideal para la cría a pequeña escala en laboratorio, aunque los métodos de cría pueden mejorarse en el futuro optimizando aún más la proporción de huéspedes a parasitoides. Un factor de mortalidad importante para el parasitoide parece estar relacionado con la baja humedad, ya que se observó que muchos parasitoides no podían eclosionar con condiciones de sustrato seco. Agregar un trozo de toalla de papel absorbente debajo de la fruta no solo absorbe los jugos a medida que la fruta se degrada, sino que también proporciona un sustrato que se puede humedecer para aumentar la humedad o proporcionar un sustrato de pupación para la mosca.
Para la cría a pequeña escala, un matraz puede mantener la humedad mejor que un vial porque el primero tiene un cuello estrecho. También se encontró en este estudio que los arándanos frescos recubiertos con un polvo de levadura seca activa ayudaron a prevenir la formación de moho y mejoraron la atracción de la fruta hacia las moscas. Otros aspectos de la cría de parasitoides que aún no se han explorado incluyen (1) la posibilidad de criar este parasitoide en huéspedes alternativos o frutos huésped y cómo los huéspedes alternativos o las frutas huésped afectarían la eficiencia del parasitoide, (2) los factores que afectan la aptitud de la descendencia del parasitoide y la proporción de sexos, (3) la capacidad de este parasitoide (tanto G1 como G3) para adaptarse a condiciones de dieta artificial, y (4) los cambios genéticos o de comportamiento que pueden ocurrir con la adaptación.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Lukas Seehausen y Marc Kenis (CABI, Suiza) por proporcionar amablemente G1 G. brasiliensis. El financiamiento en Italia fue proporcionado por la Provincia Autonoma di Trento, Trento, Italia, y en los Estados Unidos por el Instituto Nacional de Alimentos y Agricultura, el premio de la Iniciativa de Investigación de Cultivos Especializados del USDA (# 2020-5118-32140), el Servicio de Inspección de Sanidad Animal y Vegetal del USDA (Farm Bill, fondo 14-8130-0463) y los fondos base del ARS CRIS del USDA (proyecto 8010-22000-033-00D). El USDA es un proveedor y empleador de igualdad de oportunidades y no respalda los productos mencionados en esta publicación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active dry yeast | Fleischmanns Yeast, Cincinatti, OH, USA | None | Used to cover fruit to reduce mold growth and enhance the frui attraction to the flies |
| Bacteriological agar | Merk Life Science S.r.l., Milan, Italy | A1296 - 5KG | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Bleach solution | Clorox Company, Oakland, CA, USA | None | Used to disinfect flesh fruit |
| Blue stopper | Azer Scientific, Morgantown, PA, USA | ES3837 | Used for sealing the tube while allowing ventilation for insects |
| Blueberries | Grocery Store, Newark, DE, USA | None | Provided as host fruit for the flies (various other fruit can also be used) |
| BugDorm insect rearing cage (W24.5 x D24.5 x H63.0 cm) | Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan | 4E3030 | Used for rearing parasitoids (parasitism cage) |
| BugDorm insect rearing cage (W32.5 x D32.5 x H32.5 cm) | Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan | 4E4590 | Used for rearing flies |
| BugDorm insect rearing cage (W32.5 x D32.5 x H32.5 cm) | Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan | 4E4545 | Used for rearing parasitoids (eclosion cage) |
| Chicken wire (0.64 cm, 19 gauge) | Everbilt, OH, USA | 308231EB | Used to lift up the fruit to allow maximum parasitoid oviposition |
| Cornmeal | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Dental cotton roll (1 x 3.8 cm) | Gima S.p.A., Gessate, MI, Italy | 35000 | Used for providing water to the parasitoids within the storage container |
| Drosophila diet | Frontier Scientific, Newark, DE, USA | TF1003 | Custom diet used to rear flies |
| Drosophila vial narrow, Polystirene (2.5 x 9.5 cm) | VWR International, LLC., Radnor, PA, US | 75813-160 | Used for providing water to the parasitoids within the cage |
| Drosophila vial plugs, Cellulose acetate (2.5 cm) | VWR International, LLC., Radnor, PA, US | 89168-886 | Used for providing water to the parasitoids within the cage |
| Erlenmeyer flask (250 mL) | Carolina Biological, Burlington, NC, USA | 731029 | Used for rearing flies and parasitoids |
| Falcon-style centrifuge tube (50 mL) | VWR International, LLC., Radnor, PA, US | VWRI525-0611 | Modified to ship adult parasitoids |
| Foam stopper | Jaece Industries, North Tanawanda, NY, USA | L800-C | Used for sealing the flasks while allowing ventilation for insects |
| Honey | Grocery Store, Newark, DE, USA | None | Provided as food for parasitoids |
| Identi-Plug plastic foam stopper | Fisher Scientific Company, L.L.C., Pittsburg, PA, US | 14-127-40E | Used as feeder for parasitoids and to seal the storage container |
| Industrial paper towel | Grocery Store, Newark, DE, USA | None | Provided as a pupation substrate for pupae and mitigated moisture |
| Micron mesh fabric (250 mL) | Industrial Netting, Maple Grove, MN, USA | WN0250-72 | Used to make ventilation lid for insects |
| Nutritional yeast (flakes) | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Paper coaster (10.2 cm) | Hoffmaster, WI, USA | 35NG26 | Porvided as pupation substrate for flies and parsitized pupae |
| Plastic cup (Ø 13.3 cm, 800 mL) | Berry Superfos, Taastrup, Denmark | Unipak 5134 | Modified to store adult parasitoids |
| Plastic lid (Ø 13.3 cm) | Berry Superfos, Taastrup, Denmark | PP 2830 | Modified to store adult parasitoids |
| Propionic acid | Merk Life Science S.r.l., Milan, Italy | P1386 - 1L | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Saccharose | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Soup cup with lid (475 mL) | StackMan, Vietnam | DC1648 | Used for parasitized larvae to pupate |
| Soybean flour | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| White felt washer (0.64 cm thick, 5 mm ID x 20 mm OD) | Quiklok, Lincoln, NH, US | WFW/.25 x 5 x 20 mm | Used as feeding ring for parasitoids |
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