Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Методы выращивания паразитоида Ganaspis brasiliensis, перспективного агента биологического контроля для инвазивной Drosophila suzukii

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63898
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3, 4, 5, 4, 6, 1,3, 2
1Research and Innovation Centre, Fondazione Edmund Mach, 2Beneficial Insects Introduction Research Unit, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 3Center for Agriculture, Food and Environment, University of Trento, 4Department of Environmental Science, Policy and Management, University of California Berkeley, 5Department of Agriculture, Food and Environment, University of Catania, 6Systematic Entomology Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

Summary

Ganaspis brasiliensis - личиночный паразитоид Drosophila suzukii (глобальный инвазивный вредитель плодовых культур) - был одобрен или рассматривается для интродукции в Европу и Соединенные Штаты для биологического контроля этого вредителя. В этой статье представлены протоколы как мелкомасштабного, так и крупномасштабного выращивания этого паразитоида.

Abstract

Родом из Восточной Азии, пятнистая дрозофила, Drosophila suzukii (Matsumura) (Diptera: Drosophilidae), широко распространилась в Северной и Южной Америке, Европе и некоторых частях Африки за последнее десятилетие, став разрушительным вредителем различных мягкокожих фруктов в своих захваченных регионах. Ожидается, что биологический контроль, особенно с помощью самовоспроизводящихся и специализированных паразитоидов, станет жизнеспособным вариантом устойчивого управления этим высокомобильным и полифаговым вредителем в масштабах всего района. Ganaspis brasiliensis Ihering (Hymenoptera: Figitidae) является личиночным паразитоидом, который широко распространен в Восточной Азии и, как было установлено, является одним из самых эффективных паразитоидов D. suzukii.

После тщательной предварительной оценки его эффективности и потенциальных нецелевых рисков одна из наиболее специфических для хозяина генетических групп этого вида (G1 G. brasiliensis) была недавно одобрена для интродукции и выпуска в полевые условия в Соединенных Штатах и Италии. Другая генетическая группа (G3 G. brasiliensis), которая также обычно подвергалась нападению на D. suzukii в Восточной Азии, может быть рассмотрена для внедрения в ближайшем будущем. В настоящее время существует огромный интерес к выращиванию G. brasiliensis для исследований или в массовом производстве для полевого выпуска против D. suzukii. Этот протокол и связанная с ним видеостатья описывают эффективные методы выращивания этого паразитоида, как в небольшом масштабе для исследований, так и в больших масштабах для массового производства и выпуска в полевые условия. Эти методы могут принести пользу дальнейшим долгосрочным исследованиям и использованию этого паразитоида азиатского происхождения в качестве перспективного агента биологического контроля над этим глобальным инвазивным вредителем.

Introduction

Родом из Восточной Азии, пятнистая дрозофила, Drosophila suzukii (Matsumura) (Diptera: Drosophilidae), широко распространилась в Северной и Южной Америке, Европе и некоторых частях Африки 1,2. Муха чрезвычайно полифаговая, будучи способной использовать различные культурные и дикие плоды с мягкой и тонкой кожурой в своих родных и захваченных регионах 1,2,3. Современные стратегии борьбы с этим вредителем в значительной степени зависят от частого использования инсектицидов, которые нацелены на взрослых мух на полях сельскохозяйственных культур, когда созревают восприимчивые плоды. Часто используются повторные опрыскивания, возможно, из-за постоянного распространения популяций резервуарных мух из некультурных мест обитания и отсутствия эффективных естественных врагов, обитающих в захваченных регионах 1,4. Биологический контроль, особенно с помощью самовоспроизводящихся специализированных паразитоидов, может помочь подавить популяции мух на ландшафтном уровне и сыграть решающую роль в устойчивом управлении этим высокомобильным и полифаговым вредителем 4,5,6 в масштабах всего района.

За последнее десятилетие исследователи сосредоточили усилия на обнаружении совместно эволюционировавших паразитоидов Drosophila suzukii в родных ареалах мухи в Восточной Азии 7,8,9, а также эффективных, но недавно ассоциированных паразитоидов в захваченных регионах мухи в Северной и Южной Америке и Европе 4,5,6. В недавно захваченных регионах мухи обычно встречающиеся личинки Drosophila parasitoids, такие как Asobara c.f. tabida (Nees) (Hymenoptera: Braconidae), Leptopilina boulardi (Barbotin et al.) и L. heterotoma (Thompson) (Hymenoptera: Figitidae), не могут развиваться или иметь низкий уровень паразитизма на D. suzukii из-за сильного иммунного сопротивления мухи10. Только некоторые космополитические и универсальные паразитоиды куколки, такие как Pachycrepoideus vindemiae (Rondani) (Hymenoptera: Pteromalidae) и Trichopria drosophilae (Perkins) (Hymenoptera: Diapriidae) в Северной Америке и Европе, и Trichopria anastrephae Lima в Южной Америке, могут легко развиться из этой мухи4. Напротив, исследования в Восточной Азии обнаружили ряд личиночных паразитоидов от D. suzukii 4,5,6. Среди них Asobara japonica Belokobylskij, Ganaspis brasiliensis Ihering и Leptopilina japonica Novković & Kimura являются доминирующими личиночными паразитоидами 7,8,9,11. В частности, две фигитиды (L. japonica и G. brasiliensis) были основными паразитоидами, преимущественно встречающимися в свежих фруктах, зараженных D. suzukii и/или другими близкородственными дрозофилидами в естественной растительности 7,8,9. Эти три азиатских личиночных паразитоида были импортированы в карантинные учреждения в США и Европе и оценены по их относительной эффективности 12,13,14,15,16,17, климатической адаптивности 18, потенциальным межвидовым конкурентным взаимодействиям19 и, самое главное, специфичности хозяина 8,20,21 ,22.

Карантинные оценки показали, что Ganaspis brasiliensis был более специфичным для хозяина Drosophila suzukii, чем другие протестированные азиатские личиночные паразитоиды, хотя он, вероятно, состоит из разных биотипов или загадочных видов с различной специфичностью хозяина 8,21,22,23,24. Nomano et al.22 сгруппировали людей Ganaspis из разных географических регионов в пять генетических групп (названных G1-G5) на основе молекулярного анализа фрагмента гена митохондриальной цитохромоксидазы I. Группы G2 и G4 зарегистрированы только в нескольких тропических местах Южной Азии, а группа G5 была зарегистрирована из Азии и других регионов (например, Аргентины, Бразилии, Гавайев и Мексики) от неизвестного хозяина (Buffington, личное наблюдение). Полевые коллекции диких фруктов, зараженных D. suzukii в Южной Корее7, Китае8 и Японии 9,23,25 обнаружили G1 отдельно или смесь образцов, представляющих группы G1 и G3. Эти две группы, по-видимому, симпатричны и сосуществуют на одних и тех же растениях-хозяевах, населенных D. suzukii и другими близкородственными мухами-хозяевами. Тем не менее, между двумя группами наблюдались некоторые различия, причем G1, по-видимому, имеет более высокую степень специфичности хозяина или среды обитания для D. suzukii, чем G3, хотя они оба атакуют ряд близкородственных видов в карантинных тестах21,22. Дальнейший подробный молекулярный анализ может помочь определить видовой статус, особенно для групп G1 и G3. Это исследование называет их G1 G. brasiliensis и G3 G. brasiliensis. Некоторые ранние исследования также называли G1 G. brasiliensis как G. ср. brasiliensis 14,21,22. G1 G. brasiliensis недавно был одобрен для полевого выпуска против D. suzukii в США и Италии (несколько других европейских стран также в настоящее время рассматривают возможность его введения), в то время как G3 G. brasiliensis может быть рассмотрен для полевого выпуска в ближайшем будущем. Недавние опросы также обнаружили адвентивные популяции как L. japonica, так и G1 G. brasiliensis в Британской Колумбии, Канаде26 и штате Вашингтон, США (Beers et al., неопубликованные данные), и адвентивные популяции L. japonica в провинции Тренто, Италия27.

Учитывая значительный интерес к разработке программ биологического контроля для лечения Drosophila suzukii и значительный потенциал биологического контроля адвентивных и преднамеренных интродукций Ganaspis brasiliensis, существует необходимость в разработке эффективных методов выращивания этого паразитоида личинок для будущих долгосрочных исследований и / или полевого высвобождения. Этот протокол и связанная с ним видеостатья описывают два набора методов выращивания этого паразитоида: (1) мелкомасштабное лабораторное выращивание в колбах с использованием смеси плодов хозяина (черники) и искусственная диета для культуры D. suzukii. Методы были разработаны с использованием материала G3, первоначально собранного из Куньмина, Китай8. (2) Массовое выращивание для выпуска в поле в больших клетках с использованием плодов хозяина (черники) для культуры D. suzukii. Генетической группой, используемой для крупномасштабного выращивания, был стад G1, происходящий из Токио, Япония 9,22. Другие масштабы методов выращивания, такие как использование флаконов или небольших контейнеров для обеих групп, также кратко обсуждаются.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Методы мелкомасштабного лабораторного выращивания G3 G3 Ganaspis brasiliensis

  1. Подготовьте диету хозяина.
    1. Добавьте 600 мл дистиллированной воды в стеклянную емкость объемом 1 500 мл и нагрейте воду на конфорке.
    2. Добавьте 88,6 г коммерчески доступной сухой диеты (изготовленной из агара, пивных дрожжей, кукурузной муки, метилпарабена и сахарозы) или приготовьте диету, используя формулу, опубликованную Dalton et al.28 (см. этап 2.1.2).
    3. Добавьте 300 мл дистиллированной воды в сухую диету и тщательно перемешайте диетическую смесь.
    4. Добавьте смесь в кипяток.
    5. Дайте жидкой диете на горячей плите закипеть в течение 10 минут, периодически перемешивая смесь, чтобы она не пригорела.
    6. Дайте диете остыть при комнатной температуре в течение 30 минут, периодически перемешивая ее, чтобы равномерно распределить выделение тепла и предотвратить затвердевание рациона на поверхности.
    7. Измерьте 6,7 мл 95% EtOH в одном контейнере и 3,5 мл 1 M раствора пропионовой кислоты в другом контейнере.
    8. Как только диета остынет, добавьте EtOH, а затем раствор пропионовой кислоты, тщательно помешивая после каждого добавления.
    9. Приготовьте чернику (приобретенную на местном рынке), промыв ее в холодной воде, затем в растворе отбеливателя гипохлорита натрия (разбавленном до 5%), и снова в холодной воде.
    10. Высушите фрукты бумажным полотенцем и вручную размяните их до тех пор, пока кожура на каждом фрукте не будет разбита, а соки и мякоть плода не будут обнажены.
    11. Добавьте 25-30 г протертой черники в каждую колбу объемом 250 мл. Постукивайте по бокам колбы, чтобы внутренняя часть колбы была покрыта ровным слоем пюре из черники.
    12. Влейте приготовленную диету в каждую колбу так, чтобы она просто покрывала верхушку пюре из черники.
    13. Добавьте пенные пробки к шейкам колб и дайте диете затвердеть при комнатной температуре (рисунок 1).
    14. Как только диета затвердеет, используйте ее немедленно или храните при 5 °C в течение 3 недель.
  2. Задний хозяин Drosophila suzukii.
    1. Извлеките хранящуюся диету из холодильника и дайте ей уравновеситься до температуры окружающей среды в помещении или используйте свежеприготовленную диету.
    2. Вырежьте кусок впитывающего бумажного полотенца (например, 5 см х 20 см) и закрутите его в центре. Поместите скрученную среднюю часть бумажного полотенца в колбу (рисунок 1).
    3. Смочите бумажное полотенце и поверхность рациона дистиллированной водой, чтобы сохранить влагу.
    4. Переместите половозрелых взрослых мух из нынешних колб колонии мух в новую диетическую колбу, аккуратно сняв пробку на старой колбе и быстро перевернув колбу и выровняв отверстие старой колбы с новой колбой.
    5. Осторожно постучите по стороне старой колбы, чтобы побудить мух упасть в новую колбу. Убедитесь, что в новой колбе есть ~25-30 спаривающихся пар D. suzukii . Как только в новой колбе появится достаточно мух, быстро переверните старую колбу в вертикальном положении и замените пробки на обеих колбах.
    6. Повторяйте переносы мух до тех пор, пока в старых колбах не останется мух. При необходимости объедините или соберите мух из более чем одной старой колбы в новую колбу, чтобы на одну колбу приходилось достаточно мух (20-30 пар).
    7. Держите новые колбы после недели воздействия взрослых мух в подходящих условиях (21 °C, 16 л: 8 D фотопериод, относительная влажность 60%-80% [RH%]) в экологической камере в течение 3 недель для появления мух.
  3. Подвергайте личинок хозяев паразитоидам.
    1. Возьмите колбу (см. шаг 1.2.7), содержащую яйца мух и личинки, после удаления всех взрослых мух и скрученного бумажного полотенца из колбы.
    2. Сложите кусочек впитывающего бумажного полотенца пополам и положите его в колбу в качестве подложки для окукливания паразитирующих личинок.
    3. Аспирировать шесть женских и мужских пар G3 G. brasiliensis в каждую колбу (рисунок 1). Протрите тонким слоем меда на дне пенопластовой пробки.
    4. Оставьте паразитоидов в колбе на 5 дней.
    5. После 5-дневного воздействия удалите паразитоиды и удерживайте колбы в условиях, описанных выше, в экологической камере в течение 35 дней до ожидаемого появления осы.
  4. Собирайте и храните взрослых паразитоидов.
    1. В течение второй и третьей недель инкубации еженедельно проверяйте колбы на раннее появление хозяина и удаляйте взрослых мух.
    2. Как только взрослые паразитоиды начнут появляться, аспирируйте их три раза в неделю и держите их во флаконах дрозофилы (например, 2,5 см х 9,5 см) (рисунок 1).
    3. Поместите небольшой кусочек бумажного полотенца, смоченного, но не насыщенного, дистиллированной водой на дно флакона.
    4. Добавьте ~ 60 паразитоидов к каждому флакону и пометьте флакон датами появления. Нанесите тонкий слой меда на дно пенопластовой пробки, два раза в неделю. Храните флаконы со взрослыми паразитоидами в условиях, описанных выше, в экологической камере до месяца, если не используют раньше.
    5. Смачивайте бумагу во флаконе один раз в 4-7 дней или заменяйте бумажное полотенце, если есть признаки плесени.

2. Методы крупномасштабного выращивания G1 Ganaspis brasiliensis

  1. Осуществить масштабное выращивание хозяина Drosophila suzukii.
    1. Задняя часть D. suzukii в больших клетках, покрытых вязаной сеткой (например, 50 см x 50 см x 100 см), каждая из которых содержит 1 500-2 000 половозрелых взрослых мух (соотношение полов 50:50) (рисунок 2).
    2. Приготовьте стандартную дрозофилу среду (SDM), кипятив все ингредиенты (6 г бактериологического агара, 75 г кукурузной муки, 17 г пищевых дрожжей, 15 г сахарозы, 10 г соевой муки, 10 мл пропионовой кислоты) в 1 л дистиллированной воды в течение 10 минут, периодически перемешивая смесь, чтобы предотвратить ее горение28.
    3. Дайте смеси остыть в течение 5 мин и добавьте 5 г аскорбиновой кислоты.
    4. Вылейте свежеприготовленный SDM в чашку Петри 9 см и дайте среде затвердеть при комнатной температуре перед закрытием тарелок.
    5. Сложите чашки SDM Petri, оберните стопку алюминиевой фольгой и храните посуду при температуре 4 °C до 2 недель.
    6. В каждую клетку для выращивания поместите тарелку с пропитанным водой хлопком и от четырех до шести чашек Петри с SDM (рисунок 2).
    7. Два раза в неделю заменяйте зараженную посуду SDM Petri свежей.
    8. Поместите зараженные чашки SDM Petri без крышек по отдельности в пластиковые стаканчики (диаметром 13,3 см или 800 мл), закройте каждую чашку покрытием из мелкой сетки (<0,5 мм) и инкубируйте в течение 12-15 дней при 23 °C и 75% относительной влажности (рисунок 2).
    9. Перенесите недавно вылупившихся взрослых особей D. suzukii из пластиковых стаканчиков в клетки для выращивания.
  2. Подготовьте личинок хозяина.
    1. Чернику промыть в холодной воде на 1 мин, а плоды замочить в тазу, наполненном раствором отбеливателя (разбавленного до 5%) на 3 мин.
    2. Слейте раствор отбеливателя и наполните таз холодной водой, чтобы промыть чернику. Осторожно перемешайте вручную в течение не менее 30 с.
    3. Повторите этап 2.2.2 с пресной водой по меньшей мере три раза для удаления остатков отбеливателя и других членистоногих (например, клещей, трипсов), которые могут присутствовать на плодах.
    4. Поместите фрукты на поднос с несколькими слоями впитывающих бумажных полотенец и осторожно наклоните лоток вперед и назад, раскатывая ягоды, чтобы высушить их.
    5. Подготовьте несколько 9 см чашек Петри (верхняя или нижняя половинки, обращенные вверх) и наполните каждую из них промытой черникой (15-25 плодов на тарелку в зависимости от размера плода).
    6. В поздние послеобеденные часы подвергайте чашки Петри половозрелым взрослым мухам в клетках выращивания хозяина (см. шаг 2.1) и оставьте их на ночь.
    7. На следующее утро выньте чашки Петри из клетки выращивания хозяина, осторожно дуя или постукивая по ним, чтобы выбить мух на плоды, и используйте зараженные плоды для выращивания паразитоидов (см. шаг 2.4).
  3. Осуществляют масштабное паразитоидное выращивание.
    1. Используйте два типа клеток для выращивания паразитоидов: один для паразитизма, а другой для появления осы.
    2. Убедитесь, что клетка паразитизма является кубической (например, 45 см с каждой стороны) с прозрачной пластиковой панелью спереди для наблюдения за активностью насекомых, двумя отверстиями рукава 18 см на передней панели для добавления или удаления насекомых и замены пищевого материала и тонкой полиэфирной сеткой (например, сетка 96 x 26) сверху и по бокам для вентиляции.
    3. Сделайте клетку меньше (например, 30 см с каждой стороны), с одним отверстием втулки на двух противоположных сторонах и прозрачной пластиковой панелью спереди для обзора (рисунок 2).
    4. Убедитесь, что оба типа клеток имеют тонкую нить, которая висит ниже потолка, на которую можно подвесить от одного до нескольких кормушек (рисунок 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кормушка состоит из большой цилиндрической пенопластовой пробки (диаметром 9 см), покрытой разбросанными каплями меда, и может быть помещена на пол клетки или подвешена к потолку клетки (рисунок 2).
    5. В каждую клетку подавайте воду в флакон с дрозофилой с прямой стенкой (2,5 см х 9,5 см), запечатанный ацетатной пробкой целлюлозы (диаметр 2,5 см) каждые 5-7 дней в зависимости от относительной влажности. Повесьте флакон вверх ногами к потолку клетки (рисунок 2).
  4. Подвергайте личинок хозяина паразитоидам.
    1. Подвергайте зараженные хозяином фрукты в чашках Петри G1 G. brasiliensis сразу после ночного заражения D. suzukii (см. шаг 2.2.7).
    2. Оставьте 10-15 чашек Петри зараженных плодов в клетке паразитирования, содержащей 1 500-2 000 ос, в течение 2-3 дней.
    3. Используйте пластиковые стаканчики (диаметром 13,3 см или 800 мл) со слоями абсорбирующей бумаги на дне, чтобы собрать плоды, содержащие паразитирующих хозяев (рисунок 2).
    4. Поместите открытые чашки в клетку эклозии и инкубируйте в течение не менее 28 дней при 21 °C и 65% относительной влажности (рисунок 2).
    5. В течение второй и третьей недель инкубации еженедельно проверяйте клетку на раннюю эклозию хозяина и удаляйте взрослых мух, чтобы облегчить последовательный сбор паразитоидов.
    6. В конце четвертой недели инкубации добавьте в клетку кормушку и источник воды.
  5. Собирайте и храните взрослых паразитоидов.
    1. Как только паразитоидное появление начнется, соберите часть (10-15%) взрослых и перенесите их обратно в клетку паразитизма, чтобы заменить старых непродуктивных особей.
    2. Соберите и храните оставшиеся паразитоиды в пластиковых стаканчиках (диаметр 13,3 см или 800 мл) (рисунок 3А).
    3. Поместите тюбик (2 мл), наполненный водой и запечатанный зубным ватным рулоном (1 см х 3,8 см) на дно чашки (рисунок 3А).
    4. Закройте чашку модифицированной крышкой, оснащенной съемной поролоновой пробкой (диаметр 3,5 см) в качестве подложки для подачи и отверстием для вентиляции, покрытым сеткой (рисунок 3B).
    5. Добавьте до 700 взрослых в каждую чашку (соотношение полов 50:50), пометьте чашку датой появления и храните ее в экологической камере (17 ° C; 65% относительной влажности) до использования или до 1 месяца (рисунок 3B).
  6. Корабль взрослых паразитоидов.
    1. Используйте конические трубки (50 мл) для транспортировки взрослых паразитоидов.
    2. Проткните вентиляционное отверстие (диаметром 8 мм) на колпачке и закройте его мелкой сеткой (рисунок 3C).
    3. Добавьте кольцо подачи ацетата целлюлозы на внутреннюю часть колпачка (рисунок 3C).
    4. Приготовьте насыщенный раствор сахарозы с использованием дистиллированной воды, нанесите несколько капель на подающее кольцо и дайте ему впитать жидкость.
    5. Поместите веерообразный кусок абсорбирующего бумажного полотенца в трубку (рисунок 3D).
    6. Добавьте ~ 200 взрослых паразитоидов в каждую трубку и поместите трубки в изолированный транспортный контейнер вместе с пакетами со льдом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 4 показаны репрезентативные результаты мелкомасштабного лабораторного выращивания G3 G3 Ganaspis brasiliensis с использованием двух различных плотностей паразитоидов (шесть или 10 пар) и двух разных времени воздействия (5 или 10 дней) в карантинном учреждении UsDA-ARS Beneficial Insects Introduction Unit (Ньюарк, штат Делавэр). Было 14 реплик для каждой комбинации плотности паразитоидов и времени воздействия. В общей сложности 64 колбы произвели 4018 ос (71,7 ± 4,9 потомства на колбу) с 49,5% ± 1,9% потомства самок. При 21 °C взрослые паразитоиды появились примерно через 30-35 дней после яйцекладки. Плотность паразитоидов и время воздействия существенно не влияли на общее количество потомства, произведенного на реплику (колбу) (односторонняя ANOVA, F3,52 = 0,379, P = 0,769) и оказывали лишь незначительное влияние на процент потомства самок (односторонний ANOVA, данные были логит-преобразованы до анализа по мере необходимости для стабилизации вариации, F3,52 = 2,796, P = 0,049), хотя эффективность производства на душу населения женского пола (односторонняя ANOVA, F3,52 = 3,576, P = 0,020) снижалась при высокой плотности паразитоидов. Время воздействия более 5 дней, по-видимому, не увеличивало производительность. Увеличение плотности паразитоидов аналогичным образом, по-видимому, не увеличивало производительность. Поэтому сочетание шести пар и 5-дневного времени воздействия, по-видимому, наиболее подходит для лабораторного выращивания.

На рисунке 5 показана 6-месячная тенденция продуктивности крупномасштабного выращивания G1 G1 Ganaspis brasiliensis на карантинном объекте Фонда Эдмунда Маха (Тренто, Италия) в 2021 году. Выращивание было начато с использованием 150 трехдневных спаренных самок ос, полученных в результате мелкомасштабного выращивания в карантинной лаборатории CABI в Делемоне, Швейцария. Больше ос из выращивания постепенно добавлялось в клетку паразитизма, пока не достигло 1 500-2 000 особей (соотношение полов 50:50) на 5-й неделе. После этого заполняемость клетки паразитизма поддерживалась на прежнем уровне путем добавления новых ос, произведенных в самом крупномасштабном выращивании. В течение всего периода клетка паразитизма обеспечивалась свежеизображенными плодами каждые 2-3 дня. Плод (черника) был предложен G1 G. brasiliensis сразу после ночного воздействия Drosophila suzukii. Производство паразитоидов началось через 5 недель после первоначального воздействия хозяина (рисунок 5A). С 8-й по 22-ю неделю паразитоидная продукция была пропорциональна количеству обнаженных плодов, составляя в среднем 0,44 ± 0,03 г/паразитоид (среднее ± SE; Рисунок 5B). В общей сложности было собрано 53 736 паразитоидов, при этом среднее женское потомство составило 45,9% (диапазон: 32,4%-79,0%).

Figure 1
Рисунок 1: Блок-схема для мелкомасштабных лабораторных процедур выращивания Drosophila suzukii и G3 Ganaspis brasiliensis. Левая сторона показывает процедуры выращивания мухи-хозяина, в то время как правая сторона иллюстрирует цикл выращивания паразитоидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Блок-схема крупномасштабных процедур выращивания Drosophila suzukii и G1 Ganaspis brasiliensis. Левая сторона показывает процедуры выращивания мухи-хозяина, в то время как правая сторона иллюстрирует цикл выращивания паразитоидов. Аббревиатура: SDM = стандартная среда дрозофилы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Контейнеры и трубки, используемые для хранения и транспортировки G1 G1 Ganaspis brasiliensis из крупномасштабного выращивания. А) Горизонтальный вид контейнера для хранения, на котором изображена водяная трубка внутри контейнера, В) вертикальный вид контейнера с вентилируемой крышкой и пенопластовой пробкой, а также С) вентилируемая крышка и лист абсорбирующей бумаги для D) транспортной трубки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Репрезентативный пример мелкомасштабного лабораторного выращивания G3 Ganaspis brasiliensis. (A) Количество потомства, произведенного на колбу, (B) количество потомства, произведенного на самку осы, и (C) процент потомства самок при двух различных плотностях паразитоидов и времени воздействия. Значения средние ± SE, а столбики с разными буквами значительно отличаются (ANOVA, Tukey's HSD, P < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Динамика продуктивности крупномасштабного выращивания с момента его начала до 23-й недели. (A) Бары показывают количество потомства G1 Ganaspis brasiliensis , собранного еженедельно из клеток эклозии для замены старых особей в клетке паразитизма (темно-зеленый) и для хранения или отправки (светло-зеленый). Оранжевая линия указывает на количество зараженных хозяином фруктов (кг черники), предоставляемых каждую неделю паразитоидам в клетке паразитизма. (B) Еженедельное соотношение веса зараженных хозяином плодов к числу паразитоидного потомства, произведенного через 5 недель после воздействия (т.е. граммы фруктов, необходимых для производства одного взрослого паразитоида). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Долгосрочные исследования и последующие полевые выбросы агента биологического контроля зависят от наличия эффективных и экономичных методов выращивания. Описанные методы в этом исследовании оказались эффективными протоколами как для мелкомасштабного, так и для крупномасштабного выращивания Ganaspis brasiliensis. Протокол мелкомасштабного выращивания разрабатывался в течение нескольких лет для оптимизации количества рабочей силы и сокращения специализированного оборудования, необходимого для одновременного поддержания колоний паразитоидов и хозяев. Он подходит для содержания колонии для лабораторных исследований или биоанализов. Аналогичные методы были использованы авторами для выращивания этого паразитоида для карантинных оценок этого паразитоида. Масштабный протокол выращивания позволит производить большое количество ос для полевого выпуска, как это недавно проводилось в Италии. Эти технологии могут быть легко переданы другим лабораториям, производителям или компаниям для масштабного выращивания в ближайшем будущем, а также служить основой для дальнейшего совершенствования методологий.

Эти протоколы могут также использоваться для выращивания Leptopilina japonica, поскольку и Ganaspis brasiliensis, и L. japonica похожи с точки зрения предпочтения среды обитания хозяина 7,8, предпочтения стадии хозяина или репродуктивной биологии15, тепловых характеристик18 и эффективности кормления в лабораторных биоанализах13,15, а также поведенческих реакций на сигналы, связанные с хозяином12, за исключением того, что L. japonica по-видимому, имеет более широкий диапазон хозяев, чем даже У G3 G. brasiliensis20. Оба паразитоида были выращены с использованием аналогичных способов, описанных в настоящем описании. Для мелкомасштабного выращивания оба паразитоида также могут быть выращены во флаконах дрозофилы, как правило, путем переноса 20 молодых (1-2 дня) личинок Drosophila suzukii во флакон дрозофилы, заполненный 2 см искусственной диеты, или путем размещения двух зараженных плодов, каждый из которых содержит 5-10 молодых личинок D. suzukii, и воздействия на них двух спаренных самок ос в течение 2-3 дней. оба производят ~10 потомств на флакон 13,15,22.

Как обсуждалось выше, G1 и G3 Ganaspis brasiliensis, используемые в этом протоколе, могут незначительно отличаться в некоторых вариантах поведения при поиске хозяина и специфичности хозяина21,22. Girod et al.21 сообщают, что японский G1 G. brasiliensis был более строго специфичен для Drosophila suzukii и, по-видимому, не показал хороших результатов при чистой искусственной диете во флаконах по сравнению с его производительностью на фруктах-хозяевах. Matsuura et al.25 также сообщили, что популяции G1 G. brasiliensis, собранные из вишни, зараженной D. suzukii, в Японии, специализируются на D. suzukii. Мелкомасштабный метод выращивания с использованием диеты, смешанной с черникой, был первоначально разработан для выращивания G3 G. brasiliensis, потому что G1 G. brasiliensis в то время не был доступен. Позже было обнаружено, что этот метод плохо работает для выращивания G1 G. brasiliensis (Wang et al. неопубликованные данные).

Поэтому для мелкомасштабного выращивания G1 G. brasiliensis предлагается модифицировать субстрат хозяина путем (1) воздействия на мух непосредственно черники (или других плодов-хозяев) для сбора личинок хозяина в плодах и (2) переноса открытых плодов в стандартную культурную среду дрозофилы для развития личинок в среде с низкой конкуренцией путем помещения зараженных плодов, содержащих личинок хозяина, на диету в колбах для воздействия паразитоидов. Это позволит паразитированным личинкам питаться рационом, особенно при высокой плотности хозяина, а паразитированным куколкам-хозяевам собирать из бумажного полотенца. В качестве альтернативы, G1 G. brasiliensis можно выращивать на плодах непосредственно в пластиковых контейнерах (различных размеров), подвергая 5-10 самок ос воздействию 10-20 зараженных черникой в течение 4-5 дней, которые производят до 80 потомков на контейнер, в зависимости от плотности хозяина (Wang et al., неопубликованные данные). Для этого метода рекомендуется поместить зараженные плоды на приподнятую металлическую сетку («аппаратную ткань»), чтобы паразитоиды могли получить доступ к зараженным фруктам со всех сторон, особенно если слишком много фруктов помещено в один контейнер. В идеале, один или два слоя зараженных фруктов должны быть помещены в каждый контейнер для этого метода выращивания. Эти альтернативные мелкомасштабные методы также должны хорошо работать для выращивания G3 G. brasiliensis.

Независимо от методов выращивания и чешуи (флакон, колба, контейнер или клетка), крайне важно поддерживать подходящую температуру, влажность, а также контролировать возраст хозяина или самку осы, плотность и время воздействия для выращивания как G1 Ganaspis brasiliensis , так и G3 G. brasiliensis. Личинки Drosophila suzukii развились примерно за 1 неделю при нормальных лабораторных условиях (например, 22 ± 2 °C) 15. Самка G. brasiliensis предпочитала атаковать более молодых (1-2 дня), чем более старых (3-4 дня) личинок хозяина, хотя личинки хозяев разного возраста могли быть атакованы15. При 22 ± 2 °C самки G. brasiliensis появились со значительно высокой долей (~ 50%) их пожизненного дополнения зрелых яиц, а нагрузка зрелых яиц достигла пика через 2-3 дня15. Взрослые самки выживали ~20 дней, когда им предоставлялся неограниченный доступ к хозяевам и начинали яйцекладку в течение 2 дней после появления, достигая пика яйцекладки в течение 5-10 дней и после этого постепенно уменьшая яйцекладку15. Поэтому молодые (<10 дней) самки ос должны использоваться в выращивании, но самки ос могут быть повторно использованы для выращивания, когда их не хватает. Паразитоид мог легко развиваться при 21-25 ° C, но температура ниже 17,2 ° C, по-видимому, вызывала факультативную диапаузу17. Поэтому рекомендуется использовать температурный диапазон 21-25 °C для оптимального развития как мухи, так и паразитоида.

Кроме того, время воздействия более 5 дней вряд ли увеличит продуктивность паразитоида. Повышенная плотность паразитоидов, основанная на мелкомасштабном выращивании G3 G. brasiliensis , по-видимому, не увеличивает продуктивность, возможно, из-за взаимного вмешательства среди кормовых самок ос. Шесть пар мужчина-самка и 5-дневное время воздействия, по-видимому, являются идеальной комбинацией для лабораторного мелкомасштабного выращивания, хотя методы выращивания могут быть улучшены в будущем путем дальнейшей оптимизации соотношения хозяина и паразитоида. Основной фактор смертности паразитоида, по-видимому, связан с низкой влажностью, так как было замечено, что многие паразитоиды не могут изолироваться при условиях сухого субстрата. Добавление куска впитывающего бумажного полотенца под фрукт не только поглощает соки по мере деградации плода, но и обеспечивает субстрат, который можно увлажнить, чтобы увеличить влажность или обеспечить субстрат для окукливания мухи.

Для мелкомасштабного выращивания колба может поддерживать влажность лучше, чем флакон, потому что первый имеет узкое горлышко. В этом исследовании также было обнаружено, что свежая черника, покрытая пылью активных сухих дрожжей, помогла предотвратить образование плесени и усилила притяжение плодов к мухам. Другие аспекты выращивания паразитоидов, которые еще предстоит изучить, включают (1) возможность выращивания этого паразитоида на альтернативных хозяевах или фруктах-хозяевах и то, как альтернативные хозяева или плоды-хозяева будут влиять на эффективность паразитоида, (2) факторы, влияющие на приспособленность и соотношение полов потомства паразитоида, (3) способность этого паразитоида (как G1, так и G3) адаптироваться к условиям искусственной диеты, и (4) генетические или поведенческие изменения, которые могут произойти при адаптации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Авторы благодарят Лукаса Зеехаузена и Марка Кениса (CABI, Швейцария) за любезное предоставление G1 G. brasiliensis. Финансирование в Италии было предоставлено Provincia Autonoma di Trento, Тренто, Италия, и в США Национальным институтом продовольствия и сельского хозяйства, премией USDA Specialty Crops Research Initiative (#2020-5118-32140), Службой инспекции здоровья животных и растений Министерства сельского хозяйства США (Farm Bill, фонд 14-8130-0463) и базовыми фондами USDA ARS CRIS (проект 8010-22000-033-00D). Министерство сельского хозяйства США является поставщиком равных возможностей и работодателем и не одобряет продукты, упомянутые в этой публикации.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Active dry yeast Fleischmanns Yeast, Cincinatti, OH, USA None Used to cover fruit to reduce mold growth and enhance the frui attraction to the flies
Bacteriological agar Merk Life Science S.r.l., Milan, Italy A1296 - 5KG Used to prepare the Standard Drosophila Medium
Bleach solution Clorox Company, Oakland, CA, USA None Used to disinfect flesh fruit
Blue stopper Azer Scientific, Morgantown, PA, USA ES3837 Used for sealing the tube while allowing ventilation for insects
Blueberries Grocery Store, Newark, DE, USA None Provided as host fruit for the flies (various other fruit can also be used)
BugDorm insect rearing cage (W24.5 x D24.5 x H63.0 cm) Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan 4E3030 Used for rearing parasitoids (parasitism cage)
BugDorm insect rearing cage (W32.5 x D32.5 x H32.5 cm) Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan 4E4590 Used for rearing flies
BugDorm insect rearing cage (W32.5 x D32.5 x H32.5 cm) Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan 4E4545 Used for rearing parasitoids (eclosion cage)
Chicken wire (0.64 cm, 19 gauge) Everbilt, OH, USA 308231EB Used to lift up the fruit to allow maximum parasitoid oviposition
Cornmeal Grocery Store, Trento, TN, Italy None Used to prepare the Standard Drosophila Medium
Dental cotton roll (1 x 3.8 cm) Gima S.p.A., Gessate, MI, Italy 35000 Used for providing water to the parasitoids within the storage container
Drosophila diet Frontier Scientific, Newark, DE, USA TF1003 Custom diet used to rear flies
Drosophila vial narrow, Polystirene (2.5 x 9.5 cm) VWR International, LLC., Radnor, PA, US 75813-160 Used for providing water to the parasitoids within the cage
Drosophila vial plugs, Cellulose acetate (2.5 cm) VWR International, LLC., Radnor, PA, US 89168-886 Used for providing water to the parasitoids within the cage
Erlenmeyer flask (250 mL) Carolina Biological, Burlington, NC, USA 731029 Used for rearing flies and parasitoids
Falcon-style centrifuge tube (50 mL) VWR International, LLC., Radnor, PA, US VWRI525-0611 Modified to ship adult parasitoids
Foam stopper Jaece Industries, North Tanawanda, NY, USA L800-C Used for sealing the flasks while allowing ventilation for insects
Honey Grocery Store, Newark, DE, USA None Provided as food for parasitoids
Identi-Plug plastic foam stopper Fisher Scientific Company, L.L.C., Pittsburg, PA, US 14-127-40E Used as feeder for parasitoids and to seal the storage container
Industrial paper towel Grocery Store, Newark, DE, USA None Provided as a pupation substrate for pupae and mitigated moisture
Micron mesh fabric (250 mL) Industrial Netting, Maple Grove, MN, USA WN0250-72 Used to make ventilation lid for insects
Nutritional yeast (flakes) Grocery Store, Trento, TN, Italy None Used to prepare the Standard Drosophila Medium
Paper coaster (10.2 cm) Hoffmaster, WI, USA 35NG26 Porvided as pupation substrate for flies and parsitized pupae
Plastic cup (Ø 13.3 cm, 800 mL) Berry Superfos, Taastrup, Denmark Unipak 5134 Modified to store adult parasitoids
Plastic lid (Ø 13.3 cm) Berry Superfos, Taastrup, Denmark PP 2830 Modified to store adult parasitoids
Propionic acid Merk Life Science S.r.l., Milan, Italy P1386 - 1L Used to prepare the Standard Drosophila Medium
Saccharose Grocery Store, Trento, TN, Italy None Used to prepare the Standard Drosophila Medium
Soup cup with lid (475 mL) StackMan, Vietnam DC1648 Used for parasitized larvae to pupate
Soybean flour Grocery Store, Trento, TN, Italy None Used to prepare the Standard Drosophila Medium
White felt washer (0.64 cm thick, 5 mm ID x 20 mm OD) Quiklok, Lincoln, NH, US WFW/.25 x 5 x 20 mm Used as feeding ring for parasitoids

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Asplen, M. K., et al. Invasion biology of spotted wing drosophila (Drosophila suzukii): a global perspective and future priorities. Journal of Pest Science. 88 (3), 469-494 (2015).
  2. Tait, G., et al. Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae): A decade of research towards a sustainable integrated pest management program. Journal of Economic Entomology. 114 (5), 1950-1974 (2021).
  3. Kirschbaum, D. S., Funes, C. F., Buonocore-Biancheri, M. J., Suárez, L., Ovruski, S. M. The biology and ecology of Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae). Drosophila suzukii management. Garcia, F. R. M. , Springer. Cham. 41-92 (2020).
  4. Wang, X. G., Lee, J. C., Daane, K. M., Buffington, M. L., Hoelmer, K. A. Biological control of Drosophila suzukii. CAB Reviews. 15, 054 (2020).
  5. Lee, J. C., et al. Biological control of spotted-wing drosophila (Diptera: Drosophilidae): Current and pending tactics. Journal of Integreated Pest Management. 10 (1), 13 (2019).
  6. Wang, X. G., Lee, J. C., Daane, K. M., Hoelmer, K. A. Biological control of spotted-wing drosophila: An update on promising agents. Drosophilia suzukii management. Garcia, F. R. M. , Springer. Cham. 143-167 (2020).
  7. Daane, K. M., et al. First exploration of parasitoids of Drosophila suzukii in South Korea as potential classical biological agents. Journal of Pest Science. 89 (3), 823-835 (2016).
  8. Giorgini, M., et al. Exploration for native parasitoids of Drosophila suzukii in China reveals a diversity of parasitoid species and narrow host range of the dominant parasitoid. Journal of Pest Science. 92 (2), 509-522 (2019).
  9. Girod, P., et al. The parasitoid complex of D. suzukii and other fruit feeding Drosophila species in Asia. Scientific Reports. 8 (1), 11839 (2018).
  10. Kacsoh, B. Z., Schlenke, T. A. High hemocyte load is associated with increased resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D. melanogaster. PLoS ONE. 7 (4), 34721 (2012).
  11. Buffington, M. L., Forshage, M. Redescription of Ganaspis brasiliensis (Ihering, 1905), new combination (Hymenoptera: Figitidae), a natural enemy of the invasive Drosophila suzukii (Matsumura, 1931)(Diptera: Drosophilidae). Procedings of the Entomoogical Society of Washington. 118 (1), 1-13 (2016).
  12. Biondi, A., et al. Innate olfactory responses of Asobara japonica (Hymenoptera: Braconidae)towards fruits infested by the invasive spotted wing drosophila. Journal of Insect Behavior. 30 (5), 495-506 (2017).
  13. Biondi, A., Wang, X. G., Daane, K. M. Host preference of three Asian larval parasitoids to closely related Drosophila species: implications for biological control of Drosophila suzukii. Journal of Pest Science. 94 (2), 273-283 (2021).
  14. Girod, P., Rossignaud, L., Haye, T., Turlings, T. C. J., Kenis, M. Development of Asian parasitoids in larvae of Drosophila suzukii feeding on blueberry and artificial diet. Journal of Applied Entomology. 142 (5), 483-494 (2018).
  15. Wang, X. G., Nance, A. H., Jones, J. M. L., Hoelmer, K. A., Daane, K. M. Aspects of the biology and reproductive strategy of two Asian larval parasitoids evaluated for classical biological control of Drosophila suzukii. Biological Control. 121, 58-65 (2018).
  16. Wang, X. G., Biondi, A., Daane, K. M. Functional responses of three candidate Asian larval parasitoids evaluated for classical biological control of Drosophila suzukii. Journal of Economic Entomology. 113 (1), 73-80 (2020).
  17. Wang, X. G., et al. Assessment of Asobara japonica as a potential biological control agent for the spotted wing drosophila, Drosophila suzukii. Entomologia Generalis. 41, 1-12 (2021).
  18. Hougardy, E., Hogg, B. N., Wang, X. G., Daane, K. M. Comparison of thermal performances of two Asian larval parasitoids of Drosophila suzukii. Biological Control. 136, 104000 (2019).
  19. Wang, X. G., Hogg, B. N., Hougardy, E., Nance, A. H., Daane, K. M. Potential competitive outcomes among three solitary larval endoparasitoids as candidate agents for classical biological control of Drosophila suzukii. Biological Control. 130, 18-26 (2019).
  20. Daane, K. M., Biondi, A., Wang, X. G., Hogg, B. A. Potential host ranges of three Asian larval parasitoids of Drosophila suzukii. Journal of Pest Science. 94 (4), 1171-1182 (2021).
  21. Girod, P., et al. Host specificity of Asian parasitoids for potential classical biological control of Drosophila suzukii. Journal of Pest Science. 91 (4), 1241-1250 (2018).
  22. Seehausen, M. L., et al. Evidence for a cryptic parasitoid species reveals its suitability as a biological control agent. Scientific Reports. 10 (1), 19096 (2020).
  23. Nomano, F. Y., et al. Genetic differentiation of Ganaspis brasiliensis (Hymenoptera: Figitidae) from East and Southeast Asia. Applied Entomology and Zoology. 52 (3), 429-437 (2017).
  24. Kasuya, N., Mitsui, H., Ideo, S., Watada, M., Kimura, M. T. Ecological, morphological and molecular studies on Ganaspis individuals (Hymenoptera: Figitidae) attacking Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae). Applied Entomology and Zoology. 48 (1), 87-92 (2013).
  25. Matsuura, A., Mitsui, H., Kimura, M. T. A preliminary study on distributions and oviposition sites of Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae) and its parasitoids on wild cherry tree in Tokyo, central Japan. Applied Entomology and Zoology. 53 (1), 47-53 (2018).
  26. Abram, P. K., et al. New records of Leptopilina, Ganaspis, and Asobara species associated with Drosophila suzukii in North America, including detections of L. japonica and G. brasiliensis. Journal of Hymenoptera Research. 78, 1-17 (2020).
  27. Puppato, S., Grassi, A., Pedrazzoli, F., De Cristofaro, A., Ioriatti, C. First report of Leptopilina japonica in Europe. Insects. 11 (9), 611 (2020).
  28. Dalton, D. T., et al. Laboratory survival of Drosophila suzukii under simulated winter conditions of the Pacific Northwest and seasonal field trapping in five primary regions of small and stone fruit production in the United States. Pest Managagement Science. 67 (11), 1368-1374 (2011).

Tags

Биология выпуск 184 биологический контроль Figitidae инвазивный вредитель паразитоид выращивание пятнистая дрозофила
Методы выращивания <em>паразитоида Ganaspis brasiliensis</em>, перспективного агента биологического контроля для инвазивной <em>Drosophila suzukii</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rossi-Stacconi, M. V., Wang, X.,… More

Rossi-Stacconi, M. V., Wang, X., Stout, A., Fellin, L., Daane, K. M., Biondi, A., Stahl, J. M., Buffington, M. L., Anfora, G., Hoelmer, K. A. Methods for Rearing the Parasitoid Ganaspis brasiliensis, a Promising Biological Control Agent for the Invasive Drosophila suzukii. J. Vis. Exp. (184), e63898, doi:10.3791/63898 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter