Summary
Ganaspis brasiliensis - een larvale parasitoïde van Drosophila suzukii (een wereldwijde invasieve fruitgewasplaag) - is goedgekeurd of wordt overwogen voor introductie in Europa en de Verenigde Staten voor biologische bestrijding van deze plaag. Dit artikel geeft protocollen voor zowel kleinschalige als grootschalige opfok van deze parasitoïde.
Abstract
Inheems in Oost-Azië, heeft de gevlekte vleugel drosophila, Drosophila suzukii (Matsumura) (Diptera: Drosophilidae), zich het afgelopen decennium op grote schaal gevestigd in Noord- en Zuid-Amerika, Europa en delen van Afrika, en is het een verwoestende plaag geworden van verschillende zachthuidige vruchten in de binnengevallen regio's. Biologische bestrijding, vooral door middel van zichzelf in stand houdende en gespecialiseerde parasitoïden, zal naar verwachting een haalbare optie zijn voor duurzaam gebiedsbreed beheer van deze zeer mobiele en polyfagote plaag. Ganaspis brasiliensis Ihering (Hymenoptera: Figitidae) is een larvale parasitoïde die wijd verspreid is in Oost-Azië en een van de meest effectieve parasitoïden van D. suzukii is gebleken.
Na rigoureuze pre-introductie evaluaties van de werkzaamheid en potentiële niet-doelrisico's, is een van de meer gastheerspecifieke genetische groepen van deze soort (G1 G. brasiliensis) onlangs goedgekeurd voor introductie en veldintroductie in de Verenigde Staten en Italië. Een andere genetische groep (G3 G. brasiliensis), die ook vaak werd gevonden om D. suzukii in Oost-Azië aan te vallen, kan in de nabije toekomst worden overwogen voor introductie. Er is momenteel een enorme belangstelling voor het fokken van G. brasiliensis voor onderzoek of in massaproductie voor veldintroductie tegen D. suzukii. Dit protocol en het bijbehorende videoartikel beschrijven effectieve opfokmethoden voor deze parasitoïde, zowel op kleine schaal voor onderzoek als op grote schaal voor massaproductie en veldafgifte. Deze methoden kunnen profiteren van verder langetermijnonderzoek en gebruik van deze Aziatische parasitoïde als een veelbelovend biologisch bestrijdingsmiddel voor deze wereldwijde invasieve plaag.
Introduction
Inheems in Oost-Azië, heeft de gevlekte vleugel drosophila, Drosophila suzukii (Matsumura) (Diptera: Drosophilidae), zich op grote schaal gevestigd in Amerika, Europa en delen van Afrika 1,2. De vlieg is extreem polyfaag en kan verschillende gekweekte en wilde vruchten met zachte en dunne schil gebruiken in zijn inheemse en binnengevallen regio's 1,2,3. De huidige managementstrategieën voor deze plaag zijn sterk afhankelijk van het frequente gebruik van insecticiden die zich richten op volwassen vliegen in akkers wanneer gevoelige vruchten rijpen. Herhaalde sprays worden vaak gebruikt, mogelijk als gevolg van consistente overloop van reservoirvliegpopulaties van niet-gewashabitats en gebrek aan effectieve natuurlijke vijanden die in de binnengevallen regio's wonen 1,4. Biologische bestrijding, vooral door middel van zichzelf in stand houdende gespecialiseerde parasitoïden, kan helpen bij het onderdrukken van vliegpopulaties op landschapsniveau en een cruciale rol spelen voor duurzaam gebiedsbreed beheer van deze zeer mobiele en polyfagote plaag 4,5,6.
In het afgelopen decennium hebben onderzoekers hun inspanningen gericht op het ontdekken van co-geëvolueerde parasitoïden van Drosophila suzukii in de inheemse bereiken van de vlieg in Oost-Azië 7,8,9, evenals effectieve maar nieuw geassocieerde parasitoïden in de binnengevallen gebieden van de vlieg in Noord- en Zuid-Amerika en Europa 4,5,6. In de nieuw binnengevallen gebieden van de vlieg zijn vaak voorkomende larvale Drosophila-parasitoïden, zoals Asobara c.f. tabida (Nees) (Hymenoptera: Braconidae), Leptopilina boulardi (Barbotin et al.) en L. heterotoma (Thompson) (Hymenoptera: Figitidae), niet in staat om zich te ontwikkelen uit of lage parasitismeniveaus op D. suzukii te hebben vanwege de sterke immuunresistentie van de vlieg10. Alleen enkele kosmopolitische en generalistische popparasitoïden zoals Pachycrepoideus vindemiae (Rondani) (Hymenoptera: Pteromalidae) en Trichopria drosophilae (Perkins) (Hymenoptera: Diapriidae) in Noord-Amerika en Europa, en Trichopria anastrephae Lima in Zuid-Amerika kunnen zich gemakkelijk ontwikkelen uit deze vlieg4. Verkenningen in Oost-Azië hebben daarentegen een aantal larvale parasitoïden van D. suzukii 4,5,6 ontdekt. Onder hen, Asobara japonica Belokobylskij, Ganaspis brasiliensis Ihering en Leptopilina japonica Novković & Kimura zijn de dominante larvale parasitoïden 7,8,9,11. In het bijzonder waren de twee figitiden (L. japonica en G. brasiliensis) de belangrijkste parasitoïden die voornamelijk werden aangetroffen in vers fruit besmet met D. suzukii en/of andere nauw verwante drosofiiden in natuurlijke vegetatie 7,8,9. Deze drie Aziatische larvale parasitoïden werden geïmporteerd in quarantainefaciliteiten in de VS en Europa en geëvalueerd op hun relatieve efficiëntie 12,13,14,15,16,17, klimatologisch aanpassingsvermogen 18, potentiële interspecifieke competitieve interacties 19 en, belangrijker nog, gastheerspecificiteit 8,20,21 ,22.
Quarantaine-evaluaties toonden aan dat Ganaspis brasiliensis meer gastheerspecifiek was voor Drosophila suzukii dan andere geteste Aziatische larvale parasitoïden, hoewel het waarschijnlijk bestaat uit verschillende biotypen of cryptische soorten met variërende gastheerspecificiteit 8,21,22,23,24. Nomano et al.22 groepeerden Ganaspis-individuen uit verschillende geografische regio's in vijf genetische groepen (genaamd G1-G5) op basis van moleculaire analyses van het mitochondriale cytochroomoxidase I-genfragment. De G2- en G4-groepen worden alleen gerapporteerd vanaf een paar Zuid-Aziatische tropische locaties, en de G5-groep werd gerapporteerd vanuit Azië en andere regio's (bijv. Argentinië, Brazilië, Hawaï en Mexico) van onbekende gastheer (en) (Buffington, persoonlijke observatie). Veldcollecties van wilde vruchten besmet door D. suzukii in Zuid-Korea7, China8 en Japan 9,23,25 vonden alleen G1 of een mengsel van exemplaren die de groepen G1 en G3 vertegenwoordigen. De twee groepen lijken sympatrisch te zijn en bestaan naast elkaar op dezelfde waardplanten die worden bewoond door D. suzukii en andere nauw verwante gastheervliegen. Niettemin zijn er enkele verschillen waargenomen tussen de twee groepen, waarbij G1 schijnbaar een hogere mate van gastheer- of gastheer-habitat-specificiteit heeft dan D. suzukii dan G3, hoewel ze beide een aantal nauw verwante soorten aanvallen in de quarantainetests21,22. Verdere gedetailleerde moleculaire analyses kunnen helpen bij het bepalen van de soortstatus, vooral voor de G1- en G3-groepen. Deze studie verwijst naar hen als G1 G. brasiliensis en G3 G. brasiliensis. Sommige vroege studies noemden de G1 G. brasiliensis ook als G. cf. brasiliensis 14,21,22. De G1 G. brasiliensis is onlangs goedgekeurd voor veldintroductie tegen D. suzukii in de VS en Italië (verschillende andere Europese landen overwegen momenteel ook de introductie ervan), terwijl de G3 G. brasiliensis in de nabije toekomst in aanmerking kan komen voor veldintroductie. Recente enquêtes vonden ook adventieve populaties van zowel L. japonica als G1 G. brasiliensis in British Columbia, Canada26, en Washington State, VS (Beers et al., ongepubliceerde gegevens), en adventieve L. japonica-populaties in de provincie Trento, Italië27.
Gezien de grote belangstelling voor de ontwikkeling van biologische bestrijdingsprogramma's voor drosophila suzukii-beheer en het aanzienlijke biologische bestrijdingspotentieel van avontuurlijke en opzettelijke introducties van Ganaspis brasiliensis, is er behoefte aan efficiënte kweekmethoden voor deze larvale parasitoïde voor toekomstig langetermijnonderzoek en / of veldintroductie. Dit protocol en het bijbehorende videoartikel beschrijven twee sets opfokmethoden voor deze parasitoïde: (1) kleinschalige laboratoriumopfok in kolven met behulp van een mengsel van gastheerfruit (bosbes) en kunstmatig dieet voor de cultuur van D. suzukii. De methoden werden ontwikkeld met behulp van G3-materiaal dat oorspronkelijk was verzameld in Kunming, China8. (2) Massale opfok voor het uitzetten in het veld in grote kooien met gastheervruchten (blauwe bessen) voor de cultuur van D. suzukii. De genetische groep die werd gebruikt voor de grootschalige opfok was G1-stam afkomstig uit Tokio, Japan 9,22. Andere schalen van kweekmethoden, zoals het gebruik van flacons of kleine containers voor beide groepen, worden ook kort besproken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Methoden voor kleinschalige laboratoriumopfok van G3 Ganaspis brasiliensis
- Bereid gastheer dieet voor.
- Voeg 600 ml gedestilleerd water toe aan een glazen container van 1.500 ml en verwarm het water op een hete plaat.
- Voeg 88,6 g in de handel verkrijgbare droge voeding (gemaakt van agar, biergist, maïsmeel, methylparabenen en sucrose) toe of bereid een dieet met behulp van de formule gepubliceerd door Dalton et al.28 (zie stap 2.1.2).
- Voeg 300 ml gedestilleerd water toe aan het droge dieet en roer het dieetmengsel grondig.
- Voeg het mengsel toe aan het kokende water.
- Laat het vloeibare dieet op de hete plaat 10 minuten koken terwijl u het mengsel regelmatig roert om te voorkomen dat het verbrandt.
- Laat het dieet 30 minuten bij kamertemperatuur afkoelen terwijl je het af en toe roert om de afgifte van warmte gelijkmatig te verdelen en te voorkomen dat het dieet op het oppervlak stolt.
- Meet 6,7 ml 95% EtOH in één container en 3,5 ml propionzuuroplossing van 1 M in een andere container.
- Zodra het dieet is afgekoeld, voegt u de EtOH en vervolgens de propionzuuroplossing toe, grondig roerend na elke toevoeging.
- Bereid bosbessen (gekocht van de lokale markt) door ze te spoelen in koud water, vervolgens in een natriumhypochlorietbleekoplossing (verdund tot 5%) en weer koud water.
- Droog het fruit af met een papieren handdoek en pureer ze handmatig totdat de schil van elke vrucht is gebroken en de sappen en het vruchtvlees worden blootgesteld.
- Voeg 25-30 g gepureerde bosbessen toe aan elke kolf van 250 ml. Tik op de zijkanten van de kolf om ervoor te zorgen dat de binnenbodem van de kolf bedekt is met een gelijkmatige laag gepureerde bosbessen.
- Giet het bereide dieet in elke kolf, zodat het alleen de bovenkant van de gepureerde bosbessen bedekt.
- Voeg schuimstoppers toe aan de halzen van de kolven en laat het dieet stollen bij kamertemperatuur (figuur 1).
- Zodra het dieet is gestold, gebruik het dan onmiddellijk of bewaar het bij 5 °C gedurende maximaal 3 weken.
- Achterste gastheer Drosophila suzukii.
- Haal het opgeslagen dieet uit de koelkast en laat het in evenwicht zijn met de omgevingstemperatuur op kamertemperatuur, of gebruik een vers gemaakt dieet.
- Snijd een stuk absorberend keukenpapier (bijv. 5 cm x 20 cm) en draai het in het midden. Plaats het gedraaide middengedeelte van het keukenpapier in de kolf (figuur 1).
- Maak het keukenpapier en het oppervlak van het dieet nat met gedestilleerd water om vocht vast te houden.
- Breng geslachtsrijpe volwassen vliegen over van de huidige kolonievliegkolven naar een nieuwe dieetkolf door de stop op de oude kolf voorzichtig te verwijderen en de kolf snel om te keren en de opening van de oude kolf uit te lijnen met de nieuwe kolf.
- Tik voorzichtig op de zijkant van de oude kolf om de vliegen in de nieuwe kolf te laten vallen. Zorg ervoor dat er ~25-30 paringsparen D. suzukii in de nieuwe kolf zitten. Zodra er voldoende vliegen in de nieuwe kolf zitten, draai je de oude kolf snel rechtop en vervang je de stoppen op beide kolven.
- Herhaal de overdrachten van vliegen totdat er geen vliegen meer in de oude kolven achterblijven. Combineer of verzamel indien nodig vliegen uit meer dan één oude kolf in een nieuwe kolf om ervoor te zorgen dat er voldoende vliegen (20-30 paar) per kolf zijn.
- Houd de nieuwe kolven na een week blootstelling aan volwassen vliegen onder geschikte omstandigheden (21 °C, 16 L: 8 D fotoperiode, 60% -80% relatieve vochtigheid [RH%]) gedurende 3 weken in een omgevingskamer voor het ontstaan van de vlieg.
- Stel gastheerlarven bloot aan parasitoïden.
- Neem een kolf (zie stap 1.2.7) met vliegeneieren en larven nadat eventuele volwassen vliegen en het gedraaide papieren handdoekje uit de kolf zijn verwijderd.
- Vouw een stuk absorberend keukenpapier doormidden en doe het in de kolf als verpoppingssubstraat voor geparasiteerde larven.
- Aspirateer zes vrouwelijke en mannelijke paren G3 G. brasiliensis in elke kolf (figuur 1). Strooi een dun laagje honing op de bodem van de schuimstop.
- Laat de sluipparasieten 5 dagen in de kolf zitten.
- Verwijder na een blootstelling van 5 dagen de sluipieten en houd de kolven onder de hierboven beschreven omstandigheden gedurende 35 dagen in een omgevingskamer totdat de verwachte wesp opduikt.
- Verzamel en bewaar volwassen parasitoïden.
- Controleer tijdens de tweede en derde incubatieweek wekelijks de kolven op vroege opkomst van de gastheer en verwijder de volwassen vliegen.
- Zodra volwassen parasitoïden beginnen tevoorschijn te komen, aspirateert u ze drie keer per week en houdt u ze in flacons met drosophila (bijv. 2,5 cm x 9,5 cm) (figuur 1).
- Plaats een klein stukje keukenpapier bevochtigd, maar niet verzadigd, met gedestilleerd water op de bodem van de injectieflacon.
- Voeg ~60 parasitoïden toe aan elke injectieflacon en label de injectieflacon met de opkomstdata. Strooi twee keer per week een dun laagje honing op de bodem van de schuimstop. Bewaar de injectieflacons met volwassen parasitoïden onder de hierboven beschreven omstandigheden in de omgevingskamer gedurende maximaal een maand als ze niet eerder worden gebruikt.
- Verwijder het papier eens in de 4-7 dagen in de injectieflacon of vervang het papieren handdoekje als er tekenen van schimmel zijn.
2. Methoden voor grootschalige opfok van G1 Ganaspis brasiliensis
- Implementeer een grootschalige opfok van gastheer Drosophila suzukii.
- Achter D. suzukii in grote, met gaas bedekte kooien (bijv. 50 cm x 50 cm x 100 cm) met elk 1.500-2.000 geslachtsrijpe volwassen vliegen (geslachtsverhouding 50:50) (figuur 2).
- Bereid het standaard Drosophila Medium (SDM) door alle ingrediënten (6 g bacteriologische agar, 75 g maïsmeel, 17 g voedingsgist, 15 g sacharose, 10 g sojameel, 10 ml propionzuur) gedurende 10 minuten in 1 l gedestilleerd water te koken terwijl u het mengsel periodiek roert om te voorkomen dat het28 verbrandt.
- Laat het mengsel 5 min afkoelen en voeg 5 g ascorbinezuur toe.
- Giet de vers gekookte SDM in petrischalen van 9 cm en laat het medium stollen bij kamertemperatuur voordat u de borden sluit.
- Stapel de SDM Petrischalen op, wikkel de stapel met aluminiumfolie en bewaar de gerechten maximaal 2 weken op 4 °C.
- Plaats in elke opfokkooi een plaat met in water gedrenkt katoen en vier tot zes petrischalen met SDM (figuur 2).
- Vervang twee keer per week de besmette SDM Petrischalen door verse.
- Plaats de besmette SDM petrischalen zonder deksels afzonderlijk in plastic bekers (13,3 cm diameter of 800 ml), sluit elke beker met een bekleding van fijnmatjes (<0,5 mm) en incubeer gedurende 12-15 dagen bij 23 °C en 75% RV (figuur 2).
- Breng de pas uitgekomen D. suzukii-volwassenen over van de plastic bekers naar de opfokkooien.
- Bereid gastheerlarven voor.
- Spoel de bosbessen in koud water gedurende 1 min en week de vruchten in een bassin gevuld met een bleekoplossing (verdund tot 5%) gedurende 3 minuten.
- Giet de bleekoplossing af en vul het bassin met koud water om de bosbessen af te spoelen. Meng voorzichtig met de hand gedurende ten minste 30 s.
- Herhaal stap 2.2.2 met ten minste driemaal vers water om bleekresten en andere geleedpotigen (bijv. mijten, trips) die op de vrucht aanwezig kunnen zijn, te verwijderen.
- Leg het fruit op een schaal met verschillende lagen absorberende papieren handdoeken en kantel de schaal voorzichtig heen en weer, rol de bessen rond om ze te drogen.
- Bereid verschillende petrischalen van 9 cm (de bovenste of de onderste helften, naar boven gericht) en vul ze allemaal met de gewassen bosbessen (15-25 vruchten per bord, afhankelijk van de vruchtgrootte).
- Stel de petrischalen in de late namiddaguren bloot aan geslachtsrijpe volwassen vliegen in de kooien van de gastheer (zie stap 2.1) en laat ze 's nachts staan.
- Verwijder de volgende ochtend de petrischalen uit de opfokkooien van de gastheer door er zachtjes op te blazen of erop te tikken om de vliegen op de vruchten los te maken en het aangetaste fruit te gebruiken voor het fokken van parasitoïden (zie stap 2.4).
- Implementeer een grootschalige opfok van parasitoïden.
- Gebruik twee soorten kooien om de sluipoïde groot te brengen: een voor parasitisme en een andere voor het verschijnen van wespen.
- Zorg ervoor dat de parasitismekooi kubiek is (bijv. 45 cm aan elke kant) met een doorzichtig plastic paneel aan de voorkant voor het observeren van insectenactiviteit, twee 18 cm mouwopeningen in het voorpaneel voor het toevoegen of verwijderen van insecten en het vervangen van voedselmateriaal, en fijn polyester gaas (bijv. 96 x 26 gaas) aan de boven- en zijkanten voor ventilatie.
- Maak de opkomstkooi kleiner (bijv. 30 cm aan elke kant), met een enkele mouwopening aan twee tegenover elkaar liggende zijden en een doorzichtig plastic paneel aan de voorkant voor zichtbaarheid (figuur 2).
- Zorg ervoor dat beide kooitypen een dun touwtje hebben dat onder het plafond hangt waaraan één tot meerdere feeders kunnen worden opgehangen (figuur 2).
OPMERKING: Een feeder bestaat uit een grote cilindrische schuimstop (9 cm diameter) bedekt met verspreide honingdruppels en kan op de vloer van de kooi worden geplaatst of aan het plafond van de kooi worden gehangen (figuur 2). - Geef in elke kooi water in een rechtwandige drosophila-injectieflacon (2,5 cm x 9,5 cm) die om de 5-7 dagen is afgesloten met een celluloseacetaatplug (2,5 cm diameter), afhankelijk van de RV. Hang de injectieflacon ondersteboven aan het plafond van de kooi (figuur 2).
- Stel de gastheerlarven bloot aan de parasitoïden.
- Stel de met gastheer besmette vruchten in de petrischalen bloot aan G1 G. brasiliensis onmiddellijk na D. suzukii nachtelijke besmetting (zie stap 2.2.7).
- Laat de 10-15 petrischalen met besmet fruit gedurende 2-3 dagen in de parasitisatiekooi met 1.500-2.000 wespen staan.
- Gebruik plastic bekers (13,3 cm diameter of 800 ml) met lagen absorberend papier op de bodem om het fruit met de geparasiteerde gastheren te verzamelen (figuur 2).
- Plaats de open bekers in de eclosiekooi en incubeer gedurende ten minste 28 dagen bij 21 °C en 65% RV (figuur 2).
- Controleer tijdens de tweede en derde incubatieweek de kooi wekelijks op vroege gastheer-eclosie en verwijder de volwassen vliegen om de opeenvolgende verzameling parasitoïden te vergemakkelijken.
- Voeg aan het einde van de vierde incubatieweek een feeder en een waterbron toe aan de kooi.
- Verzamel en bewaar de volwassen parasitoïden.
- Zodra de opkomst van parasitoïden begint, verzamel je een deel (10% -15%) van de volwassenen en breng je ze terug naar de parasitismekooi om oude onproductieve individuen te vervangen.
- Verzamel en bewaar de resterende parasitoïden in plastic bekers (13,3 cm diameter of 800 ml) (figuur 3A).
- Plaats een buis (2 ml) gevuld met water en afgesloten met een tandheelkundige katoenen rol (1 cm x 3,8 cm) aan de onderkant van de beker (figuur 3A).
- Sluit de beker met een aangepast deksel met een afneembare schuimstop (diameter van 3,5 cm) als feedersubstraat en een met gaas bedekt gat voor ventilatie (figuur 3B).
- Voeg tot 700 volwassenen toe aan elke cup (geslachtsverhouding 50:50), label de cup met de opkomstdatum en bewaar deze in een omgevingskamer (17 °C; 65% RH) tot gebruik, of gedurende maximaal 1 maand (figuur 3B).
- Verzend de volwassen parasitoïden.
- Gebruik conische buizen (50 ml) om de volwassen parasitoïden te verzenden.
- Prik een ventilatiegat (8 mm diameter) op de dop en bedek het met een fijnmazig net (figuur 3C).
- Voeg een celluloseacetaatvoedingsring toe aan de binnenkant van de dop (figuur 3C).
- Bereid een verzadigde sucrose-oplossing met gedestilleerd water, breng een paar druppels aan op de voedingsring en laat deze de vloeistof absorberen.
- Plaats een waaiervormig stuk absorberend keukenpapier in de buis (figuur 3D).
- Voeg ~ 200 volwassen parasitoïden toe aan elke buis en plaats de buizen in een geïsoleerde zeecontainer samen met ijspakken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 4 toont representatieve resultaten van de kleinschalige laboratoriumopfok van G3 Ganaspis brasiliensis met behulp van twee verschillende parasitoïde dichtheden (zes of 10 paar) en twee verschillende blootstellingstijden (5 of 10 dagen) in de quarantainefaciliteit van de USDA-ARS Beneficial Insects Introduction Unit (Newark, Delaware). Er waren 14 replicaties voor elke combinatie van parasitoïde dichtheid en blootstellingstijd. In totaal produceerden de 64 kolven 4.018 wespen (71,7 ± 4,9 nakomelingen per kolf) met 49,5% ± 1,9% vrouwelijke nakomelingen. Bij 21 °C kwamen volwassen sluipieten ongeveer 30-35 dagen na ovipositie. De dichtheid en blootstellingstijd van de parasitoïden hadden geen significante invloed op het totale aantal nakomelingen dat per duplo (kolf) werd geproduceerd (eenrichtings-ANOVA, F3,52 = 0,379, P = 0,769) en hadden slechts een marginaal effect op het percentage vrouwelijke nakomelingen (eenrichtings-ANOVA, gegevens werden logit-getransformeerd voorafgaand aan de analyse indien nodig om de variatie te stabiliseren, F3,52 = 2,796, P = 0,049), hoewel de productie-efficiëntie per hoofd van de bevolking (eenrichtings-ANOVA, F3,52 = 3,576, P = 0,020) afnam bij de hoge parasitoïdedichtheid. Blootstellingstijd van meer dan 5 dagen leek de productiviteit niet te verhogen. Verhoogde parasitoïde dichtheid leek de productiviteit evenmin te verhogen. Daarom lijkt de combinatie van zes paren en 5-daagse blootstellingstijden het meest geschikt voor laboratoriumopfok.
Figuur 5 toont een 6-maands productiviteitstrend van de grootschalige opfok van G1 Ganaspis brasiliensis in de quarantainefaciliteit van de Edmund Mach Foundation (Trento, Italië) in 2021. De opfok werd gestart met 150 drie dagen oude, gepaarde vrouwelijke wespen afkomstig van een kleinschalige opfok in het quarantainelaboratorium van CABI in Delémont, Zwitserland. Meer wespen uit de opfok werden geleidelijk toegevoegd aan de parasitismekooi, totdat ze in week 5 1.500-2.000 personen (geslachtsverhouding 50:50) bereikten. De bezetting van de parasitismekooi werd daarna op hetzelfde niveau gehouden door nieuwe wespen toe te voegen die in de grootschalige opfok zelf werden geproduceerd. Gedurende de hele periode werd de parasitismekooi om de 2-3 dagen voorzien van vers besmet fruit. Het fruit (blauwe bessen) werd onmiddellijk na de nachtelijke blootstelling aan Drosophila suzukii aangeboden aan G1 G. brasiliensis. De productie van parasitoïden begon 5 weken na de eerste blootstelling aan de gastheer (figuur 5A). Van week 8 tot week 22 was de productie van parasitoïden evenredig met de hoeveelheid blootgesteld fruit, gemiddeld 0,44 ± 0,03 g/parasitoïde (gemiddelde ± SE; Figuur 5B). In totaal werden 53.736 parasitoïden verzameld, met een gemiddeld vrouwelijk nageslacht van 45,9% (bereik: 32,4%-79,0%).
Figuur 1: Een stroomschema voor kleinschalige laboratoriumopfokprocedures van Drosophila suzukii en G3 Ganaspis brasiliensis. De linkerkant toont de opfokprocedures van de gastheervlieg, terwijl de rechterkant de opfokcyclus van de parasitoïde illustreert. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Een stroomschema voor de grootschalige opfokprocedures van Drosophila suzukii en G1 Ganaspis brasiliensis. De linkerkant toont de opfokprocedures van de gastheervlieg, terwijl de rechterkant de opfokcyclus van de parasitoïde illustreert. Afkorting: SDM = standaard Drosophila medium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Containers en buizen die worden gebruikt voor het opslaan en verschepen van G1 Ganaspis brasiliensis uit de grootschalige opfok. (A) Een horizontaal beeld van de opslagcontainer met een waterbuis in de container, (B) een verticaal beeld van de container met een geventileerd deksel en een schuimstop, en (C) een geventileerd deksel en een stuk absorberend papier voor (D) de verzendbuis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatief voorbeeld voor kleinschalige laboratoriumopfok van G3 Ganaspis brasiliensis. (A) Aantal nakomelingen geproduceerd per kolf, (B) aantal nakomelingen geproduceerd per vrouwelijke wesp, en (C) percentage vrouwelijke nakomelingen, onder twee verschillende sluipoïde dichtheden en blootstellingstijden. Waarden zijn gemiddeld ± SE, en staven met verschillende letters zijn significant verschillend (ANOVA, Tukey's HSD, P < 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Productiviteitstrend van de grootschalige opfok vanaf het begin tot en met week 23. (A) Bars geven de aantallen G1 Ganaspis brasiliensis-nakomelingen aan die wekelijks uit de eclosiekooien worden verzameld om oude individuen in de parasitismekooi (donkergroen) te vervangen en te worden opgeslagen of verzonden (lichtgroen). De oranje lijn geeft de hoeveelheid met gastheer besmet fruit (kg bosbessen) aan dat elke week aan de parasitoïden in de parasitismekooi wordt verstrekt. (B) Wekelijkse verhouding van het gewicht van met de gastheer besmet fruit tot het aantal parasitoïde nakomelingen dat 5 weken na blootstelling wordt geproduceerd (d.w.z. gram fruit dat nodig is om een enkele volwassen parasitoïde te produceren). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Langetermijnonderzoek en daaropvolgende veldintroducties van een biologisch bestrijdingsmiddel zijn afhankelijk van de beschikbaarheid van effectieve en economische opfoktechnieken. De beschreven methoden in deze studie hebben bewezen efficiënte protocollen te zijn voor zowel kleinschalige als grootschalige opfok van Ganaspis brasiliensis. Het kleinschalige opfokprotocol is in de loop van meerdere jaren ontwikkeld om de hoeveelheid arbeid te optimaliseren en gespecialiseerde apparatuur te verminderen die nodig is om de parasitoïde en gastheerkolonies tegelijkertijd te onderhouden. Het is geschikt voor het onderhouden van een kolonie voor laboratoriumonderzoek of bioassays. Soortgelijke methoden zijn door de auteurs gebruikt om deze parasitoïde op te voeden voor quarantaine-evaluaties van deze parasitoïde. Het grootschalige opfokprotocol zal het mogelijk maken om grote aantallen wespen te produceren voor veldintroductie, zoals onlangs in Italië werd uitgevoerd. Deze technologieën kunnen gemakkelijk worden overgedragen aan andere laboratoria, producenten of bedrijven voor grootschalige opfok in de nabije toekomst, en dienen als basis voor verdere verbeteringen in methodologieën.
Deze protocollen kunnen ook worden gebruikt om Leptopilina japonica te fokken, omdat zowel Ganaspis brasiliensis als L. japonica vergelijkbaar zijn in termen van hun gastheerhabitatvoorkeur 7,8, gastheerstadiumvoorkeur of reproductieve biologie15, thermische prestaties18 en foerageerefficiëntie in laboratoriumbioassays13,15, evenals gedragsreacties op gastheer-geassocieerde signalen12, behalve dat L. japonica lijkt een breder gastheerbereik te hebben dan dat van zelfs G3 G. brasiliensis20. Beide parasitoïden zijn gekweekt met behulp van vergelijkbare methoden zoals hierin beschreven. Voor kleinschalige opfok kunnen beide parasitoïden ook worden gekweekt in drosophila-injectieflacons, meestal door 20 jonge (1-2 dagen oude) Drosophila suzukii-larven over te brengen naar een drosophila-injectieflacon gevuld met 2 cm kunstmatig dieet, of twee aangetaste vruchten te plaatsen, elk met 5-10 jonge D. suzukii-larven, en ze gedurende 2-3 dagen bloot te stellen aan twee gepaarde vrouwelijke wespen, beide produceren ~10 nakomelingen per injectieflacon 13,15,22.
Zoals hierboven besproken, kunnen de G1 en G3 Ganaspis brasiliensis die in dit protocol worden gebruikt, enigszins verschillen in sommige host-zoekgedragingen en gastheerspecificiteit21,22. Girod et al.21 melden dat de Japanse G1 G. brasiliensis strikter specifiek was voor Drosophila suzukii en niet goed leek te presteren in pure kunstmatige voeding in flacons in vergelijking met zijn prestaties op gastheerfruit. Matsuura et al.25 meldden ook dat G1 G. brasiliensis-populaties verzameld uit D. suzukii-besmette kersen in Japan gespecialiseerd zijn op D. suzukii. De kleinschalige opfokmethode met behulp van een dieet gemengd met bosbessen werd in eerste instantie ontwikkeld voor het fokken van G3 G. brasiliensis omdat G1 G. brasiliensis op dat moment niet beschikbaar was. Later bleek deze methode niet goed te werken voor de opfok van G1 G. brasiliensis (Wang et al. ongepubliceerde gegevens).
Daarom wordt voor kleinschalige kweek van G1 G. brasiliensis voorgesteld om het gastheersubstraat te wijzigen door (1) de vliegen rechtstreeks bloot te stellen aan bosbessen (of ander gastheerfruit) om gastheerlarven in de vrucht te verzamelen, en (2) blootgesteld fruit over te brengen naar een standaard Drosophila-cultuurmedium voor de larven om zich te ontwikkelen in een omgeving met weinig concurrentie door de aangetaste vruchten met de gastheerlarven op het dieet in de kolven te plaatsen voor blootstelling aan de parasitoïden. Hierdoor kunnen de geparasiteerde larven zich voeden met het dieet, vooral bij hoge gastheerdichtheden, en de geparasiteerde gastheerpoppen worden verzameld uit het papieren handdoekje. Als alternatief kan G1 G. brasiliensis direct in plastic containers (verschillende maten) op fruit worden gekweekt door 5-10 vrouwelijke wespen gedurende 4-5 dagen bloot te stellen aan 10-20 besmette bosbessen, die tot 80 nakomelingen per container produceerden, afhankelijk van de gastheerdichtheid (Wang et al., ongepubliceerde gegevens). Voor deze methode wordt aanbevolen om de aangetaste vrucht op een verhoogd metalen gaas ("hardwaredoek") te plaatsen om de parasitoïden vanuit alle richtingen toegang te geven tot het aangetaste fruit, vooral als er te veel fruit in één container wordt geplaatst. Idealiter moeten een of twee lagen besmet fruit in elke container worden geplaatst voor deze opfokmethode. Deze alternatieve kleinschalige methoden zouden ook goed moeten werken voor de opfok van G3 G. brasiliensis.
Ongeacht de kweekmethoden en -schubben (injectieflacon, kolf, container of kooi), is het van cruciaal belang om de juiste temperatuur, vochtigheid te handhaven en de leeftijd, dichtheid en blootstellingstijd van gastheer of vrouwelijke wespen te beheersen voor het fokken van zowel G1 Ganaspis brasiliensis als G3 G. brasiliensis. Drosophila suzukii larven ontwikkelden zich in ongeveer 1 week onder normale laboratoriumomstandigheden (bijv. 22 ± 2 °C) 15. Vrouwelijke G. brasiliensis gaf er de voorkeur aan om jongere (1-2 dagen oud) gastheerlarven aan te vallen dan oudere (3-4 dagen oude) gastheerlarven, hoewel verschillende leeftijden van gastheerlarven15 konden worden aangevallen. Bij 22 ± 2 °C kwamen G. brasiliensis-vrouwtjes tevoorschijn met een aanzienlijk hoog aandeel (~ 50%) van hun levenslange complement van rijpe eieren, en de rijpe eibelasting bereikte een piek na 2-3 dagen15. Volwassen vrouwtjes overleefden ~ 20 dagen wanneer ze onbeperkte toegang tot gastheren kregen en begonnen met ovipositie binnen 2 dagen na opkomst, bereikten een piek van ovipositie binnen 5-10 dagen en verminderden daarna geleidelijk ovipositie15. Daarom moeten jonge (<10 dagen oude) vrouwelijke wespen worden gebruikt in de fokkerij, maar vrouwelijke wespen kunnen worden hergebruikt voor de opfok wanneer ze schaars zijn. De parasitoïde kon zich gemakkelijk ontwikkelen bij 21-25 °C, maar temperaturen onder de 17,2 °C bleken een facultatieve diapause te veroorzaken17. Het wordt daarom aanbevolen om een temperatuurbereik van 21-25 °C te gebruiken voor een optimale ontwikkeling van zowel de vlieg als de parasitoïde.
Verder zal de blootstellingstijd van meer dan 5 dagen waarschijnlijk de productiviteit van de parasitoïde niet verhogen. Verhoogde sluipwekkersdichtheid op basis van de kleinschalige opfok voor G3 G. brasiliensis lijkt de productiviteit niet te verhogen, mogelijk als gevolg van wederzijdse inmenging tussen foeragerende vrouwelijke wespen. Zes man-vrouwparen en een blootstellingstijd van 5 dagen lijken een ideale combinatie voor de kleinschalige opfok in het laboratorium, hoewel de opfokmethoden in de toekomst kunnen worden verbeterd door de verhouding tussen gastheer en parasitoïde verder te optimaliseren. Een belangrijke sterftefactor voor de parasitoïde lijkt verband te houden met een lage luchtvochtigheid, omdat veel parasitoïden niet in staat waren om te ecloseren met droge substraatomstandigheden. Het toevoegen van een stuk absorberend keukenpapier onder het fruit absorbeert niet alleen sappen als het fruit afbreekt, maar biedt ook een substraat dat kan worden bevochtigd om de luchtvochtigheid te verhogen of een verpoppingssubstraat voor de vlieg te bieden.
Voor de kleinschalige opfok kan een kolf de luchtvochtigheid beter handhaven dan een injectieflacon omdat de eerste een smalle nek heeft. In deze studie werd ook gevonden dat verse bosbessen bedekt met een afstoffen van actieve droge gist de vorming van schimmel hielpen voorkomen en de aantrekkingskracht van het fruit op de vliegen verbeterden. Andere aspecten van de parasitoïde-opfok die nog moeten worden onderzocht, zijn (1) de mogelijkheid om deze parasitoïde op alternatieve gastheren of gastheervruchten te fokken en hoe alternatieve gastheren of gastheervruchten de efficiëntie van de parasitoïde zouden beïnvloeden, (2) factoren die de conditie en geslachtsverhouding van de nakomelingen van de parasitoïde beïnvloeden, (3) het vermogen van deze parasitoïde (zowel G1 als G3 ) om zich aan te passen aan kunstmatige dieetomstandigheden, en (4) de genetische of gedragsveranderingen die kunnen optreden bij aanpassing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Lukas Seehausen en Marc Kenis (CABI, Zwitserland) voor het vriendelijk verstrekken van G1 G. brasiliensis. Financiering in Italië werd verstrekt door Provincia Autonoma di Trento, Trento, Italië, en in de VS door het National Institute of Food and Agriculture, USDA Specialty Crops Research Initiative award (# 2020-5118-32140), USDA Animal and Plant Health Inspection Service (Farm Bill, fonds 14-8130-0463) en USDA ARS CRIS-basisfondsen (project 8010-22000-033-00D). De USDA is een aanbieder van gelijke kansen en werkgever en onderschrijft geen producten die in deze publicatie worden genoemd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active dry yeast | Fleischmanns Yeast, Cincinatti, OH, USA | None | Used to cover fruit to reduce mold growth and enhance the frui attraction to the flies |
| Bacteriological agar | Merk Life Science S.r.l., Milan, Italy | A1296 - 5KG | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Bleach solution | Clorox Company, Oakland, CA, USA | None | Used to disinfect flesh fruit |
| Blue stopper | Azer Scientific, Morgantown, PA, USA | ES3837 | Used for sealing the tube while allowing ventilation for insects |
| Blueberries | Grocery Store, Newark, DE, USA | None | Provided as host fruit for the flies (various other fruit can also be used) |
| BugDorm insect rearing cage (W24.5 x D24.5 x H63.0 cm) | Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan | 4E3030 | Used for rearing parasitoids (parasitism cage) |
| BugDorm insect rearing cage (W32.5 x D32.5 x H32.5 cm) | Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan | 4E4590 | Used for rearing flies |
| BugDorm insect rearing cage (W32.5 x D32.5 x H32.5 cm) | Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan | 4E4545 | Used for rearing parasitoids (eclosion cage) |
| Chicken wire (0.64 cm, 19 gauge) | Everbilt, OH, USA | 308231EB | Used to lift up the fruit to allow maximum parasitoid oviposition |
| Cornmeal | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Dental cotton roll (1 x 3.8 cm) | Gima S.p.A., Gessate, MI, Italy | 35000 | Used for providing water to the parasitoids within the storage container |
| Drosophila diet | Frontier Scientific, Newark, DE, USA | TF1003 | Custom diet used to rear flies |
| Drosophila vial narrow, Polystirene (2.5 x 9.5 cm) | VWR International, LLC., Radnor, PA, US | 75813-160 | Used for providing water to the parasitoids within the cage |
| Drosophila vial plugs, Cellulose acetate (2.5 cm) | VWR International, LLC., Radnor, PA, US | 89168-886 | Used for providing water to the parasitoids within the cage |
| Erlenmeyer flask (250 mL) | Carolina Biological, Burlington, NC, USA | 731029 | Used for rearing flies and parasitoids |
| Falcon-style centrifuge tube (50 mL) | VWR International, LLC., Radnor, PA, US | VWRI525-0611 | Modified to ship adult parasitoids |
| Foam stopper | Jaece Industries, North Tanawanda, NY, USA | L800-C | Used for sealing the flasks while allowing ventilation for insects |
| Honey | Grocery Store, Newark, DE, USA | None | Provided as food for parasitoids |
| Identi-Plug plastic foam stopper | Fisher Scientific Company, L.L.C., Pittsburg, PA, US | 14-127-40E | Used as feeder for parasitoids and to seal the storage container |
| Industrial paper towel | Grocery Store, Newark, DE, USA | None | Provided as a pupation substrate for pupae and mitigated moisture |
| Micron mesh fabric (250 mL) | Industrial Netting, Maple Grove, MN, USA | WN0250-72 | Used to make ventilation lid for insects |
| Nutritional yeast (flakes) | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Paper coaster (10.2 cm) | Hoffmaster, WI, USA | 35NG26 | Porvided as pupation substrate for flies and parsitized pupae |
| Plastic cup (Ø 13.3 cm, 800 mL) | Berry Superfos, Taastrup, Denmark | Unipak 5134 | Modified to store adult parasitoids |
| Plastic lid (Ø 13.3 cm) | Berry Superfos, Taastrup, Denmark | PP 2830 | Modified to store adult parasitoids |
| Propionic acid | Merk Life Science S.r.l., Milan, Italy | P1386 - 1L | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Saccharose | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Soup cup with lid (475 mL) | StackMan, Vietnam | DC1648 | Used for parasitized larvae to pupate |
| Soybean flour | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| White felt washer (0.64 cm thick, 5 mm ID x 20 mm OD) | Quiklok, Lincoln, NH, US | WFW/.25 x 5 x 20 mm | Used as feeding ring for parasitoids |
References
- Asplen, M. K., et al. Invasion biology of spotted wing drosophila (Drosophila suzukii): a global perspective and future priorities. Journal of Pest Science. 88 (3), 469-494 (2015).
- Tait, G., et al. Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae): A decade of research towards a sustainable integrated pest management program. Journal of Economic Entomology. 114 (5), 1950-1974 (2021).
- Kirschbaum, D. S., Funes, C. F., Buonocore-Biancheri, M. J., Suárez, L., Ovruski, S. M. The biology and ecology of Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae). Drosophila suzukii management. Garcia, F. R. M. , Springer. Cham. 41-92 (2020).
- Wang, X. G., Lee, J. C., Daane, K. M., Buffington, M. L., Hoelmer, K. A.
- Lee, J. C., et al. Biological control of spotted-wing drosophila (Diptera: Drosophilidae): Current and pending tactics. Journal of Integreated Pest Management. 10 (1), 13 (2019).
- Wang, X. G., Lee, J. C., Daane, K. M., Hoelmer, K. A. Biological control of spotted-wing drosophila: An update on promising agents. Drosophilia suzukii management. Garcia, F. R. M. , Springer. Cham. 143-167 (2020).
- Daane, K. M., et al. First exploration of parasitoids of Drosophila suzukii in South Korea as potential classical biological agents. Journal of Pest Science. 89 (3), 823-835 (2016).
- Giorgini, M., et al. Exploration for native parasitoids of Drosophila suzukii in China reveals a diversity of parasitoid species and narrow host range of the dominant parasitoid. Journal of Pest Science. 92 (2), 509-522 (2019).
- Girod, P., et al. The parasitoid complex of D. suzukii and other fruit feeding Drosophila species in Asia. Scientific Reports. 8 (1), 11839 (2018).
- Kacsoh, B. Z., Schlenke, T. A. High hemocyte load is associated with increased resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D. melanogaster. PLoS ONE. 7 (4), 34721 (2012).
- Buffington, M. L., Forshage, M. Redescription of Ganaspis brasiliensis (Ihering, 1905), new combination (Hymenoptera: Figitidae), a natural enemy of the invasive Drosophila suzukii (Matsumura, 1931)(Diptera: Drosophilidae). Procedings of the Entomoogical Society of Washington. 118 (1), 1-13 (2016).
- Biondi, A., et al. Innate olfactory responses of Asobara japonica (Hymenoptera: Braconidae)towards fruits infested by the invasive spotted wing drosophila. Journal of Insect Behavior. 30 (5), 495-506 (2017).
- Biondi, A., Wang, X. G., Daane, K. M. Host preference of three Asian larval parasitoids to closely related Drosophila species: implications for biological control of Drosophila suzukii. Journal of Pest Science. 94 (2), 273-283 (2021).
- Girod, P., Rossignaud, L., Haye, T., Turlings, T. C. J., Kenis, M. Development of Asian parasitoids in larvae of Drosophila suzukii feeding on blueberry and artificial diet. Journal of Applied Entomology. 142 (5), 483-494 (2018).
- Wang, X. G., Nance, A. H., Jones, J. M. L., Hoelmer, K. A., Daane, K. M. Aspects of the biology and reproductive strategy of two Asian larval parasitoids evaluated for classical biological control of Drosophila suzukii. Biological Control. 121, 58-65 (2018).
- Wang, X. G., Biondi, A., Daane, K. M. Functional responses of three candidate Asian larval parasitoids evaluated for classical biological control of Drosophila suzukii. Journal of Economic Entomology. 113 (1), 73-80 (2020).
- Wang, X. G., et al. Assessment of Asobara japonica as a potential biological control agent for the spotted wing drosophila, Drosophila suzukii. Entomologia Generalis. 41, 1-12 (2021).
- Hougardy, E., Hogg, B. N., Wang, X. G., Daane, K. M. Comparison of thermal performances of two Asian larval parasitoids of Drosophila suzukii. Biological Control. 136, 104000 (2019).
- Wang, X. G., Hogg, B. N., Hougardy, E., Nance, A. H., Daane, K. M. Potential competitive outcomes among three solitary larval endoparasitoids as candidate agents for classical biological control of Drosophila suzukii. Biological Control. 130, 18-26 (2019).
- Daane, K. M., Biondi, A., Wang, X. G., Hogg, B. A. Potential host ranges of three Asian larval parasitoids of Drosophila suzukii. Journal of Pest Science. 94 (4), 1171-1182 (2021).
- Girod, P., et al. Host specificity of Asian parasitoids for potential classical biological control of Drosophila suzukii. Journal of Pest Science. 91 (4), 1241-1250 (2018).
- Seehausen, M. L., et al. Evidence for a cryptic parasitoid species reveals its suitability as a biological control agent. Scientific Reports. 10 (1), 19096 (2020).
- Nomano, F. Y., et al. Genetic differentiation of Ganaspis brasiliensis (Hymenoptera: Figitidae) from East and Southeast Asia. Applied Entomology and Zoology. 52 (3), 429-437 (2017).
- Kasuya, N., Mitsui, H., Ideo, S., Watada, M., Kimura, M. T. Ecological, morphological and molecular studies on Ganaspis individuals (Hymenoptera: Figitidae) attacking Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae). Applied Entomology and Zoology. 48 (1), 87-92 (2013).
- Matsuura, A., Mitsui, H., Kimura, M. T. A preliminary study on distributions and oviposition sites of Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae) and its parasitoids on wild cherry tree in Tokyo, central Japan. Applied Entomology and Zoology. 53 (1), 47-53 (2018).
- Abram, P. K., et al. New records of Leptopilina, Ganaspis, and Asobara species associated with Drosophila suzukii in North America, including detections of L. japonica and G. brasiliensis. Journal of Hymenoptera Research. 78, 1-17 (2020).
- Puppato, S., Grassi, A., Pedrazzoli, F., De Cristofaro, A., Ioriatti, C. First report of Leptopilina japonica in Europe. Insects. 11 (9), 611 (2020).
- Dalton, D. T., et al. Laboratory survival of Drosophila suzukii under simulated winter conditions of the Pacific Northwest and seasonal field trapping in five primary regions of small and stone fruit production in the United States. Pest Managagement Science. 67 (11), 1368-1374 (2011).
