Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Metoder for oppdrett av parasitoid ganaspis brasiliensis, et lovende biologisk kontrollmiddel for invasiv Drosophila suzukii

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63898
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3, 4, 5, 4, 6, 1,3, 2
1Research and Innovation Centre, Fondazione Edmund Mach, 2Beneficial Insects Introduction Research Unit, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 3Center for Agriculture, Food and Environment, University of Trento, 4Department of Environmental Science, Policy and Management, University of California Berkeley, 5Department of Agriculture, Food and Environment, University of Catania, 6Systematic Entomology Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

Summary

Ganaspis brasiliensis - en larve parasitoid av Drosophila suzukii (en global invasiv fruktavling) - har blitt godkjent eller vurderes for innføring i Europa og USA for biologisk kontroll av dette. Denne artikkelen gir protokoller for både småskala og storskala oppdrett av denne parasitoide.

Abstract

Native til Øst-Asia, har spotted-wing drosophila, Drosophila suzukii (Matsumura) (Diptera: Drosophilidae), etablert seg mye i Amerika, Europa og deler av Afrika i løpet av det siste tiåret, og blitt et ødeleggende av ulike mykhudede frukter i sine invaderte regioner. Biologisk bekjempelse, spesielt ved hjelp av selvopprettholdende og spesialiserte parasitoider, forventes å være et levedyktig alternativ for bærekraftig arealomfattende forvaltning av dette svært mobile og polyfage. Ganaspis brasiliensis Ihering (Hymenoptera: Figitidae) er en larveparasitoid som er utbredt i Øst-Asia, og har vist seg å være en av de mest effektive parasitoider av D. suzukii.

Etter grundige pre-introduksjonsevalueringer av dens effekt og potensielle ikke-målrisikoer, har en av de mer vertsspesifikke genetiske gruppene av denne arten (G1 G. brasiliensis) nylig blitt godkjent for introduksjon og feltutgivelse i USA og Italia. En annen genetisk gruppe (G3 G. brasiliensis), som også ofte ble funnet å angripe D. suzukii i Øst-Asia, kan vurderes for introduksjon i nær fremtid. Det er for tiden enorm interesse for oppdrett av G. brasiliensis for forskning eller i masseproduksjon for feltutløsning mot D. suzukii. Denne protokollen og tilhørende videoartikkel beskriver effektive oppdrettsmetoder for denne parasitoide, både i liten skala for forskning og i stor skala for masseproduksjon og feltutgivelse. Disse metodene kan være til nytte for videre langsiktig forskning og bruk av denne asiatisk-innfødte parasitoide som et lovende biologisk kontrollmiddel for dette globale invasive.

Introduction

Native til Øst-Asia, den flekkete vinge drosophila, Drosophila suzukii (Matsumura) (Diptera: Drosophilidae), har etablert seg mye i Amerika, Europa og deler av Afrika 1,2. Fluen er ekstremt polyfag, og er i stand til å utnytte ulike dyrkede og ville frukter med myke og tynne skinn i sine opprinnelige og invaderte regioner 1,2,3. Nåværende styringsstrategier for dette er sterkt avhengig av hyppig bruk av insektmidler som retter seg mot voksne fluer i avlinger når mottakelig frukt modnes. Gjentatte sprøyter brukes ofte, muligens på grunn av konsekvent spillover av reservoarfluepopulasjoner fra ikke-avlingshabitater og mangel på effektive naturlige fiender bosatt i de invaderte regionene 1,4. Biologisk bekjempelse, spesielt ved hjelp av selvopprettholdende spesialiserte parasitoider, kan bidra til å undertrykke fluepopulasjoner på landskapsnivå og spille en kritisk rolle for bærekraftig arealomfattende forvaltning av dette svært mobile og polyfage 4,5,6.

I løpet av det siste tiåret har forskere fokusert innsats for å oppdage co-utviklede parasitoider av Drosophila suzukii i fluens opprinnelige områder i Øst-Asia 7,8,9, samt effektive, men nylig assosierte parasitoider i fluens invaderte regioner i Amerika og Europa 4,5,6. I fluens nylig invaderte regioner er vanlig forekommende larve Drosophila parasitoider, som Asobara c.f. tabida (Nees) (Hymenoptera: Braconidae), Leptopilina boulardi (Barbotin et al.), og L. heterotoma (Thompson) (Hymenoptera: Figitidae), ikke i stand til å utvikle seg fra eller har lave parasittnivåer på D. suzukii på grunn av fluens sterke immunresistens10. Bare noen kosmopolitiske og generalistiske puppeparasitoider som Pachycrepoideus vindemiae (Rondani) (Hymenoptera: Pteromalidae) og Trichopria drosophilae (Perkins) (Hymenoptera: Diapriidae) i Nord-Amerika og Europa, og Trichopria anastrephae Lima i Sør-Amerika kan lett utvikle seg fra denne fluen4. I motsetning til dette har undersøkelser i Øst-Asia oppdaget en rekke larveparasitoider fra D. suzukii 4,5,6. Blant dem er Asobara japonica Belokobylskij, Ganaspis brasiliensis Ihering og Leptopilina japonica Novković &Kimura de dominerende larveparasitoider 7,8,9,11. Spesielt var de to figitidene (L. japonica og G. brasiliensis) de store parasitoider som hovedsakelig finnes i frisk frukt infisert av D. suzukii og/eller andre nært beslektede drosofilider i naturlig vegetasjon 7,8,9. Disse tre asiatiske larveparasittoidene ble importert til karanteneanlegg i USA og Europa, og evaluert for deres relative effektivitet 12,13,14,15,16,17, klimatilpasningsevne 18, potensielle interspesifikke konkurranseinteraksjoner19, og viktigst av alt, vertsspesifisitet 8,20,21 ,22.

Karanteneevalueringer viste at Ganaspis brasiliensis var mer vertsspesifikk for Drosophila suzukii enn andre testede asiatiske larveparasitoider, selv om den sannsynligvis består av forskjellige biotyper eller kryptiske arter med varierende vertsspesifisitet 8,21,22,23,24. Nomano et al.22 grupperte Ganaspis-individer fra forskjellige geografiske regioner i fem genetiske grupper (kalt G1-G5) basert på molekylære analyser av mitokondrielle cytokromoksidase I-genfragmentet. G2- og G4-gruppene rapporteres bare fra noen få tropiske steder i Sør-Asia, og G5-gruppen ble rapportert fra Asia og andre regioner (f.eks. Argentina, Brasil, Hawaii og Mexico) fra ukjente verter (Buffington, personlig observasjon). Feltsamlinger av vill frukt infisert av D. suzukii i Sør-Korea7, Kina8 og Japan 9,23,25 fant G1 alene eller en blanding av prøver som representerer gruppe G1 og G3. De to gruppene ser ut til å være sympatriske og sameksistere på de samme vertsplantene bebodd av D. suzukii og andre nært beslektede vertsfluer. Ikke desto mindre er det observert noen forskjeller mellom de to gruppene, med G1 som tilsynelatende har en høyere grad av verts- eller vertshabitat-spesifisitet til D. suzukii enn G3, selv om de begge angriper en rekke nært beslektede arter i karantenetestene21,22. Ytterligere detaljerte molekylære analyser kan bidra til å bestemme artens status, spesielt for G1- og G3-gruppene. Denne studien omtaler dem som G1 G. brasiliensis og G3 G. brasiliensis. Noen tidlige studier kalte også G1 G. brasiliensis som G. jf. brasiliensis 14,21,22. G1 G. brasiliensis er nylig godkjent for feltutgivelse mot D. suzukii i USA og Italia (flere andre europeiske land vurderer også å innføre den), mens G3 G. brasiliensis kan bli vurdert for feltutgivelse i nær fremtid. Nylige undersøkelser fant også adventive populasjoner av både L. japonica og G1 G. brasiliensis i British Columbia, Canada26 og Washington State, USA (Beers et al., upubliserte data) og adventive L. japonica-populasjoner i Trento-provinsen, Italia27.

Gitt den betydelige interessen for utvikling av biologiske kontrollprogrammer for Drosophila suzukii-ledelse og det betydelige biologiske kontrollpotensialet for adventive og bevisste introduksjoner av Ganaspis brasiliensis, er det behov for å utvikle effektive oppdrettsmetoder for denne larven parasitoid for fremtidig langsiktig forskning og / eller feltutgivelse. Denne protokollen og tilhørende videoartikkel beskriver to sett med oppdrettsmetoder for denne parasitoide: (1) småskala laboratorieoppdrett i flasker ved hjelp av en blanding av vertsfrukt (blåbær) og kunstig diett for kulturen til D. suzukii. Metodene ble utviklet ved hjelp av G3-materiale opprinnelig samlet inn fra Kunming, Kina8. (2) Masseoppdrett for feltutløsning i store bur ved bruk av vertsfrukt (blåbær) for kulturen til D. suzukii. Den genetiske gruppen som ble brukt til storskala oppdrett var G1-bestanden med opprinnelse i Tokyo, Japan 9,22. Andre skalaer av oppdrettsmetoder, for eksempel bruk av hetteglass eller små beholdere for begge grupper, diskuteres også kort.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Metoder for småskala laboratorieoppdrett av G3 Ganaspis brasiliensis

  1. Forbered vertsdiett.
    1. Tilsett 600 ml destillert vann i en glassbeholder på 1 500 ml, og varm opp vannet på en kokeplate.
    2. Tilsett 88,6 g kommersielt tilgjengelig tørt kosthold (laget av agar, bryggergær, maismel, metylparaben og sukrose) eller tilbered diett ved hjelp av formelen publisert av Dalton et al.28 (se trinn 2.1.2).
    3. Tilsett 300 ml destillert vann i det tørre kostholdet og rør diettblandingen grundig.
    4. Tilsett blandingen i kokende vann.
    5. La væskedietten på kokeplaten i 10 minutter mens du regelmessig rører blandingen for å forhindre at den brenner.
    6. La dietten avkjøles ved romtemperatur i 30 minutter mens du rører den av og til for å fordele varmeutslippet jevnt og forhindre at dietten stivner på overflaten.
    7. Mål 6,7 ml 95% EtOH i en beholder og 3,5 ml 1 M propionsyreoppløsning i en annen beholder.
    8. Når dietten er avkjølt, tilsett EtOH og deretter propionsyreoppløsningen, rør grundig etter hver tilsetning.
    9. Forbered blåbær (kjøpt fra det lokale markedet) ved å skylle dem i kaldt vann, deretter i en natriumhypoklorittblekemiddelløsning (fortynnet til 5%) og kaldt vann igjen.
    10. Tørk frukten med et papirhåndkle og mos dem manuelt til skinnet på hver frukt er ødelagt og juice og kjøtt av frukten blir utsatt.
    11. Tilsett 25-30 g mosede blåbær til hver 250 ml kolbe. Trykk på sidene av kolben for å sikre at den indre bunnen av kolben er dekket med et jevnt lag med mosede blåbær.
    12. Hell den tilberedte dietten i hver kolbe slik at den bare dekker toppen av de mosede blåbærene.
    13. Tilsett skumpropper i halsen på kolbene og la dietten stivne ved romtemperatur (figur 1).
    14. Når dietten har størknet, bruk den umiddelbart eller oppbevar ved 5 ° C i opptil 3 uker.
  2. Bakvert Drosophila suzukii.
    1. Fjern den lagrede dietten fra kjøleskapet og la den balansere til romtemperaturen, eller bruk nylaget diett.
    2. Klipp et stykke absorberende papirhåndkle (f.eks. 5 cm x 20 cm) og vri det i midten. Plasser den vridde midtdelen av papirhåndkleet i kolben (figur 1).
    3. Våt papirhåndkleet og overflaten av dietten med destillert vann for å beholde fuktigheten.
    4. Overfør kjønnsmodne voksne fluer fra den nåværende koloniflueflasken til en ny diettkolbe ved forsiktig å fjerne proppen på den gamle kolben og raskt invertere kolben og justere åpningen av den gamle kolben med den nye kolben.
    5. Trykk forsiktig på siden av den gamle kolben for å få fluene til å falle ned i den nye kolben. Sørg for at det er ~ 25-30 parring par D. suzukii i den nye kolben. Når det er nok fluer i den nye kolben, snur du den gamle kolben raskt oppreist og setter proppene på begge kolbene.
    6. Gjenta overføringene av fluer til ingen fluer er igjen i de gamle kolbene. Kombiner eller samle om nødvendig fluer fra mer enn én gammel kolbe til en ny kolbe for å sikre at det er nok fluer (20-30 par) per kolbe.
    7. Hold de nye kolbene etter en uke med eksponering for voksne fluer under passende forhold (21 °C, 16 L: 8 D fotoperiode, 60%-80% relativ fuktighet [RH%]) i et miljøkammer i 3 uker for flueoppkomst.
  3. Utsett vertslarver for parasitoider.
    1. Ta en kolbe (se trinn 1.2.7) som inneholder flueegg og larver etter at du har fjernet voksne fluer og det vridde papirhåndkleet fra kolben.
    2. Brett et stykke absorberende papirhåndkle i to og legg det i kolben som et puppesubstrat for parasiterte larver.
    3. Aspirer seks kvinnelige og mannlige par G3 G. brasiliensis i hver kolbe (figur 1). Strek et tynt lag honning på bunnen av skumproppen.
    4. La parasitoider ligge i kolben i 5 dager.
    5. Etter en 5-dagers eksponering, fjern parasitoider og hold kolbene under forhold beskrevet ovenfor i et miljøkammer i 35 dager til den forventede vepseoppkomsten.
  4. Samle og lagre voksne parasitoider.
    1. I løpet av den andre og tredje uken av inkubasjon, sjekk kolbene ukentlig for tidlig vertsoppkomst og fjern de voksne fluene.
    2. Når voksne parasitoider begynner å dukke opp, aspirer dem tre ganger i uken og hold dem i drosophila hetteglass (f.eks. 2,5 cm x 9,5 cm) (figur 1).
    3. Legg et lite stykke papirhåndkle fuktet, men ikke mettet, med destillert vann i bunnen av hetteglasset.
    4. Tilsett ~60 parasitoider i hvert hetteglass og merk hetteglasset med datoer. Strek et tynt lag honning på bunnen av skumproppen, to ganger i uken. Oppbevar hetteglassene med voksne parasitoider under de forhold som er beskrevet ovenfor i miljøkammeret i opptil en måned hvis de ikke brukes tidligere.
    5. Fukt papiret i hetteglasset én gang hver 4.-7. dag, eller bytt ut papirhåndkleet hvis det er tegn på mugg.

2. Metoder for storskala oppdrett av G1 Ganaspis brasiliensis

  1. Implementere en storstilt oppdrett av verten Drosophila suzukii.
    1. Bakre D. suzukii i store, strikkede nettingdekkede bur (f.eks. 50 cm x 50 cm x 100 cm) som hver inneholder 1.500-2.000 kjønnsmodne voksne fluer (kjønnsfordeling 50:50) (figur 2).
    2. Forbered Standard Drosophila Medium (SDM) ved å koke alle ingrediensene (6 g bakteriologisk agar, 75 g maismel, 17 g næringsgjær, 15 g sakkarose, 10 g soyabønnemel, 10 ml propionsyre) i 1 liter destillert vann i 10 minutter mens du regelmessig rører blandingen for å forhindre at den brenner28.
    3. La blandingen avkjøles i 5 minutter og tilsett 5 g askorbinsyre.
    4. Hell den nykokte SDM-en i 9 cm petriskåler og la mediet stivne ved romtemperatur før du lukker tallerkenene.
    5. Stable opp SDM Petri-rettene, pakk bunken med aluminiumsfolie og oppbevar oppvasken ved 4 °C i opptil 2 uker.
    6. I hvert oppdrettsbur plasserer du en tallerken med vanndynket bomull og fire til seks petriskåler med SDM (figur 2).
    7. To ganger i uken, erstatt de infiserte SDM Petri-rettene med ferske.
    8. Plasser de infiserte SDM-petriskålene uten lokk individuelt i plastkopper (13,3 cm diameter eller 800 ml), lukk hver kopp med et dekke av finmasket (<0,5 mm) og rug i 12-15 dager ved 23 °C og 75 % RF (figur 2).
    9. Overfør de nyklekte D. suzukii-voksne fra plastkoppene til oppdrettsburene.
  2. Forbered verts larver.
    1. Skyll blåbærene i kaldt vann i 1 min, og suge fruktene i et basseng fylt med en blekemiddelløsning (fortynnet til 5%) i 3 minutter.
    2. Tøm blekemiddelløsningen og fyll bassenget med kaldt vann for å skylle blåbærene. Bland forsiktig for hånd i minst 30 s.
    3. Gjenta trinn 2.2.2 med ferskvann minst tre ganger for å fjerne blekemiddelrester og andre leddyr (f.eks. midd, krypter) som kan være tilstede på frukten.
    4. Legg frukten på et brett med flere lag absorberende papirhåndklær og vipp skuffen forsiktig frem og tilbake, rull bærene rundt for å tørke dem.
    5. Forbered flere 9 cm petriskåler (enten den øverste eller den nederste halvdelen, vendt opp) og fyll hver med de vaskede blåbærene (15-25 frukter per tallerken avhengig av fruktstørrelsen).
    6. I løpet av de sene ettermiddagstimene kan du utsette petriskålene for kjønnsmodne voksne fluer i vertsburene (se trinn 2.1) og la dem ligge over natten.
    7. Neste morgen fjerner du petriskålene fra vertsburene ved å blåse eller banke forsiktig på dem for å løsne fluene på fruktene og bruke den infiserte frukten til oppdrett av parasitoider (se trinn 2.4).
  3. Implementere en storskala parasitoid oppdrett.
    1. Bruk to typer bur for å bakre parasitoide: en for parasitisme og en annen for vepseoppkomst.
    2. Sørg for at parasittburet er kubisk (f.eks. 45 cm på hver side) med et klart plastpanel på forsiden for å observere insektaktivitet, to 18 cm hylseåpninger i frontpanelet for tilsetning eller fjerning av insekter og utskifting av matmateriale, og fin polyesternetting (f.eks. 96 x 26 nett) på toppen og sidene for ventilasjon.
    3. Gjør buret mindre (f.eks. 30 cm på hver side), med en enkelt hylseåpning på to motsatte sider og et klart plastpanel foran for synlighet (figur 2).
    4. Sørg for at begge merdtypene har en tynn snor som henger under taket for å henge en til flere matere (figur 2).
      MERK: En mater består av en stor sylindrisk skumpropp (9 cm diameter) dekket med spredte honningdråper, og kan plasseres på burgulvet eller henges fra burtaket (figur 2).
    5. I hvert bur, tilfør vann i et rettvegget drosophila hetteglass (2,5 cm x 9,5 cm) forseglet med en celluloseacetatplugg (2,5 cm diameter) hver 5.-7. dag, avhengig av rf. Heng hetteglasset opp-ned fra taket i buret (figur 2).
  4. Utsett vertslarvene for parasitoider.
    1. Utsett den vertsinfiserte frukten i petriskålene for G1 G. brasiliensis umiddelbart etter D. suzukii over natten (se trinn 2.2.7).
    2. La de 10-15 petriskålene av infisert frukt ligge i parasittiseringsburet som inneholder 1.500-2.000 veps i 2-3 dager.
    3. Bruk plastkopper (13,3 cm diameter eller 800 ml) med lag med absorberende papir på bunnen for å samle frukten som inneholder de parasiterte vertene (figur 2).
    4. Plasser de åpne koppene i eclosion buret og rug i minst 28 dager ved 21 °C og 65 % RF (figur 2).
    5. I løpet av den andre og tredje uken av inkubasjon, sjekk buret ukentlig for tidlig vertselukking og fjern de voksne fluene for å lette den påfølgende samlingen av parasitoider.
    6. På slutten av den fjerde uken av inkubasjon, legg til en mater og en vannkilde til buret.
  5. Samle og lagre de voksne parasitoider.
    1. Når parasitoide fremveksten starter, samle en del (10% -15%) av de voksne og overføre dem tilbake til parasittisme buret for å erstatte gamle uproduktive individer.
    2. Samle og oppbevar de resterende parasitoider i plastkopper (13,3 cm diameter eller 800 ml) (figur 3A).
    3. Plasser en slange (2 ml) fylt med vann og forseglet med en bomullsrull (1 cm x 3,8 cm) i bunnen av koppen (figur 3A).
    4. Lukk koppen med et modifisert lokk utstyrt med en avtagbar skumpropp (3,5 cm diameter) som materunderlag og et nettingdekket hull for ventilasjon (figur 3B).
    5. Legg opptil 700 voksne til hver kopp (kjønnsforhold 50:50), merk koppen med ankomstdatoen, og oppbevar den i et miljøkammer (17 °C; 65 % RF) til den er brukt, eller i opptil 1 måned (figur 3B).
  6. Send de voksne parasitoider.
    1. Bruk koniske rør (50 ml) for å sende de voksne parasitoider.
    2. Stikk hull i et ventilasjonshull (8 mm diameter) på hetten og dekk det med et finmasket nett (figur 3C).
    3. Tilsett en celluloseacetat-fôringsring på innsiden av hetten (figur 3C).
    4. Forbered en mettet sukroseløsning ved hjelp av destillert vann, påfør noen dråper på fôringsringen, og la den absorbere væsken.
    5. Plasser et vifteformet stykke absorberende papirhåndkle i røret (figur 3D).
    6. Legg ~ 200 voksne parasitoider til hvert rør, og plasser rørene i en isolert fraktbeholder sammen med ispakker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 4 viser representative resultater av småskala laboratorieoppdrett av G3 Ganaspis brasiliensis ved bruk av to forskjellige parasitoide tettheter (seks eller 10 par) og to forskjellige eksponeringstider (5 eller 10 dager) på karanteneanlegget til USDA-ARS Beneficial Insects Introduction Unit (Newark, Delaware). Det var 14 replikasjoner for hver kombinasjon av parasitoid tetthet og eksponeringstid. Totalt produserte de 64 kolbene 4018 veps (71,7 ± 4,9 avkom per kolbe) med 49,5% ± 1,9% kvinnelig avkom. Ved 21 °C oppsto voksne parasitoider ca. 30-35 dager etter oviposisjon. Parasitoide tetthet og eksponeringstid påvirket ikke signifikant det totale antall produserte avkom per replikasjon (kolbe) (enveis ANOVA, F3,52 = 0,379, P = 0,769) og hadde bare en marginal effekt på prosentandelen av kvinnelige avkom (enveis ANOVA, data ble logit-transformert før analysen etter behov for å stabilisere variasjonen, F3,52 = 2,796, P = 0, 049), selv om produksjonseffektiviteten per innbygger kvinne (enveis ANOVA, F3, 52 = 3, 576, P = 0, 020) redusert ved høy parasitoid tetthet. Eksponeringstid på mer enn 5 dager så ikke ut til å øke produktiviteten. Økt parasitoid tetthet så heller ikke ut til å øke produktiviteten. Derfor synes kombinasjonen av seks par og 5-dagers eksponeringstider å være mest egnet for laboratorieoppdrett.

Figur 5 viser en 6-måneders produktivitetstrend for storskala oppdrett av G1 Ganaspis brasiliensis ved karanteneanlegget til Edmund Mach Foundation (Trento, Italia) i 2021. Oppdretten ble startet ved hjelp av 150 tre dager gamle, parrede kvinnelige veps avledet fra en liten oppdrett ved karantenelaboratoriet til CABI i Delémont, Sveits. Flere veps fra oppdrett ble gradvis lagt til parasittburet, til de nådde 1.500-2.000 individer (kjønnsforhold 50:50) i uke 5. Belegget i parasittburet ble deretter opprettholdt på samme nivå ved å legge til nye veps produsert i selve den store oppdretten. I løpet av hele perioden ble parasitismeburet forsynt med nyinfisert frukt hver 2-3 dag. Frukten (blåbær) ble tilbudt til G1 G. brasiliensis umiddelbart etter natten eksponering for Drosophila suzukii. Parasitoide produksjon startet 5 uker etter første vertseksponering (figur 5A). Fra uke 8 til uke 22 var parasitoideproduksjonen proporsjonal med mengden frukt som ble eksponert, i gjennomsnitt 0,44 ± 0,03 g/parasitoid (gjennomsnittlig ± SE; Figur 5B). Totalt 53 736 parasitoider ble samlet inn, med et gjennomsnittlig kvinnelig avkom på 45,9% (område: 32,4% -79,0%).

Figure 1
Figur 1: Flytskjema for småskala laboratoriebearbeiding av Drosophila suzukii og G3 Ganaspis brasiliensis. Venstre side viser vertsflueoppdrettsprosedyrene mens høyre side illustrerer den parasitoide oppdrettssyklusen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Flytskjema for storskala oppdrettsprosedyrer av Drosophila suzukii og G1 Ganaspis brasiliensis. Venstre side viser vertsflueoppdrettsprosedyrene mens høyre side illustrerer den parasitoide oppdrettssyklusen. Forkortelse: SDM = standard Drosophila medium. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Containere og rør som brukes til å lagre og frakte G1 Ganaspis brasiliensis fra storstilt oppdrett. (A) En horisontal visning av lagringsbeholderen som viser et vannrør inne i beholderen, (B) en vertikal visning av beholderen som viser et ventilert lokk og en skumpropp, og (C) et ventilert lokk og et stykke absorberende papir for (D) fraktrøret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representativt eksempel på småskala laboratorieoppdrett av G3 Ganaspis brasiliensis. (A) Antall produserte avkom per kolbe, (B) antall avkom produsert per hunnveps, og (C) prosentandel av kvinnelige avkom, under to forskjellige parasitoide tettheter og eksponeringstider. Verdier er gjennomsnittlige ± SE, og stolper med forskjellige bokstaver er signifikant forskjellige (ANOVA, Tukeys HSD, P < 0,05). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Produktivitetstrend for storskala oppdrett fra starten til og med uke 23. (A) Stolper angir antall G1 Ganaspis brasiliensis-avkom samlet ukentlig fra eclosjonsburene for å erstatte gamle individer i parasittburet (mørkegrønn) og som skal lagres eller sendes (lysegrønn). Den oransje linjen indikerer mengden vertsinfisert frukt (kg blåbær) som leveres hver uke til parasitoider i parasittismeburet. (B) Ukentlig forhold mellom vekten av vertsinfisert frukt og antall parasitoide avkom produsert 5 uker etter eksponering (dvs. gram frukt som kreves for å produsere en enkelt voksen parasitoid). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Langsiktig forskning og påfølgende feltutgivelser av et biologisk kontrollmiddel avhenger av tilgjengeligheten av effektive og økonomiske oppdrettsteknikker. De beskrevne metodene i denne studien har vist seg å være effektive protokoller for både småskala og storskala oppdrett av Ganaspis brasiliensis. Den småskala oppdrettsprotokollen er utviklet over flere år for å optimalisere mengden arbeidskraft og redusere spesialisert utstyr som trengs for å opprettholde parasitoide og vertskolonier samtidig. Den er egnet for å opprettholde en koloni for laboratorieforskning eller bioassays. Lignende metoder har blitt brukt av forfatterne for å bakre denne parasitoide for karanteneevalueringer av denne parasitoide. Den store oppdrettsprotokollen vil tillate å produsere et stort antall veps for feltutgivelse, som nylig ble utført i Italia. Disse teknologiene kan enkelt overføres til andre laboratorier, produsenter eller selskaper for storskala oppdrett i nær fremtid, samt tjene som grunnlag for ytterligere forbedringer i metoder.

Disse protokollene kan også brukes til å bakre Leptopilina japonica, da både Ganaspis brasiliensis og L. japonica er like når det gjelder deres vertshabitatpreferanse 7,8, vertsstadiepreferanse eller reproduksjonsbiologi15, termisk ytelse18 og foraging effektivitet i laboratoriebioassays13,15, samt atferdsmessige responser mot vertsassosierte signaler12, bortsett fra at L. japonica synes å ha et bredere vertsområde enn selv G3 G. brasiliensis20. Begge parasitoider har blitt oppdrettet ved hjelp av lignende metoder som beskrevet her. For småskala oppdrett kan begge parasitoider også oppdrettes i drosophila hetteglass, vanligvis ved å overføre 20 unge (1-2 dager gamle) Drosophila suzukii larver til et drosophila hetteglass fylt med 2 cm kunstig diett, eller plassere to infiserte frukter, hver med 5-10 unge D. suzukii larver, og utsette dem for to parrede kvinnelige veps i 2-3 dager, begge produserer ~10 avkom per hetteglass 13,15,22.

Som diskutert ovenfor, kan G1 og G3 Ganaspis brasiliensis som brukes i denne protokollen avvike noe i noen vertssøkende atferd og vertsspesifisitet 21,22. Girod et al.21 rapporterer at den japanske G1 G. brasiliensis var strengere spesifikk for Drosophila suzukii, og så ikke ut til å fungere godt i rent kunstig kosthold i hetteglass sammenlignet med ytelsen på vertsfrukt. Matsuura et al.25 rapporterte også at G1 G. brasiliensis populasjoner samlet fra D. suzukii-infiserte kirsebær i Japan spesialiserer seg på D. suzukii. Småskala oppdrettsmetode ved bruk av diett blandet med blåbær ble opprinnelig utviklet for oppdrett av G3 G. brasiliensis fordi G1 G. brasiliensis ikke var tilgjengelig på den tiden. Senere ble denne metoden funnet å ikke fungere godt for oppdrett av G1 G. brasiliensis (Wang et al. upubliserte data).

For småskala oppdrett av G1 G. brasiliensis foreslås det derfor å modifisere vertssubstratet ved å (1) utsette fluene direkte for blåbær (eller annen vertsfrukt) for å samle vertslarver i frukten, og (2) overføre eksponert frukt til et standard Drosophila-kulturmedium for larvene å utvikle seg i et miljø med lav konkurranse ved å plassere de infiserte fruktene som inneholder vertslarvene på dietten i kolbene for eksponering for parasitoider. Dette vil tillate de parasiterte larver å mate på dietten, spesielt ved høye vertstettheter, og de parasiterte vertspuppene skal samles fra papirhåndkleet. Alternativt kan G1 G. brasiliensis oppdrettes på frukt direkte i plastbeholdere (forskjellige størrelser) ved å utsette 5-10 kvinnelige veps til 10-20 infiserte blåbær i 4-5 dager, noe som produserte opptil 80 avkom per beholder, avhengig av vertstetthet (Wang et al., upubliserte data). For denne metoden anbefales det å plassere den infiserte frukten på et hevet metallnett ("maskinvareduk") for å la parasitoider få tilgang til den infiserte frukten fra alle retninger, spesielt hvis for mange frukter er plassert i en beholder. Ideelt sett bør ett eller to lag infisert frukt plasseres i hver beholder for denne oppdrettsmetoden. Disse alternative småskalametodene bør også fungere godt for oppdrett av G3 G. brasiliensis.

Uavhengig av oppdrettsmetoder og vekter (hetteglass, kolbe, beholder eller bur), er det avgjørende å opprettholde egnet temperatur, fuktighet, samt kontrollere verts- eller hunnvepsens alder, tetthet og eksponeringstid for oppdrett av både G1 Ganaspis brasiliensis og G3 G. brasiliensis. Drosophila suzukii larver utviklet seg på ca. 1 uke under normale laboratorieforhold (f.eks. 22 ± 2 °C) 15. Hunn G. brasiliensis foretrakk å angripe yngre (1-2 dager gamle) enn eldre (3-4 dager gamle) vertslarver, selv om ulike aldre av vertslarver kunne angripes15 år. Ved 22 ± 2 °C oppsto G. brasiliensis-hunnene med en betydelig høy andel (~50 %) av deres levetid komplement av modne egg, og den modne eggmengden nådde en topp etter 2-3 dager15. Voksne hunner overlevde ~ 20 dager da de fikk ubegrenset tilgang til verter og begynte oviposisjon innen 2 dager etter fremveksten, og nådde en topp av oviposisjon innen 5-10 dager og deretter gradvis reduserte oviposisjon15. Derfor bør unge (<10 dager gamle) hunnveps brukes i oppdrett, men kvinnelige veps kan gjenbrukes til oppdrett når de er mangelvare. Parasitoide kunne lett utvikle seg ved 21-25 °C, men temperaturer under 17,2 °C så ut til å utløse en fakultativ diapause17. Det anbefales derfor å bruke et temperaturområde på 21-25 °C for optimal utvikling av både flue og parasitoid.

Videre vil eksponeringstid på mer enn 5 dager sannsynligvis ikke øke produktiviteten til parasitoide. Økt parasitoid tetthet basert på småskala oppdrett for G3 G. brasiliensis ser ikke ut til å øke produktiviteten, muligens på grunn av gjensidig forstyrrelse blant fôring av kvinnelige veps. Seks mannlige-kvinnelige par og en 5-dagers eksponeringstid ser ut til å være en ideell kombinasjon for laboratoriets småskala oppdrett, selv om oppdrettsmetodene kan forbedres i fremtiden ved å optimalisere forholdet mellom vert og parasitoid ytterligere. En viktig dødelighetsfaktor for parasitoide synes å være relatert til lav luftfuktighet, da mange parasitoider ble observert å være ute av stand til å lukke med tørre substratforhold. Å legge til et stykke absorberende papirhåndkle under frukten absorberer ikke bare juice når frukten brytes ned, men gir også et substrat som kan dempes for å øke luftfuktigheten eller gi et puppesubstrat for fluen.

For småskala oppdrett kan en kolbe opprettholde fuktigheten bedre enn et hetteglass fordi førstnevnte har en smal nakke. Det ble også funnet i denne studien at friske blåbær belagt med støv av aktiv tørr gjær bidro til å forhindre dannelse av mugg og forbedret tiltrekningen av frukten til fluene. Andre aspekter ved den parasitoide oppdretten som gjenstår å bli utforsket inkluderer (1) muligheten for å oppdrette denne parasitoide på alternative verter eller vertsfrukter og hvordan alternative verter eller vertsfrukter vil påvirke parasitoideens effektivitet, (2) faktorer som påvirker parasitoides avkoms kondisjon og kjønnsforhold, (3) evnen til denne parasitoide (både G1 og G3 ) til å tilpasse seg kunstige diettforhold, og (4) de genetiske eller atferdsmessige endringene som kan oppstå med tilpasning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.

Acknowledgments

Forfatterne takker Lukas Seehausen og Marc Kenis (CABI, Sveits) for vennlig å gi G1 G. brasiliensis. Finansiering i Italia ble gitt av Provincia Autonoma di Trento, Trento, Italia, og i USA av National Institute of Food and Agriculture, USDA Specialty Crops Research Initiative Award (# 2020-5118-32140), USDA Animal and Plant Health Inspection Service (Farm Bill, fond 14-8130-0463) og USDA ARS CRIS basisfond (prosjekt 8010-22000-033-00D). USDA er en likeverdig leverandør og arbeidsgiver og støtter ikke produkter som er nevnt i denne publikasjonen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Active dry yeast Fleischmanns Yeast, Cincinatti, OH, USA None Used to cover fruit to reduce mold growth and enhance the frui attraction to the flies
Bacteriological agar Merk Life Science S.r.l., Milan, Italy A1296 - 5KG Used to prepare the Standard Drosophila Medium
Bleach solution Clorox Company, Oakland, CA, USA None Used to disinfect flesh fruit
Blue stopper Azer Scientific, Morgantown, PA, USA ES3837 Used for sealing the tube while allowing ventilation for insects
Blueberries Grocery Store, Newark, DE, USA None Provided as host fruit for the flies (various other fruit can also be used)
BugDorm insect rearing cage (W24.5 x D24.5 x H63.0 cm) Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan 4E3030 Used for rearing parasitoids (parasitism cage)
BugDorm insect rearing cage (W32.5 x D32.5 x H32.5 cm) Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan 4E4590 Used for rearing flies
BugDorm insect rearing cage (W32.5 x D32.5 x H32.5 cm) Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan 4E4545 Used for rearing parasitoids (eclosion cage)
Chicken wire (0.64 cm, 19 gauge) Everbilt, OH, USA 308231EB Used to lift up the fruit to allow maximum parasitoid oviposition
Cornmeal Grocery Store, Trento, TN, Italy None Used to prepare the Standard Drosophila Medium
Dental cotton roll (1 x 3.8 cm) Gima S.p.A., Gessate, MI, Italy 35000 Used for providing water to the parasitoids within the storage container
Drosophila diet Frontier Scientific, Newark, DE, USA TF1003 Custom diet used to rear flies
Drosophila vial narrow, Polystirene (2.5 x 9.5 cm) VWR International, LLC., Radnor, PA, US 75813-160 Used for providing water to the parasitoids within the cage
Drosophila vial plugs, Cellulose acetate (2.5 cm) VWR International, LLC., Radnor, PA, US 89168-886 Used for providing water to the parasitoids within the cage
Erlenmeyer flask (250 mL) Carolina Biological, Burlington, NC, USA 731029 Used for rearing flies and parasitoids
Falcon-style centrifuge tube (50 mL) VWR International, LLC., Radnor, PA, US VWRI525-0611 Modified to ship adult parasitoids
Foam stopper Jaece Industries, North Tanawanda, NY, USA L800-C Used for sealing the flasks while allowing ventilation for insects
Honey Grocery Store, Newark, DE, USA None Provided as food for parasitoids
Identi-Plug plastic foam stopper Fisher Scientific Company, L.L.C., Pittsburg, PA, US 14-127-40E Used as feeder for parasitoids and to seal the storage container
Industrial paper towel Grocery Store, Newark, DE, USA None Provided as a pupation substrate for pupae and mitigated moisture
Micron mesh fabric (250 mL) Industrial Netting, Maple Grove, MN, USA WN0250-72 Used to make ventilation lid for insects
Nutritional yeast (flakes) Grocery Store, Trento, TN, Italy None Used to prepare the Standard Drosophila Medium
Paper coaster (10.2 cm) Hoffmaster, WI, USA 35NG26 Porvided as pupation substrate for flies and parsitized pupae
Plastic cup (Ø 13.3 cm, 800 mL) Berry Superfos, Taastrup, Denmark Unipak 5134 Modified to store adult parasitoids
Plastic lid (Ø 13.3 cm) Berry Superfos, Taastrup, Denmark PP 2830 Modified to store adult parasitoids
Propionic acid Merk Life Science S.r.l., Milan, Italy P1386 - 1L Used to prepare the Standard Drosophila Medium
Saccharose Grocery Store, Trento, TN, Italy None Used to prepare the Standard Drosophila Medium
Soup cup with lid (475 mL) StackMan, Vietnam DC1648 Used for parasitized larvae to pupate
Soybean flour Grocery Store, Trento, TN, Italy None Used to prepare the Standard Drosophila Medium
White felt washer (0.64 cm thick, 5 mm ID x 20 mm OD) Quiklok, Lincoln, NH, US WFW/.25 x 5 x 20 mm Used as feeding ring for parasitoids

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Asplen, M. K., et al. Invasion biology of spotted wing drosophila (Drosophila suzukii): a global perspective and future priorities. Journal of Pest Science. 88 (3), 469-494 (2015).
  2. Tait, G., et al. Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae): A decade of research towards a sustainable integrated pest management program. Journal of Economic Entomology. 114 (5), 1950-1974 (2021).
  3. Kirschbaum, D. S., Funes, C. F., Buonocore-Biancheri, M. J., Suárez, L., Ovruski, S. M. The biology and ecology of Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae). Drosophila suzukii management. Garcia, F. R. M. , Springer. Cham. 41-92 (2020).
  4. Wang, X. G., Lee, J. C., Daane, K. M., Buffington, M. L., Hoelmer, K. A. Biological control of Drosophila suzukii. CAB Reviews. 15, 054 (2020).
  5. Lee, J. C., et al. Biological control of spotted-wing drosophila (Diptera: Drosophilidae): Current and pending tactics. Journal of Integreated Pest Management. 10 (1), 13 (2019).
  6. Wang, X. G., Lee, J. C., Daane, K. M., Hoelmer, K. A. Biological control of spotted-wing drosophila: An update on promising agents. Drosophilia suzukii management. Garcia, F. R. M. , Springer. Cham. 143-167 (2020).
  7. Daane, K. M., et al. First exploration of parasitoids of Drosophila suzukii in South Korea as potential classical biological agents. Journal of Pest Science. 89 (3), 823-835 (2016).
  8. Giorgini, M., et al. Exploration for native parasitoids of Drosophila suzukii in China reveals a diversity of parasitoid species and narrow host range of the dominant parasitoid. Journal of Pest Science. 92 (2), 509-522 (2019).
  9. Girod, P., et al. The parasitoid complex of D. suzukii and other fruit feeding Drosophila species in Asia. Scientific Reports. 8 (1), 11839 (2018).
  10. Kacsoh, B. Z., Schlenke, T. A. High hemocyte load is associated with increased resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D. melanogaster. PLoS ONE. 7 (4), 34721 (2012).
  11. Buffington, M. L., Forshage, M. Redescription of Ganaspis brasiliensis (Ihering, 1905), new combination (Hymenoptera: Figitidae), a natural enemy of the invasive Drosophila suzukii (Matsumura, 1931)(Diptera: Drosophilidae). Procedings of the Entomoogical Society of Washington. 118 (1), 1-13 (2016).
  12. Biondi, A., et al. Innate olfactory responses of Asobara japonica (Hymenoptera: Braconidae)towards fruits infested by the invasive spotted wing drosophila. Journal of Insect Behavior. 30 (5), 495-506 (2017).
  13. Biondi, A., Wang, X. G., Daane, K. M. Host preference of three Asian larval parasitoids to closely related Drosophila species: implications for biological control of Drosophila suzukii. Journal of Pest Science. 94 (2), 273-283 (2021).
  14. Girod, P., Rossignaud, L., Haye, T., Turlings, T. C. J., Kenis, M. Development of Asian parasitoids in larvae of Drosophila suzukii feeding on blueberry and artificial diet. Journal of Applied Entomology. 142 (5), 483-494 (2018).
  15. Wang, X. G., Nance, A. H., Jones, J. M. L., Hoelmer, K. A., Daane, K. M. Aspects of the biology and reproductive strategy of two Asian larval parasitoids evaluated for classical biological control of Drosophila suzukii. Biological Control. 121, 58-65 (2018).
  16. Wang, X. G., Biondi, A., Daane, K. M. Functional responses of three candidate Asian larval parasitoids evaluated for classical biological control of Drosophila suzukii. Journal of Economic Entomology. 113 (1), 73-80 (2020).
  17. Wang, X. G., et al. Assessment of Asobara japonica as a potential biological control agent for the spotted wing drosophila, Drosophila suzukii. Entomologia Generalis. 41, 1-12 (2021).
  18. Hougardy, E., Hogg, B. N., Wang, X. G., Daane, K. M. Comparison of thermal performances of two Asian larval parasitoids of Drosophila suzukii. Biological Control. 136, 104000 (2019).
  19. Wang, X. G., Hogg, B. N., Hougardy, E., Nance, A. H., Daane, K. M. Potential competitive outcomes among three solitary larval endoparasitoids as candidate agents for classical biological control of Drosophila suzukii. Biological Control. 130, 18-26 (2019).
  20. Daane, K. M., Biondi, A., Wang, X. G., Hogg, B. A. Potential host ranges of three Asian larval parasitoids of Drosophila suzukii. Journal of Pest Science. 94 (4), 1171-1182 (2021).
  21. Girod, P., et al. Host specificity of Asian parasitoids for potential classical biological control of Drosophila suzukii. Journal of Pest Science. 91 (4), 1241-1250 (2018).
  22. Seehausen, M. L., et al. Evidence for a cryptic parasitoid species reveals its suitability as a biological control agent. Scientific Reports. 10 (1), 19096 (2020).
  23. Nomano, F. Y., et al. Genetic differentiation of Ganaspis brasiliensis (Hymenoptera: Figitidae) from East and Southeast Asia. Applied Entomology and Zoology. 52 (3), 429-437 (2017).
  24. Kasuya, N., Mitsui, H., Ideo, S., Watada, M., Kimura, M. T. Ecological, morphological and molecular studies on Ganaspis individuals (Hymenoptera: Figitidae) attacking Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae). Applied Entomology and Zoology. 48 (1), 87-92 (2013).
  25. Matsuura, A., Mitsui, H., Kimura, M. T. A preliminary study on distributions and oviposition sites of Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae) and its parasitoids on wild cherry tree in Tokyo, central Japan. Applied Entomology and Zoology. 53 (1), 47-53 (2018).
  26. Abram, P. K., et al. New records of Leptopilina, Ganaspis, and Asobara species associated with Drosophila suzukii in North America, including detections of L. japonica and G. brasiliensis. Journal of Hymenoptera Research. 78, 1-17 (2020).
  27. Puppato, S., Grassi, A., Pedrazzoli, F., De Cristofaro, A., Ioriatti, C. First report of Leptopilina japonica in Europe. Insects. 11 (9), 611 (2020).
  28. Dalton, D. T., et al. Laboratory survival of Drosophila suzukii under simulated winter conditions of the Pacific Northwest and seasonal field trapping in five primary regions of small and stone fruit production in the United States. Pest Managagement Science. 67 (11), 1368-1374 (2011).

Tags

Biologi Utgave 184 biologisk bekjempelse Figitidae invasiv parasitoid oppdrett flekkvinge drosophila
Metoder for oppdrett av parasitoid <em>ganaspis brasiliensis</em>, et lovende biologisk kontrollmiddel for invasiv <em>Drosophila suzukii</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rossi-Stacconi, M. V., Wang, X.,… More

Rossi-Stacconi, M. V., Wang, X., Stout, A., Fellin, L., Daane, K. M., Biondi, A., Stahl, J. M., Buffington, M. L., Anfora, G., Hoelmer, K. A. Methods for Rearing the Parasitoid Ganaspis brasiliensis, a Promising Biological Control Agent for the Invasive Drosophila suzukii. J. Vis. Exp. (184), e63898, doi:10.3791/63898 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter