Summary
Ganaspis brasiliensis - en larval parasitoid av Drosophila suzukii (en global invasiv fruktgröda skadedjur) - har godkänts eller övervägs för introduktion i Europa och USA för biologisk bekämpning av denna skadedjur. Denna artikel innehåller protokoll för både småskalig och storskalig uppfödning av denna parasitoid.
Abstract
Infödd i Östasien har den fläckiga vingen drosophila, Drosophila suzukii (Matsumura) (Diptera: Drosophilidae), etablerat sig i stor utsträckning i Amerika, Europa och delar av Afrika under det senaste decenniet och blivit ett förödande skadedjur av olika mjukhudade frukter i dess invaderade regioner. Biologisk bekämpning, särskilt med hjälp av självförstärkande och specialiserade parasitoider, förväntas vara ett genomförbart alternativ för hållbar områdesomfattande hantering av denna mycket rörliga och polyfagiska skadedjur. Ganaspis brasiliensis Ihering (Hymenoptera: Figitidae) är en larvparasitoid som är utbredd i Östasien och har visat sig vara en av de mest effektiva parasitoiderna av D. suzukii.
Efter rigorösa utvärderingar före introduktion av dess effektivitet och potentiella icke-målrisker har en av de mer värdspecifika genetiska grupperna av denna art (G1 G. brasiliensis) nyligen godkänts för introduktion och fältutsättning i USA och Italien. En annan genetisk grupp (G3 G. brasiliensis), som också var vanligt förekommande för att attackera D. suzukii i Östasien, kan komma i fråga för introduktion inom en snar framtid. Det finns för närvarande ett enormt intresse för att föda upp G. brasiliensis för forskning eller för massproduktion för fältfrisättning mot D. suzukii. Detta protokoll och tillhörande videoartikel beskriver effektiva uppfödningsmetoder för denna parasitoid, både i liten skala för forskning och i stor skala för massproduktion och fältutsläpp. Dessa metoder kan gynna ytterligare långsiktig forskning och användning av denna asiatisk-infödda parasitoid som ett lovande biologiskt bekämpningsmedel för detta globala invasiva skadedjur.
Introduction
Infödd i Östasien har den fläckiga vingen drosophila, Drosophila suzukii (Matsumura) (Diptera: Drosophilidae), etablerat sig i stor utsträckning i Amerika, Europa och delar av Afrika 1,2. Flugan är extremt polyfagisk och kan använda olika odlade och vilda frukter med mjuka och tunna skinn i sina inhemska och invaderade regioner 1,2,3. Nuvarande förvaltningsstrategier för detta skadedjur är starkt beroende av den frekventa användningen av insekticider som riktar sig mot vuxna flugor i grödor när mottaglig frukt mognar. Upprepade sprayer används ofta, möjligen på grund av konsekvent spridning av reservoarflugpopulationer från icke-grödor och brist på effektiva naturliga fiender bosatta i de invaderade regionerna 1,4. Biologisk bekämpning, särskilt med hjälp av självförstärkande specialiserade parasitoider, kan hjälpa till att undertrycka flugpopulationer på landskapsnivå och spela en avgörande roll för hållbar områdesomfattande hantering av denna mycket mobila och polyfagiskaskadedjur 4,5,6.
Under det senaste decenniet har forskare fokuserat ansträngningar för att upptäcka samutvecklade parasitoider av Drosophila suzukii i flugans inhemska områden i Östasien 7,8,9, liksom effektiva men nyligen associerade parasitoider i flugans invaderade regioner i Amerika och Europa 4,5,6. I flugans nyligen invaderade regioner kan vanligt förekommande larval Drosophila parasitoider, såsom Asobara c.f. tabida (Nees) (Hymenoptera: Braconidae), Leptopilina boulardi (Barbotin et al.) och L. heterotoma (Thompson) (Hymenoptera: Figitidae), inte utvecklas från eller ha låga parasitismnivåer på D. suzukii på grund av flugans starka immunresistens10. Endast vissa kosmopolitiska och generalistiska puppasparoider som Pachycrepoideus vindemiae (Rondani) (Hymenoptera: Pteromalidae) och Trichopria drosophilae (Perkins) (Hymenoptera: Diapriidae) i Nordamerika och Europa, och Trichopria anastrephae Lima i Sydamerika kan lätt utvecklas från denna fluga4. Däremot har utforskningar i Östasien upptäckt ett antal larvparasitoider från D. suzukii 4,5,6. Bland dem är Asobara japonica Belokobylskij, Ganaspis brasiliensis Ihering och Leptopilina japonica Novković & Kimura de dominerande larvparasitoiderna 7,8,9,11. I synnerhet var de två figitiderna (L. japonica och G. brasiliensis) de viktigaste parasitoiderna som främst hittades i färska frukter infekterade av D. suzukii och/eller andra närbesläktade drosofilider i naturlig vegetation 7,8,9. Dessa tre asiatiska larvparasitoider importerades till karantänanläggningar i USA och Europa och utvärderades för deras relativa effektivitet 12,13,14,15,16,17, klimatanpassningsförmåga18, potentiella interspecifika konkurrensinteraktioner19 och, viktigast av allt, värdspecificitet 8,20,21 ,22.
Karantänutvärderingar visade att Ganaspis brasiliensis var mer värdspecifik för Drosophila suzukii än andra testade asiatiska larvparasitoider, även om den sannolikt består av olika biotyper eller kryptiska arter med varierande värdspecificitet 8,21,22,23,24. Nomano et al.22 grupperade Ganaspis-individer från olika geografiska regioner i fem genetiska grupper (namngivna som G1-G5) baserat på molekylära analyser av det mitokondriella cytokromoxidas I-genfragmentet. G2- och G4-grupperna rapporteras endast från ett fåtal sydasiatiska tropiska platser, och G5-gruppen rapporterades från Asien och andra regioner (t.ex. Argentina, Brasilien, Hawaii och Mexiko) från okända värdar (Buffington, personlig observation). Fältsamlingar av vilda frukter infekterade av D. suzukii i Sydkorea7, Kina8 och Japan 9,23,25 hittade G1 ensam eller en blandning av exemplar som representerar grupperna G1 och G3. De två grupperna verkar vara sympatriska och samexistera på samma värdväxter bebodda av D. suzukii och andra närbesläktade värdflugor. Icke desto mindre har vissa skillnader observerats mellan de två grupperna, där G1 till synes har en högre grad av värd- eller värdhabitatspecifikitet för D. suzukii än G3, även om de båda attackerar ett antal närbesläktade arter i karantäntesterna21,22. Ytterligare detaljerade molekylära analyser kan hjälpa till att bestämma artens status, särskilt för G1- och G3-grupperna. Denna studie hänvisar till dem som G1 G. brasiliensis och G3 G. brasiliensis. Några tidiga studier namngav också G1 G. brasiliensis som G. jfr brasiliensis 14,21,22. G1 G. brasiliensis har nyligen godkänts för fältfrisättning mot D. suzukii i USA och Italien (flera andra europeiska länder överväger för närvarande också att introducera den), medan G3 G. brasiliensis kan komma i fråga för fältutsättning inom en snar framtid. Nyligen genomförda undersökningar fann också adventiva populationer av både L. japonica och G1 G. brasiliensis i British Columbia, Kanada26, och Washington State, USA (Beers et al., opublicerade data) och adventiva L. japonica -populationer i Trento -provinsen, Italien27.
Med tanke på det betydande intresset för utveckling av biologiska bekämpningsprogram för Drosophila suzukii-hantering och den betydande biologiska kontrollpotentialen för adventiva och avsiktliga introduktioner av Ganaspis brasiliensis, finns det ett behov av att utveckla effektiva uppfödningsmetoder för denna larval parasitoid för framtida långsiktig forskning och / eller fältutsättning. Detta protokoll och tillhörande videoartikel beskriver två uppsättningar uppfödningsmetoder för denna parasitoid: (1) småskalig laboratorieuppfödning i kolvar med en blandning av värdfrukt (blåbär) och konstgjord kost för odling av D. suzukii. Metoderna utvecklades med hjälp av G3-material som ursprungligen samlats in från Kunming, Kina8. (2) Massuppfödning för fältutsättning i stora burar med värdfrukt (blåbär) för odling av D. suzukii. Den genetiska grupp som användes för den storskaliga uppfödningen var G1-beståndet med ursprung i Tokyo, Japan 9,22. Andra skalor av uppfödningsmetoder, såsom användning av injektionsflaskor eller små behållare för båda grupperna, diskuteras också kortfattat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Metoder för småskalig laboratorieuppfödning av G3 Ganaspis brasiliensis
- Förbered värddiet.
- Tillsätt 600 ml destillerat vatten i en 1 500 ml glasbehållare och värm vattnet på en kokplatta.
- Tillsätt 88,6 g kommersiellt tillgänglig torr kost (gjord av agar, bryggerjäst, majsmjöl, metylparaben och sackaros) eller förbered diet med den formel som publicerats av Dalton et al.28 (se steg 2.1.2).
- Tillsätt 300 ml destillerat vatten i den torra kosten och rör om dietblandningen noggrant.
- Tillsätt blandningen i kokande vatten.
- Låt den flytande kosten på kokplattan koka i 10 minuter under omrörning av blandningen regelbundet för att förhindra att den brinner.
- Låt kosten svalna vid rumstemperatur i 30 minuter under omrörning ibland för att fördela värmeavgivningen jämnt och förhindra att kosten stelnar på ytan.
- Mät 6,7 ml 95% EtOH i en behållare och 3,5 ml 1 M propionsyralösning i en annan behållare.
- När dieten har svalnat, tillsätt EtOH och sedan propionsyralösningen under omrörning noggrant efter varje tillsats.
- Förbered blåbär (köpt från den lokala marknaden) genom att skölja dem i kallt vatten, sedan i en natriumhypokloritblekmedellösning (utspädd till 5%) och kallt vatten igen.
- Torka frukten med en pappershandduk och mosa dem manuellt tills huden på varje frukt är trasig och fruktens juice och kött exponeras.
- Tillsätt 25-30 g mosade blåbär till varje 250 ml kolv. Knacka på sidorna på kolven för att säkerställa att kolvens inre botten är täckt med ett jämnt lager mosade blåbär.
- Häll den beredda kosten i varje kolv så att den bara täcker toppen av de mosade blåbären.
- Tillsätt skumproppar i kolvarnas halsar och låt kosten stelna vid rumstemperatur (figur 1).
- När dieten har stelnat, använd den omedelbart eller förvara vid 5 °C i upp till 3 veckor.
- Bakre värd Drosophila suzukii.
- Ta bort den lagrade kosten från kylskåpet och låt den balansera till den omgivande rumstemperaturen, eller använd nygjord kost.
- Skär en bit absorberande pappershandduk (t.ex. 5 cm x 20 cm) och vrid den i mitten. Placera den tvinnade mittdelen av pappershandduken i kolven (figur 1).
- Våt pappershandduken och ytan på kosten med destillerat vatten för att behålla fukt.
- Överför sexuellt mogna vuxna flugor från de nuvarande koloniflugkolvarna till en ny dietkolv genom att försiktigt ta bort proppen på den gamla kolven och snabbt vända på kolven och rikta in öppningen på den gamla kolven med den nya kolven.
- Knacka försiktigt på sidan av den gamla kolven för att få flugorna att falla ner i den nya kolven. Se till att det finns ~ 25-30 parningspar av D. suzukii i den nya kolven. När det finns tillräckligt med flugor i den nya kolven, vänd snabbt den gamla kolven upprätt och byt ut propparna på båda kolvarna.
- Upprepa överföringarna av flugor tills inga flugor finns kvar i de gamla kolvarna. Om det behövs, kombinera eller samla flugor från mer än en gammal kolv till en ny kolv för att säkerställa att det finns tillräckligt med flugor (20-30 par) per kolv.
- Håll de nya kolvarna efter en veckas exponering för vuxna flugor under lämpliga förhållanden (21 °C, 16 L: 8 D fotoperiod, 60%-80% relativ luftfuktighet [RH%]) i en miljökammare i 3 veckor för fluguppkomst.
- Utsätt värdlarver för parasitoider.
- Ta en kolv (se steg 1.2.7) som innehåller flugägg och larver efter att ha tagit bort alla vuxna flugor och den tvinnade pappershandduken från kolven.
- Vik en bit absorberande pappershandduk i hälften och lägg den i kolven som ett pupationssubstrat för parasiterade larver.
- Aspirera sex hon- och hanpar av G3 G. brasiliensis i varje kolv (figur 1). Streak ett tunt lager honung på botten av skumproppen.
- Lämna parasitoiderna i kolven i 5 dagar.
- Efter en 5-dagars exponering, avlägsna parasitoiderna och håll kolvarna under förhållanden som beskrivs ovan i en miljökammare i 35 dagar tills den förväntade getinguppkomsten.
- Samla och lagra vuxna parasitoider.
- Under den andra och tredje veckan av inkubation, kontrollera kolvarna varje vecka för tidig värduppkomst och ta bort de vuxna flugorna.
- När vuxna parasitoider börjar dyka upp, aspirera dem tre gånger per vecka och håll dem i drosophila-injektionsflaskor (t.ex. 2,5 cm x 9,5 cm) (figur 1).
- Placera en liten bit pappershandduk fuktad, men inte mättad, med destillerat vatten i botten av injektionsflaskan.
- Tillsätt ~60 parasitoider till varje injektionsflaska och märk injektionsflaskan med uppkomstdatum. Stryk ett tunt lager honung på botten av skumproppen, två gånger per vecka. Förvara injektionsflaskorna med vuxna parasitoider under de förhållanden som beskrivs ovan i miljökammaren i upp till en månad om de inte används tidigare.
- Sätt tillbaka papperet i injektionsflaskan en gång var 4-7: e dag eller byt ut pappershandduken om det finns tecken på mögel.
2. Metoder för storskalig uppfödning av G1 Ganaspis brasiliensis
- Genomföra en storskalig uppfödning av värden Drosophila suzukii.
- Bakre D. suzukii i stora, stickade nättäckta burar (t.ex. 50 cm x 50 cm x 100 cm) som var och en innehåller 1 500-2 000 sexuellt mogna vuxna flugor (könsförhållande 50:50) (figur 2).
- Förbered Standard Drosophila Medium (SDM) genom att koka alla ingredienser (6 g bakteriologisk agar, 75 g majsmjöl, 17 g näringsjäst, 15 g sackaros, 10 g sojamjöl, 10 ml propionsyra) i 1 liter destillerat vatten i 10 minuter under periodisk omrörning av blandningen för att förhindra att den brinner28.
- Låt blandningen svalna i 5 min och tillsätt 5 g askorbinsyra.
- Häll den nykokta SDM i 9 cm petriskålar och låt mediet stelna vid rumstemperatur innan du stänger plattorna.
- Stapla upp SDM Petri-diskarna, linda in stapeln med aluminiumfolie och förvara diskarna vid 4 ° C i upp till 2 veckor.
- Placera en tallrik med vattendränkt bomull och fyra till sex petriskålar med SDM (figur 2) i varje uppfödningsbur.
- Två gånger i veckan, byt ut de angripna SDM Petri-rätterna med färska.
- Placera de angripna SDM Petri-skålarna utan lock individuellt i plastmuggar (13,3 cm diameter eller 800 ml), stäng varje kopp med ett lock av finmaskigt nät (<0,5 mm) och inkubera i 12-15 dagar vid 23 °C och 75% RH (figur 2).
- Överför de nykläckta D. suzukii-vuxna från plastkopparna till uppfödningsburarna.
- Förbered värdlarver.
- Skölj blåbären i kallt vatten i 1 min och blötlägg frukterna i ett handfat fyllt med en blekmedellösning (utspädd till 5%) i 3 min.
- Töm blekmedelslösningen och fyll bassängen med kallt vatten för att skölja blåbären. Blanda försiktigt för hand i minst 30 s.
- Upprepa steg 2.2.2 med färskt vatten minst tre gånger för att avlägsna blekmedelsrester och andra leddjur (t.ex. kvalster, thrips) som kan finnas på frukten.
- Lägg frukten på en bricka med flera lager absorberande pappershanddukar och luta försiktigt brickan fram och tillbaka och rulla bären runt för att torka dem.
- Förbered flera 9 cm petriskålar (antingen de övre eller nedre halvorna, uppåt) och fyll var och en med de tvättade blåbären (15-25 frukter per tallrik beroende på fruktstorlek).
- Under sena eftermiddagstimmar utsätter du petriskålarna för sexuellt mogna vuxna flugor i värdens uppfödningsburar (se steg 2.1) och lämnar dem över natten.
- Nästa morgon, ta bort petriskålarna från värdens uppfödningsburar genom att försiktigt blåsa eller knacka på dem för att lossa flugorna på frukterna och använd den angripna frukten för uppfödning av parasitoider (se steg 2.4).
- Implementera en storskalig parasitoid uppfödning.
- Använd två typer av burar för att föda upp parasitoiden: en för parasitism och en annan för getinguppkomst.
- Se till att parasitismburen är kubisk (t.ex. 45 cm på varje sida) med en klar plastpanel på framsidan för att observera insektsaktivitet, två 18 cm ärmöppningar i frontpanelen för tillsats eller borttagning av insekter och ersättning av livsmedelsmaterial och fint polyesternät (t.ex. 96 x 26 nät) på toppen och sidorna för ventilation.
- Gör uppkomstburen mindre (t.ex. 30 cm på varje sida), med en enda hylsa som öppnas på två motsatta sidor och en klar plastpanel på framsidan för synlighet (figur 2).
- Se till att båda burtyperna har en tunn sträng som hänger under taket för att hänga upp en till flera matare (figur 2).
OBS: En matare består av en stor cylindrisk skumpropp (9 cm diameter) täckt med spridda honungsdroppar och kan placeras på burgolvet eller hängas från burtaket (figur 2). - Inom varje bur, ge vatten i en rakväggig drosophila injektionsflaska (2,5 cm x 9,5 cm) förseglad med en cellulosaacetatplugg (2,5 cm diameter) var 5-7 dagar beroende på RH. Häng injektionsflaskan upp och ner från burens tak (figur 2).
- Utsätt värdlarverna för parasitoiderna.
- Utsätt den värdinfekterade frukten i petriskålarna för G1 G. brasiliensis omedelbart efter D. suzukii-angrepp över natten (se steg 2.2.7).
- Lämna 10-15 petriskålar av infekterad frukt i parasiteringsburet som innehåller 1 500-2 000 getingar i 2-3 dagar.
- Använd plastkoppar (13,3 cm diameter eller 800 ml) med lager av absorberande papper på botten för att samla frukten som innehåller de parasiterade värdarna (figur 2).
- Placera de öppna kopparna i exklusionsburen och inkubera i minst 28 dagar vid 21 °C och 65 % RH (figur 2).
- Under den andra och tredje veckan av inkubation, kontrollera buret varje vecka för tidig värdeneklosion och ta bort de vuxna flugorna för att underlätta den successiva samlingen av parasitoider.
- Vid slutet av den fjärde veckan av inkubation, lägg till en matare och en vattenkälla till buret.
- Samla och lagra de vuxna parasitoiderna.
- När parasitoid uppkomst börjar, samla en del (10% -15%) av de vuxna och överför dem tillbaka till parasitismburet för att ersätta gamla oproduktiva individer.
- Samla och förvara de återstående parasitoiderna i plastmuggar (13,3 cm diameter eller 800 ml) (figur 3A).
- Placera ett rör (2 ml) fyllt med vatten och förseglat med en tandbomullsrulle (1 cm x 3,8 cm) längst ner på koppen (figur 3A).
- Stäng koppen med ett modifierat lock försett med en avtagbar skumpropp (3,5 cm diameter) som matarsubstrat och ett nättäckt hål för ventilation (figur 3B).
- Lägg till upp till 700 vuxna i varje kopp (könsförhållande 50:50), märk koppen med uppkomstdatum och förvara den i en miljökammare (17 ° C; 65% RH) tills den används, eller i upp till 1 månad (figur 3B).
- Skicka de vuxna parasitoiderna.
- Använd koniska rör (50 ml) för att skicka de vuxna parasitoiderna.
- Genomborra ett ventilationshål (8 mm diameter) på locket och täck det med ett finmaskigt nät (figur 3C).
- Tillsätt en matningsring av cellulosaacetat på insidan av locket (figur 3C).
- Förbered en mättad sackaroslösning med destillerat vatten, applicera några droppar på matningsringen och låt den absorbera vätskan.
- Placera en fläktformad bit absorberande pappershandduk i röret (figur 3D).
- Tillsätt ~ 200 vuxna parasitoider till varje rör och placera rören i en isolerad fraktbehållare tillsammans med ispaket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4 visar representativa resultat av den småskaliga laboratorieuppfödningen av G3 Ganaspis brasiliensis med två olika parasitoiddensiteter (sex eller 10 par) och två olika exponeringstider (5 eller 10 dagar) vid karantänanläggningen för USDA-ARS Beneficial Insects Introduction Unit (Newark, Delaware). Det fanns 14 replikat för varje kombination av parasitoiddensitet och exponeringstid. Totalt producerade de 64 kolvarna 4 018 getingar (71,7 ± 4,9 avkommor per kolv) med 49,5% ± 1,9% kvinnliga avkommor. Vid 21 °C uppstod vuxna parasitoider ungefär 30–35 dagar efter oviposition. Parasitoiddensiteten och exponeringstiden påverkade inte signifikant det totala antalet producerade avkommor per replikat (kolv) (enkelriktad ANOVA, F3,52 = 0,379, P = 0,769) och hade endast en marginell effekt på andelen kvinnliga avkommor (enkelriktad ANOVA, data logittransformerades före analysen efter behov för att stabilisera variationen, F3,52 = 2,796. P = 0,049), även om produktionseffektiviteten per capita kvinna (enkelriktad ANOVA, F3,52 = 3,576, P = 0,020) minskade vid den höga parasitoiddensiteten. Exponeringstiden på mer än 5 dagar verkade inte öka produktiviteten. Ökad parasitoiddensitet verkade inte heller öka produktiviteten. Därför verkar kombinationen av sex par och 5-dagars exponeringstider vara mest lämplig för laboratorieuppfödning.
Figur 5 visar en 6-månaders produktivitetstrend för storskalig uppfödning av G1 Ganaspis brasiliensis vid karantänanläggningen vid Edmund Mach Foundation (Trento, Italien) 2021. Uppfödningen startades med 150 tre dagar gamla, parade kvinnliga getingar som härrör från en småskalig uppfödning vid karantänlaboratoriet CABI i Delémont, Schweiz. Fler getingar från uppfödningen lades gradvis till parasitismburen tills de nådde 1 500-2 000 individer (könsförhållande 50:50) vecka 5. Beläggningen av parasitismburen bibehölls därefter på samma nivå genom att lägga till nya getingar som producerades i själva den storskaliga uppfödningen. Under hela perioden var parasitismburet försedd med nyinfekterad frukt var 2-3: e dag. Frukten (blåbär) erbjöds till G1 G. brasiliensis omedelbart efter nattens exponering för Drosophila suzukii. Parasitoidproduktionen startade 5 veckor efter den första värdexponeringen (figur 5A). Från vecka 8 till vecka 22 var parasitoidproduktionen proportionell mot mängden exponerad frukt, i genomsnitt 0,44 ± 0,03 g / parasitoid (medelvärde ± SE; Figur 5B). Totalt samlades 53 736 parasitoider, med en genomsnittlig kvinnlig avkomma på 45,9% (intervall: 32,4% -79,0%).
Figur 1: Ett flödesschema för småskalig laboratorieuppfödning av Drosophila suzukii och G3 Ganaspis brasiliensis. Den vänstra sidan visar värdflugans uppfödningsprocedurer medan den högra sidan illustrerar parasitoiduppfödningscykeln. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Ett flödesschema för storskaliga uppfödningsförfaranden för Drosophila suzukii och G1 Ganaspis brasiliensis. Den vänstra sidan visar värdflugans uppfödningsprocedurer medan den högra sidan illustrerar parasitoiduppfödningscykeln. Förkortning: SDM = standard Drosophila medium. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Containrar och rör som används för att lagra och skeppa G1 Ganaspis brasiliensis från den storskaliga uppfödningen. (A) En horisontell vy av förvaringsbehållaren som visar ett vattenrör inuti behållaren, (B) en vertikal vy av behållaren som visar ett ventilerat lock och en skumpropp, och (C) ett ventilerat lock och en bit absorberande papper för (D) transportröret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativt exempel för småskalig laboratorieuppfödning av G3 Ganaspis brasiliensis. (A) Antal producerade avkommor per kolv, (B) antal producerade avkommor per getinghona och (C) procentandel kvinnliga avkommor, under två olika parasitoiddensiteter och exponeringstider. Värdena är medelvärde ± SE, och staplar med olika bokstäver är signifikant olika (ANOVA, Tukeys HSD, P < 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Produktivitetsutvecklingen för den storskaliga uppfödningen från början till vecka 23. (A) Staplarna anger antalet G1 Ganaspis brasiliensis-avkommor som samlas in varje vecka från eclosionsburarna för att ersätta gamla individer i parasitismburen (mörkgrön) och för att lagras eller skickas (ljusgrön). Den orange linjen anger mängden värdinfekterad frukt (kg blåbär) som tillhandahålls varje vecka till parasitoiderna i parasitismburen. (B) Veckoförhållande mellan vikten av värdinfekterad frukt och antalet parasitoida avkommor som produceras 5 veckor efter exponering (dvs. gram frukt som krävs för att producera en enda vuxen parasitoid). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Långsiktig forskning och efterföljande fältutsläpp av ett biologiskt bekämpningsmedel är beroende av tillgången till effektiva och ekonomiska uppfödningstekniker. De beskrivna metoderna i denna studie har visat sig vara effektiva protokoll för både småskalig och storskalig uppfödning av Ganaspis brasiliensis. Det småskaliga uppfödningsprotokollet har utvecklats under flera år för att optimera mängden arbetskraft och minska specialutrustning som behövs för att upprätthålla parasitoid- och värdkolonierna samtidigt. Den är lämplig för att upprätthålla en koloni för laboratorieforskning eller bioassays. Liknande metoder har använts av författarna för att föda upp denna parasitoid för karantänutvärderingar av denna parasitoid. Det storskaliga uppfödningsprotokollet kommer att göra det möjligt att producera ett stort antal getingar för fältutsättning, vilket nyligen genomfördes i Italien. Dessa tekniker kan enkelt överföras till andra laboratorier, producenter eller företag för storskalig uppfödning inom en snar framtid, samt tjäna som grund för ytterligare förbättringar av metoder.
Dessa protokoll kan också användas för att föda upp Leptopilina japonica, eftersom både Ganaspis brasiliensis och L. japonica liknar varandra när det gäller deras värdhabitatpreferens 7,8, värdstadiepreferens ellerreproduktionsbiologi 15, termisk prestanda18 och födosökseffektivitet i laboratoriebioassays 13,15, samt beteendemässiga svar mot värdassocierade ledtrådar12, förutom att L. japonica verkar ha ett bredare värdområde än även G3 G. brasiliensis20. Båda parasitoiderna har fötts upp med liknande metoder som beskrivs häri. För småskalig uppfödning kan båda parasitoiderna också födas upp i drosophila-injektionsflaskor, vanligtvis genom att överföra 20 unga (1-2 dagar gamla) Drosophila suzukii-larver till en drosophila-injektionsflaska fylld med 2 cm konstgjord kost, eller placera två infekterade frukter, var och en innehållande 5-10 unga D. suzukii-larver, och utsätta dem för två parade kvinnliga getingar i 2-3 dagar, båda producerar ~ 10 avkommor per injektionsflaska 13,15,22.
Som diskuterats ovan kan G1 och G3 Ganaspis brasiliensis som används i detta protokoll skilja sig något i vissa värdsökningsbeteenden och värdspecificitet21,22. Girod et al.21 rapporterar att den japanska G1 G. brasiliensis var mer strikt specifik för Drosophila suzukii och inte verkade fungera bra i ren konstgjord kost i injektionsflaskor jämfört med dess prestanda på värdfrukt. Matsuura et al.25 rapporterade också att G1 G. brasiliensis populationer som samlats in från D. suzukii-angripna körsbär i Japan specialiserar sig på D. suzukii. Den småskaliga uppfödningsmetoden med diet blandad med blåbär utvecklades ursprungligen för uppfödning av G3 G. brasiliensis eftersom G1 G. brasiliensis inte var tillgänglig vid den tiden. Senare visade sig denna metod inte fungera bra för uppfödning av G1 G. brasiliensis (Wang et al. opublicerade data).
För småskalig uppfödning av G1 G. brasiliensis föreslås därför att värdsubstratet modifieras genom att (1) utsätta flugorna direkt för blåbär (eller annan värdfrukt) för att samla värdlarver i frukten, och (2) överföra exponerad frukt till ett standard Drosophila-odlingsmedium för larverna att utvecklas i en miljö med låg konkurrens genom att placera de angripna frukterna som innehåller värdlarverna på kosten i kolvarna för exponering för parasitoiderna. Detta gör det möjligt för de parasiterade larverna att mata på kosten, särskilt vid höga värddensiteter, och de parasiterade värdpupporna som ska samlas in från pappershandduken. Alternativt kan G1 G. brasiliensis födas upp på frukt direkt i plastbehållare (olika storlekar) genom att utsätta 5-10 kvinnliga getingar för 10-20 angripna blåbär i 4-5 dagar, vilket gav upp till 80 avkommor per behållare, beroende på värddensitet (Wang et al., opublicerade data). För denna metod rekommenderas att placera den angripna frukten på ett upphöjt metallnät ("hårdvaruduk") för att låta parasitoiderna komma åt den angripna frukten från alla håll, särskilt om för många frukter placeras i en behållare. Helst bör ett eller två lager angripen frukt placeras i varje behållare för denna uppfödningsmetod. Dessa alternativa småskaliga metoder bör också fungera bra för uppfödning av G3 G. brasiliensis.
Oavsett uppfödningsmetoder och skalor (injektionsflaska, kolv, behållare eller bur) är det viktigt att bibehålla lämplig temperatur, fuktighet samt kontrollvärd eller kvinnlig getingålder, densitet och exponeringstid för uppfödning av både G1 Gana brasilienspissis och G3 G. brasiliensis. Drosophila suzukii larver utvecklades på cirka 1 vecka under normala laboratorieförhållanden (t.ex. 22 ± 2 °C) 15. Kvinnliga G. brasiliensis föredrog att attackera yngre (1-2 dagar gamla) än äldre (3-4 dagar gamla) värdlarver, även om olika åldrar av värdlarver kunde attackeras15. Vid 22 ± 2 °C uppstod G. brasiliensis-honor med en väsentligt hög andel (~50 %) av sitt livstidskomplement av mogna ägg, och den mogna äggbelastningen nådde en topp efter 2-3 dagar15. Vuxna kvinnor överlevde ~ 20 dagar när de gav obegränsad tillgång till värdar och började oviposition inom 2 dagar efter uppkomsten, nådde en topp av oviposition inom 5-10 dagar och därefter gradvis minskade oviposition15. Därför bör unga (<10 dagar gamla) kvinnliga getingar användas i uppfödningen, men kvinnliga getingar kan återanvändas för uppfödningen när de är bristfälliga. Parasitoiden kunde lätt utvecklas vid 21-25 °C, men temperaturer under 17,2 °C tycktes utlösa en fakultativ diapaus17. Det rekommenderas därför att använda ett temperaturområde på 21-25 °C för optimal utveckling av både flugan och parasitoiden.
Vidare kommer exponeringstiden på mer än 5 dagar sannolikt inte att öka parasitoidens produktivitet. Ökad parasitoiddensitet baserad på småskalig uppfödning för G3 G. brasiliensis verkar inte öka produktiviteten, möjligen på grund av ömsesidig inblandning bland födosökande kvinnliga getingar. Sex manliga-kvinnliga par och en 5-dagars exponeringstid verkar vara en idealisk kombination för laboratorie småskalig uppfödning, även om uppfödningsmetoderna kan förbättras i framtiden genom att ytterligare optimera förhållandet mellan värd och parasitoid. En viktig dödlighetsfaktor för parasitoiden verkar vara relaterad till låg luftfuktighet, eftersom många parasitoider observerades kunna eclose med torra substratförhållanden. Att lägga till en bit absorberande pappershandduk under frukten absorberar inte bara juicer när frukten försämras, utan ger också ett substrat som kan fuktas för att öka luftfuktigheten eller ge ett valpsubstrat för flugan.
För småskalig uppfödning kan en kolv bibehålla fuktigheten bättre än en injektionsflaska eftersom den förra har en smal hals. Det konstaterades också i denna studie att färska blåbär belagda med en dammning av aktiv torrjäst hjälpte till att förhindra bildandet av mögel och förbättrade fruktens attraktion till flugorna. Andra aspekter av parasitoiduppfödningen som återstår att utforska inkluderar (1) möjligheten att odla denna parasitoid på alternativa värdar eller värdfrukter och hur alternativa värdar eller värdfrukter skulle påverka parasitoidens effektivitet, (2) faktorer som påverkar parasitoidens avkommans kondition och könsförhållande, (3) förmågan hos denna parasitoid (både G1 och G3 ) att anpassa sig till konstgjorda dietförhållanden, och (4) de genetiska eller beteendemässiga förändringar som kan uppstå med anpassning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Lukas Seehausen och Marc Kenis (CABI, Schweiz) för att de vänligen tillhandahöll G1 G. brasiliensis. Finansiering i Italien tillhandahölls av Provincia Autonoma di Trento, Trento, Italien, och i USA av National Institute of Food and Agriculture, USDA Specialty Crops Research Initiative award (#2020-5118-32140), USDA Animal and Plant Health Inspection Service (Farm Bill, fond 14-8130-0463) och USDA ARS CRIS basfonder (projekt 8010-22000-033-00D). USDA är en leverantör av lika möjligheter och arbetsgivare och stöder inte produkter som nämns i denna publikation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active dry yeast | Fleischmanns Yeast, Cincinatti, OH, USA | None | Used to cover fruit to reduce mold growth and enhance the frui attraction to the flies |
| Bacteriological agar | Merk Life Science S.r.l., Milan, Italy | A1296 - 5KG | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Bleach solution | Clorox Company, Oakland, CA, USA | None | Used to disinfect flesh fruit |
| Blue stopper | Azer Scientific, Morgantown, PA, USA | ES3837 | Used for sealing the tube while allowing ventilation for insects |
| Blueberries | Grocery Store, Newark, DE, USA | None | Provided as host fruit for the flies (various other fruit can also be used) |
| BugDorm insect rearing cage (W24.5 x D24.5 x H63.0 cm) | Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan | 4E3030 | Used for rearing parasitoids (parasitism cage) |
| BugDorm insect rearing cage (W32.5 x D32.5 x H32.5 cm) | Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan | 4E4590 | Used for rearing flies |
| BugDorm insect rearing cage (W32.5 x D32.5 x H32.5 cm) | Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan | 4E4545 | Used for rearing parasitoids (eclosion cage) |
| Chicken wire (0.64 cm, 19 gauge) | Everbilt, OH, USA | 308231EB | Used to lift up the fruit to allow maximum parasitoid oviposition |
| Cornmeal | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Dental cotton roll (1 x 3.8 cm) | Gima S.p.A., Gessate, MI, Italy | 35000 | Used for providing water to the parasitoids within the storage container |
| Drosophila diet | Frontier Scientific, Newark, DE, USA | TF1003 | Custom diet used to rear flies |
| Drosophila vial narrow, Polystirene (2.5 x 9.5 cm) | VWR International, LLC., Radnor, PA, US | 75813-160 | Used for providing water to the parasitoids within the cage |
| Drosophila vial plugs, Cellulose acetate (2.5 cm) | VWR International, LLC., Radnor, PA, US | 89168-886 | Used for providing water to the parasitoids within the cage |
| Erlenmeyer flask (250 mL) | Carolina Biological, Burlington, NC, USA | 731029 | Used for rearing flies and parasitoids |
| Falcon-style centrifuge tube (50 mL) | VWR International, LLC., Radnor, PA, US | VWRI525-0611 | Modified to ship adult parasitoids |
| Foam stopper | Jaece Industries, North Tanawanda, NY, USA | L800-C | Used for sealing the flasks while allowing ventilation for insects |
| Honey | Grocery Store, Newark, DE, USA | None | Provided as food for parasitoids |
| Identi-Plug plastic foam stopper | Fisher Scientific Company, L.L.C., Pittsburg, PA, US | 14-127-40E | Used as feeder for parasitoids and to seal the storage container |
| Industrial paper towel | Grocery Store, Newark, DE, USA | None | Provided as a pupation substrate for pupae and mitigated moisture |
| Micron mesh fabric (250 mL) | Industrial Netting, Maple Grove, MN, USA | WN0250-72 | Used to make ventilation lid for insects |
| Nutritional yeast (flakes) | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Paper coaster (10.2 cm) | Hoffmaster, WI, USA | 35NG26 | Porvided as pupation substrate for flies and parsitized pupae |
| Plastic cup (Ø 13.3 cm, 800 mL) | Berry Superfos, Taastrup, Denmark | Unipak 5134 | Modified to store adult parasitoids |
| Plastic lid (Ø 13.3 cm) | Berry Superfos, Taastrup, Denmark | PP 2830 | Modified to store adult parasitoids |
| Propionic acid | Merk Life Science S.r.l., Milan, Italy | P1386 - 1L | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Saccharose | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Soup cup with lid (475 mL) | StackMan, Vietnam | DC1648 | Used for parasitized larvae to pupate |
| Soybean flour | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| White felt washer (0.64 cm thick, 5 mm ID x 20 mm OD) | Quiklok, Lincoln, NH, US | WFW/.25 x 5 x 20 mm | Used as feeding ring for parasitoids |
References
- Asplen, M. K., et al. Invasion biology of spotted wing drosophila (Drosophila suzukii): a global perspective and future priorities. Journal of Pest Science. 88 (3), 469-494 (2015).
- Tait, G., et al. Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae): A decade of research towards a sustainable integrated pest management program. Journal of Economic Entomology. 114 (5), 1950-1974 (2021).
- Kirschbaum, D. S., Funes, C. F., Buonocore-Biancheri, M. J., Suárez, L., Ovruski, S. M. The biology and ecology of Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae). Drosophila suzukii management. Garcia, F. R. M. , Springer. Cham. 41-92 (2020).
- Wang, X. G., Lee, J. C., Daane, K. M., Buffington, M. L., Hoelmer, K. A.
- Lee, J. C., et al. Biological control of spotted-wing drosophila (Diptera: Drosophilidae): Current and pending tactics. Journal of Integreated Pest Management. 10 (1), 13 (2019).
- Wang, X. G., Lee, J. C., Daane, K. M., Hoelmer, K. A. Biological control of spotted-wing drosophila: An update on promising agents. Drosophilia suzukii management. Garcia, F. R. M. , Springer. Cham. 143-167 (2020).
- Daane, K. M., et al. First exploration of parasitoids of Drosophila suzukii in South Korea as potential classical biological agents. Journal of Pest Science. 89 (3), 823-835 (2016).
- Giorgini, M., et al. Exploration for native parasitoids of Drosophila suzukii in China reveals a diversity of parasitoid species and narrow host range of the dominant parasitoid. Journal of Pest Science. 92 (2), 509-522 (2019).
- Girod, P., et al. The parasitoid complex of D. suzukii and other fruit feeding Drosophila species in Asia. Scientific Reports. 8 (1), 11839 (2018).
- Kacsoh, B. Z., Schlenke, T. A. High hemocyte load is associated with increased resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D. melanogaster. PLoS ONE. 7 (4), 34721 (2012).
- Buffington, M. L., Forshage, M. Redescription of Ganaspis brasiliensis (Ihering, 1905), new combination (Hymenoptera: Figitidae), a natural enemy of the invasive Drosophila suzukii (Matsumura, 1931)(Diptera: Drosophilidae). Procedings of the Entomoogical Society of Washington. 118 (1), 1-13 (2016).
- Biondi, A., et al. Innate olfactory responses of Asobara japonica (Hymenoptera: Braconidae)towards fruits infested by the invasive spotted wing drosophila. Journal of Insect Behavior. 30 (5), 495-506 (2017).
- Biondi, A., Wang, X. G., Daane, K. M. Host preference of three Asian larval parasitoids to closely related Drosophila species: implications for biological control of Drosophila suzukii. Journal of Pest Science. 94 (2), 273-283 (2021).
- Girod, P., Rossignaud, L., Haye, T., Turlings, T. C. J., Kenis, M. Development of Asian parasitoids in larvae of Drosophila suzukii feeding on blueberry and artificial diet. Journal of Applied Entomology. 142 (5), 483-494 (2018).
- Wang, X. G., Nance, A. H., Jones, J. M. L., Hoelmer, K. A., Daane, K. M. Aspects of the biology and reproductive strategy of two Asian larval parasitoids evaluated for classical biological control of Drosophila suzukii. Biological Control. 121, 58-65 (2018).
- Wang, X. G., Biondi, A., Daane, K. M. Functional responses of three candidate Asian larval parasitoids evaluated for classical biological control of Drosophila suzukii. Journal of Economic Entomology. 113 (1), 73-80 (2020).
- Wang, X. G., et al. Assessment of Asobara japonica as a potential biological control agent for the spotted wing drosophila, Drosophila suzukii. Entomologia Generalis. 41, 1-12 (2021).
- Hougardy, E., Hogg, B. N., Wang, X. G., Daane, K. M. Comparison of thermal performances of two Asian larval parasitoids of Drosophila suzukii. Biological Control. 136, 104000 (2019).
- Wang, X. G., Hogg, B. N., Hougardy, E., Nance, A. H., Daane, K. M. Potential competitive outcomes among three solitary larval endoparasitoids as candidate agents for classical biological control of Drosophila suzukii. Biological Control. 130, 18-26 (2019).
- Daane, K. M., Biondi, A., Wang, X. G., Hogg, B. A. Potential host ranges of three Asian larval parasitoids of Drosophila suzukii. Journal of Pest Science. 94 (4), 1171-1182 (2021).
- Girod, P., et al. Host specificity of Asian parasitoids for potential classical biological control of Drosophila suzukii. Journal of Pest Science. 91 (4), 1241-1250 (2018).
- Seehausen, M. L., et al. Evidence for a cryptic parasitoid species reveals its suitability as a biological control agent. Scientific Reports. 10 (1), 19096 (2020).
- Nomano, F. Y., et al. Genetic differentiation of Ganaspis brasiliensis (Hymenoptera: Figitidae) from East and Southeast Asia. Applied Entomology and Zoology. 52 (3), 429-437 (2017).
- Kasuya, N., Mitsui, H., Ideo, S., Watada, M., Kimura, M. T. Ecological, morphological and molecular studies on Ganaspis individuals (Hymenoptera: Figitidae) attacking Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae). Applied Entomology and Zoology. 48 (1), 87-92 (2013).
- Matsuura, A., Mitsui, H., Kimura, M. T. A preliminary study on distributions and oviposition sites of Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae) and its parasitoids on wild cherry tree in Tokyo, central Japan. Applied Entomology and Zoology. 53 (1), 47-53 (2018).
- Abram, P. K., et al. New records of Leptopilina, Ganaspis, and Asobara species associated with Drosophila suzukii in North America, including detections of L. japonica and G. brasiliensis. Journal of Hymenoptera Research. 78, 1-17 (2020).
- Puppato, S., Grassi, A., Pedrazzoli, F., De Cristofaro, A., Ioriatti, C. First report of Leptopilina japonica in Europe. Insects. 11 (9), 611 (2020).
- Dalton, D. T., et al. Laboratory survival of Drosophila suzukii under simulated winter conditions of the Pacific Northwest and seasonal field trapping in five primary regions of small and stone fruit production in the United States. Pest Managagement Science. 67 (11), 1368-1374 (2011).
