Method Article

骨類似体の生成のための細胞内懸濁液中のセラミック全方向性バイオプリンティング

DOI:

10.3791/63943

⸱

August 8th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1School of Materials Science and Engineering, University of New South Wales, 2School of Chemistry, Australian Centre for NanoMedicine, University of New South Wales, 3School of Biomedical Engineering, University of Sydney

In This Article

Summary

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このプロトコルは、ゼラチンベースの顆粒支持体にリン酸カルシウムインクを堆積させることによって骨様構造を作製する3D印刷技術を説明する。印刷された骨類似体は自由形態で寄託され、多相構築物用の生細胞マトリックス内で印刷物を直接採取したり架橋したりするための柔軟性を備えています。

Abstract

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構造的には、骨組織は、階層的で高度に石灰化されたマトリックス内に埋め込まれた代謝活性細胞を含む無機-有機複合体です。この組織は、骨の不均一な環境のために複製することは困難です。細胞懸濁液中のセラミック全方向性バイオプリンティング(COBICS)は、骨のミネラルおよび細胞構造を独自に複製するミクロゲルベースのバイオプリンティング技術である。COBICSは、骨模倣コンストラクトの積層造形における最大の課題の2つである犠牲サポート材料や過酷な後処理ステップ(放射線や高温焼結など)を必要とせずに、複雑で生物学的に関連するコンストラクトを印刷します。この技術は、ゼラチンベースのミクロゲル懸濁液内の新規リン酸カルシウムベースのインクの自由形状押出によって可能になります。懸濁液の降伏応力特性は、沈着を可能にし、印刷された骨構造を支持する。UV架橋とナノ沈殿は、それを所定の位置に「ロック」します。細胞を含んだ生体材料内にナノ構造の骨模倣セラミックを印刷する機能は、マクロおよびミクロアーキテクチャの時空間制御を提供し、臨床現場での複雑な骨構造のリアルタイム製造を容易にします。

Introduction

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骨は、内因性の治癒能力が損なわれる重大な欠陥サイズまで、正常な細胞組成、配向、および機械的強度を再現することによって治癒できる体内で数少ない構造の1つとして、顕著な再生能力を持っています1。骨は、軟骨や靭帯とともに、体の動きをサポートおよび促進すると同時に、ミネラルや脂肪を貯蔵し、血球を生成します。硬くて緻密な結合組織として、骨は主に無機相、水、およびコラーゲン線維を主成分とする有機材料で構成されています2。細胞は、コラーゲンI繊維とハイドロキシアパタイト(HA)結晶のこの高度にミネラル化されたマトリックス内に埋め込まれ、階層構造を形成します3。

この組織の複雑な構成は、不均一な骨のマイクロおよびナノ環境を再現するための合成代替物の製造を非常に困難にします3。この目的のために、バイオセラミックス、細胞を含んだヒドロゲル、合成材料など、さまざまな材料が骨マトリックスを作成するためのソリューションとして提案されています。足場製造技術の中で、3D印刷ベースの技術が最近登場し、患者固有の治療の大きな可能性を備えた高度に洗練された精密な構造の製造を可能にする優れた能力により、組織工学コミュニティから多くの注目を集めています4,5,6

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Protocol

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1. 骨墨加工

  1. リン酸α-三カルシウムの合成
    1. リン酸水素カルシウム(CaHPO4)と炭酸カルシウム(CaCO3)粉末を3:2のCa:Pモル比で計量します。スパチュラを使用して、2つの粉末を完全に均質化します。
    2. リン酸水素カルシウム-炭酸カルシウム粉末混合物をジルコニアるつぼに、75%以下になるように加えます。
      注意: 汚染を避けるために、新しいるつぼまたは以前に同じ材料を作るために使用したるつぼを使用してください。きれいにするには、100%エタノールですすぎ、完全に乾くまでヒュームフードで風乾してから、粉末を加えます。
    3. るつぼを炉に移します。5°C/分の速度で1,400°Cまで加熱し、3時間保持します。
    4. るつぼを炉から取り出して反応を急冷し、耐火物ブロックの上に置いておきます。取り扱う前に完全に冷ましてください。
      注意: 適切な長さのるつぼトングを使用し、適切な熱保護を確保してください。
    5. 乳鉢と乳棒を使用して、得られた顆粒の最大サイズが200μmになるようにα-TCPケーキを破って粉砕します。
      注意: 正しい粒子サイズを確保するために、標準のステンレス鋼ふるいを使用してください。
    6. さらに遊星ミルを用いて顆粒を2段階で粉砕する。まず、3 mmのイットリア安定化ジルコニアボールを8:1のボール:粉末....

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Results

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COBICSは、骨模倣コンストラクトの積層造形における最大の課題の2つである犠牲サポート材料や過酷な後処理ステップ(放射線や高温焼結など)を必要とせずに、複雑で生物学的に関連するコンストラクトをプリントします。複雑な骨構造のCOBICS形成とミクロゲル懸濁液中の細胞のコプリンティングを実証するために、骨インクで作られた骨様複合材料の代表的な画像を撮影し、COBICにおけるADSC生存率を最大7日間半定量的に分析しました。 図4 は、非ニュートン流体として振る舞い、高せん断応力下で粘性流体のように流れ始める固体として応答するゼラチンミクロゲルからなる支持浴に骨インクを堆積させることによって、複雑な骨様構造を作製する能力を示しています。次いで、印刷された構築物を粘性浴から単離することができる(図4A、B)。

図4の骨模倣構造を実現するために使用されるプリンタは、カスタマイズさ.......

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Discussion

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3D印刷技術COBICSは、生細胞を含む架橋可能なミクロゲル懸濁液への押し出しによる石灰化骨様構造の製造を可能にするために開発されました。この技術は、分解性ミクロゲル懸濁液に適用されており、細胞は、系11内で良好な生存率、拡散性、および骨形成分化能を示す。この手法を使用して作成されたコンストラクトの成功の重要な決定要因は、α-TCPベースのボーンインクの適切な合成です。第一に、α-TCPの形成は、適切な温度制御に大きく依存しています。リン酸三カルシウムの正しい相を形成するためには、反応が相境界を越えてβ-TCP相場14に入る前に、1,400〜1,200°Cの範囲内で反応をクエンチすることが重要です。X線回折分析は、単相α-TCP組成を確認するために使用することができる。その後、すべてのボーンインク前駆体を正しい比率で混合することは、押出印刷、硬化時間、およびナノ微細構造形成に最適な流動特性を備えたボーンインクの形成に不可欠です。GelMAミクロゲル懸濁液は、光架橋を介して印刷された構造の「ロック」を可能にするため、前駆体材料の比率を調整して、.......

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Disclosures

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著者は、開示する利益相反がないことを宣言します。

Acknowledgements

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著者らは、国立保健医療研究評議会(助成金番号GNT1111694およびGNT1141602)およびオーストラリア研究評議会(助成金番号FT180100417、FL150100060、およびCE14100036)に感謝したいと思います。著者らは、ニューサウスウェールズ大学の生物医学画像施設に感謝したいと思います。図は Biorender.com、Adobe Photoshop、Adobe Illustratorで作成され、有料サブスクリプションでエクスポートされています。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3Dプリンター押出機Hyrel3DEMO-25
50 mL遠心分離管ファルコンBDAA352070
無水エタノール 100%変性化学供給
アセトン化学供給154871
アルミナるつぼクアー
リン酸二塩基性アンモニウム (NaHPO4)シグマA5764
Autodesk Fusion 360オートデスク
バイオセーフティキャビネット レベル 2
炭酸カルシウムグマ239216
リン酸水素カルシウム (CaHPO4)シグマC7263
細胞培養フラスココーニングさまざまな使用容量
セルロース透析チューブ、14 kDaカットオフシグマD9777遠心
分離機エッペンドルフ5430R
遠心分離機シグマ3-16KL
分注チップ、23 Gノードソン7018302
DMEM、低グルコース、ピルビン酸サーモフィッシャー11885084
DPBS、カルシウム、マグネシウムサーモフィッシャーなし
エレベーター炉Labec
エンジン HR マルチヘッドプリンターHyrel3D
ウシ胎児血清ボボゲン
ゼラチンA型、豚皮からシグマG2500
汎用ステンレス鋼 ヒントノードソンEF
グリセロールシグマG9012
ヒト脂肪由来幹細胞ATCCPCS-500-011
LSM 800 共焦点顕微鏡ZEISS
凍結乾燥機 (Alpha 1-4 LDplus)Christ101541
磁気ホットプレートと攪拌機
無水メタクリSigma 276685
Mini 2 デスクトップ 3D プリンターLulzBot
パラフィルムシーリングフィルムフィルムPM996
ペニシリン-ストレプトマイシンサーモフィッシャー15140122
遊星ボールミル
遊星ボールミルジャー
ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートTween-80シグマP6224
スキャン電子顕微鏡FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM
科学 Kimwipes デリケートなタスクワイパーKimtech18813156
ステンレス鋼 標準試験ふるい
ひまわり油コミュニティ Co
トリプシン-EDTA 0.25% フェノールレッドサーモフィッシャー25200056
ZEN顕微鏡ソフトウェアZEISS
哺乳類細胞用生死生存率/細胞毒性キット InvitrogenL3224
DMEM、低グルコース、フェノール不Thermo Fisher11054020
ズ シ14190144ル パラ使用

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bates, P., Ramachandran, M. Bone injury, healing and grafting. Basic Orthopaedic Sciences. The Stanmore Guide. , CRC Press. Boca Raton, FL. 123-134 (2007).
  2. Lin, X., et al. The bone extracellular matrix in bone formation and regeneration. Frontiers in Pharmacology. 11, 757(2020).
    3. <....

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