Summary
Denne protokol beskriver en 3D-printteknik til fremstilling af knoglelignende strukturer ved at deponere et calciumphosphatblæk i en gelatinebaseret granulær støtte. Trykte knogleanaloger deponeres i fri form med fleksibilitet til direkte høst af udskriften eller tværbinding i en levende cellematrix til multifasiske konstruktioner.
Abstract
Strukturelt er knoglevæv en uorganisk-organisk sammensætning indeholdende metabolisk aktive celler indlejret i en hierarkisk, stærkt mineraliseret matrix. Denne organisation er udfordrende at replikere på grund af det heterogene miljø af knogler. Keramisk omnidirektionel bioprint i cellesuspensioner (COBICS) er en mikrogelbaseret bioprintteknik, der unikt replikerer knoglens mineralske og cellulære struktur. COBICS printer komplekse, biologisk relevante konstruktioner uden behov for offerstøttematerialer eller barske efterbehandlingstrin (f.eks. stråling og sintring ved høj temperatur), som er to af de største udfordringer i additiv fremstilling af knoglemimetiske konstruktioner. Denne teknik muliggøres via fri ekstrudering af en ny calciumphosphatbaseret blæk i en gelatinebaseret mikrogelsuspension. Suspensionens udbytte-stressegenskaber tillader aflejring og understøtter den trykte knoglestruktur. UV-tværbinding og nanonedbør "låser" den derefter på plads. Evnen til at udskrive nanostruktureret knoglemimetisk keramik inden for cellebelastede biomaterialer giver rumlig tidsmæssig kontrol over makro- og mikroarkitektur og letter realtidsfremstilling af komplekse knoglekonstruktioner i kliniske omgivelser.
Introduction
Knogle har bemærkelsesværdige regenereringsevner som en af de få strukturer i kroppen, der kan helbrede ved at genskabe sin normale cellulære sammensætning, orientering og mekaniske styrke indtil en kritisk defektstørrelse, når endogen helingskapacitet er kompromitteret1. Knogler, sammen med brusk og ledbånd, understøtter og letter kroppens bevægelse, samtidig med at de lagrer mineraler og fedtstoffer og producerer blodlegemer. Som et hårdt, tæt bindevæv består knoglen hovedsageligt af en uorganisk fase, vand og organisk materiale, der primært består af kollagenfibre2. Celler er indlejret i denne stærkt mineraliserede matrix af kollagen I fibre og hydroxyapatit (HA) krystaller, der danner en hierarkisk struktur3.
Den komplekse organisering af dette væv gør fremstillingen af syntetiske alternativer til at replikere de heterogene knoglemikro- og nanomiljøer usædvanligt udfordrende3. Til dette formål er en række forskellige materialer, herunder biokeramik, cellebelastede hydrogeler og syntetiske materialer blevet foreslået som løsninger til at skabe knoglematricer. Blandt stilladsfremstillingsteknikkerne er 3D-printbaserede teknikker for nylig opstået og modtaget meget opmærksomhed fra vævsingeniørsamfundet på grund af deres bemærkelsesværdige evne til at tillade fremstilling af meget sofistikerede og præcise strukturer med stort løfte om patientspecifik behandling 4,5,6 . Hydrogeler har været det mest populære valg af matrixefterligninger og bioblæk, da de kan udskrives sammen med celler og bioaktive molekyler, hvilket genererer funktionelle konstruktioner6. Imidlertid mangler hydrogeler de funktionelle egenskaber af knogler, såsom mekanisk styrke og en stærkt forkalket, uorganisk fase indeholdende metabolisk aktive celler.
3D-printede keramiske stilladser kræver typisk efterbehandlingstrin, herunder sintring, højtemperaturbehandlinger eller brug af skrappe kemikalier, der skal vaskes grundigt inden in vitro - eller in vivo-applikationer 5. For at løse disse begrænsninger udviklede Lode et al.7 for nylig en α-tricalciumphosphatbaseret pasta dannet af hydroxyapatit, som kan udskrives og indstilles under fysiologiske forhold. Dette materiale kan dog stadig ikke udskrives sammen med levende celler, da det kræver efterbehandling i et fugtigt miljø og efterfølgende nedsænkning i vandig opløsning i lang tid.
Alternativt er cellebelastede hydrogeler med inkorporerede uorganiske partikler blevet foreslået som erstatning for 3D-knoglematrix 8,9. På trods af deres store evne til at understøtte cellelevedygtighed er de ikke i stand til at rekapitulere det tæt mineraliserede knoglevævsmiljø. Thrivikarman et al.10 vedtog en biomimetisk tilgang, hvor et overmættet calcium- og fosfatmedium blev anvendt med en ikke-kollagen proteinanalog for bedre at efterligne nanoskala apatitaflejring. Imidlertid kan deres konstruktioner stadig ikke generere stive 3D-konstruktioner med mikro- og makroskalaarkitektur, der ligner knogle.
Denne undersøgelse adresserer disse mangler gennem udvikling af en trykstrategi til fremstilling af knoglelignende konstruktioner i uorganiske og organiske faser, der er i stand til at integrere både celler og vækstfaktorer11. COBICS rekapitulerer entydigt knoglens mineralske og cellulære struktur ved hjælp af en mikrogelbaseret bioprintteknik. Protokollen heri beskriver processen med at syntetisere de keramiske knogleblæk og gelatinebaserede mikrogeler og derefter kombinere celler, der muliggør COBICS. Processen begynder med syntesen af knogleblækkets vigtigste forløbermateriale. Den tværbundne hydrogel syntetiseres derefter og formes til mikrogeler. Endelig deponeres knogleblækket omnidirektionelt i et støttebad af mikrogelerne belæsset med celler (figur 1).
Knogleblækket kan trykkes i enhver suspension af mikrogeler, der har de passende udbytte-stressegenskaber, det vil sige evnen til at fluidisere ved en bestemt forskydningshastighed og efterfølgende understøtte den deponerede struktur. Der er påvist to fleksible tilgange: en suspension bestående af gelatinemikrogeler og en suspension bestående af gelatinemethacrylatmikrogeler. Den førstnævnte suspension opløses, når temperaturen hæves til 37 °C, den frie form reversible indlejring af suspenderede hydrogeler (FRESH) teknik12, mens sidstnævnte kan fototværbindes efter udskrivning, hvilket effektivt "syr" mikrogelerne sammen og låser den trykte knogleblæk på plads. Dette studie fokuserer på at bruge GelMA som matrix, da det giver den unikke fordel at kunne understøtte cellevækst med in situ-print af komplekse knoglemimetiske strukturer. I sidste ende muliggør denne tilgang generering af komplekse vævsmodeller med høje niveauer af biomimetik og brede konsekvenser for sygdomsmodellering, lægemiddelopdagelse og regenerativ teknik.
Figur 1: Skematisk over arbejdsgangen . (A) Knogleblækket syntetiseres fra α-tricalciumphosphatsyntese og dets efterfølgende kombination med glycerol, polysorbat 80 og ammoniumphosphatdibasisk. (B) GelMA-mikrogeler fremstilles ved vand-i-olie-emulsionsmetoden. De opnåede mikrogeler hydreres derefter (C) og (D) kombineres med celler. Celle-mikrogelkompositter anvendes derefter som et granulært bad, hvor knogleblækket deponeres. (E) Hele konstruktionen UV-tværbindes derefter og overføres til inkubatoren til kultur. Forkortelser: α-TCP = α-tricalciumphosphat; GelMA = gelatine methacrylat. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af knogleblæk
- Syntese af α-tricalciumphosphat
- Calciumhydrogenphosphat (CaHPO4) og calciumcarbonat (CaCO 3) pulvere afvejes i et molforhold på3: 2 Ca: P. Brug en spatel til at homogenisere de to pulvere grundigt.
- Blandingen af calciumhydrogenphosphat-calciumcarbonatpulver tilsættes til en zirkonia-digel, således at den ikke er mere end 75% fuld.
BEMÆRK: For at undgå kontaminering skal du bruge en ny digel eller en digel, der tidligere blev brugt til at fremstille det samme materiale. For at rengøre, skyl med 100% ethanol og lufttør i en stinkhætte, indtil den er helt tør, før pulverne tilsættes. - Overfør diglen til en ovn. Der opvarmes til 1.400 °C med en hastighed på 5 °C/min., og den holdes i 3 timer.
- Sluk reaktionen ved at fjerne digelen fra ovnen og lad den stå oven på en ildfast blok. Lad det køle helt af inden håndtering.
BEMÆRK: Brug digeltænger af en passende længde og sørg for tilstrækkelig varmebeskyttelse. - Brug en mørtel og støderen til at bryde og male α-TCP-kagen, så de resulterende granulater har en maksimal størrelse på 200 μm.
BEMÆRK: Brug en standard sigte i rustfrit stål for at sikre korrekt partikelstørrelse. - Slib granulerne yderligere ved hjælp af en planetmølle i to faser. Først tilsættes 3 mm yttriumstabiliserede zirconiakugler i et vægtforhold på 8:1 kugler:pulver, derefter 100% ethanol i et vægtforhold på 3:1 ethanol:pulver. Fastgør låget og slib i 2 timer ved 180 o / min.
- Opsaml suspensionen og adskil kuglerne ved hjælp af 100% ethanol til vask.
- Suspensionen tørres i en ovn ved 120 °C i 24 timer.
- Tilsæt det tørrede pulver til fræseglas med 1 mm zirconiakugler og 100% ethanol i samme vægtforhold som i første trin. Slib i 2 timer ved 180 o / min, adskil og tør.
BEMÆRK: Hele synteseproceduren er vist i figur 1A.
- Formulering af knogleblæk
- For at fremstille knogleblækket tilsættes 2 g α-TCP-pulver til en kuglemølleglas, der indeholder 630 μL glycerol og 130 μL polysorbat 80, mens der kontinuerligt omrøres med en spatel.
- Der tilsættes 100 mg ammoniumphosphatdibasisk ((NH 4)2HPO4, APD) og omrøres for at kombinere.
BEMÆRK: Overdreven rest af flydende faser, der er tilbage på spatelen, vil resultere i en forholdsubalance mellem blækkomponenterne og dermed indstillingens kinetik. - Tilsæt en 25 mm zirkoniakugle, fastgør låget, og placer det inde i en planetmølle i 60 minutter ved 180 o / min, og hold pause halvvejs for at skrabe siderne af krukken ned med en spatel.
- Brug en spatel til at lægge blækket i en 1 ml sprøjte. Pak tilstrækkeligt ind for at undgå kontakt med fugt. Opbevares ved -20 °C, hvis det ikke anvendes med det samme.
- Karakterisering af knogle-blæk mikrostruktur
- Udskriv knogleblækket i deioniseret vand og lad det indstille i 5 min.
- Vask prøven 3x med 100% ethanol og lad den tørre helt.
- Frakke med et tyndt lag (15 nm tykkelse) guld.
- Optag mikrografer ved hjælp af et feltemissionsscanningselektronmikroskop ved en accelerationsspænding på 5 kV.
2. Fremstilling af mikrogelsuspensioner til trykning
- Syntese af GelMA
BEMÆRK: Denne procedure er testet for batchstørrelser bestående af 10 g og 20 g gelatine. Denne metode beskriver målinger for en batch ved hjælp af 10 g.- Lav en 10% w / w opløsning af gelatine type A (svin, blomstringsstyrke 300) i 1x fosfatbufret saltvand (PBS) ved at veje 10 g gelatine og tilsætte det til en konisk kolbe med 90 ml PBS. Der opvarmes til 50 °C under omrøring, indtil gelatinen er helt opløst.
- Tilsæt 5.796 ml methacrylsyreanhydrid. Anbring en gummihætte på den koniske kolbe og omrør videre i mørke ved 50 °C i 90 minutter.
FORSIGTIG: Methacrylsyreanhydrid er giftigt ved indånding eller indtagelse og er hud- og øjenirriterende. Håndter kun inde i en stinkhætte, og brug passende PPE. - Reaktionen slukkes ved at fortynde den koniske kolbes indhold dobbelt med PBS.
- Dekanter i 50 ml rør og centrifuger ved 3.000 × g ved stuetemperatur i 3 minutter for at fjerne ureageret methacrylsyreanhydrid.
- Supernatanten dialyseres i 14 kDa afskårne cellulosedialyserør mod deioniseret vand ved 40 °C i 5 dage under forsigtig omrøring. Udskift det deioniserede vand hver dag.
- Forbered opbevaring ved at dekantere i 50 ml rør, fastgør hætten og sæt den i køleskabet i 12 timer. Opbevares i køleskab i op til 7 dage.
- Fryses med flydende nitrogen og frysetørres straks i 5 dage ved -54 °C og 0,4 mbar.
BEMÆRK: Sørg for, at rørene ikke indeholder mere end 40 ml væske ved frysning. Når hætten er frosset, skal du udskifte den med en belægning, der tillader gasudveksling, såsom en delikat opgaveserviet, der er sikret med et elastikbånd. - Opbevar det resulterende skum i en fryser ved -20 °C, indtil det kræves til mikrogelsuspensionssyntese.
- Syntese af GelMA mikrogeler
BEMÆRK: Mikrogelerne syntetiseres ved hjælp af en vand-i-olie-emulsionsmetode13 (figur 2). Denne metode er testet for GelMA-opløsningsvolumener på 1-10 ml. Den samme protokol kan bruges til at syntetisere gelatinemikrogeler, der bruges til at udskrive selvstændige knogleaftryk.- Lav en 10% w/w GelMA-opløsning i PBS ved at veje den frysetørrede GelMA, tilsætte den til et rør med PBS og opvarme den i et vandbad ved 50 °C, indtil den er fuldt hydreret.
- Der tilsættes 37 ml olie pr. 1 ml GelMA-opløsning til et bægerglas, hvilket sikrer, at det ikke er mere end 65 % fyldt.
- Et dobbeltbægersystem anbringes på en kogeplade med magnetisk omrøring ved at anbringe bægerglasset med olie i et større bægerglas.
BEMÆRK: Størrelsen på de to bægre skal være sådan, at is let kan tabes i rummet mellem deres vægge. Opsætningen er vist i figur 2. - Varm op til 40 °C under omrøring.
BEMÆRK: Sørg for, at hvirvelstrømmen ikke er turbulent og har en dybde på ca. 1/3 af oliens højde i bægeret. - GelMA-opløsningen lægges i en sprøjte, og der tilsættes den dråbevis i omrøringsolien gennem et filter på 0,45 μm. Lad emulsionen balancere i 10 min.
- Emulsionens temperatur reduceres til 15 °C for termisk at stabilisere kuglerne ved at tilsætte knust is i rummet mellem de to bægre.
- Tilsæt acetone til spindeemulsionen i et volumenforhold på 1:11 GelMA-opløsning til acetone.
BEMÆRK: Tilsæt acetonen forsigtigt gennem en tragt for at undgå at forstyrre emulsionen. Rør i 60 min. - Bægerglassets indhold dekanteres i 50 ml rør, og sørg for at vaske bægerglassets vægge med acetone. Lad stå i 20 minutter for at lade de dehydrerede mikrogeler sætte sig til bunden.
- Kassér supernatanten og vask mindst 2x med acetone.
BEMÆRK: Supernatanten skal være klar. - Konsolider i et rør, fyld op med acetone og sonikat i 10 s. Vask 2x med acetone.
- Opbevares i acetone ved stuetemperatur, indtil det er nødvendigt til udskrivning.
- Klargøring af GelMA microgel suspension til udskrivning
- Forbered en 1% w/w opløsning af GelMA i Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) ved at veje frysetørret GelMA i et rør, tilsætte DMEM og opvarme i et vandbad ved 50 °C, indtil det er fuldt hydreret.
- Acetonen inddampes fra de dehydrerede mikrogeler og vejer det resulterende pulver i et rør. Tilsæt acetone og overfør til et sterilt miljø.
- For at danne mikrogelsuspensionen inddampes acetonen og tilsættes DMEM, 1% w/w GelMA-opløsning i DMEM og 2,5% w/w lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat (LAP)-initiatoropløsning for at opnå en slutpakningsfraktion på 30%. Lad det hydrere helt i mindst 12 timer ved stuetemperatur. Opbevares i køleskab i op til 7 dage. Lad det komme op til stuetemperatur før brug.
BEMÆRK: Volumenerne af disse reagenser er baseret på mikrogelernes tørvægt og kan beregnes ved hjælp af ligningerne i tabel 1.
| Ligning | |
| x = vægt af tørre mikrogeler (mg) | |
| Volumen på 1% w/w GelMA i DMEM, a (μL) | a = 21,93x |
| Mængde af DMEM, b (μL) | b = 8,773x |
| Volumen på 2,5 % w/w LAP-opløsning, c (μL) | c = 0,6267x |
| Samlet volumen produceret mikrogelsuspension (μL) | a + b + c |
Tabel 1: Ligninger til beregning af de mængder reagenser, der kræves for at hydrere GelMA-mikrogelsuspensionerne. Forkortelser: GelMA = gelatinemethacrylat; LAP = lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat.
Figur 2: Skematisk oversigt over olieemulsionsmetoden anvendt til mikrogelsyntese. Opsætningen med dobbelt bægerglas viser et bægerglas indeholdende omrøringsemulsionen (angivet med pil) anbragt inde i et større bægerglas for at muliggøre afkøling. Forkortelse: GelMA = gelatine methacrylat Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Udskrivning af knogleblæk i cellesuspensioner
BEMÆRK: Gelatinebaserede mikrogeler understøtter vedhæftningen af mange forskellige celletyper, hvilket gør denne tilgang modtagelig for enkelt- og flere celler i mikrogelmatrixen. Denne protokol beskriver proceduren for anvendelse af fedtafledte mesenkymale stamceller (ADSC'er), da dette er en populær og robust celletype til muskuloskeletal vævsteknik.
- Dyrkning af ADSC'erne i DMEM med lavt glukoseindhold suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin ved 37 °C og 5% CO2 , indtil det er sammenflydende.
- ADSC'erne fjernes fra vævsdyrkningskolben ved at fjerne mediet, vaskes med sterilt PBS og inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2 med 0,25 % trypsin i 3 min.
- Pillecellerne centrifugeres ved 150 × g ved stuetemperatur i 5 min.
- Tæl cellerne og beregn 5 × 105 celler for hver 1 ml GelMA mikrogel. Alloker det krævede volumen cellesuspension til et separat rør og pellet som ovenfor.
- Så meget supernatant som muligt fjernes forsigtigt med en pipette, idet der kun er cellepillen tilbage. Tilsæt det nødvendige volumen mikrogelsuspension til pelleten og aspirer forsigtigt for at sikre jævn cellefordeling.
BEMÆRK: Hvis der er overskydende luftbobler i suspensionen, centrifugeres forsigtigt for at fjerne og pipetteres op og ned for at omfordele cellerne. - Den cellebelastede mikrogelsuspension fyldes i en reaktor ved hjælp af en pipette.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev 10 mm x 10 mm x 3 mm reaktorer med en volumenkapacitet på 100 μL 3D-printet. - Knogleblæk deponeres med en 1 ml sprøjte forsynet med en 23 G kanyle.
BEMÆRK: Dette kan gøres med en 3D-printer enten ved at eftermontere et ekstruderingssystem, der tillader udskrivning direkte fra 1 ml sprøjten eller ved at lægge knogleblækket direkte i printerens ekstruderingspatron (figur 3). - Crosslink den celle- og knogleblækbelastede GelMA-mikrogelkonstruktion med en UV-crosslinkerlampe (405 nm) til 90 s. Overfør straks til en passende størrelse brøndplade og dæksel med komplet DMEM.
BEMÆRK: De førnævnte 3D-printede reaktorer passer ind i 24-brønds cellekulturplader. - Der inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2. Udskift kulturmediet efter 24 timer, derefter hver 48-72 timer efter behov.
Figur 3: Skematisk repræsentation af COBICS-proceduren, der viser hydrering af mikrogeler, inkorporering af celler og efterfølgende udskrivning af knogleblæk i den cellebelastede mikrogelsuspension. Forkortelse: COBICS = keramisk omnidirektionel bioprinting i cellesuspensioner; GelMA = gelatinemethacrylat. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Vurdering af cellers levedygtighed og spredning
- For at vurdere knogleblækcytotoksicitet skal du holde cellebelastede COBIC-konstruktioner i komplet dyrkningsmedium. Udfør en Live Dead-analyse ved 24 timer, 72 timer og 120 timer (eller relevante tidspunkter).
- På hvert tidspunkt vaskes konstruktionerne med PBS, og der tilsættes derefter en opløsning af phenolfrit DMEM indeholdende 4 mM calcein og 2 mM ethidiumbromid. Der inkuberes i 1 time ved 37 °C og 5 % CO2.
- Der vaskes med PBS og overføres til en skål med glasbund til billeddannelse med et konfokalmikroskop ved Ex/Em-spektre på 494/517 nm og 528/617 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
COBICS printer komplekse, biologisk relevante konstruktioner uden behov for offerstøttematerialer eller barske efterbehandlingstrin (f.eks. stråling og sintring ved høj temperatur), som er to af de største udfordringer i additiv fremstilling af knoglemimetiske konstruktioner. For at demonstrere COBIC-dannelse af komplekse knoglestrukturer og co-print af celler i mikrogelsuspensioner blev der taget repræsentative billeder af knoglelignende kompositter fremstillet af knogleblækket, og en semikvantitativ analyse af ADSC-levedygtighed i COBICS i op til 7 dage blev udført. Figur 4 viser evnen til at fremstille komplekse knoglelignende strukturer ved aflejring af knogleblæk i støttebadet sammensat af gelatinemikrogeler, der opfører sig som en ikke-newtonsk væske, der reagerer som et fast stof, der begynder at strømme som en viskøs væske under høj forskydningsspænding. De trykte konstruktioner kan derefter isoleres fra det tyktflydende bad (figur 4A, B).
Printeren, der bruges til at realisere de knogleefterlignende konstruktioner i figur 4 , er en multiheadprinter udstyret med en tilpasset ekstruder. En milliliter knogleblæk blev lagt i en 3 ml tryksprøjte, som blev monteret i ekstruderen. Alle de anvendte nåle havde en indvendig diameter på 0,2-0,8 mm. Computermodeller af de knogleefterlignede strukturer blev oprettet ved hjælp af en CAD-modelleringssoftware og konverteret til STL-filer, hvorefter G-koden blev genereret. Konstruktionerne blev trykt i 96-brønds cellekulturplader indeholdende gelatinemikrogeler og komplet medium ved hjælp af en 0,2 mm nål. Efter udskrivning fik konstruktionerne lov til at sætte sig inde i støttebadene i 6 minutter, før de blev fjernet med pincet.
Gelatinemikrogeler er blevet krydsbundet med glutaraldehyd for at muliggøre deres dyrkning under de fysiologiske betingelser på 37 °C og 5% CO2 sammen med celler11. I denne undersøgelse blev systemet implementeret ved fremstilling af GelMA-mikrogeler, hvilket gjorde det muligt for hele konstruktionen at være UV-tværbundet (figur 4C) for termisk stabilitet og frysetørret til langtidsopbevaring og transport (figur 4D, E). Frysetørrede prøver kan rehydreres i destilleret vand, PBS eller cellekulturmedium for at genvinde deres oprindelige struktur (figur 4E). Knogleblækket blev analyseret ved scanning elektronmikroskopi (SEM) for at bestemme dets mikrostruktur (figur 4F), som viste dannelsen af hydroxyapatitkrystal efter blækindstilling, især synlig i tør tilstand (figur 4Fii).
I dette studie blev cellerne blandet med GelMA-mikrogeler og opbevaret i kultur i op til 5 dage, enten kun i mikrogelsuspension (figur 5A) eller i COBIC-systemet, som beskrevet i protokolafsnit 3. Cellerne viste god levedygtighed i nærværelse af knogleblækket, både på dag 1 og dag 5, hvilket bekræftede, at blækets udvaskningsprodukter ikke var skadelige for cellerne (figur 5B). Udskrivning af nanostruktureret knoglemimetisk keramik inden for cellebelastede biomaterialer giver spatiotemporal kontrol over makro- og mikroarkitektur, hvilket letter realtidsfremstilling af komplekse knoglekonstruktioner i kliniske omgivelser.
Figur 4: Eksempel på 3D-printede konstruktioner printet af COBICS. (A) Menneskelig osseøs labyrint; (B) spiralformet Harversian kanal. (C) Billeder af knogleblæk trykt i GelMA-mikrogeler; D) frysetørret og E) rehydreret prøve. (F) SEM-billeder af eftertrykt knogleblæk, der viser dannelsen af HA-krystaller under (i) våde og (ii) tørre forhold. Skalastænger = (A,E) 3 mm, (C) 2 mm, (B) 1 mm, (Fi) 100 μm, (Fii) 3 μm. Figur 4A,B er fra Romanazzo et al.11. Forkortelser: COBICS = keramisk omnidirektionel bioprint i cellesuspensioner; GelMA = gelatinemethacrylat; SEM = scanning elektronmikroskopi; HA = hydroxyapatit. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Levende/døde farvninger. A) ADSC'er dyrket med GelMA-mikrogeler B) ADSC'er, der dyrkes med benblæk (illustreret med hvidt), og som viser høj cellelevedygtighed både på dag 1 og dag 5. Billeder taget ved 10x forstørrelse. Indsatte billeder viser z-stakke af de respektive konstruktioner på dag 5 med knogleblæk illustreret i hvidt. Skala søjler = 200 μm. Forkortelser: ADSC'er = fedtafledte mesenkymale stamceller; GelMA = gelatinemethacrylat. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D-printteknikken COBICS blev udviklet til at muliggøre fremstilling af mineraliserede knoglelignende strukturer via ekstrudering til en tværlænbar mikrogelsuspension indeholdende levende celler. Teknikken er blevet anvendt på en nedbrydelig mikrogelsuspension, og celler viser god levedygtighed, spredning og osteogen differentieringsevne inden for systemet11. En nøgledeterminant for succesen med konstruktioner skabt ved hjælp af denne teknik er den korrekte syntese af det α-TCP-baserede knogleblæk. For det første er dannelsen af α-TCP stærkt afhængig af tilstrækkelig temperaturkontrol. For dannelsen af den korrekte fase af tricalciumphosphat er det afgørende at slukke reaktionen inden for 1.400-1.200 ° C-området, før den krydser fasegrænsen til β-TCP-fasefeltet14. Røntgendiffraktionsanalyse kan bruges til at bekræfte enfaset α-TCP-sammensætning. Derefter er blandingen af alle knogleblækforstadier i de korrekte proportioner afgørende for dannelsen af et knogleblæk med optimale flowegenskaber til ekstruderingsudskrivning, indstillingstid og nanomikrostrukturdannelse. Da GelMA-mikrogelophænget tillader "låsning" af de trykte strukturer via fototværbinding, kan proportionerne af forløbermaterialer indstilles til at optimere til den 3D-printer, der bruges. Det anbefales dog kraftigt at foretage grundige test for at sikre, at dette ikke kompromitterer teknikkens integritet.
En afgørende overvejelse under GelMA-syntese er, at alle ureagerede methacrylsyreanhydrid og syrebiprodukter fjernes via tilstrækkelig centrifugering og dialyse. Dialyse skal udføres i mindst den angivne tid, da methacrylsyreanhydrid og syrebiprodukter er cytotoksiske og kan påvirke cellelevedygtigheden. Desuden vil en lavere pH-værdi kompromittere gelernes strukturelle integritet og kan påvirke indstillingen af knogleblækket. Frysetørring i den angivne tid er afgørende for beregningen af den korrekte vægtprocent ved fremstilling af GelMA-opløsninger til syntese af mikrogelsuspensionen. Frysetørring i en kortere periode end specificeret kan medføre, at adsorberet vand medregnes i tørvægten af GelMA, hvilket får de resulterende mikrogeler til at indeholde en lavere vægtprocent af GelMA og dermed være meget svagere end beregnet. GelMA-graden af funktionalisering (DoF) påvirker kovalent hydrogeldannelse og dermed hydrogelstabilitet. Den optimale DoF viste sig at være 95%.
Et andet kritisk trin er vand-i-olie-emulsionssyntesen af mikrogeler. Centrifugeringshastigheden påvirker størrelsen af de dannede mikrogeler. Hurtigere centrifugeringshastigheder tillader fremstilling af mindre mikrogeler; Men hvis hvirvelen er turbulent, vil emulsionen ikke stabilisere sig, og mikrogelsyntesen vil mislykkes. Omvendt vil en for lav centrifugeringshastighed medføre, at GelMA-opløsningen samles til en masse i stedet for at danne en stabil emulsion. I denne undersøgelse genererede kombinationen af oliens viskositet og den anvendte spindehastighed mikrogeler med en gennemsnitlig diameter på 100 μm, når de blev hydreret. Det anbefales kraftigt at udføre tilstrækkelig test for at indstille kombinationen af olietype og omrøringshastighed for at give ensartede ønskelige resultater.
En begrænsning ved COBIC-teknikken er, at parametrene for blækformuleringen kan kræve en vis finjustering for at optimere ekstrudering med forskellige printere. Selvom designet af teknikken gør det muligt at være modulær, betyder det også, at brugerne muligvis skal udøve en vis grad af forsøg og fejl for at opnå de ønskede resultater med det udstyr, der er tilgængeligt for dem. Som tidligere nævnt giver brugen af en fototværbindende mikrogelsuspension mildhed over parametre via låsning af de trykte strukturer. Desuden er den aktuelle batchstørrelse begrænset til 2 ml knogleblæk pr. Krukke. Dette kan løses ved at have flere krukker, hvilket tillader syntese af flere batcher af formuleringen. Dette er muligvis heller ikke påkrævet afhængigt af de specifikke flowegenskaber, som brugeren kræver til deres udstyr og anvendelse. Igen anbefales passende test fra brugerens side.
Afslutningsvis letter COBICS udskrivningen af en optimeret, nanostruktureret, knoglemimetisk keramisk blæk i cellebelastede biomaterialer. Denne teknik giver spatiotemporal kontrol over makro- og mikroarkitektur, mens den fremstiller komplekse knoglestrukturer. Brugen af mikrogeler muliggør stabilisering af knogleblækket, mens især GelMA-mikrogeler forbedrer udskriftsintegriteten ved fototværbindingsmedieret låsning og giver tilstrækkelige hulrum til celleproliferation og migration. Den tilgang, der beskrives her, har potentielle anvendelser inden for knoglevævsteknik, sygdomsmodellering og lægemiddelscreening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende National Health and Medical Research Council (bevillingsnr. GNT1111694 og GNT1141602) og Australian Research Council (bevillingsnr. FT180100417, FL150100060 og CE14100036). Forfatterne vil gerne anerkende Biomedical Imaging Facility ved University of New South Wales. Figurerne blev oprettet med Biorender.com, Adobe Photoshop og Adobe Illustrator og er blevet eksporteret under et betalt abonnement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer Extruder | Hyrel3D | EMO-25 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon | BDAA352070 | |
| Absolute Ethanol 100% Denatured | Chem-Supply | ||
| Acetone | Chem-Supply | 154871 | |
| Alumina crucible | Coors | ||
| Ammonium phosphate dibasic (NaHPO4) | Sigma | A5764 | |
| Autodesk Fusion 360 | Autodesk | ||
| Biosafety cabinet level 2 | |||
| Calcium carbonate | Sigma | 239216 | |
| Calcium hydrogen phosphate (CaHPO4) | Sigma | C7263 | |
| Cell culture flasks | Corning | various volumes used | |
| Cellulose Dialysis Tubes, 14 kDa cut-off | Sigma | D9777 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL | |
| Dispensing Tip, 23 G | Nordson | 7018302 | |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo FIsher | 11885084 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo FIsher | 14190144 | |
| Elevator furnace | Labec | ||
| Engine HR Multihead Printer | Hyrel3D | ||
| Fetal Bovine Serum | Bovogen | ||
| Gelatin type A, from porcine skin | Sigma | G2500 | |
| General Purpose Stainless Steel Tips | Nordson EF | ||
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Human adipose derived stem cells | ATCC | PCS-500-011 | |
| LSM 800 Confocal Microscope | ZEISS | ||
| Lyophilizer (Alpha 1-4 LDplus) | Christ | 101541 | |
| Magnetic hot plate and stirrer | |||
| Methacrylic anhydride | Sigma | 276685 | |
| Mini 2 Desktop 3D Printer | LulzBot | ||
| Parafilm sealing film | Parafilm | PM996 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo FIsher | 15140122 | |
| Planetary ball mill | |||
| Planetary ball mill jar | |||
| Polyoxyethylenesorbitan monooleate Tween-80 | Sigma | P6224 | |
| Scanning electron microscope | FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM | ||
| Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech | 18813156 | |
| Stainless steel standard test sieve | |||
| Sunflower Oil | Community Co | ||
| Trypsin-EDTA 0.25% phenol red | Thermo FIsher | 25200056 | |
| ZEN Microscope Software | ZEISS | ||
| Live/Dead viability/ cytotoxicity kit for mammalian cells | Invitrogen | L3224 | |
| DMEM, low glucose, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 |
References
- Bates, P., Ramachandran, M. Bone injury, healing and grafting. Basic Orthopaedic Sciences. The Stanmore Guide. , CRC Press. Boca Raton, FL. 123-134 (2007).
- Lin, X., et al. The bone extracellular matrix in bone formation and regeneration. Frontiers in Pharmacology. 11, 757 (2020).
- Reznikov, N., et al. A materials science vision of extracellular matrix mineralization. Nature Reviews Materials. 1, 16041 (2016).
- Kang, H. W., et al. A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity. Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).
- Lin, K., et al. 3D printing of bioceramic scaffolds-Barriers to the clinical translation: From promise to reality, and future perspectives. Materials. 12 (17), 2660 (2019).
- Qu, M., et al. Multi-dimensional printing for bone tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 10 (11), 2001986 (2021).
- Lode, A., et al. Fabrication of porous scaffolds by three-dimensional plotting of a pasty calcium phosphate bone cement under mild conditions. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 682-693 (2014).
- Bernal, P. N., et al. Volumetric bioprinting of complex living-tissue constructs within seconds. Advanced Materials. 31 (42), 1904209 (2019).
- Diloksumpan, P., et al. Combining multi-scale 3D printing technologies to engineer reinforced hydrogel-ceramic interfaces. Biofabrication. 12 (2), 025014 (2020).
- Thrivikraman, G., et al. Rapid fabrication of vascularized and innervated cell-laden bone models with biomimetic intrafibrillar collagen mineralization. Nature Communications. 10 (1), 3520 (2019).
- Romanazzo, S., et al. Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions. Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
- Phromsopha, T., Baimark, Y. Preparation of starch/gelatin blend microparticles by a water-in-oil emulsion method for controlled release drug delivery. International Journal of Biomaterials. 2014, 829490 (2014).
- Moreno, D., et al. Solid-state synthesis of alpha tricalcium phosphate for cements used in biomedical applications. Boletín de la Sociedad Española de Cerámica y Vidrio. 59 (5), 193-200 (2020).
