Summary
Este protocolo describe una técnica de impresión 3D para fabricar estructuras similares a huesos depositando una tinta de fosfato de calcio en un soporte granular a base de gelatina. Los análogos óseos impresos se depositan en forma libre, con flexibilidad para la recolección directa de la impresión o la reticulación dentro de una matriz de células vivas para construcciones multifásicas.
Abstract
Estructuralmente, el tejido óseo es un compuesto inorgánico-orgánico que contiene células metabólicamente activas incrustadas dentro de una matriz jerárquica altamente mineralizada. Esta organización es difícil de replicar debido al entorno heterogéneo del hueso. La bioimpresión omnidireccional cerámica en suspensiones celulares (COBICS) es una técnica de bioimpresión basada en microgeles que replica de forma única la estructura mineral y celular del hueso. COBICS imprime construcciones complejas y biológicamente relevantes sin la necesidad de materiales de soporte de sacrificio o pasos de posprocesamiento severos (por ejemplo, radiación y sinterización a alta temperatura), que son dos de los mayores desafíos en la fabricación aditiva de construcciones miméticas óseas. Esta técnica se habilita a través de la extrusión de forma libre de una nueva tinta a base de fosfato de calcio dentro de una suspensión de microgel a base de gelatina. Las propiedades de límite elástico de la suspensión permiten la deposición y soportan la estructura ósea impresa. La reticulación UV y la nanoprecipitación luego lo "bloquean" en su lugar. La capacidad de imprimir cerámicas nanoestructuradas miméticas óseas dentro de biomateriales cargados de células proporciona control espaciotemporal sobre la macro y microarquitectura y facilita la fabricación en tiempo real de construcciones óseas complejas en entornos clínicos.
Introduction
El hueso tiene notables capacidades de regeneración como una de las pocas estructuras en el cuerpo que puede sanar recreando su composición celular normal, orientación y resistencia mecánica hasta un tamaño de defecto crítico, cuando la capacidad de curación endógena se ve comprometida1. El hueso, junto con el cartílago y el ligamento, apoya y facilita el movimiento del cuerpo, al tiempo que almacena minerales y grasas y produce células sanguíneas. Como tejido conectivo duro y denso, el hueso está compuesto principalmente de una fase inorgánica, agua y material orgánico compuesto principalmente de fibras de colágeno2. Las células están incrustadas dentro de esta matriz altamente mineralizada de fibras de colágeno I y cristales de hidroxiapatita (HA), formando una estructura jerárquica3.
La compleja organización de este tejido hace que la fabricación de alternativas sintéticas para replicar los micro y nanoambientes óseos heterogéneossea excepcionalmente desafiante 3. Para este propósito, se han propuesto una variedad de materiales, incluyendo biocerámicas, hidrogeles cargados de células y materiales sintéticos como soluciones para crear matrices óseas. Entre las técnicas de fabricación de andamios, las técnicas basadas en la impresión 3D han surgido recientemente y han recibido mucha atención de la comunidad de ingeniería de tejidos debido a su notable capacidad para permitir la fabricación de estructuras altamente sofisticadas y precisas con una gran promesa de tratamiento específico para el paciente 4,5,6 . Los hidrogeles han sido la opción más popular de imitadores de matrices y biotintas, ya que pueden imprimirse junto con células y moléculas bioactivas, generando construcciones funcionales6. Sin embargo, los hidrogeles carecen de las propiedades funcionales del hueso, como la resistencia mecánica y una fase inorgánica altamente calcificada que contiene células metabólicamente activas.
Los andamios cerámicos impresos en 3D generalmente requieren pasos de posprocesamiento, incluida la sinterización, los tratamientos a alta temperatura o el uso de productos químicos agresivos que deben lavarse a fondo antes de las aplicaciones in vitro o in vivo 5. Para abordar estas limitaciones, Lode et al.7 desarrollaron recientemente una pasta a base de fosfato α-tricálcico formada por hidroxiapatita, que puede imprimirse y fijarse en condiciones fisiológicas. Sin embargo, este material todavía no se puede imprimir junto con células vivas, ya que requiere un tratamiento posterior en un ambiente húmedo y una posterior inmersión en solución acuosa durante un largo período.
Alternativamente, se han propuesto hidrogeles cargados de células con partículas inorgánicas incorporadas como reemplazo de la matriz ósea 3D 8,9. A pesar de su gran capacidad para apoyar la viabilidad celular, no son capaces de recapitular el entorno de tejido óseo densamente mineralizado. Thrivikarman et al.10 adoptaron un enfoque biomimético en el que se utilizó un medio sobresaturado de calcio y fosfato con un análogo de proteína no colágena para imitar mejor la deposición de apatita a nanoescala. Sin embargo, sus construcciones aún no pueden generar construcciones 3D rígidas con una arquitectura a micro y macroescala que se asemeje al hueso.
El presente estudio aborda estas deficiencias a través del desarrollo de una estrategia de impresión para fabricar construcciones que imitan los huesos, en fases inorgánicas y orgánicas, que son capaces de integrar tanto células como factores de crecimiento11. COBICS recapitula de manera única la estructura mineral y celular del hueso utilizando una técnica de bioimpresión basada en microgeles. El protocolo aquí describe el proceso de síntesis de la tinta de hueso cerámico y los microgeles a base de gelatina y luego la combinación de células que permiten COBICS. El proceso comienza con la síntesis del principal material precursor de la tinta de hueso. El hidrogel reticulado se sintetiza y se forma en microgeles. Por último, la tinta ósea se deposita omnidireccionalmente en un baño de soporte de los microgeles cargados de células (Figura 1).
La tinta de hueso puede imprimirse en cualquier suspensión de microgeles que tengan las características apropiadas de tensión de fluencia, es decir, la capacidad de fluidificar a una velocidad de cizallamiento específica y posteriormente soportar la estructura depositada. Se han demostrado dos enfoques flexibles: una suspensión que consiste en microgeles de gelatina y una suspensión que consiste en microgeles de metacrilato de gelatina (GelMA). La primera suspensión se disuelve cuando la temperatura se eleva a 37 °C, la técnica de incrustación reversible de hidrogeles suspendidos (FRESH) de forma libre12, mientras que la segunda puede ser reticulada después de la impresión, "cosiendo" efectivamente los microgeles juntos y bloqueando la tinta de hueso impresa en su lugar. El presente estudio se centra en el uso de GelMA como matriz, ya que proporciona la ventaja única de poder apoyar el crecimiento celular con la impresión in situ de estructuras miméticas óseas complejas. En última instancia, este enfoque permite la generación de modelos de tejidos complejos con altos niveles de biomímesis y amplias implicaciones para el modelado de enfermedades, el descubrimiento de fármacos y la ingeniería regenerativa.
Figura 1: Esquema del flujo de trabajo . (A) La tinta ósea se sintetiza a partir de la síntesis de fosfato α-tricálcico y su posterior combinación con glicerol, polisorbato 80 y fosfato de amonio dibásico. (B) Los microgeles GelMA se fabrican mediante el método de emulsión de agua en aceite. Los microgeles obtenidos son entonces (C) hidratados y (D) combinados con células. Los compuestos de microgel celular se utilizan como un baño granular en el que se deposita la tinta ósea. (E) Todo el constructo se reticula a los rayos UV y se transfiere a la incubadora para su cultivo. Abreviaturas: α-TCP = fosfato α-tricálcico; GelMA = metacrilato de gelatina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Protocol
1. Fabricación de tinta de hueso
- Síntesis de fosfato α-tricálcico
- Pesar los polvos de hidrogenofosfato de calcio (CaHPO4) y carbonato de calcio (CaCO 3) en una relación molar de Ca:P de3:2. Usando una espátula, homogeneice bien los dos polvos.
- Agregue la mezcla de polvo de fosfato de hidrógeno y carbonato de calcio a un crisol de zirconia de tal manera que no esté más del 75% lleno.
NOTA: Para evitar la contaminación, utilice un crisol nuevo o un crisol utilizado previamente para hacer el mismo material. Para limpiar, enjuague con etanol al 100% y seque al aire en una campana extractora hasta que esté completamente seco antes de agregar los polvos. - Transfiera el crisol a un horno. Calentar a 1.400 °C a una velocidad de 5 °C/min y mantener durante 3 h.
- Apague la reacción retirando el crisol del horno y déjelo encima de un bloque refractario. Deje que se enfríe completamente antes de manipularlo.
NOTA: Utilice pinzas de crisol de una longitud adecuada y asegure una protección adecuada contra el calor. - Utilice un mortero para romper y moler la torta α-TCP de modo que los gránulos resultantes tengan un tamaño máximo de 200 μm.
NOTA: Utilice un tamiz estándar de acero inoxidable para garantizar el tamaño de partícula correcto. - Moler aún más los gránulos utilizando un molino planetario en dos etapas. Primero, agregue bolas de zirconia estabilizadas con itria de 3 mm en una relación de peso de 8: 1 bolas: polvo, luego 100% etanol en una relación de peso de etanol: polvo de 3: 1. Asegure la tapa y muele durante 2 h a 180 rpm.
- Recoger la suspensión y separar las bolas, utilizando etanol 100% para el lavado.
- Secar la suspensión en horno a 120 °C durante 24 h.
- Agregue el polvo seco a los frascos de molienda con bolas de zirconia de 1 mm y etanol al 100% en las mismas proporciones de peso que en la primera etapa. Moler durante 2 h a 180 rpm, separar y secar.
NOTA: Todo el procedimiento de síntesis se representa en la Figura 1A.
- Formulación de tinta de hueso
- Para hacer la tinta de hueso, agregue 2 g de polvo α-TCP a un frasco de molino de bolas que contenga 630 μL de glicerol y 130 μL de polisorbato 80 mientras agita continuamente con una espátula.
- Añadir 100 mg de fosfato de amonio dibásico ((NH 4)2HPO4, APD) y remover para combinar.
NOTA: El exceso de residuos de fases líquidas que quedan en la espátula dará lugar a un desequilibrio de la relación de los componentes de la tinta y, por lo tanto, de la cinética de fraguado. - Agregue una bola de zirconia de 25 mm, asegure la tapa y colóquela dentro de un molino planetario durante 60 minutos a 180 rpm, deteniéndose hasta la mitad para raspar los lados del frasco con una espátula.
- Con una espátula, cargue la tinta en una jeringa de 1 ml. Envuélvase adecuadamente para evitar el contacto con la humedad. Conservar a -20 °C si no se utiliza inmediatamente.
- Caracterización de la microestructura hueso-tinta
- Imprima la tinta de hueso en agua desionizada y deje reposar durante 5 min.
- Lave la muestra 3 veces con etanol 100% y deje que se seque completamente.
- Capa con una capa delgada (15 nm de espesor) de oro.
- Capture micrografías utilizando un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo a un voltaje de aceleración de 5 kV.
2. Fabricación de suspensiones de microgel para impresión
- Síntesis de GelMA
NOTA: Este procedimiento ha sido probado para tamaños de lote que consisten en 10 g y 20 g de gelatina. Este método detalla las mediciones de un lote utilizando 10 g.- Hacer una solución al 10% p/p de gelatina tipo A (porcino, Bloom strength 300) en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) pesando 10 g de gelatina y añadiéndola a un matraz cónico con 90 ml de PBS. Calentar a 50 °C mientras se agita hasta que la gelatina se disuelva por completo.
- Añadir 5.796 mL de anhídrido metacrílico. Colocar un tapón de goma sobre el matraz cónico y continuar agitando en la oscuridad a 50 °C durante 90 min.
PRECAUCIÓN: El anhídrido metacrílico es tóxico si se inhala o ingiere y es un irritante para la piel y los ojos. Manéjese solo dentro de una campana extractora y use el EPP adecuado. - Apagar la reacción diluyendo el contenido del matraz cónico dos veces con PBS.
- Decantar en tubos de 50 ml y centrifugar a 3.000 × g a temperatura ambiente durante 3 min para eliminar el anhídrido metacrílico sin reaccionar.
- Dializar el sobrenadante dentro de los tubos de diálisis de celulosa de corte de 14 kDa contra agua desionizada a 40 °C durante 5 días mientras agita suavemente. Reemplace el agua desionizada todos los días.
- Prepárese para el almacenamiento decantando en tubos de 50 ml, asegurando la tapa y colocándola en el refrigerador durante 12 h. Guarde este producto en el refrigerador hasta por 7 días.
- Congelar con nitrógeno líquido y liofilizar inmediatamente durante 5 días a -54 °C y 0,4 mbar.
NOTA: Asegúrese de que los tubos no contengan más de 40 ml de líquido cuando se congelen. Una vez congelada, reemplace la tapa con una cubierta que permita el intercambio de gases, como una delicada toallita de tareas asegurada con una banda elástica. - Almacene la espuma resultante en un congelador a -20 °C hasta que sea necesario para la síntesis de suspensión de microgel.
- Síntesis de microgeles GelMA
NOTA: Los microgeles se sintetizan utilizando un método de emulsión de agua en aceite13 (Figura 2). Este método ha sido probado para volúmenes de solución de GelMA de 1-10 ml. El mismo protocolo se puede utilizar para sintetizar microgeles de gelatina utilizados para imprimir impresiones óseas independientes.- Hacer una solución de GelMA al 10% p/p en PBS pesando el GelMA liofilizado, añadiéndolo a un tubo con PBS y calentándolo en un baño maría a 50 °C hasta que esté completamente hidratado.
- Agregue 37 ml de aceite por 1 ml de solución de GelMA a un vaso de precipitados, asegurándose de que no esté más del 65% lleno.
- Configure un sistema de vaso de precipitados dobles en una placa caliente con agitación magnética colocando el vaso que contiene aceite dentro de un vaso de precipitados más grande.
NOTA: El tamaño de los dos vasos de precipitados debe ser tal que el hielo pueda caer fácilmente en el espacio entre sus paredes. La configuración se muestra en la figura 2. - Calentar a 40 °C mientras se agita.
NOTA: Asegúrese de que el vórtice no sea turbulento y tenga una profundidad de aproximadamente 1/3 de la altura del aceite en el vaso de precipitados. - Cargue la solución de GelMA en una jeringa y agréguela gota a gota en el aceite de agitación a través de un filtro de 0,45 μm. Deje que la emulsión se equilibre durante 10 min.
- Reduzca la temperatura de la emulsión a 15 °C para estabilizar térmicamente las esferas añadiendo hielo picado en el espacio entre los dos vasos de precipitados.
- Agregue acetona a la emulsión giratoria en una proporción de volumen de 1:11 GelMA solución a acetona.
NOTA: Agregue la acetona suavemente a través de un embudo para evitar interrumpir la emulsión. Revuelva durante 60 min. - Decantar el contenido del vaso de precipitados en tubos de 50 ml, asegurándose de lavar las paredes del vaso de precipitados con acetona. Dejar actuar durante 20 minutos para permitir que los microgeles deshidratados se asienten en el fondo.
- Deseche el sobrenadante y lave al menos 2 veces con acetona.
NOTA: El sobrenadante debe ser claro. - Consolidar en un tubo, rellenar con acetona y sonicar durante 10 s. Lavar 2x con acetona.
- Conservar en acetona a temperatura ambiente hasta que sea necesario para la impresión.
- Preparación de la suspensión de microgel GelMA para la impresión
- Prepare una solución al 1% p/p de GelMA en el medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco pesando GelMA liofilizado en un tubo, añadiendo DMEM y calentando en un baño maría a 50 °C hasta que esté completamente hidratado.
- Evaporar la acetona de los microgeles deshidratados y pesar el polvo resultante en un tubo. Agregue acetona y transfiérala a un ambiente estéril.
- Para formar la suspensión de microgel, evapore la acetona y agregue DMEM, solución iniciadora de GelMA al 1% p/p en DMEM y solución iniciadora de fenil-2,4,6-trimetilbenzoilofinato de litio (LAP) al 2,5% p/p para lograr una fracción de empaquetamiento final del 30%. Dejar hidratar completamente durante al menos 12 h a temperatura ambiente. Guarde este producto en el refrigerador hasta por 7 días. Deje subir a temperatura ambiente antes de usar.
NOTA: Los volúmenes de estos reactivos se basan en el peso seco de los microgeles y se pueden calcular utilizando las ecuaciones de la Tabla 1.
| Ecuación | |
| x = peso de los microgeles secos (mg) | |
| Volumen de 1% p/p de GelMA en DMEM, a (μL) | a = 21,93x |
| Volumen de DMEM, b (μL) | b = 8,773x |
| Volumen de solución LAP al 2,5% p/p, c (μL) | c = 0,6267x |
| Volumen total de suspensión de microgel producida (μL) | a + b + c |
Tabla 1: Ecuaciones para calcular los volúmenes de reactivos necesarios para hidratar las suspensiones de microgel GelMA. Abreviaturas: GelMA = metacrilato de gelatina; LAP = fenil-2,4,6-trimetilbenzoilofinato de litio.
Figura 2: Esquema del método aceite-emulsión utilizado para la síntesis de microgel. La configuración de vaso doble muestra un vaso de precipitados que contiene la emulsión de agitación (indicada por flecha) colocada dentro de un vaso de precipitados más grande para permitir el enfriamiento. Abreviatura: GelMA = metacrilato de gelatina Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. Impresión de tinta de hueso en suspensiones celulares
NOTA: Los microgeles a base de gelatina apoyan la adhesión de muchos tipos de células diferentes, lo que hace que este enfoque sea susceptible a células individuales y múltiples dentro de la matriz de microgel. Este protocolo describe el procedimiento para usar células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo (ADSC), ya que este es un tipo de célula popular y robusto para la ingeniería de tejidos musculoesqueléticos.
- Cultivar las ADSC en DMEM bajo en glucosa suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina-estreptomicina a 37 °C y 5% deCO2 hasta que estén confluentes.
- Separar las ADSC del matraz de cultivo de tejidos retirando el medio, lavando con PBS estéril e incubando a 37 °C y 5% deCO2 con tripsina al 0,25% durante 3 min.
- Granular las células centrifugando a 150 × g a temperatura ambiente durante 5 min.
- Contar las células y calcular 5 × 105 células por cada 1 ml de microgeles GelMA. Asigne el volumen requerido de suspensión celular a un tubo y pellet separados como se mencionó anteriormente.
- Retire con cuidado la mayor cantidad posible de sobrenadante con una pipeta, dejando solo la bolita celular. Agregue el volumen requerido de suspensión de microgel al pellet y aspire suavemente para garantizar una distribución celular uniforme.
NOTA: Si hay exceso de burbujas de aire en la suspensión, centrifugar suavemente para eliminar y pipetear hacia arriba y hacia abajo para redistribuir las celdas. - Cargue la suspensión de microgel cargada de células en un reactor utilizando una pipeta.
NOTA: En el presente estudio, se imprimieron en 3D reactores de 10 mm x 10 mm x 3 mm con una capacidad volumétrica de 100 μL. - Depositar tinta de hueso con una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de 23 G.
NOTA: Esto se puede hacer con una impresora 3D, ya sea adaptando un sistema de extrusión que permite imprimir directamente desde la jeringa de 1 ml o cargando la tinta de hueso directamente en el cartucho de extrusión de la impresora (Figura 3). - Reticulación de la construcción de microgel GelMA cargada de tinta celular y ósea con una lámpara reticulante UV (405 nm) durante 90 s. Transfiera inmediatamente a una placa de pozo del tamaño adecuado y cubra con DMEM completo.
NOTA: Los reactores impresos en 3D antes mencionados caben dentro de placas de cultivo celular de 24 pocillos. - Incubar a 37 °C y 5% deCO2. Reemplace el medio de cultivo después de 24 h, luego cada 48-72 h según sea necesario.
Figura 3: Representación esquemática del procedimiento COBICS que muestra la hidratación de microgeles, incorporación de células y posterior impresión de tinta ósea en la suspensión de microgel cargada de células. Abreviatura: COBICS = bioimpresión omnidireccional cerámica en suspensiones celulares; GelMA = metacrilato de gelatina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. Evaluación de la viabilidad celular y la proliferación
- Para evaluar la citotoxicidad de la tinta ósea, mantenga las construcciones COBICS cargadas de células en un medio de cultivo completo. Realice un ensayo de muertos vivos a las 24 h, 72 h y 120 h (o puntos de tiempo relevantes).
- En cada punto de tiempo, lave las construcciones con PBS, luego agregue una solución de DMEM sin fenol que contenga 4 mM de calceína y 2 mM de bromuro de etidio. Incubar durante 1 h a 37 °C y 5% deCO2.
- Lavar con PBS y transferir a un plato con fondo de vidrio para obtener imágenes con un microscopio confocal a espectros Ex/Em de 494/517 nm y 528/617 nm.
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Representative Results
COBICS imprime construcciones complejas y biológicamente relevantes sin la necesidad de materiales de soporte de sacrificio o pasos de posprocesamiento severos (por ejemplo, radiación y sinterización a alta temperatura), que son dos de los mayores desafíos en la fabricación aditiva de construcciones miméticas óseas. Para demostrar la formación de COBICS de estructuras óseas complejas y la coimpresión de células en suspensiones de microgel, se tomaron imágenes representativas de compuestos similares a hueso hechos de tinta ósea y se realizó un análisis semicuantitativo de la viabilidad de ADSC en COBICS durante un máximo de 7 días. La Figura 4 muestra la capacidad de fabricar estructuras óseas complejas mediante la deposición de tinta ósea en el baño de soporte compuesto de microgeles de gelatina, que se comportan como un fluido no newtoniano, respondiendo como un sólido que comienza a fluir como un fluido viscoso bajo alto esfuerzo cortante. Las construcciones impresas se pueden aislar del baño viscoso (Figura 4A, B).
La impresora utilizada para realizar las construcciones que imitan los huesos en la Figura 4 es una impresora multicabezal equipada con una extrusora personalizada. Se cargó un mililitro de tinta ósea en una jeringa de impresión de 3 ml, que se instaló en la extrusora. Todas las agujas utilizadas tenían un diámetro interior de 0,2-0,8 mm. Los modelos informáticos de las estructuras imitadas con huesos se crearon utilizando un software de modelado CAD y se convirtieron en archivos STL, después de lo cual se generó el código G. Las construcciones se imprimieron en placas de cultivo celular de 96 pocillos que contenían microgeles de gelatina y medio completo utilizando una aguja de 0,2 mm. Después de la impresión, se permitió que las construcciones se colocaran dentro de los baños de soporte durante 6 minutos antes de retirarlas con pinzas.
Los microgeles de gelatina han sido reticulados con glutaraldehído para permitir su cultivo en condiciones fisiológicas de 37 °C y 5% deCO2, junto con células11. En el presente estudio, el sistema se implementó mediante la fabricación de microgeles GelMA, lo que permitió que toda la construcción fuera reticulada UV (Figura 4C) para estabilidad térmica y liofilizada para almacenamiento y transporte a largo plazo (Figura 4D, E). Las muestras liofilizadas se pueden rehidratar en agua destilada, PBS o medio de cultivo celular para recuperar su estructura original (Figura 4E). La tinta ósea se analizó mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) para determinar su microestructura (Figura 4F), que mostró la formación de cristal de hidroxiapatita después del ajuste de la tinta, particularmente visible en condiciones secas (Figura 4Fii).
En este estudio, las células se mezclaron con microgeles GelMA y se mantuvieron en cultivo durante un máximo de 5 días, ya sea solo en suspensión de microgel (Figura 5A) o en el sistema COBICS, como se detalla en la sección 3 del protocolo. Las células mostraron buena viabilidad en presencia de la tinta ósea, tanto en el día 1 como en el día 5, confirmando que los productos de lixiviación de la tinta no eran perjudiciales para las células (Figura 5B). La impresión de cerámica mimética ósea nanoestructurada dentro de biomateriales cargados de células proporciona un control espacio-temporal sobre la macro y microarquitectura, lo que facilita la fabricación en tiempo real de construcciones óseas complejas en entornos clínicos.
Figura 4: Ejemplo de construcciones impresas en 3D impresas por COBICS. (A) Laberinto óseo humano; (B) canal helicoidal de Harversian. (C) Imágenes de tinta de hueso impresas en microgeles GelMA; (D) muestra liofilizada y (E) rehidratada. (F) Imágenes SEM de tinta de hueso postimpresa que muestran la formación de cristales de HA, en (i) condiciones húmedas y (ii) secas. Barras de escala = (A,E) 3 mm, (C) 2 mm, (B) 1 mm, (Fi) 100 μm, (Fii) 3 μm. La figura 4A,B es de Romanazzo et al.11. Abreviaturas: COBICS = bioimpresión omnidireccional cerámica en suspensiones celulares; GelMA = metacrilato de gelatina; SEM = microscopía electrónica de barrido; HA = hidroxiapatita. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Tinción viva/muerta. (A) ADSC cultivadas con microgeles GelMA; (B) ADSC cultivadas en presencia de tinta de hueso (ilustradas en blanco), mostrando alta viabilidad celular tanto en el día 1 como en el día 5. Imágenes tomadas con un aumento de 10x. Las imágenes insertadas muestran pilas z de las construcciones respectivas en el día 5 con la tinta de hueso ilustrada en blanco. Barras de escala = 200 μm. Abreviaturas: ADSC = células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo; GelMA = metacrilato de gelatina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La técnica de impresión 3D COBICS se desarrolló para permitir la fabricación de estructuras óseas mineralizadas mediante extrusión en una suspensión de microgel reticulable que contiene células vivas. La técnica ha sido aplicada a una suspensión de microgel degradable, y las células muestran buena viabilidad, diseminación y capacidad de diferenciación osteogénica dentro del sistema11. Un determinante clave del éxito de las construcciones creadas utilizando esta técnica es la síntesis adecuada de la tinta ósea basada en α-TCP. En primer lugar, la formación de α-TCP depende en gran medida de un control adecuado de la temperatura. Para la formación de la fase correcta del fosfato tricálcico, es vital apagar la reacción dentro del rango de 1.400-1.200 °C antes de que cruce el límite de fase en el campo de faseβ-TCP 14. El análisis de difracción de rayos X se puede utilizar para confirmar la composición monofásica α-TCP. Posteriormente, la mezcla de todos los precursores de tinta ósea en las proporciones correctas es crucial para la formación de una tinta de hueso con características de flujo óptimas para la impresión por extrusión, el tiempo de fraguado y la formación de nanomicroestructuras. Dado que la suspensión de microgel GelMA permite el "bloqueo" de las estructuras impresas a través de la reticulación, las proporciones de los materiales precursores se pueden ajustar para optimizar la impresora 3D que se está utilizando. Sin embargo, se recomienda encarecidamente realizar pruebas exhaustivas para garantizar que esto no comprometa la integridad de la técnica.
Una consideración crucial durante la síntesis de GelMA es que todos los subproductos ácidos y anhídrido metacrílico sin reaccionar se eliminen mediante centrifugación y diálisis adecuadas. La diálisis debe realizarse durante al menos el período de tiempo especificado, ya que el anhídrido metacrílico y los subproductos ácidos son citotóxicos y pueden afectar la viabilidad celular. Además, un pH más bajo comprometerá la integridad estructural de los geles y puede afectar el fraguado de la tinta de hueso. La liofilización durante el tiempo especificado es crucial para el cálculo del porcentaje de peso correcto al preparar soluciones GelMA para la síntesis de la suspensión de microgel. La liofilización durante un período más corto que el especificado puede hacer que el agua adsorbida se contabilice en el peso seco del GelMA, haciendo que los microgeles resultantes contengan un porcentaje de peso menor de GelMA y, por lo tanto, sean mucho más débiles de lo previsto. El grado de funcionalización (DoF) de GelMA afecta la formación de hidrogel covalente y, por lo tanto, la estabilidad del hidrogel. Se encontró que el DoF óptimo era del 95%.
Otro paso crítico es la síntesis de microgeles en emulsión de agua en aceite. La velocidad de giro afecta el tamaño de los microgeles formados. Las velocidades de giro más rápidas permitirán la fabricación de microgeles más pequeños; Sin embargo, si el vórtice es turbulento, la emulsión no se estabilizará y la síntesis de microgel fallará. Por el contrario, una velocidad de giro demasiado baja hará que la solución de GelMA se fusione en una masa en lugar de formar una emulsión estable. En el presente estudio, la combinación de la viscosidad del aceite y la velocidad de giro utilizada generó microgeles con un diámetro promedio de 100 μm cuando se hidrataron. Se recomienda encarecidamente llevar a cabo pruebas adecuadas para marcar la combinación del tipo de aceite y la velocidad de agitación para obtener resultados deseables consistentes.
Una limitación de la técnica COBICS es que los parámetros de la formulación de la tinta pueden requerir algunos ajustes finos para optimizar la extrusión con diferentes impresoras. Aunque el diseño de la técnica permite que sea modular, también significa que los usuarios pueden necesitar un grado de prueba y error para lograr los resultados deseados con el equipo disponible para ellos. Como se indicó anteriormente, el uso de una suspensión de microgel reticulable proporciona indulgencia sobre los parámetros a través del bloqueo de las estructuras impresas. Además, el tamaño actual del lote está limitado a 2 ml de tinta de hueso por frasco. Esto se puede abordar teniendo múltiples frascos, lo que permite la síntesis de múltiples lotes de la formulación. Esto también puede no ser necesario dependiendo de las características de flujo específicas requeridas por el usuario para su equipo y aplicación. Una vez más, se recomienda realizar pruebas apropiadas por parte del usuario.
En conclusión, COBICS facilita la impresión de una tinta cerámica optimizada, nanoestructurada y mimética ósea dentro de biomateriales cargados de células. Esta técnica proporciona control espaciotemporal sobre la macro y microarquitectura mientras fabrica estructuras óseas complejas. El uso de microgeles permite la estabilización de la tinta ósea, mientras que los microgeles GelMA, en particular, mejoran la integridad de la impresión mediante el bloqueo mediado por reticulación y proporcionan espacios vacíos adecuados para la proliferación y migración celular. El enfoque descrito aquí tiene aplicaciones potenciales en ingeniería de tejido óseo, modelado de enfermedades y detección de medicamentos.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean reconocer al Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (Grant no. GNT1111694 y GNT1141602) y al Consejo Australiano de Investigación (Grant no. FT180100417, FL150100060 y CE14100036). Los autores desean reconocer el Centro de Imágenes Biomédicas de la Universidad de Nueva Gales del Sur. Las figuras se crearon con Biorender.com, Adobe Photoshop y Adobe Illustrator y se han exportado bajo una suscripción paga.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer Extruder | Hyrel3D | EMO-25 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon | BDAA352070 | |
| Absolute Ethanol 100% Denatured | Chem-Supply | ||
| Acetone | Chem-Supply | 154871 | |
| Alumina crucible | Coors | ||
| Ammonium phosphate dibasic (NaHPO4) | Sigma | A5764 | |
| Autodesk Fusion 360 | Autodesk | ||
| Biosafety cabinet level 2 | |||
| Calcium carbonate | Sigma | 239216 | |
| Calcium hydrogen phosphate (CaHPO4) | Sigma | C7263 | |
| Cell culture flasks | Corning | various volumes used | |
| Cellulose Dialysis Tubes, 14 kDa cut-off | Sigma | D9777 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL | |
| Dispensing Tip, 23 G | Nordson | 7018302 | |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo FIsher | 11885084 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo FIsher | 14190144 | |
| Elevator furnace | Labec | ||
| Engine HR Multihead Printer | Hyrel3D | ||
| Fetal Bovine Serum | Bovogen | ||
| Gelatin type A, from porcine skin | Sigma | G2500 | |
| General Purpose Stainless Steel Tips | Nordson EF | ||
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Human adipose derived stem cells | ATCC | PCS-500-011 | |
| LSM 800 Confocal Microscope | ZEISS | ||
| Lyophilizer (Alpha 1-4 LDplus) | Christ | 101541 | |
| Magnetic hot plate and stirrer | |||
| Methacrylic anhydride | Sigma | 276685 | |
| Mini 2 Desktop 3D Printer | LulzBot | ||
| Parafilm sealing film | Parafilm | PM996 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo FIsher | 15140122 | |
| Planetary ball mill | |||
| Planetary ball mill jar | |||
| Polyoxyethylenesorbitan monooleate Tween-80 | Sigma | P6224 | |
| Scanning electron microscope | FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM | ||
| Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech | 18813156 | |
| Stainless steel standard test sieve | |||
| Sunflower Oil | Community Co | ||
| Trypsin-EDTA 0.25% phenol red | Thermo FIsher | 25200056 | |
| ZEN Microscope Software | ZEISS | ||
| Live/Dead viability/ cytotoxicity kit for mammalian cells | Invitrogen | L3224 | |
| DMEM, low glucose, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 |
References
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