Bio-impression omnidirectionnelle céramique dans des suspensions chargées de cellules pour la génération d’analogues osseux
Summary
Ce protocole décrit une technique d’impression 3D pour fabriquer des structures ressemblant à des os en déposant une encre au phosphate de calcium dans un support granulaire à base de gélatine. Les analogues osseux imprimés sont déposés sous forme libre, avec une flexibilité pour la récolte directe de l’empreinte ou la réticulation dans une matrice de cellules vivantes pour les constructions multiphasiques.
Abstract
Structurellement, le tissu osseux est un composite inorganique-organique contenant des cellules métaboliquement actives intégrées dans une matrice hiérarchique hautement minéralisée. Cette organisation est difficile à reproduire en raison de l’environnement hétérogène de l’os. La bioimpression céramique omnidirectionnelle en suspensions cellulaires (COBICS) est une technique de bio-impression à base de microgel qui reproduit de manière unique la structure minérale et cellulaire de l’os. COBICS imprime des constructions complexes et biologiquement pertinentes sans avoir besoin de matériaux de support sacrificiels ou d’étapes de post-traitement sévères (par exemple, rayonnement et frittage à haute température), qui sont deux des plus grands défis de la fabrication additive de constructions mimétiques osseuses. Cette technique est rendue possible par l’extrusion libre d’une nouvelle encre à base de phosphate de calcium dans une suspension de microgel à base de gélatine. Les propriétés de limite d’élasticité de la suspension permettent le dépôt et soutiennent la structure osseuse imprimée. La réticulation UV et les nanoprécipitations le « verrouillent » ensuite en place. La capacité d’imprimer des céramiques nanostructurées mimétiques osseuses dans des biomatériaux chargés de cellules fournit un contrôle spatio-temporel sur la macro et la micro-architecture et facilite la fabrication en temps réel de constructions osseuses complexes dans des contextes cliniques.
Introduction
L’os a des capacités de régénération remarquables en tant que l’une des rares structures du corps qui peut guérir en recréant sa composition cellulaire normale, son orientation et sa force mécanique jusqu’à une taille de défaut critique, lorsque la capacité de guérison endogène est compromise1. L’os, avec le cartilage et les ligaments, soutient et facilite le mouvement du corps, tout en stockant les minéraux et les graisses et en produisant des cellules sanguines. En tant que tissu conjonctif dur et dense, l’os est principalement composé d’une phase inorganique, d’eau et de matière organique composée principalement de fibres de collagène2. Les cellules sont intégrées dans cette matrice hautement minéralisée de fibres de collagène I et de cristaux d’hydroxyapatite (HA), formant une structure hiérarchique3.
L’organisation complexe de ce tissu rend la fabrication d’alternatives synthétiques pour reproduire les micro et nano-environnements osseux hétérogènes exceptionnellement difficile3. À cette fin, une variété de matériaux, y compris des biocéramiques, des hydrogels chargés de cellules et des matériaux synthétiques ont été proposés comme solutions pour créer des matrices osseuses. Parmi les techniques de fabrication d’échafaudages, les techniques basées sur l’impression 3D ont récemment émergé et ont reçu beaucoup d’attention de la communauté de l’ingénierie tissulaire en raison de leur capacité remarquable à permettre la fabrication de structures hautement sophistiquées et précises avec de grandes promesses de traitement spécifique au patient 4,5,6 . Les hydrogels ont été le choix le plus populaire d’imitations matricielles et de bio-encres car ils peuvent être imprimés avec des cellules et des molécules bioactives, générant des constructions fonctionnelles6. Cependant, les hydrogels n’ont pas les propriétés fonctionnelles de l’os, telles que la résistance mécanique et une phase inorganique hautement calcifiée contenant des cellules métaboliquement actives.
Les échafaudages en céramique imprimés en 3D nécessitent généralement des étapes de post-traitement, y compris le frittage, les traitements à haute température ou l’utilisation de produits chimiques agressifs qui doivent être soigneusement lavés avant les applications in vitro ou in vivo 5. Pour remédier à ces limitations, Lode et coll.7 ont récemment mis au point une pâte à base de phosphate α-tricalcique formée d’hydroxyapatite, qui peut être imprimée et durcie dans des conditions physiologiques. Cependant, ce matériau ne peut toujours pas être imprimé avec des cellules vivantes car il nécessite un post-traitement dans un environnement humide et une immersion ultérieure en solution aqueuse pendant une longue période.
Alternativement, des hydrogels chargés de cellules avec des particules inorganiques incorporées ont été proposés en remplacement de la matrice osseuse 3D 8,9. Malgré leur grande capacité à soutenir la viabilité cellulaire, ils ne sont pas en mesure de récapituler l’environnement du tissu osseux densément minéralisé. Thrivikarman et coll.10 ont adopté une approche biomimétique dans laquelle un milieu sursaturé de calcium et de phosphate a été utilisé avec un analogue protéique non collagène pour mieux imiter le dépôt d’apatite à l’échelle nanométrique. Cependant, leurs constructions ne peuvent toujours pas générer de constructions 3D rigides avec une architecture à l’échelle micro et macro ressemblant à de l’os.
La présente étude comble ces lacunes en élaborant une stratégie d’impression pour fabriquer des constructions imitant les os, en phases inorganiques et organiques, capables d’intégrer à la fois les cellules et les facteursde croissance 11. COBICS récapitule de manière unique la structure minérale et cellulaire de l’os en utilisant une technique de bio-impression à base de microgel. Le protocole décrit ici le processus de synthèse des microgels céramiques à base d’encre d’os et de gélatine, puis de combinaison de cellules permettant COBICS. Le processus commence par la synthèse du principal matériau précurseur de l’encre osseuse. L’hydrogel réticulable est ensuite synthétisé et formé en microgels. Enfin, l’encre osseuse est déposée de manière omnidirectionnelle dans un bain de support des microgels chargés de cellules (Figure 1).
L’encre osseuse peut être imprimée dans n’importe quelle suspension de microgels présentant les caractéristiques de limite d’élasticité appropriées, c’est-à-dire la capacité de fluidiser à une vitesse de cisaillement spécifique et de soutenir ensuite la structure déposée. Deux approches flexibles ont été démontrées : une suspension constituée de microgels de gélatine et une suspension constituée de microgels de méthacrylate de gélatine (GelMA). La première suspension se dissout lorsque la température est portée à 37 °C, la technique d’encastrement réversible d’hydrogels en suspension (FRESH)12, tandis que la seconde peut être photoréticulée après impression, ce qui permet de « coudre » efficacement les microgels ensemble et de verrouiller l’encre osseuse imprimée en place. La présente étude se concentre sur l’utilisation de GelMA comme matrice car elle offre l’avantage unique de pouvoir soutenir la croissance cellulaire avec l’impression in situ de structures mimétiques osseuses complexes. En fin de compte, cette approche permet la génération de modèles tissulaires complexes avec des niveaux élevés de biomimétisme et de vastes implications pour la modélisation de la maladie, la découverte de médicaments et l’ingénierie régénérative.
Figure 1 : Schéma du flux de travail. (A) L’encre osseuse est synthétisée à partir de la synthèse du phosphate α-tricalcique et de sa combinaison ultérieure avec du glycérol, du polysorbate 80 et du phosphate d’ammonium dibasique. (B) Les microgels GelMA sont fabriqués par la méthode de l’émulsion eau dans huile. Les microgels obtenus sont alors (C) hydratés et (D) combinés avec des cellules. Les composites cellule-microgel sont ensuite utilisés comme un bain granulaire dans lequel l’encre osseuse est déposée. (E) L’ensemble de la construction est ensuite réticulé par UV et transféré à l’incubateur pour la culture. Abréviations : α-TCP = phosphate α-tricalcique; GelMA = méthacrylate de gélatine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Protocol
Representative Results
Discussion
La technique d’impression 3D COBICS a été développée pour permettre la fabrication de structures minéralisées ressemblant à des os par extrusion dans une suspension de microgel réticulable contenant des cellules vivantes. La technique a été appliquée à une suspension de microgel dégradable, et les cellules montrent une bonne viabilité, propagation et capacité de différenciation ostéogénique dans le système11. Un déterminant clé du succès des constructions créées à l’ai…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le National Health and Medical Research Council (subventions no. GNT1111694 et GNT1141602) et l’Australian Research Council (subvention no. FT180100417, FL150100060 et CE14100036). Les auteurs aimeraient remercier le Biomedical Imaging Facility de l’Université de Nouvelle-Galles du Sud. Les figurines ont été créées avec Biorender.com, Adobe Photoshop et Adobe Illustrator et ont été exportées dans le cadre d’un abonnement payant.
Materials
| 3D Printer Extruder | Hyrel3D | EMO-25 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon | BDAA352070 | |
| Absolute Ethanol 100% Denatured | Chem-Supply | ||
| Acetone | Chem-Supply | 154871 | |
| Alumina crucible | Coors | ||
| Ammonium phosphate dibasic (NaHPO4) | Sigma | A5764 | |
| Autodesk Fusion 360 | Autodesk | ||
| Biosafety cabinet level 2 | |||
| Calcium carbonate | Sigma | 239216 | |
| Calcium hydrogen phosphate (CaHPO4) | Sigma | C7263 | |
| Cell culture flasks | Corning | various volumes used | |
| Cellulose Dialysis Tubes, 14 kDa cut-off | Sigma | D9777 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL | |
| Dispensing Tip, 23 G | Nordson | 7018302 | |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo FIsher | 11885084 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo FIsher | 14190144 | |
| Elevator furnace | Labec | ||
| Engine HR Multihead Printer | Hyrel3D | ||
| Fetal Bovine Serum | Bovogen | ||
| Gelatin type A, from porcine skin | Sigma | G2500 | |
| General Purpose Stainless Steel Tips | Nordson EF | ||
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Human adipose derived stem cells | ATCC | PCS-500-011 | |
| LSM 800 Confocal Microscope | ZEISS | ||
| Lyophilizer (Alpha 1-4 LDplus) | Christ | 101541 | |
| Magnetic hot plate and stirrer | |||
| Methacrylic anhydride | Sigma | 276685 | |
| Mini 2 Desktop 3D Printer | LulzBot | ||
| Parafilm sealing film | Parafilm | PM996 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo FIsher | 15140122 | |
| Planetary ball mill | |||
| Planetary ball mill jar | |||
| Polyoxyethylenesorbitan monooleate Tween-80 | Sigma | P6224 | |
| Scanning electron microscope | FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM | ||
| Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech | 18813156 | |
| Stainless steel standard test sieve | |||
| Sunflower Oil | Community Co | ||
| Trypsin-EDTA 0.25% phenol red | Thermo FIsher | 25200056 | |
| ZEN Microscope Software | ZEISS | ||
| Live/Dead viability/ cytotoxicity kit for mammalian cells | Invitrogen | L3224 | |
| DMEM, low glucose, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 |
References
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- Lin, X., et al. The bone extracellular matrix in bone formation and regeneration. Frontiers in Pharmacology. 11, 757 (2020).
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- Kang, H. W., et al. A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity. Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).
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- Romanazzo, S., et al. Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions. Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).
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