Summary
Dit protocol beschrijft een 3D-printtechniek om botachtige structuren te fabriceren door een calciumfosfaatinkt af te zetten in een op gelatine gebaseerde korrelige ondersteuning. Geprinte botanalogen worden in vrije vorm afgezet, met flexibiliteit voor het direct oogsten van de afdruk of crosslinking binnen een levende celmatrix voor multifasische constructies.
Abstract
Structureel gezien is botweefsel een anorganisch-organische samenstelling die metabolisch actieve cellen bevat die zijn ingebed in een hiërarchische, sterk gemineraliseerde matrix. Deze organisatie is een uitdaging om te repliceren vanwege de heterogene omgeving van bot. Keramische omnidirectionele bioprinting in celsuspensies (COBICS) is een op microgel gebaseerde bioprinttechniek die op unieke wijze de minerale en cellulaire structuur van bot repliceert. COBICS print complexe, biologisch relevante constructies zonder de noodzaak van opofferingsmaterialen of harde nabewerkingsstappen (bijv. Straling en hoge temperatuur sinteren), twee van de grootste uitdagingen in de additieve productie van bot mimetische constructies. Deze techniek wordt mogelijk gemaakt via de vrije extrusie van een nieuwe inkt op basis van calciumfosfaat in een op gelatine gebaseerde microgelsuspensie. De vloeigrenseigenschappen van de suspensie maken afzetting mogelijk en ondersteunen de geprinte botstructuur. UV-crosslinking en nanoprecipitatie "vergrendelen" het vervolgens op zijn plaats. De mogelijkheid om nanogestructureerde bot-mimetische keramiek te printen in celbeladen biomaterialen biedt spatiotemporale controle over macro- en micro-architectuur en vergemakkelijkt de real-time fabricage van complexe botconstructies in klinische omgevingen.
Introduction
Bot heeft opmerkelijke regeneratiecapaciteiten als een van de weinige structuren in het lichaam die kunnen genezen door de normale cellulaire samenstelling, oriëntatie en mechanische sterkte te recreëren tot een kritieke defectgrootte, wanneer de endogene genezingscapaciteit wordt aangetast1. Bot, samen met kraakbeen en ligament, ondersteunt en vergemakkelijkt de lichaamsbeweging, terwijl het ook mineralen en vetten opslaat en bloedcellen produceert. Als hard, dicht bindweefsel bestaat bot voornamelijk uit een anorganische fase, water en organisch materiaal dat voornamelijk bestaat uit collageenvezels2. Cellen zijn ingebed in deze sterk gemineraliseerde matrix van collageen I-vezels en hydroxyapatiet (HA) kristallen, die een hiërarchische structuur vormen3.
De complexe organisatie van dit weefsel maakt de fabricage van synthetische alternatieven om de heterogene botmicro- en nano-omgevingen te repliceren uitzonderlijk uitdagend3. Voor dit doel zijn verschillende materialen, waaronder biokeramiek, met cellen beladen hydrogels en synthetische materialen voorgesteld als oplossingen om botmatrices te maken. Onder de steigerfabricagetechnieken zijn onlangs op 3D-printen gebaseerde technieken naar voren gekomen en hebben ze veel aandacht gekregen van de tissue engineering-gemeenschap vanwege hun opmerkelijke vermogen om de fabricage van zeer geavanceerde en nauwkeurige structuren mogelijk te maken met een grote belofte van patiëntspecifieke behandeling 4,5,6 . Hydrogels zijn de meest populaire keuze van matrix-mimics en bio-inkten, omdat ze samen met cellen en bioactieve moleculen kunnen worden afgedrukt en functionele constructen genereren6. Hydrogels missen echter de functionele eigenschappen van bot, zoals mechanische sterkte en een sterk verkalkte, anorganische fase die metabolisch actieve cellen bevat.
3D-geprinte keramische steigers vereisen meestal nabewerkingsstappen, waaronder sinteren, behandelingen op hoge temperatuur of het gebruik van agressieve chemicaliën die grondig moeten worden gewassen voordat ze in vitro of in vivo worden toegepast5. Om deze beperkingen aan te pakken, hebben Lode et al.7 onlangs een pasta op basis van α tricalciumfosfaat ontwikkeld, gevormd door hydroxyapatiet, die onder fysiologische omstandigheden kan worden afgedrukt en ingesteld. Dit materiaal kan echter nog steeds niet samen met levende cellen worden afgedrukt, omdat het nabehandeling in een vochtige omgeving en daaropvolgende onderdompeling in waterige oplossingen gedurende een lange periode vereist.
Als alternatief zijn celbeladen hydrogels met anorganische deeltjes erin opgenomen voorgesteld als vervanging voor 3D-botmatrix 8,9. Ondanks hun grote vermogen om de levensvatbaarheid van cellen te ondersteunen, zijn ze niet in staat om de dicht gemineraliseerde botweefselomgeving samen te vatten. Thrivikarman et al.10 hanteerden een biomimetische benadering waarbij een oververzadigd calcium- en fosfaatmedium werd gebruikt met een niet-collageenachtig eiwitanaloog om de apatietafzetting op nanoschaal beter na te bootsen. Hun constructies kunnen echter nog steeds geen rigide 3D-constructies genereren met micro- en macroschaalarchitectuur die op bot lijkt.
De huidige studie pakt deze tekortkomingen aan door de ontwikkeling van een printstrategie om bot-nabootsende constructies te fabriceren, in anorganische en organische fasen, die in staat zijn om zowel cellen als groeifactoren te integreren11. COBICS recapituuleert op unieke wijze de minerale en cellulaire structuur van bot met behulp van een op microgel gebaseerde bioprinttechniek. Het protocol hierin beschrijft het proces van het synthetiseren van de keramische botinkt en op gelatine gebaseerde microgels en vervolgens het combineren van cellen die COBICS mogelijk maken. Het proces begint met de synthese van het belangrijkste precursormateriaal van de botinkt. De cross-linkable hydrogel wordt vervolgens gesynthetiseerd en gevormd tot microgels. Ten slotte wordt de botinkt omnidirectioneel afgezet in een steunbad van de microgels beladen met cellen (figuur 1).
De botinkt kan worden afgedrukt in elke suspensie van microgels die de juiste vloeigrenskenmerken hebben, dat wil zeggen het vermogen om te fluïdiseren met een specifieke afschuifsnelheid en vervolgens de gedeponeerde structuur te ondersteunen. Er zijn twee flexibele benaderingen gedemonstreerd: een suspensie bestaande uit gelatinemicrogels en een suspensie bestaande uit gelatinemethacrylaat (GelMA) microgels. De eerste suspensie lost op wanneer de temperatuur wordt verhoogd tot 37 °C, de vrije vorm omkeerbare inbedding van gesuspendeerde hydrogels (FRESH) techniek12, terwijl de laatste na het afdrukken kan worden gefotocrosslinkt, waardoor de microgels effectief aan elkaar worden "gestikt" en de bedrukte botinkt op zijn plaats wordt vergrendeld. De huidige studie richt zich op het gebruik van GelMA als de matrix, omdat het het unieke voordeel biedt dat het de celgroei kan ondersteunen met in situ printen van complexe bot mimetische structuren. Uiteindelijk maakt deze aanpak het mogelijk om complexe weefselmodellen te genereren met hoge niveaus van biomimicry en brede implicaties voor ziektemodellering, medicijnontdekking en regeneratieve engineering.
Figuur 1: Schematische weergave van de workflow. (A) De botinkt wordt gesynthetiseerd op basis van α-tricalciumfosfaatsynthese en de daaropvolgende combinatie met glycerol, polysorbaat 80 en ammoniumfosfaatdibasisch. (B) GelMA-microgels worden vervaardigd door de water-in-olie-emulsiemethode. De verkregen microgels worden vervolgens (C) gehydrateerd en (D) gecombineerd met cellen. Cel-microgel composieten worden vervolgens gebruikt als een korrelig bad waarin de botinkt wordt afgezet. (E) Het hele construct wordt vervolgens UV-crosslinked en overgebracht naar de incubator voor kweek. Afkortingen: α-TCP = α-tricalciumfosfaat; GelMA =gelatinemethacrylaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fabricage van beeninkt
- Synthese van α-tricalciumfosfaat
- Weeg calciumwaterstoffosfaat (CaHPO4) en calciumcarbonaat (CaCO3) poeders af in een 3:2 Ca:P molaire verhouding. Gebruik een spatel om de twee poeders grondig te homogeniseren.
- Voeg het mengsel van calciumwaterstoffosfaat-calciumcarbonaatpoeder toe aan een zirkoniakroes, zodat deze niet meer dan 75% vol is.
OPMERKING: Om besmetting te voorkomen, gebruikt u een nieuwe smeltkroes of een smeltkroes die eerder is gebruikt om hetzelfde materiaal te maken. Om schoon te maken, spoel met 100% ethanol en droog aan de lucht in een zuurkast totdat het volledig droog is voordat u de poeders toevoegt. - Breng de kroes over in een oven. Verwarm tot 1.400 °C met een snelheid van 5 °C/min en houd dit 3 uur vast.
- Doof de reactie door de kroes uit de oven te verwijderen en bovenop een vuurvast blok te laten. Laat het volledig afkoelen voordat u het hanteert.
OPMERKING: Gebruik een kroestang van de juiste lengte en zorg voor voldoende hittebescherming. - Gebruik een vijzel en stamper om de α-TCP-cake zodanig te breken en te malen dat de resulterende korrels een maximale grootte van 200 μm hebben.
OPMERKING: Gebruik een standaard roestvrijstalen zeef om de juiste deeltjesgrootte te garanderen. - Vermaal de korrels verder met behulp van een planetaire molen in twee fasen. Voeg eerst 3 mm yttria-gestabiliseerde zirkoniaballen toe in een gewichtsverhouding van 8: 1 ballen: poeder, vervolgens 100% ethanol in een gewichtsverhouding van 3: 1 ethanol: poeder. Zet het deksel vast en maal gedurende 2 uur bij 180 tpm.
- Verzamel de ophanging en scheid de ballen, met behulp van 100% ethanol voor het wassen.
- Droog de suspensie in een oven op 120 °C gedurende 24 uur.
- Voeg het gedroogde poeder toe aan maalpotten met 1 mm zirkoniaballen en 100% ethanol in dezelfde gewichtsverhoudingen als in de eerste fase. Maal gedurende 2 uur bij 180 tpm, scheid en droog.
OPMERKING: De volledige syntheseprocedure is weergegeven in figuur 1A.
- Formulering van been-inkt
- Om de botinkt te maken, voegt u 2 g α-TCP-poeder toe aan een kogelmolenpot die 630 μL glycerol en 130 μL polysorbaat 80 bevat terwijl u voortdurend roert met een spatel.
- Voeg 100 mg ammoniumfosfaat dibasisch ((NH4)2HPO4, APD) toe en roer om te combineren.
OPMERKING: Overmatig residu van vloeibare fasen achtergelaten op de spatel zal resulteren in een verhoudingsonbalans van de inktcomponenten en dus de kinetiek van de instelling. - Voeg een zirkoniabal van 25 mm toe, bevestig het deksel en plaats het gedurende 60 minuten bij 180 tpm in een planetaire molen, waarbij je halverwege pauzeert om de zijkanten van de pot met een spatel naar beneden te schrapen.
- Gebruik een spatel om de inkt in een spuit van 1 ml te laden. Wikkel voldoende om contact met vocht te voorkomen. Bewaren bij −20 °C indien niet onmiddellijk gebruikt.
- Karakterisering van de microstructuur van de botinkt
- Druk de bone-ink af in gedeïoniseerd water en laat 5 minuten uitharden.
- Was het monster 3x met 100% ethanol en laat het volledig drogen.
- Laag met een dunne laag (15 nm dikte) goud.
- Leg micrografieën vast met behulp van een veldemissie scanning elektronenmicroscoop bij een versnellingsspanning van 5 kV.
2. Fabricage van microgel suspensies voor bedrukking
- Synthese van GelMA
OPMERKING: Deze procedure is getest op batchgrootten bestaande uit 10 g en 20 g gelatine. Deze methode beschrijft metingen voor een batch met 10 g.- Maak een 10% g/w oplossing van gelatine type A (varkens, Bloeisterkte 300) in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) door 10 g gelatine af te wegen en toe te voegen aan een erlenmeyer met 90 ml PBS. Verwarm al roerend tot 50 °C tot de gelatine volledig is opgelost.
- Voeg 5,796 ml methacrylzuuranhydride toe. Plaats een rubberen dop op de erlenmeyer en blijf gedurende 90 minuten roeren in het donker bij 50 °C.
LET OP: Methacrylzuuranhydride is giftig bij inademing of inslikken en is irriterend voor de huid en de ogen. Behandel alleen in een zuurkast en gebruik geschikte PBM's. - Doof de reactie door de inhoud van de erlenmeyer tweevoudig te verdunnen met PBS.
- Decanteer in buizen van 50 ml en centrifugeer bij 3.000 × g bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten om niet-gereageerd methacrylzuuranhydride te verwijderen.
- Dialyseer het supernatant in 14 kDa afgesneden cellulosedialysebuizen tegen gedeïoniseerd water bij 40 °C gedurende 5 dagen onder voorzichtig roeren. Vervang het gedeïoniseerde water elke dag.
- Bereid je voor op opslag door in buizen van 50 ml te decanteren, de dop vast te zetten en 12 uur in de koelkast te plaatsen. Bewaren in de koelkast voor maximaal 7 dagen.
- Vries in met vloeibare stikstof en lyofiel onmiddellijk gedurende 5 dagen bij −54 °C en 0,4 mbar.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de tubes niet meer dan 40 ml vloeistof bevatten bij het invriezen. Eenmaal bevroren, vervangt u de dop door een bekleding die gasuitwisseling mogelijk maakt, zoals een delicaat taakdoekje dat is beveiligd met een elastische band. - Bewaar het resulterende schuim in een vriezer bij −20 °C totdat het nodig is voor de synthese van microgelsuspensie.
- Synthese van GelMA microgels
OPMERKING: De microgels worden gesynthetiseerd met behulp van een water-in-olie emulsiemethode13 (figuur 2). Deze methode is getest op GelMA-oplossingsvolumes van 1-10 ml. Hetzelfde protocol kan worden gebruikt om gelatinemicrogels te synthetiseren die worden gebruikt om zelfstandige botafdrukken te printen.- Maak een GelMA-oplossing van 10% zonder g/w in PBS door de gelofieliseerde GelMA te wegen, toe te voegen aan een buis met PBS en te verwarmen in een waterbad bij 50 °C totdat deze volledig gehydrateerd is.
- Voeg 37 ml olie per 1 ml GelMA-oplossing toe aan een bekerglas en zorg ervoor dat het niet meer dan 65% vol is.
- Zet een dubbelbekersysteem op een hete plaat met magnetisch roeren door het bekerglas met olie in een groter bekerglas te plaatsen.
OPMERKING: De grootte van de twee bekers moet zodanig zijn dat ijs gemakkelijk in de ruimte tussen hun muren kan worden gedropt. De opstelling is weergegeven in figuur 2. - Verwarm al roerend tot 40 °C.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de vortex niet turbulent is en een diepte heeft van ongeveer 1/3 van de hoogte van de olie in het bekerglas. - Laad de GelMA-oplossing in een spuit en voeg deze druppelsgewijs toe aan de roerolie door een filter van 0,45 μm. Laat de emulsie gedurende 10 minuten in evenwicht zijn.
- Verlaag de temperatuur van de emulsie tot 15 °C om de bollen thermisch te stabiliseren door gemalen ijs toe te voegen aan de ruimte tussen de twee bekers.
- Voeg aceton toe aan de draaiende emulsie in een volumeverhouding van 1:11 GelMA-oplossing tot aceton.
OPMERKING: Voeg de aceton voorzichtig toe door een trechter om te voorkomen dat de emulsie wordt verstoord. Roer gedurende 60 min. - Decanteer de inhoud van het bekerglas in buizen van 50 ml en zorg ervoor dat u de wanden van het bekerglas met aceton wast. Laat 20 minuten staan om de gedehydrateerde microgels naar de bodem te laten zakken.
- Gooi het supernatant weg en was minstens 2x met aceton.
OPMERKING: Het supernatant moet duidelijk zijn. - Consolideer in één buis, vul aan met aceton en soniceer gedurende 10 s. Was 2x met aceton.
- Bewaren in aceton bij kamertemperatuur totdat dit nodig is voor het afdrukken.
- De GelMA microgel suspensie voorbereiden voor bedrukking
- Bereid een 1% g/w oplossing van GelMA in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) door gelyofiliseerde GelMA in een buis te wegen, DMEM toe te voegen en te verwarmen in een waterbad bij 50 °C totdat het volledig gehydrateerd is.
- Verdamp de aceton uit de gedehydrateerde microgels en weeg het resulterende poeder in een buis. Voeg aceton toe en breng over naar een steriele omgeving.
- Om de microgelsuspensie te vormen, verdampt u het aceton en voegt u DMEM, 1% w/w GelMA-oplossing in DMEM en 2,5% m/w lithiumfenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosfinaat (LAP) initiatoroplossing toe om een uiteindelijke verpakkingsfractie van 30% te bereiken. Laat minstens 12 uur bij kamertemperatuur volledig hydrateren. Bewaren in de koelkast voor maximaal 7 dagen. Laat voor gebruik op kamertemperatuur komen.
OPMERKING: De volumes van deze reagentia zijn gebaseerd op het drooggewicht van de microgels en kunnen worden berekend met behulp van de vergelijkingen in tabel 1.
| Vergelijking | |
| x = gewicht van droge microgels (mg) | |
| Volume van 1% w/w GelMA in DMEM, a (μL) | a = 21,93x |
| Volume DMEM, b (μL) | b = 8,773x |
| Volume van 2,5% w/w LAP-oplossing, c (μL) | c = 0,6267x |
| Totaal volume geproduceerde microgelsuspensie (μL) | a + b + c |
Tabel 1: Vergelijkingen voor het berekenen van de volumes reagentia die nodig zijn om de GelMA-microgelsuspensies te hydrateren. Afkortingen: GelMA = gelatine methacrylaat; LAP = lithiumfenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosfinaat.
Figuur 2: Schema van de olie-emulsiemethode die wordt gebruikt voor microgelsynthese. De opstelling met dubbele beker toont een bekerglas met de roerende (aangegeven met pijl) emulsie die in een groter bekerglas is geplaatst om afkoeling mogelijk te maken. Afkorting: GelMA = gelatine methacrylaat Klik hier om een grotere versie van dit figuur te bekijken.
3. Botinkt printen in celsuspensies
OPMERKING: Op gelatine gebaseerde microgels ondersteunen de hechting van veel verschillende celtypen, waardoor deze aanpak vatbaar is voor enkele en meerdere cellen binnen de microgelmatrix. Dit protocol beschrijft de procedure voor het gebruik van van vetweefsel afgeleide mesenchymale stamcellen (ADSC's), omdat dit een populair en robuust celtype is voor musculoskeletale weefseltechnologie.
- Kweek de ADSC's in dmem met een laag glucosegehalte aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine bij 37 °C en 5% CO2 tot confluent.
- Maak de ADSC's los van de weefselkweekkolf door het medium te verwijderen, te wassen met steriel PBS en te broeden op 37 °C en 5% CO2 met 0,25% trypsine gedurende 3 minuten.
- Pelleteer de cellen door centrifugeren bij 150 × g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Tel de cellen en bereken 5 × 105 cellen voor elke 1 ml GelMA-microgels. Wijs het vereiste volume celsuspensie toe aan een afzonderlijke buis en pellet zoals hierboven.
- Verwijder voorzichtig zoveel mogelijk supernatant met behulp van een pipet, waarbij alleen de celkorrel overblijft. Voeg het vereiste volume microgelsuspensie toe aan de pellet en aspirateer voorzichtig om een gelijkmatige celverdeling te garanderen.
OPMERKING: Als er overtollige luchtbellen in de suspensie zijn, centrifugeer dan voorzichtig om te verwijderen en pipetteer op en neer om de cellen opnieuw te verdelen. - Laad de met cellen beladen microgelsuspensie in een reactor met behulp van een pipet.
OPMERKING: In deze studie werden 10 mm x 10 mm x 3 mm reactoren met een volumecapaciteit van 100 μL 3D-geprint. - Deponeer botinkt met een spuit van 1 ml met een naald van 23 G.
OPMERKING: Dit kan worden gedaan met een 3D-printer door een extrusiesysteem achteraf in te bouwen waarmee rechtstreeks vanaf de spuit van 1 ml kan worden afgedrukt of door de botinkt rechtstreeks in de extrusiecartridge van de printer te plaatsen (figuur 3). - Kruis de cel- en botinktbeladen GelMA microgel constructie met een UV-crosslinker lamp (405 nm) gedurende 90 s. Breng onmiddellijk over op een putplaat van de juiste grootte en dek af met volledige DMEM.
OPMERKING: De bovengenoemde 3D-geprinte reactoren passen in 24-well celkweekplaten. - Incubeer bij 37 °C en 5% CO2. Vervang het kweekmedium na 24 uur en vervolgens om de 48-72 uur indien nodig.
Figuur 3: Schematische weergave van de COBICS-procedure met de hydratatie van microgels, opname van cellen en daaropvolgende afdrukken van botinkt in de met cellen beladen microgelsuspensie. Afkorting: COBICS = keramisch omnidirectioneel bioprinten in celsuspensies; GelMA = gelatinemethacrylaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Beoordeling van de levensvatbaarheid en proliferatie van cellen
- Om de cytotoxiciteit van botinkt te beoordelen, moet u celbeladen COBICS-constructies in een volledig kweekmedium houden. Voer een Live Dead-test uit op 24 uur, 72 uur en 120 uur (of relevante tijdstippen).
- Was op elk tijdstip de constructen met PBS en voeg vervolgens een oplossing van fenolvrije DMEM toe die 4 mM calceïne en 2 mM ethidiumbromide bevat. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C en 5% CO2.
- Wassen met PBS en overbrengen naar een schaal met glazen bodem voor beeldvorming met een confocale microscoop bij Ex/Em spectra van 494/517 nm en 528/617 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
COBICS print complexe, biologisch relevante constructies zonder de noodzaak van opofferingsmaterialen of harde nabewerkingsstappen (bijv. Straling en hoge temperatuur sinteren), twee van de grootste uitdagingen bij de additieve productie van bot mimetische constructies. Om cobics-vorming van complexe botstructuren en het co-printen van cellen in microgel-suspensies aan te tonen, werden representatieve beelden van botachtige composieten gemaakt van de botinkt genomen en werd een semikwantitatieve analyse van de levensvatbaarheid van ADSC in COBICS gedurende maximaal 7 dagen uitgevoerd. Figuur 4 toont het vermogen om complexe botachtige structuren te fabriceren door de afzetting van botinkt in het steunbad dat bestaat uit gelatine-microgels, die zich gedragen als een niet-Newtoniaanse vloeistof, reagerend als een vaste stof die begint te stromen als een viskeuze vloeistof onder hoge schuifspanning. De geprinte constructies kunnen vervolgens worden geïsoleerd uit het stroperige bad (figuur 4A,B).
De printer die wordt gebruikt voor het realiseren van de bot-nabootsende constructies in figuur 4 is een multihead printer uitgerust met een aangepaste extruder. Een milliliter van de botinkt werd in een 3 ml drukspuit geladen, die in de extruder werd gemonteerd. Alle gebruikte naalden hadden een binnendiameter van 0,2-0,8 mm. Computermodellen van de bot-nagebootste structuren werden gemaakt met behulp van een CAD-modelleringssoftware en geconverteerd naar STL-bestanden, waarna de G-code werd gegenereerd. De constructies werden geprint in 96-well celkweekplaten met gelatinemicrogels en een compleet medium met behulp van een naald van 0,2 mm. Na het afdrukken mochten de constructies 6 minuten in de steunbaden worden geplaatst voordat ze met een pincet werden verwijderd.
Gelatinemicrogels zijn verknoopt met glutaaraldehyde om hun kweek mogelijk te maken onder de fysiologische omstandigheden van 37 °C en 5% CO2, samen met cellen11. In de huidige studie werd het systeem geïmplementeerd door de fabricage van GelMA-microgels, waardoor het hele construct UV-crosslinked kon zijn (figuur 4C) voor thermische stabiliteit en gevriesdroogd voor langdurige opslag en transport (figuur 4D, E). Gelyofiliseerde monsters kunnen worden gerehydrateerd in gedestilleerd water, PBS of celkweekmedium om hun oorspronkelijke structuur te herstellen (figuur 4E). De botinkt werd geanalyseerd door scanning elektronenmicroscopie (SEM) om de microstructuur te bepalen (figuur 4F), die de vorming van hydroxyapatietkristal na inktinstelling liet zien, vooral zichtbaar in droge omstandigheden (figuur 4Fii).
In deze studie werden cellen gemengd met GelMA-microgels en tot 5 dagen in cultuur gehouden, hetzij alleen in microgelsuspensie (figuur 5A) of in het COBICS-systeem, zoals beschreven in protocolparagraaf 3. De cellen vertoonden een goede levensvatbaarheid in aanwezigheid van de botinkt, zowel op dag 1 als dag 5, wat bevestigt dat de uitlogingsproducten van de inkt niet schadelijk waren voor de cellen (figuur 5B). Het printen van nanogestructureerde bot-mimetische keramiek in celbeladen biomaterialen biedt spatiotemporale controle over macro- en micro-architectuur, wat de real-time fabricage van complexe botconstructies in klinische omgevingen vergemakkelijkt.
Figuur 4: Voorbeeld van 3D-geprinte constructies geprint door COBICS. (A) Menselijk bot labyrint; (B) spiraalvormig Harversisch kanaal. (C) Afbeeldingen van beeninkt gedrukt in GelMA-microgels; D) gevriesdroogd en E) gerehydrateerd monster. (F) SEM-afbeeldingen van postbedrukte beeninkt die de vorming van HA-kristallen laten zien, in (i) natte en (ii) droge omstandigheden. Schaalstaven = (A,E) 3 mm, (C) 2 mm, (B) 1 mm, (Fi) 100 μm, (Fii) 3 μm. Figuur 4A,B zijn van Romanazzo et al.11. Afkortingen: COBICS = keramisch omnidirectioneel bioprinten in celsuspensies; GelMA = gelatinemethacrylaat; SEM = scanning elektronenmicroscopie; HA = hydroxyapatiet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Levende/Dode kleuring. (A) ADSC's gekweekt met GelMA-microgels; (B) ADSC's gekweekt in aanwezigheid van bone-ink (geïllustreerd in wit), met een hoge levensvatbaarheid van cellen, zowel op dag 1 als op dag 5. Foto's gemaakt met een vergroting van 10x. Inzetafbeeldingen tonen z-stacks van de respectievelijke constructies op dag 5 met de bone-ink in wit geïllustreerd. Schaalstaven = 200 μm. Afkortingen: ADSC's = van vetweefsel afgeleide mesenchymale stamcellen; GelMA = gelatinemethacrylaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De 3D-printtechniek COBICS is ontwikkeld om de fabricage van gemineraliseerde botachtige structuren via extrusie in een crosslinkable microgel-suspensie met levende cellen mogelijk te maken. De techniek is toegepast op een afbreekbare microgelsuspensie en cellen vertonen een goede levensvatbaarheid, verspreiding en osteogene differentiatiecapaciteit binnen het systeem11. Een belangrijke determinant van het succes van constructen die met deze techniek zijn gemaakt, is de juiste synthese van de α-TCP-gebaseerde bone-inkt. Ten eerste is de vorming van α-TCP sterk afhankelijk van een adequate temperatuurregeling. Voor de vorming van de juiste fase van tricalciumfosfaat is het van vitaal belang om de reactie binnen het bereik van 1.400-1.200 °C te doven voordat deze de fasegrens overschrijdt in het β-TCP faseveld14. Röntgendiffractieanalyse kan worden gebruikt om de eenfasige α-TCP-samenstelling te bevestigen. Vervolgens is het mengen van alle bot-inktprecursoren in de juiste verhoudingen cruciaal voor de vorming van een botinkt met optimale stromingseigenschappen voor extrusieprinten, insteltijd en nano-microstructuurvorming. Aangezien de GelMA microgel-ophanging het mogelijk maakt om de geprinte structuren te "vergrendelen" via photocrosslinking, kunnen de verhoudingen van precursormaterialen worden afgestemd om te optimaliseren voor de 3D-printer die wordt gebruikt. Het wordt echter sterk aanbevolen om grondige tests uit te voeren om ervoor te zorgen dat dit de integriteit van de techniek niet in gevaar brengt.
Een cruciale overweging tijdens gelma-synthese is dat alle niet-gereageerde methacrylzuuranhydride en zure bijproducten worden verwijderd via adequate centrifugatie en dialyse. Dialyse moet gedurende ten minste de opgegeven hoeveelheid tijd worden uitgevoerd, omdat methacrylzuuranhydride en zure bijproducten cytotoxisch zijn en de levensvatbaarheid van cellen kunnen beïnvloeden. Bovendien zal een lagere pH de structurele integriteit van de gels in gevaar brengen en de instelling van de botinkt beïnvloeden. Lyofilisatie voor de gespecificeerde hoeveelheid tijd is cruciaal voor de berekening van het juiste gewichtspercentage bij het bereiden van GelMA-oplossingen voor de synthese van de microgelsuspensie. Lyofiliseren gedurende een periode korter dan gespecificeerd kan ertoe leiden dat geadsorbeerd water wordt verantwoord in het droge gewicht van de GelMA, waardoor de resulterende microgels een lager gewichtspercentage GelMA bevatten en dus veel zwakker zijn dan bedoeld. De GelMA-mate van functionalisatie (DoF) beïnvloedt de covalente hydrogelvorming en dus de hydrogelstabiliteit. De optimale DoF bleek 95% te zijn.
Een andere cruciale stap is de water-in-olie emulsiesynthese van microgels. De draaisnelheid beïnvloedt de grootte van de gevormde microgels. Hogere spinsnelheden maken de fabricage van kleinere microgels mogelijk; als de vortex echter turbulent is, zal de emulsie niet stabiliseren en zal de microgelsynthese falen. Omgekeerd zal een te lage draaisnelheid ervoor zorgen dat de GelMA-oplossing samensmelt tot één massa in plaats van een stabiele emulsie te vormen. In deze studie genereerde de combinatie van de viscositeit van de olie en de gebruikte spinsnelheid microgels met een gemiddelde diameter van 100 μm wanneer ze gehydrateerd waren. Het wordt ten zeerste aanbevolen om adequate tests uit te voeren om de combinatie van olietype en roersnelheid in te stellen om consistente gewenste resultaten te geven.
Een beperking van de COBICS-techniek is dat de parameters van de inktformulering enige fijnafstelling vereisen om de extrusie met verschillende printers te optimaliseren. Hoewel het ontwerp van de techniek het mogelijk maakt om modulair te zijn, betekent dit ook dat gebruikers mogelijk een zekere mate van vallen en opstaan moeten gebruiken om de gewenste resultaten te bereiken met de apparatuur die voor hen beschikbaar is. Zoals eerder vermeld, zorgt het gebruik van een fotocrosslinkbare microgel-ophanging voor clementie over parameters via vergrendeling van de afgedrukte structuren. Verder is de huidige batchgrootte beperkt tot 2 ml bone-ink per pot. Dit kan worden aangepakt door meerdere potten te hebben, waardoor de synthese van meerdere batches van de formulering mogelijk is. Dit is mogelijk ook niet vereist, afhankelijk van de specifieke stroomkarakteristieken die de gebruiker nodig heeft voor zijn apparatuur en toepassing. Nogmaals, passende tests van de kant van de gebruiker worden aanbevolen.
Kortom, COBICS vergemakkelijkt het printen van een geoptimaliseerde, nanogestructureerde, bot-mimetische keramische inkt in celbeladen biomaterialen. Deze techniek biedt spatiotemporale controle over macro- en micro-architectuur tijdens het fabriceren van complexe botstructuren. Het gebruik van microgels zorgt voor stabilisatie van de bone-inkt, terwijl gelMA-microgels in het bijzonder de afdrukintegriteit verbeteren door fotocrosslinking-gemedieerde vergrendeling en voldoende lege ruimtes bieden voor celproliferatie en migratie. De hier beschreven aanpak heeft potentiële toepassingen in botweefseltechnologie, ziektemodellering en geneesmiddelenscreening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben om bekend te maken.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de National Health and Medical Research Council (Grant no. GNT1111694 en GNT1141602) en de Australian Research Council (Grant no. FT180100417, FL150100060 en CE14100036) erkennen. De auteurs willen graag de Biomedical Imaging Facility aan de Universiteit van New South Wales erkennen. Figuren zijn gemaakt met Biorender.com, Adobe Photoshop en Adobe Illustrator en zijn geëxporteerd onder een betaald abonnement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer Extruder | Hyrel3D | EMO-25 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon | BDAA352070 | |
| Absolute Ethanol 100% Denatured | Chem-Supply | ||
| Acetone | Chem-Supply | 154871 | |
| Alumina crucible | Coors | ||
| Ammonium phosphate dibasic (NaHPO4) | Sigma | A5764 | |
| Autodesk Fusion 360 | Autodesk | ||
| Biosafety cabinet level 2 | |||
| Calcium carbonate | Sigma | 239216 | |
| Calcium hydrogen phosphate (CaHPO4) | Sigma | C7263 | |
| Cell culture flasks | Corning | various volumes used | |
| Cellulose Dialysis Tubes, 14 kDa cut-off | Sigma | D9777 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL | |
| Dispensing Tip, 23 G | Nordson | 7018302 | |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo FIsher | 11885084 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo FIsher | 14190144 | |
| Elevator furnace | Labec | ||
| Engine HR Multihead Printer | Hyrel3D | ||
| Fetal Bovine Serum | Bovogen | ||
| Gelatin type A, from porcine skin | Sigma | G2500 | |
| General Purpose Stainless Steel Tips | Nordson EF | ||
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Human adipose derived stem cells | ATCC | PCS-500-011 | |
| LSM 800 Confocal Microscope | ZEISS | ||
| Lyophilizer (Alpha 1-4 LDplus) | Christ | 101541 | |
| Magnetic hot plate and stirrer | |||
| Methacrylic anhydride | Sigma | 276685 | |
| Mini 2 Desktop 3D Printer | LulzBot | ||
| Parafilm sealing film | Parafilm | PM996 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo FIsher | 15140122 | |
| Planetary ball mill | |||
| Planetary ball mill jar | |||
| Polyoxyethylenesorbitan monooleate Tween-80 | Sigma | P6224 | |
| Scanning electron microscope | FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM | ||
| Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech | 18813156 | |
| Stainless steel standard test sieve | |||
| Sunflower Oil | Community Co | ||
| Trypsin-EDTA 0.25% phenol red | Thermo FIsher | 25200056 | |
| ZEN Microscope Software | ZEISS | ||
| Live/Dead viability/ cytotoxicity kit for mammalian cells | Invitrogen | L3224 | |
| DMEM, low glucose, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 |
References
- Bates, P., Ramachandran, M. Bone injury, healing and grafting. Basic Orthopaedic Sciences. The Stanmore Guide. , CRC Press. Boca Raton, FL. 123-134 (2007).
- Lin, X., et al. The bone extracellular matrix in bone formation and regeneration. Frontiers in Pharmacology. 11, 757 (2020).
- Reznikov, N., et al. A materials science vision of extracellular matrix mineralization. Nature Reviews Materials. 1, 16041 (2016).
- Kang, H. W., et al. A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity. Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).
- Lin, K., et al. 3D printing of bioceramic scaffolds-Barriers to the clinical translation: From promise to reality, and future perspectives. Materials. 12 (17), 2660 (2019).
- Qu, M., et al. Multi-dimensional printing for bone tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 10 (11), 2001986 (2021).
- Lode, A., et al. Fabrication of porous scaffolds by three-dimensional plotting of a pasty calcium phosphate bone cement under mild conditions. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 682-693 (2014).
- Bernal, P. N., et al. Volumetric bioprinting of complex living-tissue constructs within seconds. Advanced Materials. 31 (42), 1904209 (2019).
- Diloksumpan, P., et al. Combining multi-scale 3D printing technologies to engineer reinforced hydrogel-ceramic interfaces. Biofabrication. 12 (2), 025014 (2020).
- Thrivikraman, G., et al. Rapid fabrication of vascularized and innervated cell-laden bone models with biomimetic intrafibrillar collagen mineralization. Nature Communications. 10 (1), 3520 (2019).
- Romanazzo, S., et al. Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions. Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
- Phromsopha, T., Baimark, Y. Preparation of starch/gelatin blend microparticles by a water-in-oil emulsion method for controlled release drug delivery. International Journal of Biomaterials. 2014, 829490 (2014).
- Moreno, D., et al. Solid-state synthesis of alpha tricalcium phosphate for cements used in biomedical applications. Boletín de la Sociedad Española de Cerámica y Vidrio. 59 (5), 193-200 (2020).
