Summary
يصف هذا البروتوكول تقنية الطباعة 3D لتصنيع هياكل تشبه العظام عن طريق إيداع حبر فوسفات الكالسيوم في دعامة حبيبية قائمة على الجيلاتين. يتم ترسيب نظائر العظام المطبوعة في شكل حر ، مع مرونة للحصاد المباشر للطباعة أو التشابك داخل مصفوفة الخلية الحية للتركيبات متعددة الأطوار.
Abstract
من الناحية الهيكلية ، فإن الأنسجة العظمية عبارة عن مركب عضوي غير عضوي يحتوي على خلايا نشطة أيضيا مضمنة داخل مصفوفة هرمية عالية التمعدن. هذه المنظمة صعبة التكرار بسبب البيئة غير المتجانسة للعظام. الطباعة الحيوية الخزفية متعددة الاتجاهات في معلقات الخلايا (COBICS) هي تقنية طباعة حيوية قائمة على ميكروجيل تكرر بشكل فريد البنية المعدنية والخلوية للعظام. تطبع COBICS تركيبات معقدة وذات صلة بيولوجية دون الحاجة إلى مواد دعم قربانية أو خطوات قاسية بعد المعالجة (مثل الإشعاع والتلبيد بدرجة حرارة عالية) ، وهما من أكبر التحديات في التصنيع الإضافي لتركيبات محاكاة العظام. يتم تمكين هذه التقنية عن طريق البثق الحر لحبر جديد قائم على فوسفات الكالسيوم داخل معلق ميكروجيل قائم على الجيلاتين. تسمح خصائص إجهاد الخضوع للتعليق بالترسب ودعم بنية العظام المطبوعة. تشابك الأشعة فوق البنفسجية والترسيب النانوي ثم "قفله" في مكانه. توفر القدرة على طباعة سيراميك محاكاة العظام ذات البنية النانوية داخل المواد الحيوية المحملة بالخلايا تحكما زمانيا مكانيا في البنية الكلية والجزئية وتسهل التصنيع في الوقت الفعلي لتركيبات العظام المعقدة في البيئات السريرية.
Introduction
تتمتع العظام بقدرات تجديد ملحوظة كواحدة من الهياكل القليلة في الجسم التي يمكن أن تلتئم عن طريق إعادة تكوين تركيبتها الخلوية الطبيعية واتجاهها وقوتها الميكانيكية حتى حجم العيب الحرج ، عندما تتعرض قدرة الشفاء الداخليةللخطر 1. العظام ، جنبا إلى جنب مع الغضاريف والأربطة ، تدعم وتسهل حركة الجسم ، مع تخزين المعادن والدهون وإنتاج خلايا الدم. كنسيج ضام صلب وكثيف ، يتكون العظم بشكل أساسي من طور غير عضوي وماء ومواد عضوية تتكون بشكل أساسي من ألياف الكولاجين2. يتم تضمين الخلايا داخل هذه المصفوفة عالية التمعدن من ألياف الكولاجين I وبلورات هيدروكسيباتيت (HA) ، وتشكل بنية هرمية3.
إن التنظيم المعقد لهذا النسيج يجعل تصنيع البدائل الاصطناعية لتكرار البيئات الدقيقة والنانوية العظمية غير المتجانسة تحديا استثنائيا3. لهذا الغرض ، تم اقتراح مجموعة متنوعة من المواد ، بما في ذلك السيراميك الحيوي ، والهلاميات المائية المحملة بالخلايا ، والمواد الاصطناعية كحلول لإنشاء مصفوفات العظام. من بين تقنيات تصنيع السقالات ، ظهرت مؤخرا تقنيات تعتمد على الطباعة ثلاثية الأبعاد وحظيت باهتمام كبير من مجتمع هندسة الأنسجة نظرا لقدرتها الرائعة على السماح بتصنيع هياكل متطورة ودقيقة للغاية مع وعد كبير بالعلاج الخاص بالمريض4،5،6 . كانت الهلاميات المائية هي الخيار الأكثر شيوعا لمحاكاة المصفوفة والأحبار الحيوية حيث يمكن طباعتها مع الخلايا والجزيئات النشطة بيولوجيا ، مما يؤدي إلى إنشاء تركيبات وظيفية6. ومع ذلك ، تفتقر الهلاميات المائية إلى الخصائص الوظيفية للعظام ، مثل القوة الميكانيكية ومرحلة غير عضوية متكلسة للغاية تحتوي على خلايا نشطة أيضيا.
تتطلب سقالات السيراميك المطبوعة ثلاثية الأبعاد عادة خطوات ما بعد المعالجة ، بما في ذلك التلبيد ، أو العلاجات ذات درجات الحرارة العالية ، أو استخدام المواد الكيميائية القاسية التي يجب غسلها جيدا قبل التطبيقات في المختبر أو في الجسم الحي 5. لمعالجة هذه القيود ، طور Lode et al.7 مؤخرا عجينة أساسها فوسفات α-tricalcium مكونة من هيدروكسيباتيت ، والتي يمكن طباعتها ووضعها في ظل ظروف فسيولوجية. ومع ذلك ، لا يزال يتعذر طباعة هذه المادة مع الخلايا الحية لأنها تتطلب المعالجة اللاحقة في بيئة رطبة والغمر المائي اللاحق لفترة طويلة.
بدلا من ذلك ، تم اقتراح الهلاميات المائية المحملة بالخلايا مع جزيئات غير عضوية مدمجة كبديل لمصفوفة العظام ثلاثية الأبعاد 8,9. على الرغم من قدرتها الكبيرة على دعم بقاء الخلايا ، إلا أنها غير قادرة على تلخيص بيئة الأنسجة العظمية المعدنية الكثيفة. اعتمد Thrivikarman et al.10 نهج المحاكاة الحيوية حيث تم استخدام وسط الكالسيوم والفوسفات المفرط التشبع مع نظير بروتين غير كولاجيني لتقليد ترسب الأباتيت النانوي بشكل أفضل. ومع ذلك ، لا تزال بنياتها غير قادرة على توليد بنيات 3D جامدة مع بنية صغيرة وكبيرة تشبه العظام.
تعالج الدراسة الحالية أوجه القصور هذه من خلال تطوير استراتيجية طباعة لتصنيع تركيبات تحاكي العظام ، في المراحل غير العضوية والعضوية ، القادرة على دمج كل من الخلايا وعوامل النمو11. تلخص COBICS بشكل فريد البنية المعدنية والخلوية للعظام باستخدام تقنية الطباعة الحيوية القائمة على microgel. يصف البروتوكول هنا عملية توليف حبر العظام الخزفي والهلام الدقيق القائم على الجيلاتين ثم الجمع بين الخلايا التي تمكن COBICS. تبدأ العملية بتوليف مادة السلائف الرئيسية لحبر العظام. ثم يتم تصنيع هيدروجيل قابل للربط وتشكيله في كبسولات هلامية دقيقة. أخيرا ، يتم ترسيب حبر العظام في كل اتجاه في حمام دعم من المواد الهلامية الدقيقة المحملة بالخلايا (الشكل 1).
يمكن طباعة الحبر العظمي في أي تعليق من الهلاميات الدقيقة التي لها خصائص إجهاد الخضوع المناسبة ، أي القدرة على التمييع بمعدل قص محدد وبالتالي دعم الهيكل المترسب. تم عرض نهجين مرنين: معلق يتكون من كبسولات جيلاتينية دقيقة ومعلق يتكون من كبسولات ميكروجيلاتينية ميثاكريلات (GelMA). يذوب التعليق السابق عندما ترتفع درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية ، وتقنية التضمين الحر القابل للانعكاس للهلاميات المائية المعلقة (FRESH)12 ، بينما يمكن ربط الأخير ضوئيا بعد الطباعة ، مما يؤدي إلى "خياطة" الكبسولات الهلامية الدقيقة معا بشكل فعال وقفل الحبر العظمي المطبوع في مكانه. تركز الدراسة الحالية على استخدام GelMA كمصفوفة لأنها توفر ميزة فريدة تتمثل في القدرة على دعم نمو الخلايا من خلال الطباعة في الموقع لهياكل محاكاة العظام المعقدة. في نهاية المطاف ، يتيح هذا النهج توليد نماذج الأنسجة المعقدة ذات المستويات العالية من المحاكاة الحيوية والآثار الواسعة لنمذجة الأمراض واكتشاف الأدوية والهندسة التجديدية.
الشكل 1: رسم تخطيطي لسير العمل . (أ) تخليق الحبر العظمي بدءا من تخليق فوسفات α-tricalcium واتحاده اللاحق مع الجليسرول وبوليسوربات 80 وفوسفات الأمونيوم ثنائي القاعدة. (ب) يتم تصنيع الهلاميات الدقيقة GelMA بطريقة مستحلب الماء في الزيت. ثم يتم ترطيب الكبسولات الهلامية الدقيقة التي تم الحصول عليها (C) و (D) مع الخلايا. ثم يتم استخدام مركبات الخلايا microgel كحمام حبيبي يتم فيه ترسيب حبر العظام. (ه) ثم يتم ربط البناء بأكمله بالأشعة فوق البنفسجية ونقله إلى الحاضنة للثقافة. الاختصارات: α-TCP = فوسفات α-tricalcium ؛ GelMA = الجيلاتين ميثاكريلات. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تصنيع الحبر العظمي
- تخليق فوسفات α-tricalcium
- قم بوزن مساحيق فوسفات هيدروجين الكالسيوم (CaHPO4) وكربونات الكالسيوم (CaCO 3) بنسبة مولار3: 2 Ca: P. باستخدام ملعقة ، قم بتجانس المساحيق تماما.
- أضف خليط مسحوق فوسفات هيدروجين الكالسيوم وكربونات الكالسيوم إلى بوتقة زركونيا بحيث لا تزيد عن 75٪ ممتلئة.
ملاحظة: لتجنب التلوث ، استخدم بوتقة جديدة أو بوتقة كانت تستخدم سابقا لصنع نفس المادة. للتنظيف ، اشطفه بالإيثانول 100٪ وجففه بالهواء في غطاء دخان حتى يجف تماما قبل إضافة المساحيق. - نقل البوتقة إلى الفرن. يسخن إلى 1400 درجة مئوية بمعدل 5 درجات مئوية / دقيقة ويستمر لمدة 3 ساعات.
- قم بإخماد التفاعل عن طريق إزالة البوتقة من الفرن واتركها فوق كتلة مقاومة للحرارة. اتركه ليبرد تماما قبل التعامل معه.
ملاحظة: استخدم ملقط بوتقة بطول مناسب وتأكد من الحماية الكافية من الحرارة. - استخدم الهاون والمدقة لكسر وطحن كعكة α-TCP بحيث يكون حجم الحبيبات الناتجة 200 ميكرومتر كحد أقصى.
ملاحظة: استخدم غربالا قياسيا من الفولاذ المقاوم للصدأ لضمان الحجم الصحيح للجسيمات. - مزيد من طحن الحبيبات باستخدام مطحنة الكواكب على مرحلتين. أولا ، أضف كرات زركونيا مثبتة بالإيتريا 3 مم بنسبة وزن 8: 1 كرات: مسحوق ، ثم إيثانول 100٪ بنسبة وزن 3: 1 إيثانول: مسحوق. تأمين الغطاء وطحن لمدة 2 ساعة في 180 دورة في الدقيقة.
- جمع التعليق وفصل الكرات ، وذلك باستخدام الإيثانول 100 ٪ للغسيل.
- جفف المعلق في الفرن على حرارة 120 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- أضف المسحوق المجفف إلى برطمانات الطحن مع كرات زركونيا 1 مم وإيثانول 100٪ بنفس نسب الوزن كما في المرحلة الأولى. طحن لمدة 2 ساعة عند 180 دورة في الدقيقة ، منفصلة وجافة.
ملاحظة: يتم تمثيل إجراء التوليف بأكمله في الشكل 1A.
- صياغة الحبر العظمي
- لعمل حبر العظم ، أضف 2 جم من مسحوق α-TCP إلى جرة مطحنة الكرة التي تحتوي على 630 ميكرولتر من الجلسرين و 130 ميكرولتر من بوليسوربات 80 مع التحريك المستمر باستخدام ملعقة.
- يضاف 100 ملغ من فوسفات الأمونيوم ثنائي القاعدة ((NH 4)2HPO4، APD) ويحرك المزيج.
ملاحظة: ستؤدي البقايا المفرطة للأطوار السائلة المتبقية على الملعقة إلى اختلال توازن نسبة مكونات الحبر ، وبالتالي حركية الإعداد. - أضف كرة زركونيا مقاس 25 مم ، وقم بتأمين الغطاء ، وضعها داخل مطحنة كوكبية لمدة 60 دقيقة عند 180 دورة في الدقيقة ، وتوقف مؤقتا في منتصف الطريق لكشط جوانب الجرة باستخدام ملعقة.
- باستخدام ملعقة ، قم بتحميل الحبر في حقنة سعة 1 مل. لف بشكل كاف لتجنب ملامسة الرطوبة. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية إذا لم يستخدم على الفور.
- توصيف البنية المجهرية للحبر العظمي
- اطبع الحبر العظمي في ماء منزوع الأيونات واتركه لمدة 5 دقائق.
- اغسل العينة 3x بالإيثانول 100٪ واتركها تجف تماما.
- معطف بطبقة رقيقة (سمك 15 نانومتر) من الذهب.
- التقط الصور المجهرية باستخدام مجهر إلكتروني ماسح للانبعاثات الميدانية بجهد تسارع يبلغ 5 كيلو فولت.
2. تصنيع معلقات ميكروجيل للطباعة
- توليف GelMA
ملاحظة: تم اختبار هذا الإجراء لأحجام الدفعات التي تتكون من 10 جم و 20 جم من الجيلاتين. تفصل هذه الطريقة قياسات دفعة باستخدام 10 جم.- اصنع محلول 10٪ وزن / وزن من الجيلاتين من النوع A (الخنازير ، قوة بلوم 300) في محلول ملحي 1x مخزن بالفوسفات (PBS) عن طريق وزن 10 جم من الجيلاتين وإضافته إلى دورق مخروطي مع 90 مل من PBS. يسخن إلى 50 درجة مئوية مع التحريك حتى يذوب الجيلاتين تماما.
- أضف 5.796 مل من أنهيدريد الميثاكريليك. ضع غطاء مطاطي على القارورة المخروطية واستمر في التقليب في الظلام عند 50 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
تنبيه: أنهيدريد الميثاكريليك سام إذا تم استنشاقه أو ابتلاعه وهو مهيج للجلد والعين. تعامل فقط داخل غطاء الدخان واستخدم معدات الوقاية الشخصية المناسبة. - إخماد التفاعل عن طريق تخفيف محتويات القارورة المخروطية ذات شقين باستخدام PBS.
- صب في أنابيب سعة 50 مل وأجهزة طرد مركزي عند 3000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق لإزالة أنهيدريد الميثاكريليك غير المتفاعل.
- قم بغسيل المادة الطافية داخل أنابيب غسيل السليلوز المقطوعة 14 كيلو دالتون ضد الماء منزوع الأيونات عند 40 درجة مئوية لمدة 5 أيام مع التحريك برفق. استبدل الماء منزوع الأيونات كل يوم.
- استعد للتخزين عن طريق الصب في أنابيب سعة 50 مل ، وتأمين الغطاء ، ووضعه في الثلاجة لمدة 12 ساعة. تخزينها في الثلاجة لمدة تصل إلى 7 أيام.
- تجمد باستخدام النيتروجين السائل وتجف على الفور لمدة 5 أيام عند -54 درجة مئوية و 0.4 ملي بار.
ملاحظة: تأكد من أن الأنابيب لا تحتوي على أكثر من 40 مل من السائل عند التجميد. بمجرد التجميد ، استبدل الغطاء بغطاء يسمح بتبادل الغازات مثل مسح المهمة الدقيق المثبت بشريط مطاطي. - قم بتخزين الرغوة الناتجة في الفريزر عند -20 درجة مئوية حتى تكون مطلوبة لتخليق تعليق ميكروجيل.
- توليف الهلاميات الدقيقة GelMA
ملاحظة: يتم تصنيع الهلاميات الدقيقة باستخدام طريقة مستحلب الماء في الزيت13 (الشكل 2). تم اختبار هذه الطريقة لأحجام محلول GelMA من 1-10 مل. يمكن استخدام نفس البروتوكول لتجميع الهلاميات الدقيقة الجيلاتينية المستخدمة لطباعة مطبوعات العظام المستقلة.- اصنع محلول GelMA بنسبة 10٪ وزن / وزن في PBS عن طريق وزن GelMA المجفف بالتجميد ، وإضافته إلى أنبوب مع PBS ، وتسخينه في حمام مائي عند 50 درجة مئوية حتى يتم ترطيبه بالكامل.
- أضف 37 مل من الزيت لكل 1 مل من محلول GelMA إلى دورق ، مع التأكد من أنه لا يزيد عن 65٪ ممتلئ.
- قم بإعداد نظام دورق مزدوج على لوح تسخين مع التقليب المغناطيسي عن طريق وضع الكأس الزجاجية التي تحتوي على الزيت داخل كأس زجاجية أكبر.
ملاحظة: يجب أن يكون حجم الزجاجيتين بحيث يمكن إسقاط الثلج بسهولة في الفراغ بين جدرانهما. يظهر الإعداد في الشكل 2. - يسخن إلى 40 درجة مئوية مع التحريك.
ملاحظة: تأكد من أن الدوامة ليست مضطربة ويبلغ عمقها حوالي 1/3 من ارتفاع الزيت في الدورق. - قم بتحميل محلول GelMA في حقنة وأضفه قطرة إلى زيت التحريك من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر. اترك المستحلب يتوازن لمدة 10 دقائق.
- خفض درجة حرارة المستحلب إلى 15 درجة مئوية لتثبيت الكرات حراريا عن طريق إضافة الثلج المجروش إلى الفراغ بين الزجاجين.
- أضف الأسيتون إلى مستحلب الغزل بنسبة حجم 1:11 محلول GelMA إلى الأسيتون.
ملاحظة: أضف الأسيتون برفق من خلال قمع لتجنب تعطيل المستحلب. يقلب لمدة 60 دقيقة. - صب محتويات الكأس الزجاجية في أنابيب سعة 50 مل ، مع التأكد من غسل جدران الكأس الزجاجية بالأسيتون. اتركيه لمدة 20 دقيقة للسماح للكبسولات الهلامية المجففة بالاستقرار في القاع.
- تخلص من المادة الطافية واغسلها على الأقل 2x بالأسيتون.
ملاحظة: يجب أن يكون الطافي واضحا. - دمج في أنبوب واحد ، وأعلى مع الأسيتون ، وصوتيك لمدة 10 ثوان. غسل 2x مع الأسيتون.
- يحفظ في الأسيتون في درجة حرارة الغرفة حتى يكون مطلوبا للطباعة.
- تحضير معلق ميكروجيل GelMA للطباعة
- قم بإعداد محلول 1٪ وزن / وزن من GelMA في وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) عن طريق وزن GelMA المجفف بالتجميد في أنبوب ، وإضافة DMEM ، وتسخينه في حمام مائي عند 50 درجة مئوية حتى يتم ترطيبه بالكامل.
- تبخر الأسيتون من الهلاميات الدقيقة المجففة ووزن المسحوق الناتج في أنبوب. أضف الأسيتون وانقله إلى بيئة معقمة.
- لتشكيل معلق microgel ، قم بتبخير الأسيتون وإضافة DMEM ، 1٪ وزن / وزن محلول GelMA في DMEM ، و 2.5٪ وزن / وزن محلول بادئ ليثيوم فينيل -2،4،6-ثلاثي ميثيل بنزويل فوسفينات (LAP) لتحقيق جزء تعبئة نهائي بنسبة 30٪. اتركيه لترطيب كامل لمدة 12 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. تخزينها في الثلاجة لمدة تصل إلى 7 أيام. السماح للتصل إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
ملاحظة: تعتمد أحجام هذه الكواشف على الوزن الجاف للكبسولات الهلامية الدقيقة ويمكن حسابها باستخدام المعادلات الواردة في الجدول 1.
| معادلة | |
| x = وزن الهلام الدقيق الجاف (ملغ) | |
| حجم 1٪ وزن / وزن GelMA في DMEM ، أ (ميكرولتر) | أ = 21.93 س |
| حجم DMEM ، ب (ميكرولتر) | ب = 8.773x |
| حجم 2.5٪ وزن / وزن محلول LAP ، c (ميكرولتر) | ج = 0.6267x |
| الحجم الكلي لتعليق ميكروجيل المنتج (ميكرولتر) | أ + ب + ج |
الجدول 1: معادلات لحساب أحجام الكواشف المطلوبة لترطيب معلقات GelMA microgel. الاختصارات: GelMA = الجيلاتين ميثاكريلات. LAP = ليثيوم فينيل -2،4،6-ثلاثي ميثيل بنزويل فوسفينات.
الشكل 2: رسم تخطيطي لطريقة مستحلب الزيت المستخدمة في تخليق الميكروجيل. يوضح إعداد الكأس الزجاجية المزدوجة دورقا يحتوي على مستحلب التقليب (المشار إليه بالسهم) موضوعا داخل كأس زجاجية أكبر للسماح بالتبريد. اختصار: GelMA = الجيلاتين ميثاكريلات الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
3. طباعة الحبر العظمي في معلقات الخلية
ملاحظة: تدعم الهلاميات الدقيقة القائمة على الجيلاتين التصاق العديد من أنواع الخلايا المختلفة ، مما يجعل هذا النهج قابلا للخلايا المفردة والمتعددة داخل مصفوفة الهلام الميكروجي. يصف هذا البروتوكول إجراء استخدام الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الدهون (ADSCs) ، حيث يعد هذا نوعا شائعا وقويا من الخلايا لهندسة الأنسجة العضلية الهيكلية.
- استزرع ADSCs في DMEM منخفض الجلوكوز مكمل ب 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ بنسلين ستربتومايسين عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 حتى يتلاقى.
- افصل ADSCs عن قارورة زراعة الأنسجة عن طريق إزالة الوسط ، والغسيل باستخدام PBS المعقم ، والتحضين عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 مع 0.25٪ تربسين لمدة 3 دقائق.
- قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 150 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- عد الخلايا واحسب 5 × 105 خلايا لكل 1 مل من الهلاميات الدقيقة GelMA. قم بتخصيص الحجم المطلوب من تعليق الخلية لأنبوب منفصل وحبيبات على النحو الوارد أعلاه.
- قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الطافية بعناية باستخدام ماصة ، ولم يتبق سوى حبيبات الخلية. أضف الحجم المطلوب من معلق ميكروجيل إلى الحبيبات واستنشق برفق لضمان التوزيع المتساوي للخلايا.
ملاحظة: إذا كانت هناك فقاعات هواء زائدة في التعليق ، فقم بجهاز طرد مركزي برفق لإزالته وماصة لأعلى ولأسفل لإعادة توزيع الخلايا. - قم بتحميل معلق microgel المحمل بالخلايا في مفاعل باستخدام ماصة.
ملاحظة: في هذه الدراسة ، تمت طباعة مفاعلات ثلاثية الأبعاد مقاس 10 مم × 10 مم × 3 مم بسعة حجم 100 ميكرولتر. - قم بإيداع حبر العظم باستخدام حقنة سعة 1 مل مزودة بإبرة 23 جم.
ملاحظة: يمكن القيام بذلك باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد إما عن طريق تعديل نظام البثق الذي يسمح بالطباعة مباشرة من المحقنة سعة 1 مل أو عن طريق تحميل الحبر العظمي مباشرة في خرطوشة بثق الطابعة (الشكل 3). - قم بربط بنية GelMA microgel المحملة بالخلايا والعظام بمصباح GelMA المتقاطع للأشعة فوق البنفسجية (405 نانومتر) لمدة 90 ثانية. انقله على الفور إلى لوحة بئر بحجم مناسب وقم بتغطيتها ب DMEM الكامل.
ملاحظة: تتناسب المفاعلات المطبوعة 3D المذكورة أعلاه داخل لوحات زراعة الخلايا ذات 24 بئرا. - احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. استبدل وسط الاستزراع بعد 24 ساعة ، ثم كل 48-72 ساعة حسب الحاجة.
الشكل 3: تمثيل تخطيطي لإجراء COBICS يوضح ترطيب الهلاميات الدقيقة ، ودمج الخلايا ، والطباعة اللاحقة لحبر العظام في معلق microgel المحمل بالخلية. اختصار: COBICS = الطباعة الحيوية الخزفية متعددة الاتجاهات في تعليق الخلايا ؛ GelMA = الجيلاتين ميثاكريلات. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
4. تقييم صلاحية الخلية وانتشارها
- لتقييم السمية الخلوية لحبر العظام ، احتفظ بتركيبات COBICS المحملة بالخلايا في وسط زراعة كامل. قم بإجراء فحص Live Dead في 24 ساعة و 72 ساعة و 120 ساعة (أو النقاط الزمنية ذات الصلة).
- في كل نقطة زمنية ، اغسل التركيبات باستخدام PBS ، ثم أضف محلولا من DMEM الخالي من الفينول يحتوي على 4 mM calcein و 2 mM من بروميد الإيثيديوم. احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- اغسل باستخدام PBS وانقله إلى طبق ذو قاع زجاجي للتصوير باستخدام مجهر متحد البؤر في أطياف Ex / Em تبلغ 494/517 نانومتر و 528/617 نانومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تطبع COBICS تركيبات معقدة وذات صلة بيولوجية دون الحاجة إلى مواد دعم قربانية أو خطوات ما بعد المعالجة القاسية (مثل الإشعاع والتلبيد بدرجة حرارة عالية) وهما من أكبر التحديات في التصنيع الإضافي لتركيبات محاكاة العظام. لإثبات تكوين COBICS للهياكل العظمية المعقدة والطباعة المشتركة للخلايا في معلقات microgel ، تم التقاط صور تمثيلية لمركبات تشبه العظام مصنوعة من حبر العظام ، وتم إجراء تحليل شبه كمي لصلاحية ADSC في COBICS لمدة تصل إلى 7 أيام. يوضح الشكل 4 القدرة على تصنيع هياكل معقدة تشبه العظام عن طريق ترسب حبر العظام في حمام الدعم المكون من الهلاميات الجيلاتينية الدقيقة ، والتي تتصرف كمائع غير نيوتن ، وتستجيب كمادة صلبة تبدأ في التدفق مثل السائل اللزج تحت ضغط القص العالي. يمكن بعد ذلك عزل التركيبات المطبوعة عن الحمام اللزج (الشكل 4 أ ، ب).
الطابعة المستخدمة لتحقيق بنيات محاكاة العظام في الشكل 4 هي طابعة متعددة الرؤوس مزودة بآلة بثق مخصصة. تم تحميل ملليلتر واحد من حبر العظام في حقنة طباعة سعة 3 مل ، والتي تم تركيبها في الطارد. يبلغ قطر جميع الإبر المستخدمة 0.2-0.8 مم. تم إنشاء نماذج الكمبيوتر للهياكل المقلدة للعظام باستخدام برنامج نمذجة CAD وتحويلها إلى ملفات STL ، وبعد ذلك تم إنشاء G-code. تمت طباعة التركيبات في 96 لوحة زراعة خلوية تحتوي على كبسولات جيلاتينية دقيقة ووسط كامل باستخدام إبرة 0.2 مم. بعد الطباعة ، سمح للتركيبات بالتثبيت داخل حمامات الدعم لمدة 6 دقائق قبل إزالتها باستخدام الملقط.
تم ربط المواد الهلامية الدقيقة الجيلاتينية مع الجلوتارالدهيد للسماح بزراعتها في ظل الظروف الفسيولوجية 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ، جنبا إلى جنب مع الخلايا11. في الدراسة الحالية ، تم تنفيذ النظام من خلال تصنيع الهلاميات الدقيقة GelMA ، مما سمح للبناء بأكمله بأن يكون متشابكا بالأشعة فوق البنفسجية (الشكل 4C) من أجل الاستقرار الحراري والتجفيف بالتجميد للتخزين والنقل على المدى الطويل (الشكل 4D ، E). يمكن إعادة ترطيب العينات المجففة بالتجميد في الماء المقطر أو PBS أو وسط زراعة الخلايا لاستعادة هيكلها الأصلي (الشكل 4E). تم تحليل الحبر العظمي عن طريق المسح المجهري الإلكتروني (SEM) لتحديد بنيته المجهرية (الشكل 4F) ، والتي أظهرت تكوين بلورة هيدروكسيباتيت بعد إعداد الحبر ، خاصة في حالة الجفاف (الشكل 4Fii).
في هذه الدراسة ، تم خلط الخلايا مع الهلاميات الدقيقة GelMA والاحتفاظ بها في المزرعة لمدة تصل إلى 5 أيام ، إما في تعليق microgel فقط (الشكل 5A) أو في نظام COBICS ، كما هو مفصل في قسم البروتوكول 3. أظهرت الخلايا صلاحية جيدة في وجود الحبر العظمي ، في كل من اليوم 1 واليوم 5 ، مما يؤكد أن منتجات ترشيح الحبر لم تكن ضارة بالخلايا (الشكل 5 ب). توفر طباعة السيراميك النحاكية للعظام ذات البنية النانوية داخل المواد الحيوية المحملة بالخلايا تحكما زمانيا مكانيا في البنية الكلية والجزئية ، مما يسهل التصنيع في الوقت الفعلي لتركيبات العظام المعقدة في البيئات السريرية.
الشكل 4: مثال على التركيبات المطبوعة 3D المطبوعة بواسطة COBICS. (أ) متاهة عظمية بشرية؛ (ب) قناة هارفرس الحلزونية. (ج) صور لحبر عظمي مطبوع في هلاميات ميكرولاميا GelMA؛ د: العينة المجففة بالتجميد، ه: العينة المعاد ترطيبها. (و) صور SEM لحبر عظمي مطبوع بعد الطباعة يظهر تكوين بلورات HA ، في (i) الظروف الرطبة و (ii) الجافة. قضبان المقياس = (أ ، ه) 3 مم ، (ج) 2 مم ، (ب) 1 مم ، (في) 100 ميكرومتر ، (في) 3 ميكرومتر. الشكل 4 أ ، ب من رومانازو وآخرون 11. الاختصارات: COBICS = الطباعة الحيوية الخزفية متعددة الاتجاهات في معلقات الخلايا ؛ GelMA = الجيلاتين ميثاكريلات. SEM = المسح المجهري الإلكتروني ؛ HA = هيدروكسيباتيت. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: تلطيخ حي / ميت. (أ) ADSCs المستنبتة بالهلام الدقيق GelMA؛ (ب) ADSCs المستزرعة في وجود حبر عظمي (موضح باللون الأبيض) ، مما يدل على قابلية عالية للخلية في كل من اليوم 1 واليوم 5. الصور الملتقطة بتكبير 10x. تظهر الصور الداخلية أكوام z للتركيبات المعنية في اليوم 5 مع الحبر العظمي الموضح باللون الأبيض. قضبان المقياس = 200 ميكرومتر. الاختصارات: ADSCs = الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الدهون ؛ GelMA = الجيلاتين ميثاكريلات. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم تطوير تقنية الطباعة 3D COBICS لتمكين تصنيع الهياكل الشبيهة بالعظام المعدنية عن طريق البثق إلى تعليق ميكروجيل قابل للتشابك يحتوي على خلايا حية. تم تطبيق هذه التقنية على معلق ميكروجيل قابل للتحلل ، وتظهر الخلايا قدرة جيدة على الجدوى والانتشار والتمايز العظمي داخل النظام11. أحد المحددات الرئيسية لنجاح التركيبات التي تم إنشاؤها باستخدام هذه التقنية هو التوليف المناسب للحبر العظمي المستند إلى α-TCP. أولا ، يعتمد تكوين α-TCP بشكل كبير على التحكم الكافي في درجة الحرارة. لتكوين المرحلة الصحيحة من فوسفات ثلاثي الكالسيوم ، من الضروري إخماد التفاعل ضمن نطاق 1400-1200 درجة مئوية قبل أن يعبر حدود الطور إلى حقل طور β-TCP14. يمكن استخدام تحليل حيود الأشعة السينية لتأكيد تكوين α-TCP أحادي الطور. بعد ذلك ، يعد خلط جميع سلائف الحبر العظمي بالنسب الصحيحة أمرا بالغ الأهمية لتشكيل حبر عظمي بخصائص تدفق مثالية للطباعة بالبثق ، وتحديد الوقت ، وتشكيل البنية المجهرية النانوية. نظرا لأن تعليق GelMA microgel يسمح "بقفل" الهياكل المطبوعة عبر الربط الضوئي ، يمكن ضبط نسب المواد الأولية لتحسين طابعة 3D المستخدمة. ومع ذلك ، ينصح بشدة بإجراء اختبار شامل للتأكد من أن هذا لا يضر بسلامة التقنية.
أحد الاعتبارات الحاسمة أثناء تخليق GelMA هو إزالة جميع أنهيدريد الميثاكريليك غير المتفاعل والمنتجات الثانوية الحمضية عن طريق الطرد المركزي الكافي وغسيل الكلى. يجب إجراء غسيل الكلى لفترة زمنية محددة على الأقل ، لأن أنهيدريد الميثاكريليك والمنتجات الثانوية الحمضية سامة للخلايا ويمكن أن تؤثر على بقاء الخلية. علاوة على ذلك ، فإن انخفاض درجة الحموضة سيضر بالسلامة الهيكلية للمواد الهلامية وقد يؤثر على وضع حبر العظام. يعد التجفيد لفترة زمنية محددة أمرا بالغ الأهمية لحساب نسبة الوزن الصحيحة عند إعداد حلول GelMA لتوليف تعليق microgel. قد يؤدي التجفيد لفترة أقصر من المحدد إلى حساب الماء الممتز في الوزن الجاف ل GelMA ، مما يتسبب في احتواء الكبسولات الهلامية الدقيقة الناتجة على نسبة وزن أقل من GelMA ، وبالتالي تكون أضعف بكثير مما هو مقصود. تؤثر درجة GelMA للوظائف (DoF) على تكوين هيدروجيل تساهمي ، وبالتالي استقرار هيدروجيل. تم العثور على DoF الأمثل ليكون 95٪.
خطوة أخرى حاسمة هي تخليق مستحلب الماء في الزيت من microgels. تؤثر سرعة الغزل على حجم الهلاميات الدقيقة المتكونة. ستسمح سرعات الغزل الأسرع بتصنيع الهلاميات الدقيقة الأصغر ؛ ومع ذلك ، إذا كانت الدوامة مضطربة ، فلن يستقر المستحلب ، وسيفشل تخليق microgel. على العكس من ذلك ، فإن سرعة الدوران المنخفضة جدا ستؤدي إلى اندماج محلول GelMA في كتلة واحدة بدلا من تكوين مستحلب مستقر. في الدراسة الحالية ، أدى الجمع بين لزوجة الزيت وسرعة الدوران المستخدمة إلى توليد كبسولات هلامية دقيقة يبلغ متوسط قطرها 100 ميكرومتر عند ترطيبها. يوصى بشدة بإجراء اختبار مناسب للاتصال بمزيج من نوع الزيت وسرعة التحريك لإعطاء نتائج مرغوبة متسقة.
أحد قيود تقنية COBICS هو أن معلمات صياغة الحبر قد تتطلب بعض الضبط الدقيق لتحسين البثق باستخدام طابعات مختلفة. على الرغم من أن تصميم التقنية يسمح بأن تكون معيارية ، إلا أنه يعني أيضا أنه قد يلزم ممارسة درجة من التجربة والخطأ من قبل المستخدمين لتحقيق النتائج المرجوة مع المعدات المتاحة لهم. كما ذكرنا سابقا ، فإن استخدام تعليق microgel القابل للربط الضوئي يوفر تساهلا على المعلمات عن طريق قفل الهياكل المطبوعة. علاوة على ذلك ، يقتصر حجم الدفعة الحالية على 2 مل من الحبر العظمي لكل جرة. يمكن معالجة ذلك من خلال وجود برطمانات متعددة ، مما يسمح بتوليف دفعات متعددة من التركيبة. قد لا يكون هذا مطلوبا أيضا اعتمادا على خصائص التدفق المحددة التي يطلبها المستخدم لمعداته وتطبيقاته. مرة أخرى ، يوصى بإجراء الاختبار المناسب من جانب المستخدم.
في الختام ، تسهل COBICS طباعة حبر خزفي محسن ، ذو بنية نانوية ، محاكي للعظام داخل مواد حيوية محملة بالخلايا. توفر هذه التقنية التحكم الزماني المكاني في البنية الكلية والجزئية أثناء تصنيع الهياكل العظمية المعقدة. يسمح استخدام الكبسولات الهلامية الدقيقة بتثبيت حبر العظام ، بينما تعمل الهلاميات الدقيقة GelMA ، على وجه الخصوص ، على تعزيز سلامة الطباعة عن طريق القفل بوساطة الربط الضوئي وتوفير مساحات فارغة كافية لتكاثر الخلايا والهجرة. النهج الموصوف هنا له تطبيقات محتملة في هندسة أنسجة العظام ، ونمذجة الأمراض ، وفحص الأدوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن ينوهوا المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (رقم المنحة. GNT1111694 و GNT1141602) ومجلس البحوث الأسترالي (رقم المنحة. FT180100417 وFL150100060 وCE14100036). يود المؤلفون أن ينوهوا بمرفق التصوير الطبي الحيوي في جامعة نيو ساوث ويلز. تم إنشاء الأشكال باستخدام Biorender.com و Adobe Photoshop و Adobe Illustrator وتم تصديرها بموجب اشتراك مدفوع.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer Extruder | Hyrel3D | EMO-25 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon | BDAA352070 | |
| Absolute Ethanol 100% Denatured | Chem-Supply | ||
| Acetone | Chem-Supply | 154871 | |
| Alumina crucible | Coors | ||
| Ammonium phosphate dibasic (NaHPO4) | Sigma | A5764 | |
| Autodesk Fusion 360 | Autodesk | ||
| Biosafety cabinet level 2 | |||
| Calcium carbonate | Sigma | 239216 | |
| Calcium hydrogen phosphate (CaHPO4) | Sigma | C7263 | |
| Cell culture flasks | Corning | various volumes used | |
| Cellulose Dialysis Tubes, 14 kDa cut-off | Sigma | D9777 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL | |
| Dispensing Tip, 23 G | Nordson | 7018302 | |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo FIsher | 11885084 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo FIsher | 14190144 | |
| Elevator furnace | Labec | ||
| Engine HR Multihead Printer | Hyrel3D | ||
| Fetal Bovine Serum | Bovogen | ||
| Gelatin type A, from porcine skin | Sigma | G2500 | |
| General Purpose Stainless Steel Tips | Nordson EF | ||
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Human adipose derived stem cells | ATCC | PCS-500-011 | |
| LSM 800 Confocal Microscope | ZEISS | ||
| Lyophilizer (Alpha 1-4 LDplus) | Christ | 101541 | |
| Magnetic hot plate and stirrer | |||
| Methacrylic anhydride | Sigma | 276685 | |
| Mini 2 Desktop 3D Printer | LulzBot | ||
| Parafilm sealing film | Parafilm | PM996 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo FIsher | 15140122 | |
| Planetary ball mill | |||
| Planetary ball mill jar | |||
| Polyoxyethylenesorbitan monooleate Tween-80 | Sigma | P6224 | |
| Scanning electron microscope | FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM | ||
| Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech | 18813156 | |
| Stainless steel standard test sieve | |||
| Sunflower Oil | Community Co | ||
| Trypsin-EDTA 0.25% phenol red | Thermo FIsher | 25200056 | |
| ZEN Microscope Software | ZEISS | ||
| Live/Dead viability/ cytotoxicity kit for mammalian cells | Invitrogen | L3224 | |
| DMEM, low glucose, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 |
References
- Bates, P., Ramachandran, M. Bone injury, healing and grafting. Basic Orthopaedic Sciences. The Stanmore Guide. , CRC Press. Boca Raton, FL. 123-134 (2007).
- Lin, X., et al. The bone extracellular matrix in bone formation and regeneration. Frontiers in Pharmacology. 11, 757 (2020).
- Reznikov, N., et al. A materials science vision of extracellular matrix mineralization. Nature Reviews Materials. 1, 16041 (2016).
- Kang, H. W., et al. A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity. Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).
- Lin, K., et al. 3D printing of bioceramic scaffolds-Barriers to the clinical translation: From promise to reality, and future perspectives. Materials. 12 (17), 2660 (2019).
- Qu, M., et al. Multi-dimensional printing for bone tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 10 (11), 2001986 (2021).
- Lode, A., et al. Fabrication of porous scaffolds by three-dimensional plotting of a pasty calcium phosphate bone cement under mild conditions. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 682-693 (2014).
- Bernal, P. N., et al. Volumetric bioprinting of complex living-tissue constructs within seconds. Advanced Materials. 31 (42), 1904209 (2019).
- Diloksumpan, P., et al. Combining multi-scale 3D printing technologies to engineer reinforced hydrogel-ceramic interfaces. Biofabrication. 12 (2), 025014 (2020).
- Thrivikraman, G., et al. Rapid fabrication of vascularized and innervated cell-laden bone models with biomimetic intrafibrillar collagen mineralization. Nature Communications. 10 (1), 3520 (2019).
- Romanazzo, S., et al. Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions. Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
- Phromsopha, T., Baimark, Y. Preparation of starch/gelatin blend microparticles by a water-in-oil emulsion method for controlled release drug delivery. International Journal of Biomaterials. 2014, 829490 (2014).
- Moreno, D., et al. Solid-state synthesis of alpha tricalcium phosphate for cements used in biomedical applications. Boletín de la Sociedad Española de Cerámica y Vidrio. 59 (5), 193-200 (2020).
