Summary
Este protocolo apresenta e descreve as etapas para o isolamento, dissecção, cultivo e coloração de explantes de retina obtidos de um camundongo adulto. Este método é benéfico como um modelo ex vivo para o estudo de diferentes doenças neurovasculares da retina, como a retinopatia diabética.
Abstract
Um dos desafios na pesquisa da retina é estudar a conversa cruzada entre diferentes células da retina, como neurônios da retina, células gliais e células vasculares. Isolar, cultivar e sustentar neurônios da retina in vitro têm limitações técnicas e biológicas. A cultura de explantes de retina pode superar essas limitações e oferecer um modelo ex vivo único para estudar o cross-talk entre várias células da retina com parâmetros bioquímicos bem controlados e independentes do sistema vascular. Além disso, os explantes da retina são uma ferramenta de triagem eficaz para o estudo de novas intervenções farmacológicas em várias doenças vasculares e neurodegenerativas da retina, como a retinopatia diabética. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para isolamento e cultura de explantes da retina por um período prolongado. O manuscrito também apresenta alguns dos problemas técnicos durante este procedimento que podem afetar os resultados desejados e a reprodutibilidade da cultura de explante retinal. A imunocoloração dos vasos da retina, células gliais e neurônios demonstrou capilares da retina intactos e células neurogliais após 2 semanas do início da cultura do explante da retina. Isso estabelece explantes de retina como uma ferramenta confiável para estudar mudanças na vasculatura da retina e células neurogliais sob condições que imitam doenças da retina, como a retinopatia diabética.
Introduction
Diferentes modelos foram apresentados para estudar doenças da retina, incluindo modelos in vivo e in vitro. O uso de animais em pesquisa ainda é uma questão de contínuo debate ético e translacional1. Modelos animais envolvendo roedores, como camundongos ou ratos, são comumente utilizados em pesquisas sobre retina 2,3,4. No entanto, preocupações clínicas têm surgido devido às diferentes funções fisiológicas da retina em roedores em comparação com humanos, como a ausência de mácula ou diferenças na visão de cores5. O uso de olhos post-mortem humanos para pesquisa da retina também tem muitos problemas, incluindo, entre outros, diferenças nos antecedentes genéticos das amostras originais, no histórico médico dos doadores e nos ambientes ou estilos de vida anteriores dos doadores6. Além disso, o uso de modelos in vitro na pesquisa da retina também tem algumas desvantagens. Os modelos de cultura celular utilizados para estudar doenças da retina incluem a utilização de linhagens celulares de origem humana, células primárias ou células-tronco7. Os modelos de cultura celular utilizados têm demonstrado problemas em termos de contaminação, identificação incorreta ou desdiferenciação 8,9,10,11. Recentemente, a tecnologia organoide da retina mostrou um progresso significativo. No entanto, a construção de retinas altamente complexas in vitro tem várias limitações. Por exemplo, os organoides da retina não têm as mesmas características fisiológicas e bioquímicas que as retinas maduras in vivo. Para superar essa limitação, a tecnologia organoide da retina deve integrar mais características biológicas e celulares, incluindo células musculares lisas, vasculatura e células imunes como a micróglia12,13,14,15.
Os explantes organotípicos da retina têm emergido como uma ferramenta confiável para o estudo de doenças da retina, como a retinopatia diabética e as doenças degenerativas da retina16,17,18,19. Em comparação com outras técnicas existentes, o uso de explantes de retina suporta tanto culturas de células da retina in vitro quanto modelos animais in vivo atuais, adicionando uma característica única para estudar o cross-talk entre várias células da retina sob os mesmos parâmetros bioquímicos e independentes de variáveis sistêmicas. As culturas de explante permitem que diferentes células da retina sejam mantidas juntas no mesmo ambiente, permitindo a preservação das interações intercelulares da retina20,21,22. Além disso, um estudo anterior mostrou que os explantes da retina foram capazes de preservar a estrutura morfológica e a funcionalidade das células da retina cultivadas23. Assim, os explantes de retina podem fornecer uma plataforma decente para a investigação de possíveis alvos terapêuticos para uma ampla variedade de doenças da retina24,25,26. As culturas de explante retiniano fornecem uma técnica controlável e são substitutas muito flexíveis dos mothods existentes que permitem inúmeras manipulações farmacológicas e podem descobrir vários mecanismos moleculares27.
O objetivo geral deste trabalho é apresentar a técnica de explante retiniano como um sistema de modelo intermediário razoável entre culturas de células in vitro e modelos animais in vivo. Esta técnica pode imitar as funções da retina de uma maneira melhor do que as células dissociadas. Como várias camadas retinianas permanecem intactas, as interações intercelulares da retina podem ser avaliadas em laboratório sob condições bioquímicas bem controladas e independentes do funcionamento do sistema vascular28.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Oakland University, Rochester, MI, EUA e seguiram as diretrizes estabelecidas pela Declaração da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e Visual.
1. Preparação animal
- Mantenha os animais alojados sob uma temperatura constante em um ambiente controlado pela luz. As configurações de temperatura para a sala de alojamento de animais devem seguir as diretrizes estabelecidas pelo "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório". A faixa de temperatura para camundongos está entre 18 °C e 26 °C. Mantenha os níveis de umidade controlados e definidos em cerca de 42%.
- Para este experimento, use camundongos machos C57BL/6J (verifique a Tabela de Materiais para obter detalhes) com mais de 12 semanas de idade (um camundongo adulto foi usado para este protocolo).
NOTA: Uma cepa do tipo selvagem foi utilizada neste protocolo para a demonstração, pois não apresentava nenhuma anormalidade genética que afetasse a retina. No entanto, pode-se usar outras cepas, incluindo cepas geneticamente manipuladas, para a cultura do explante da retina. - Forneça ciclos de luz / escuridão de 12 horas através do controle de iluminação nas salas de alojamento de animais.
- Inspecione todos os animais quanto à saúde e ingestão adequada de alimentos e água duas vezes por dia durante a semana e uma vez por dia nos fins de semana. Certifique-se de fornecer-lhes alimentos frescos e água limpa.
- Se os níveis de comida e água estiverem baixos durante a semana, lave a garrafa de água e recarregue-a. Adicione alimentos frescos sempre que necessário. Troque as gaiolas sujas diariamente ou conforme necessário para a saúde dos animais.
NOTA: Para estudar os fotorreceptores e as alterações induzidas pela luz na retina, adapte os ratos durante a noite em uma caixa escura especial localizada em uma sala escura na instalação animal. - Eutanasiar os animais em sua gaiola doméstica por overdose de inalação de CO 2 usando gás CO 2 comprimido em cilindros conectados a uma câmara de CO2. Realizar a confirmação da morte usando um método secundário de eutanásia, como luxação cervical.
- Após a conclusão do procedimento, confirme a morte do animal por um método apropriado, como confirmar a parada cardíaca e respiratória ou observar pupilas fixas e dilatadas do animal.
2. Preparação de tecidos
- Uma vez que o animal é sacrificado, limpe a área com etanol a 70%. Em seguida, abra as pálpebras com uma mão para que o olho fique visível. Aplique pressão nas partes superior e inferior da órbita com a mão oposta usando pinças curvas até que o globo se projete.
- Para enuclear o olho, feche suavemente a pinça na porção posterior do olho e eleve em um movimento contínuo. Usando fórceps, segure o globo ocular do nervo óptico. Certifique-se de usar ferramentas de dissecação esterilizadas para todas as etapas e trabalhar sob condições assépticas completas.
- Mergulhe cada globo ocular em um tubo de 1,5 mL contendo 1 mL de HBSS gelado com penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL). Lave o globo ocular em HBSS duas vezes por 5 minutos cada.
- Transfira o globo ocular para um tubo de 1,5-2 mL contendo meios completos (10% FBS, 2% B27, 1% N2, 1% L-glutamina e 1% penicilina e estreptomicina).
3. Dissecção tecidual
- Dissecar a retina cuidadosamente sob um microscópio cirúrgico, conforme ilustrado sequencialmente na Figura 1.
- Faça uma incisão circunferencial ao redor do limbo para abrir o globo ocular. Remova a córnea dissecando circularmente ao longo da borda da córnea e da incisão (límbica), seguido da remoção do segmento anterior, lente e corpo vítreo, deixando um copo ocular vazio.
- Ao segurar a região da cabeça do nervo óptico com pinça fina, retire a camada externa do olho suavemente. Preste muita atenção durante a remoção do revestimento externo, a fim de não ferir a retina neural e garantir que a retina permaneça totalmente intacta.
NOTA: A retina deve ser cuidadosamente descascada do epitélio pigmentar da retina (EPR), e um único corte na cabeça do nervo óptico deve ser realizado para descolar a retina do nervo óptico. Assegure-se visualmente identificando o orifício deixado pelo nervo óptico (a cabeça do nervo óptico). - Dissecar a retina radialmente em quatro pedaços de tamanho igual.
- Siga os passos abaixo para manusear os pequenos pedaços da retina para garantir a orientação adequada da cultura da retina.
- Usando uma lâmina de tesoura dissecante, abra logo abaixo da peça da retina (Tabela de Materiais).
- Levante lentamente a peça da retina com a ponta de uma lâmina de tesoura aberta e transfira-a suavemente para a placa de cultura.
- Transfira os explantes derivados da retina isolada separadamente para inserções de cultura celular em uma placa de 12 poços, cada uma contendo 300 μL de meio de explante da retina, com o lado da célula ganglionar da retina (neurorretina) voltado para cima.
Observação : Certifique-se de que a mídia é mídia DMEM com suplementos N2 e B27. Adicione penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL) ao meio também (Tabela de Materiais). A retina é formada por múltiplas camadas de células neuronais interligadas através de sinapses e suportadas do lado de fora pela camada pigmentada do epitélio pigmentar da retina, que é a camada preta que foi removida durante a dissecção. - Remova quaisquer restos do epitélio pigmentado; no entanto, esses remanescentes podem ajudar a identificar a orientação adequada do explante. Certifique-se de que a parte pigmentada está voltada para baixo e que a parte não pigmentada está voltada para cima.
- Incubar a cultura de explante retiniano em incubadoras umidificadas a 37 °C e 5% de CO2.
- Certifique-se de que a superfície da retina está voltada para cima. Se a peça da retina estiver virada ou dobrada, tente ajustá-la suavemente à orientação correta.
NOTA: Preste muita atenção à orientação correta do explante da retina na placa de cultura. Evite qualquer inversão ou dobramento do explante na placa de cultura, pois isso resultará em falha do crescimento adequado das células da retina em cultura.
4. Cultura de explante retiniano
- Manter as culturas de explante retiniano (preparadas nas etapas 3.2-3.3) em incubadoras umidificadas a 37 °C e 5% de CO2.
- Troque metade da mídia de cada poço a cada dois dias durante 2 semanas. Faça isso pipetando 150 μL do poço com cuidado. Em seguida, adicione 150 μL de mídia fresca de volta ao poço. Evite virar o explante ao trocar a mídia.
- Verifique o explante cuidadosamente sob o microscópio antes de colocar a placa de cultura de volta na incubadora. Examine a integridade das células e a arquitetura da retina sob um microscópio de campo brilhante. Certifique-se de que o explante ainda está orientado corretamente. Use as lentes objetivas de 4x e 20x para examinar o explante.
NOTA: Evite a imersão completa do explante no meio.
5. Imuno-histoquímica
- Após 2 semanas, corrija o explante da retina removendo o meio. Faça isso lavando primeiro uma vez com 200 μL de 1x PBS e, em seguida, adicionando 300 μL de paraformaldeído a 4% em PBS 0,1 M, pH 7,4, ao poço que contém o explante e deixando-o durante a noite.
NOTA: Esta etapa pode ser feita sem remover as inserções de cultura da placa. Os explantes também podem ser transferidos para um tubo cônico de 500 μL, e a lavagem e fixação podem ser feitas dentro do tubo. - Transfira o explante para um tubo cônico de 500 μL contendo 300 μL de 1x PBS-2,5% Triton X para lavagem.
- Lave os explantes fixos no tubo três vezes durante 5 minutos cada utilizando velocidade média num agitador (25 rpm).
- Bloquear as reações inespecíficas esperadas incubando o explante com 300 μL de tampão bloqueador 1x contendo timerosal a 0,02% por 1 h à temperatura ambiente antes da incubação do anticorpo.
- Incubar os explantes fixos com os anticorpos primários durante a noite a 4 °C utilizando velocidade média num agitador.
NOTA: Detectar as células endoteliais da retina no explante fixo por coloração com o anticorpo GSL I, BSL I (lectina) (7:1.000). Detectar as células gliais nos explantes da retina por coloração com anticorpo de proteína ácida fibrilar glial de coelho (GFAP) (1:250). Detectar os neurônios da retina corando o explante com o anticorpo NeuN do coelho (1:250)29,30. Incubate s{Tual-Chalot, 2013 #117}{Tual-Chalot, 2013 #116}{Tual-Chalot, 2013 #116}ome explanta com a lectina, combinação NeuN, e incubar outros com a lectina, combinação GFAP. - No dia seguinte, remova o anticorpo primário dos tubos por aspiração com uma pipeta. Lave os explantes com 1x PBS-2,5% Triton X três vezes por 5 min cada usando velocidade média em um agitador.
- Adicione os anticorpos secundários: Goat anti-Rabbit IgG (1:500) (secundário para GFAP e NeuN) e Texas Red (7:1.000) (para a lectina). Incubar durante 1 h à temperatura ambiente utilizando velocidade média num agitador.
NOTA: Os anticorpos secundários são sensíveis à luz, por isso cubra o tubo com papel alumínio. - Remova os anticorpos secundários por aspiração e, em seguida, lave três vezes por 5 minutos cada com 1x PBS-2,5% Triton X.
- Transfira o explante do tubo para uma lâmina de vidro usando uma pipeta de transferência. Remova qualquer excesso de líquido no slide e adicione uma gota de mídia de montagem com DAPI ao slide.
- Cubra o tecido com uma tampa. Não permita bolhas de ar entre a tampa e o tecido.
- Leve as lâminas coradas para o microscópio de fluorescência e comece a tirar as imagens. É importante cobrir as lâminas coradas usando uma caixa de deslizamento, pois a coloração por fluorescência é sensível à luz.
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Representative Results
Sobrevivência das células neuronais e vasculares da retina do explante retiniano em meio de cultura ex vivo por um tempo prolongado
Ao cultivar um explante de retina utilizando nosso protocolo, fomos bem-sucedidos em manter diferentes células da retina que eram viáveis por até 2 semanas. Para verificar a presença de diferentes células da retina, foi realizada coloração por imunofluorescência do explante retiniano utilizando um marcador de células neuronais (NeuN), marcador de células gliais (GFAP) e marcador vascular (isolectina-B4) (Figura 2). A coloração mostrou neurônios da retina e células gliais bem organizados e bem desenvolvidos. Além disso, os vasos sanguíneos da retina estavam estruturalmente intactos, conforme indicado pela coloração de isolectina-B4. A integridade morfológica do explante da retina, como demonstrado pela imunocoloração, indicou que a cultura do explante da retina foi bem-sucedida na manutenção de células retinianas viáveis que poderiam ser usadas experimentalmente como modelo. As diferentes condições experimentais a serem estudadas utilizando o explante podem ser avaliadas e analisadas por coloração por imunofluorescência para múltiplos marcadores celulares utilizando o software ImageJ. A imunocoloração permite a medição dos níveis de imunorreatividade de cada marcador celular e do número de células específicas, como o número de células ganglionares da retina ou fotorreceptores, entre vários grupos experimentais.
Importância da correta orientação do explante retiniano na placa de cultura para os desfechos experimentais
A orientação correta do explante da retina na placa de cultura é alcançada pela incubação da neurorretina voltada para cima. Por outro lado, a falha do explante da retina pode resultar de virar ou dobrar o tecido da retina, o que faz com que a neurorretina fique voltada para baixo. A coloração por imunofluorescência do explante retiniano cultivado após 2 semanas utilizando diferentes marcadores da retina como o experimento anterior (NeuN, GFAP e isolectina-B4) demonstrou que a falha da orientação adequada do explante resulta na falha do desenvolvimento adequado do elemento neurovascular (Figura 3).
Figura 1: Etapas de dissecação do globo ocular para criar o explante da retina . (a) O globo ocular enucleado é imerso na mídia imediatamente após ser removido do animal. (b) Uma incisão circunferencial é feita ao longo do limbo para abrir o globo ocular. c) A córnea é removida dissecando ao longo da incisão límbica. d) Ao segurar o nervo óptico com pinça fina, a camada exterior do olho é descascada suavemente. (e) O cristalino, o vítreo e o corpo ciliar são removidos. (F) Apenas a retina neural é deixada para trás. (g) Quatro incisões radiais são feitas na retina para facilitar o corte na etapa seguinte. h) A retina pode ser cortada em dois ou quatro pedaços e depois transferida para a placa de cultura celular que contém a inserção e o meio. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Cultura de explante retiniano bem-sucedida com estrutura retiniana preservada. Coloração por imunofluorescência dos explantes da retina que permaneceram em cultura por 2 semanas. Os explantes foram fixados e corados com (a) NeuN para neurônios da retina (verde) e isolectina-B4 para vasos sanguíneos (vermelho), e (b) GFAP para células gliais (verde) e isolectina-B4 para vasos sanguíneos (vermelho). A coloração mostrou células da retina bem desenvolvidas e vasos da retina. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Cultura de explante retiniano malsucedida com células da retina defeituosas e subdesenvolvidas. Coloração por imunofluorescência de explantes de retina que permaneceram em cultura por duas semanas. Os explantes foram fixados e corados com GFAP para células gliais (verde) e isolectina-B4 para vasos sanguíneos (vermelho). As imagens mostram coloração defeituosa e células retinianas e vasos da retina subdesenvolvidos. O explante da retina estava dobrado e não estava orientado corretamente na placa de cultura. Grande atenção deve ser dada para garantir a orientação adequada do explante com a retina voltada para cima. A falha em colocar o explante da retina na orientação correta resultará em falha no desenvolvimento adequado do explante. Barra de escala = 100 μm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nosso laboratório vem estudando as alterações fisiopatológicas que promovem a disfunção microvascular da retina há anos 31,32,33,34,35,36. Os explantes de retina são uma das técnicas que podem ser de grande valia para o estudo de doenças da retina, como a retinopatia diabética ou doenças degenerativas da retina. Ter um grupo controle derivado da mesma retina ou animal único que o grupo ou grupos tratados dá a esta técnica uma grande vantagem em termos de fornecer comparações mais confiáveis de diferentes condições experimentais.
Um dos principais desafios durante a preparação do explante da retina é o dobramento do explante ou orientação errada na placa de cultura com a superfície da retina voltada para baixo. Outros pesquisadores sugeriram pipetar a retina para cima e para baixo dentro da pipeta de transferência para tê-la na orientação correta na placa37. No entanto, em seu protocolo, eles usaram toda a retina para um único explante, mas neste protocolo, uma única retina foi cortada em duas a quatro partes, o que significa que as peças são menores e é difícil fazer essa manobra para a orientação adequada. Cortar uma única retina em duas a quatro peças permite que quatro a oito peças de retina sejam obtidas do mesmo animal que poderia ser usado para um experimento. Isso permite experimentos em que o grupo controle e os grupos experimentais são derivados do mesmo animal.
No entanto, cortar a retina em pequenos pedaços torna o manuseio dela mais desafiador. Portanto, desenvolvemos uma técnica para manusear essas pequenas peças da retina para garantir a orientação adequada da cultura da retina. Para fazer isso, a lâmina de tesoura dissecante aberta é colocada logo abaixo da peça da retina, com a superfície da retina voltada para cima. Se a peça da retina estiver virada ou dobrada, ela é ajustada suavemente à orientação correta. Lentamente, a peça da retina é elevada com a ponta de uma lâmina de tesoura aberta e colocada suavemente na placa de cultura. Essa técnica simples garante que cada peça da retina esteja na orientação correta com a retina voltada para cima e promove melhores resultados para o estudo dos vasos da retina e das células neurogliais (Figura 2). A não colocação do explante da retina na orientação correta com a neurorretina voltada para cima resultará na falha do crescimento adequado das células da retina em cultura, como mostra a Figura 3. O treinamento adequado é altamente recomendado para evitar esse erro técnico.
Este protocolo descreve um explante retiniano organotípico de uma retina adulta de camundongo; no entanto, a técnica também foi descrita anteriormente para retinas imaturas de camundongos37 e retinas humanas38. Em estudo anterior, culturas de explante retiniano foram descritas para o estudo do desenvolvimento vascular, no qual a manipulação da função endotelial foi viabilizada ex vivo27. Como exemplo da avaliação morfológica de um explante de retina, o explante de retina foi deixado em cultura por 2 semanas e, em seguida, a imunocoloração foi realizada usando NeuN (marcador de células neuronais), GFAP (marcador de células gliais) e isolectina-B4 (marcador vascular). A coloração mostrou que as células da retina e os vasos sanguíneos estavam bem desenvolvidos e bem preservados no explante (Figura 2). No entanto, mais dados de coloração imuno-histoquímica podem ser obtidos para verificar a viabilidade e a funcionalidade de outras células da retina no explante também.
A cultura de explante em si pode ser estressante para as células da retina. No entanto, as células poderiam ser incubadas em condições relativamente normais para que as alterações morfológicas que ocorrem sob várias condições experimentais, como hiperglicemia ou hipóxia, pudessem ser comparadas à condição basal. O explante, portanto, representa uma boa ferramenta para avaliar várias células da retina e testar suas respostas a diferentes agentes farmacológicos ou alvos terapêuticos simultaneamente em uma ampla variedade de doenças da retina.
A neovascularização da retina é um sinal cardinal de retinopatia isquêmica, como na retinopatia da prematuridade e na retinopatia diabética. Nós (Figura 2) e outros 27,39,40,41,42 pudemos observar vasculatura retiniana intacta em explantes cultivados por até 2 semanas. Assim, o explante retiniano tem sido utilizado para estudar a fisiopatologia da neovascularização retiniana normal e patológica 41,42,43,44,45,46,47,48,49. Curiosamente, um grupo de pesquisa registrou a brotação vascular induzida por VEGF em explantes de retina de camundongos enquanto investigava os fatores proangiogênicos que estão elevados na retinopatia diabética proliferativa43. Além disso, os explantes da retina foram incorporados em um gel tridimensional, permitindo o estudo da brotação de células endoteliais da retina em uma orientação espaço-temporal mais detalhada45,46,47.
Além dos estudos morfológicos, os explantes da retina também são utilizados, em certa medida, para avaliar as funções da retina50,51,52,53. Imagens de eletrorretinograma ex vivo (ERG) foram realizadas em explantes isolados de retina de camundongos, permitindo o estudo das diferentes funções de uma variedade de células da retina, incluindo fotorreceptores de bastonetes e cones54,55,56,57. Curiosamente, Calbiague et al. relataram que, em resposta ao tratamento com alta glicose, as culturas de explante da retina derivadas de camundongos ou ratos mostraram uma espessura cada vez mais reduzida das camadas da retina58. No entanto, as células bipolares da retina, que estão entre as primeiras células sensíveis às condições diabéticas, mantiveram não apenas sua morfologia, mas também suas propriedades eletrofisiológicas em cultura por até 2 semanas58. Em resumo, acreditamos que este protocolo poderia ser uma base ou um ponto de partida para estudos futuros adicionais para otimizar os benefícios do uso de explante na pesquisa oftalmológica.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao National Institute of Health (NIH) Funding Grant ao National Eye Institute (R01 EY030054) ao Dr. Mohamed Al-Shabrawey. Gostaríamos de agradecer a Kathy Wolosiewicz por nos ajudar com a narração em vídeo. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Ken Mitton, do laboratório de Pesquisa da Retina Pediátrica do Eye Research Institute, da Oakland University, por sua ajuda durante o uso do microscópio cirúrgico e da gravação. Este vídeo foi editado e dirigido pelo Dr. Khaled Elmasry.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult C57Bl/6J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA | 664 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A. | BZ-X800 | |
| B27 supplements | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #17504-04 | |
| Blockade blocking solution | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | B10710 | |
| DMEM F12 | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #11320033 | |
| Goat anti-Rabbit IgG. | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | F-2765 | |
| GSL I, BSL I (Isolectin) | Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA | B-1105-2 | |
| Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #14175095 | |
| Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades | World Precision Instruments,FL 34240, USA | Straight (503365) | |
| N2 supplements | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #17502-048 | |
| Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | 140652 | |
| Paraformaldehyde 4% in PBS | BBP, Ashland, MA, 01721 USA | C25N107 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | 15140148 | |
| PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | P36962 | |
| Rabbit Anti-NeuN Antibody | Abcam.,Cambridge, UK | ab177487 | |
| Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody | Dako,Carpinteria, CA 93013, USA. | Z0334 | |
| Texas Red | Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA | SA-5006-1 | |
| TritonX | BioRad Hercules, CA, 94547,USA | 1610407 |
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