Medicine

網膜神経血管疾患研究のための ex vivo モデルとしての成体マウス網膜網膜の外植片

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/63966

Khaled Elmasry^1,2,3, Mohamed Moustafa^1,2, Mohamed Al-Shabrawey^1,2

¹Eye Research Center and Department of Foundational Medical Studies, Oakland University William Beaumont School of Medicine, ²Eye Research Institute, Oakland University, ³Human Anatomy and Embryology Department, Mansoura Faculty of Medicine, Mansoura University

Summary

このプロトコルは、成体マウスから得られた網膜外植片の単離、解剖、培養、および染色の手順を提示し、説明しています。この方法は、糖尿病性網膜症などの異なる網膜神経血管疾患を研究するための ex vivo モデルとして有益である。

Abstract

網膜研究における課題の1つは、網膜ニューロン、グリア細胞、血管細胞などの異なる網膜細胞間のクロストークを研究することです。網膜ニューロンを in vitroで 単離、培養、維持することには、技術的および生物学的な限界があります。網膜外植片の培養は、これらの制限を克服し、血管系に依存しない生化学的パラメータが十分に制御されたさまざまな網膜細胞間のクロストークを研究するための独自の ex vivo モデルを提供する可能性があります。さらに、網膜外植片は、糖尿病性網膜症などのさまざまな網膜血管および神経変性疾患における新しい薬理学的介入を研究するための効果的なスクリーニングツールです。ここでは、網膜外植片の分離と長期間の培養のための詳細なプロトコルについて説明します。原稿はまた、網膜外植片培養の望ましい結果と再現性に影響を与える可能性のあるこの手順中の技術的な問題のいくつかを提示します。網膜血管、グリア細胞、およびニューロンの免疫染色は、網膜外植片培養の開始から2週間後に無傷の網膜毛細血管および神経膠細胞を示しました。これにより、糖尿病性網膜症などの網膜疾患を模倣する条件下での網膜血管系および神経膠細胞の変化を研究するための信頼できるツールとして網膜外植片が確立されます。

Introduction

網膜疾患を研究するために、in vivoモデルとin vitroモデルの両方を含むさまざまなモデルが提示されています。研究における動物の使用は、依然として継続的な倫理的およびトランスレーショナルな議論の問題です¹。マウスまたはラットなどのげっ歯類を含む動物モデルは、網膜研究において一般的に使用される²、³^、⁴。しかし、黄斑の欠如や色覚の違いなど、げっ歯類の網膜の生理学的機能が人間と比較して異なるため、臨床上の懸念が生じています⁵。網膜研究のための人間の死後眼の使用には、元のサンプルの遺伝的背景、ドナーの病歴、およびドナーの以前の環境またはライフスタイルの違いを含むがこれらに限定されない多くの問題もあります⁶。さらに、網膜研究におけるin vitroモデルの使用には、いくつかの欠点もあります。網膜疾患の研究に使用される細胞培養モデルには、ヒト由来の細胞株、初代細胞、または幹細胞の利用が含まれます⁷。使用した細胞培養モデルは、汚染、誤認、または脱分化の点で問題があることが示されています⁸、⁹^、¹⁰^、¹¹。最近、網膜オルガノイド技術は大きな進歩を示しています。しかしながら、in vitroでの非常に複雑な網膜の構築にはいくつかの制限がある。例えば、網膜オルガノイドは、成熟したin vivo網膜と同じ生理学的および生化学的特徴を有しない。この制限を克服するために、網膜オルガノイド技術は、平滑筋細胞、血管系、およびミクログリア^12、13、^14、¹⁵のような免疫細胞を含む^、より多くの生物学的および細胞的特徴を統合する必要があります。

有機型網膜外植片は、糖尿病性網膜症および変性網膜疾患などの網膜疾患を研究するための信頼できるツールとして浮上している^16,17,18,19。他の既存の技術と比較して、網膜外植片の使用は、同じ生化学的パラメータの下で全身変数とは無関係に様々な網膜細胞間のクロストークを研究する独自の機能を追加することによって、in vitro網膜細胞培養と現在のin vivo動物モデルの両方をサポートします。外植片培養により、異なる網膜細胞を同じ環境に一緒に保持することができ、網膜細胞間相互作用の保存が可能になります^20、21^、²²。さらに、以前の研究では、網膜外植片が培養網膜細胞の形態学的構造と機能を維持できることが示されました²³。したがって、網膜外植片は、多種多様な網膜疾患の可能な治療標的を調査するための適切なプラットフォームを提供することができる^24、25^、²⁶。網膜外植片培養は、制御可能な技術を提供し、多数の薬理学的操作を可能にし、いくつかの分子メカニズムを明らかにすることができる既存のモトッドの非常に柔軟な代替品です²⁷。

この論文の全体的な目標は、網膜外植片技術をin vitro 細胞培養と in vivo 動物モデルの間の合理的な中間モデルシステムとして提示することです。この技術は、解離した細胞よりも優れた方法で網膜機能を模倣することができます。さまざまな網膜層が無傷のままであるため、網膜細胞間相互作用は、十分に制御された生化学的条件下で、血管系の機能とは無関係に実験室で評価できます²⁸。

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Protocol

すべての動物実験は、米国ミシガン州ロチェスターのオークランド大学の施設動物管理使用委員会(IACUC)によって承認され、眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚眼科学研究協会(ARVO)の声明によって確立されたガイドラインに従いました。

1.動物の準備

動物を光制御された環境で一定の温度下に保管してください。動物飼育室の温度設定は、「実験動物の世話と使用に関するガイド」に定められたガイドラインに従う必要があります。マウスの温度範囲は18°Cから26°Cの間です。湿度レベルを制御し、約42%に設定します。
この実験では、12週齢以上の雄C57BL/6Jマウス(詳細は 材料表 を参照)を使用しました(このプロトコルには成体マウスを使用しました)。
注:このプロトコルでは、網膜に影響を与える遺伝的異常がなかったため、野生型株がデモンストレーションに使用されました。ただし、網膜外植片培養には、遺伝子操作された株を含む他の株を使用できます。
動物飼育室の照明制御 を介して 12時間の明暗サイクルを提供します。
すべての動物の健康状態と適切な食物と水の摂取量を平日2回、週末に1日1回検査します。生鮮食品ときれいな水を必ず提供してください。
週の間に食べ物と水のレベルが低い場合は、ウォーターボトルをすすぎ、補充してください。必要に応じて生鮮食品を追加します。汚れたケージを毎日、または動物の健康のために必要に応じて交換してください。
注:網膜の光受容体と光誘発性の変化を研究するには、動物施設の暗い部屋にある特別な暗い箱でマウスを一晩暗順応させます。
CO2チャンバーに接続されたシリンダー内の圧縮CO2ガスを使用した_CO2吸入過剰摂取によって、ホームケージ内の動物を安楽死させる。頸部脱臼などの安楽死の二次的方法を用いて死亡確認を行う。
手順が完了したら、心停止や呼吸停止を確認したり、動物の固定および拡張した瞳孔を観察するなど、適切な方法で動物の死亡を確認します。

2.ティッシュの準備

動物が安楽死させたら、70%エタノールでその領域をきれいにします。次に、片手でまぶたを開き、目が見えるようにします。地球が突き出るまで、湾曲した鉗子を使用して反対側の手で軌道の上と下の部分に圧力をかけます。
眼を摘出するには、眼の後部の鉗子をそっと閉じ、連続的な動きで持ち上げます。鉗子を使用して、視神経から眼球を持ちます。すべてのステップで滅菌された解剖ツールを使用し、完全な無菌条件下で作業してください。
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U / mL)を含む1 mLの氷冷HBSSを含む1.5 mLチューブに各眼球を浸します。.眼球をHBSSでそれぞれ5分間2回洗います。
眼球を完全な培地(10%FBS、2%B27、1%N2、1%L-グルタミン、および1%ペニシリンとストレプトマイシン)を含む1.5〜2mLのチューブに移します。

3.組織解剖

図1に順次示されているように、手術顕微鏡で網膜を注意深く解剖します。
1. 眼球を開くために、辺縁の周りを円周方向に切開します。角膜と(辺縁)切開の境界に沿って円形に解剖し、続いて前部、水晶体、硝子体を取り除き、空のアイカップを残して角膜を取り除きます。
2. 視神経乳頭の領域を細かい鉗子で保持することで、目の外側のコートをやさしく剥がします。神経網膜を傷つけないように、そして網膜が完全に無傷のままであることを確認するために、外皮の除去中は細心の注意を払ってください。
  注:網膜は網膜色素上皮(RPE)から慎重に剥がし、視神経から網膜を剥離するために視神経頭を1回切断する必要があります。視神経(視神経乳頭)が残した穴を特定することにより、これを視覚的に確認します。
3. 網膜を放射状に4つの同じサイズの断片に解剖します。
網膜の小片を処理するには、以下の手順に従って、網膜培養の適切な方向を確保します。
1. 解剖シザーブレードを使用して、網膜片のすぐ下を開きます(材料表)。
2. 開いたハサミ刃の先端で網膜片をゆっくりと持ち上げ、培養プレートにそっと移します。
単離された網膜に由来する外植片を、網膜神経節細胞(神経網膜)側を上に向けて、それぞれ300 μLの網膜外植片培地を含む12ウェルプレートの細胞培養インサートに別々に移します。
メモ: メディアが N2 および B27 サプリメント付きの DMEM メディアであることを確認します。ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U / mL)も培地に追加します(材料表)。網膜は、シナプス を介して 相互接続された神経細胞の複数の層から形成され、解剖中に除去された黒色層である網膜色素上皮の色素層によって外部から支持されています。
色素性上皮の残りを取り除きます。ただし、これらの残骸は、外植片の適切な向きを特定するのに役立ちます。顔料のある部分が下を向いており、着色されていない部分が上を向いていることを確認します。
網膜外植片培養物を加湿インキュベーター内で37°Cおよび5%_CO2でインキュベートする。
網膜表面が上を向いていることを確認してください。網膜片がひっくり返ったり折りたたまれたりしている場合は、正しい向きにそっと調整してみてください。
注:培養プレート内の網膜外植片の正しい向きに細心の注意を払ってください。培養プレート内の外植片の反転や折り畳みは、培養中の網膜細胞の適切な増殖の失敗につながるため、避けてください。

4.網膜外植片培養

網膜外植片培養物(ステップ3.2〜3.3で調製)を加湿インキュベーター内で37°Cおよび5%_CO2に維持する。
2週間、1日おきに各ウェルから培地の半分を交換します。これを行うには、ウェルから150 μLを慎重にピペッティングします。次に、150 μLの新鮮な培地をウェルに戻します。メディアを交換するときは、外植片をひっくり返さないでください。
培養プレートをインキュベーターに戻す前に、顕微鏡で外植片を注意深く確認してください。明視野顕微鏡で細胞と網膜構造の完全性を調べます。外植片がまだ正しい方向になっていることを確認してください。4倍と20倍の両方の対物レンズを使用して、外植片を調べます。
注意: 外植片をメディアに完全に浸さないでください。

5. 免疫組織化学

2週間後、培地を取り除いて網膜外植片を固定します。これを行うには、最初に200 μLの1x PBSで1回洗浄し、次に0.1 M PBS、pH 7.4中の300 μLの4%パラホルムアルデヒドを外植体を含むウェルに加え、一晩放置します。
注:この手順は、プレートから培養インサートを取り外さずに実行できます。外植片は500μLのコニカルチューブに移すこともでき、洗浄と固定はチューブ内で行うことができます。
洗浄のために、300 μLの1x PBS-2.5%トリトンXを含む500 μLのコニカルチューブに外植片を移します。
チューブ内の固定外植片をシェーカー(25 rpm)で中速を使用してそれぞれ5分間3回洗浄します。
抗体インキュベート前に、0.02%チメロサールを含む300 μLの1xブロッキングバッファーで外植体を室温で1時間インキュベートすることにより、予想される非特異的反応をブロックします。
固定した外植片を一次抗体とともに、シェーカー上で中速で4°Cで一晩インキュベートします。
注:GSL I、BSL I抗体(レクチン)(7:1,000)で染色することにより、固定外植片の網膜内皮細胞を検出します。ウサギグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)抗体(1:250)で染色することにより、網膜外植片中のグリア細胞を検出します。外植片をウサギNeuN抗体(1:250)^29,30で染色することにより、網膜ニューロンを検出します。レクチン、NeuNの組み合わせで外植体をインキュベートし、レクチン、GFAPの組み合わせで他のものをインキュベートします。
翌日、ピペットで吸引することにより、一次抗体をチューブから除去します。1x PBS-2.5%トリトンXで片片をシェーカーで中速でそれぞれ5分間3回洗浄します。
二次抗体を追加します:ヤギ抗ウサギIgG(1:500)(GFAPおよびNeuNの二次)およびテキサスレッド(7:1,000)(レクチンの場合)。シェーカーで中速を使用して室温で1時間インキュベートします。
注意: 二次抗体は光に敏感なので、チューブをアルミホイルで覆います。
二次抗体を吸引除去し、次いで1x PBS-2.5%Triton Xでそれぞれ5分間3回洗浄する。
トランスファーピペットを使用して、外植片をチューブからスライドガラスに移します。スライド上の余分な液体を取り除き、DAPIを含む封入剤を1滴スライドに追加します。
ティッシュをカバーガラスで覆います。カバーガラスとティッシュの間に気泡を入れないでください。
染色したスライドを蛍光顕微鏡に持っていき、画像の撮影を開始します。蛍光染色は光に敏感であるため、スライドボックスを使用して染色されたスライドを覆うことが重要です。

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Representative Results

網膜外植体の神経細胞および血管網膜細胞の培養培地ex vivoでの長時間の生存
私たちのプロトコルを利用して網膜外植片を培養することにより、最大2週間生存可能なさまざまな網膜細胞を維持することに成功しました。異なる網膜細胞の存在を確認するために、神経細胞マーカー(NeuN)、グリア細胞マーカー(GFAP)、および血管マーカー(イソレクチン-B4)を用いて網膜外植体の免疫蛍光染色を行った(図2)。染色は、よく組織化され、よく発達した網膜ニューロンとグリア細胞を示しました。さらに、網膜血管は、イソレクチン-B4染色によって示されるように、構造的に無傷であった。免疫染色によって実証されたように、網膜外植片の形態学的完全性は、網膜外植片培養が実験的にモデルとして使用できる生存可能な網膜細胞を維持することに成功したことを示した。外植片を使用して研究される異なる実験条件は、ImageJソフトウェアを使用した複数の細胞マーカーの免疫蛍光染色によって評価および分析できます。免疫染色は、さまざまな実験グループ間の各細胞マーカーの免疫反応性のレベルと、網膜神経節細胞や光受容体の数などの特定の細胞の数を測定することができます。

実験結果における培養プレートにおける網膜外植体の正しい配向の重要性
培養プレートにおける網膜外植体の正しい配向は、神経網膜を上向きにインキュベートすることによって達成される。一方、網膜外植片の障害は、網膜組織が反転または折り畳まれ、神経網膜が下向きになることに起因する可能性があります。前回の実験とは異なる網膜マーカー(NeuN、GFAP、およびイソレクチン-B4)を使用して、2週間後に培養した網膜外植体の免疫蛍光染色を行ったところ、適切な外植片配向の失敗が神経血管要素の適切な発達の失敗をもたらすことが示されました(図3)。

図1:眼球を解剖して網膜外植片を作成する手順。 (a)除核された眼球は、動物から取り除かれた直後に培地に浸される。(b)眼球を開くために、辺縁に沿って円周方向の切開が行われます。(c)角膜は、辺縁切開に沿って解剖することによって除去されます。(d)視神経を細かい鉗子で保持することにより、目の外側のコートをやさしく剥がします。(e)水晶体、硝子体、毛様体が除去されます。(F)神経網膜だけが取り残されます。(g)網膜に4つの橈骨切開を行い、次のステップで網膜を切断しやすくします。(h)網膜を2つまたは4つの小片に切断し、次いでインサートおよび培地を含む細胞培養プレートに移すことができる。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:網膜構造が保存された網膜外植片培養の成功。培養に2週間滞在した網膜外植体の免疫蛍光染色。外植片を固定し、網膜ニューロンのNeuN(緑)と血管のイソレクチン-B4(赤)、および(b)グリア細胞(緑)のGFAP(緑)と血管のイソレクチン-B4(赤)で染色しました。染色は、よく発達した網膜細胞および網膜血管を示した。スケールバー = 50 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:欠陥のある未発達の網膜細胞による網膜外植片培養の失敗。培養液に2週間留置した網膜外植体の免疫蛍光染色。外植片を固定し、グリア細胞(緑)についてはGFAP、血管についてはイソレクチン-B4(赤色)で染色した。画像は、欠陥のある染色と未発達の網膜細胞と網膜血管を示しています。網膜外植片は折り畳まれており、培養プレート内で正しく配向していませんでした。網膜が上を向いた状態で外植体の適切な向きを確実にするために細心の注意を払うべきである。網膜外植体を正しい方向に置かないと、外植片の適切な発達が失敗します。スケールバー = 100 μm この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

私たちの研究室では、網膜微小血管機能障害を促進する病態生理学的変化を^31、32^、³³、³⁴、³⁵^、³⁶年間研究してきました。網膜外植片は、糖尿病性網膜症や変性網膜疾患などの網膜疾患を研究するためのモデルとして使用するのに非常に価値のある技術の1つです。治療群または群と同じ単一の網膜または動物に由来する対照群を有することは、異なる実験条件のより信頼性の高い比較を提供するという点でこの技術に大きな利点を与える。

網膜外植片調製中の主要な課題の1つは、外植体の折り畳みまたは網膜表面を下向きにした培養プレートの誤った向きです。他の研究者は、プレート³⁷内で正しい向きにするために、トランスファーピペット内で網膜を上下にピペッティングすることを提案した。しかし、彼らのプロトコルでは、彼らは単一の外植片に網膜全体を使用しましたが、このプロトコルでは、単一の網膜が2〜4個に切断されたため、断片が小さくなり、適切な向きでこの操作を行うことは困難です。単一の網膜を2〜4個に切断すると、実験に使用できる同じ動物から4〜8個の網膜片を得ることができます。これにより、対照群と実験群とが同じ動物に由来する実験が可能になる。

ただし、網膜を細かく切断すると、網膜の取り扱いがより困難になります。そこで、これらの小さな網膜片を取り扱う技術を開発し、網膜培養の適切な配向を確保しました。これを行うために、開いた解剖シザーブレードを網膜片のすぐ下に置き、網膜表面を上向きにします。網膜片をひっくり返したり折りたたんだりすると、正しい向きに穏やかに調整されます。ゆっくりと、開いたハサミ刃の先端で網膜片を持ち上げ、培養プレートに静かに入れます。このシンプルな技術により、各網膜片が正しい向きになり、網膜が上を向くようになり、網膜血管と神経膠細胞を研究するためのより良い結果が得られます(図2)。網膜外植片を神経網膜を上に向けて正しい向きに配置しないと、図3に示すように、培養中の網膜細胞の適切な増殖が失敗します。この技術的なエラーを回避するために、適切なトレーニングを行うことを強くお勧めします。

このプロトコルは、成体マウス網膜の器官型網膜外植片を記載する。しかしながら、この技術は、未熟マウス網膜³⁷およびヒト網膜³⁸の両方についても以前に記載されている。以前の研究では、血管発生を研究するために網膜外植片培養物が記載されており、内皮機能操作がex vivoで実行可能になりました²⁷。網膜外植体の形態評価の一例として、網膜外植体を2週間培養した後、NeuN(神経細胞マーカー)、GFAP(グリア細胞マーカー)、イソレクチン-B4(血管マーカー)を用いて免疫染色を行った。染色は、網膜細胞と血管が外植片でよく発達し、よく保存されていることを示しました(図2)。ただし、外植片の他の網膜細胞の生存率と機能を確認するために、より多くの免疫組織化学染色データを得ることができます。

外植片培養自体は網膜細胞にストレスを与える可能性があります。しかし、細胞は比較的正常な条件下でインキュベートすることができ、高血糖症や低酸素症などのさまざまな実験条件下で起こる形態学的変化をベースライン条件と比較することができました。したがって、外植体は、さまざまな網膜細胞を評価し、さまざまな網膜疾患においてさまざまな薬理学的物質または治療標的に対するそれらの応答を同時にテストするための優れたツールです。

網膜新生血管は、未熟児網膜症および糖尿病性網膜症などの虚血性網膜症の基本的な徴候である。私たち(図2)と他の27,39,40,41,42は、培養外植片における無傷の網膜血管系を最大2週間観察することができました。したがって、網膜外植片は、正常および病理学的網膜新生血管の両方の病態生理学を研究するために使用されてきた41、42、43、⁴⁴^、⁴⁵、46、47、⁴⁸^、⁴⁹。興味深いことに、研究グループは、増殖性糖尿病性網膜症で上昇する血管新生促進因子を調査しながら、マウス網膜外植片でVEGF誘発血管発芽を記録しました⁴³。さらに、網膜外植片は三次元ゲルに埋め込まれており、より詳細な時空間方向における網膜内皮細胞の発芽の研究を可能にしている^45,46,47。

形態学的研究に加えて、網膜外植片も網膜機能を評価するためにある程度使用される^50、51^、⁵²^、⁵³。Ex vivo網膜電図(ERG)イメージングは、単離されたマウス網膜外植片に対して行われており、桿体および錐体光受容体の両方を含む様々な網膜細胞の異なる機能の研究を可能にしている⁵⁴、⁵⁵^、⁵⁶^、⁵⁷。興味深いことに、Calbiagueらは、高グルコース処理に応答して、マウスまたはラットのいずれかに由来する網膜外植片培養物が、網膜層のますます減少した厚さを示した^{ことを報告した58}。しかし、糖尿病状態に対して最も敏感な細胞の1つである網膜双極細胞は、その形態だけでなく電気生理学的特性も最大2週間培養中に保持しました⁵⁸。要約すると、このプロトコルは、眼科研究における外植片の使用の利点を最適化するための追加の将来の研究の基礎または出発点になる可能性があると考えています。

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Disclosures

著者は開示するものは何もありません。

Acknowledgments

国立衛生研究所(NIH)の国立眼科研究所への資金提供助成金(R01 EY030054)からモハメド・アル・シャブラウェイ博士に感謝します。ビデオナレーションを手伝ってくれたキャシー・ウォロシェヴィッチに感謝します。オークランド大学眼科研究所小児網膜研究所のケン・ミットン博士には、手術用顕微鏡の使用と記録にご協力いただき、ありがとうございました。このビデオは、ハレド・エルマスリー博士によって編集および監督されました。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult C57Bl/6J mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA	664
All-in-One Fluorescence Microscope	KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A.	BZ-X800
B27 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17504-04
Blockade blocking solution	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	B10710
DMEM F12	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #11320033
Goat anti-Rabbit IgG.	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	F-2765
GSL I, BSL I (Isolectin)	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	B-1105-2
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #14175095
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades	World Precision Instruments,FL 34240, USA	Straight (503365)
N2 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17502-048
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	140652
Paraformaldehyde 4% in PBS	BBP, Ashland, MA, 01721 USA	C25N107
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	15140148
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	P36962
Rabbit Anti-NeuN Antibody	Abcam.,Cambridge, UK	ab177487
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody	Dako,Carpinteria, CA 93013, USA.	Z0334
Texas Red	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	SA-5006-1
TritonX	BioRad Hercules, CA, 94547,USA	1610407