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Medicine

रेटिना न्यूरोवास्कुलर रोगों का अध्ययन करने के लिए एक पूर्व विवो मॉडल के रूप में वयस्क माउस रेटिना का रेटिना एक्सप्लांट

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/63966
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2
1Eye Research Center and Department of Foundational Medical Studies, Oakland University William Beaumont School of Medicine, 2Eye Research Institute, Oakland University, 3Human Anatomy and Embryology Department, Mansoura Faculty of Medicine, Mansoura University

Summary

यह प्रोटोकॉल एक वयस्क माउस से प्राप्त रेटिना खोजों के अलगाव, विच्छेदन, संवर्धन और धुंधलापन के लिए चरणों को प्रस्तुत और वर्णित करता है। यह विधि विभिन्न रेटिना न्यूरोवास्कुलर रोगों जैसे मधुमेह रेटिनोपैथी का अध्ययन करने के लिए एक पूर्व विवो मॉडल के रूप में फायदेमंद है।

Abstract

रेटिना अनुसंधान में चुनौतियों में से एक रेटिना न्यूरॉन्स, ग्लियल कोशिकाओं और संवहनी कोशिकाओं जैसे विभिन्न रेटिना कोशिकाओं के बीच क्रॉस-टॉक का अध्ययन कर रहा है। विट्रो में रेटिना न्यूरॉन्स को अलग करना, संवर्धन करना और बनाए रखना तकनीकी और जैविक सीमाएं हैं। रेटिना खोजों की खेती इन सीमाओं को दूर कर सकती है और अच्छी तरह से नियंत्रित जैव रासायनिक मापदंडों और संवहनी प्रणाली से स्वतंत्र विभिन्न रेटिना कोशिकाओं के बीच क्रॉस-टॉक का अध्ययन करने के लिए एक अद्वितीय पूर्व विवो मॉडल प्रदान कर सकती है। इसके अलावा, रेटिना एक्सप्लेंट विभिन्न रेटिना संवहनी और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों जैसे मधुमेह रेटिनोपैथी में नए औषधीय हस्तक्षेपों का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी स्क्रीनिंग टूल है। यहां, हम एक विस्तारित अवधि के लिए रेटिना खोजों के अलगाव और संस्कृति के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। पांडुलिपि इस प्रक्रिया के दौरान कुछ तकनीकी समस्याओं को भी प्रस्तुत करती है जो रेटिना खोज संस्कृति के वांछित परिणामों और प्रजनन क्षमता को प्रभावित कर सकती हैं। रेटिना एक्सप्लेंट कल्चर की शुरुआत से 2 सप्ताह के बाद रेटिना वाहिकाओं, ग्लियल कोशिकाओं और न्यूरॉन्स के इम्यूनोस्टेनिंग ने बरकरार रेटिना केशिकाओं और न्यूरोग्लियल कोशिकाओं का प्रदर्शन किया। यह रेटिना वास्कुलचर और न्यूरोग्लियल कोशिकाओं में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण के रूप में रेटिना खोजों को स्थापित करता है जो मधुमेह रेटिनोपैथी जैसे रेटिना रोगों की नकल करते हैं।

Introduction

रेटिना रोगों का अध्ययन करने के लिए विभिन्न मॉडल प्रस्तुत किए गए हैं, जिनमें विवो और इन विट्रो मॉडल दोनों शामिल हैं। अनुसंधान में जानवरों का उपयोग अभी भी निरंतर नैतिक और अनुवाद बहस का विषय है। चूहों या चूहों जैसे कृन्तकों को शामिल करने वाले पशु मॉडल आमतौर पर रेटिना अनुसंधान 2,3,4 में उपयोग किए जाते हैं। हालांकि, मनुष्यों की तुलना में कृन्तकों में रेटिना के विभिन्न शारीरिक कार्यों के कारण नैदानिक चिंताएं उत्पन्न हुई हैं, जैसे कि मैक्यूला की अनुपस्थिति या रंग दृष्टि5 में अंतर। रेटिना अनुसंधान के लिए मानव पोस्टमॉर्टम आंखों के उपयोग में भी कई समस्याएं हैं, जिनमें मूल नमूनों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि, दाताओं के चिकित्सा इतिहास और दाताओं के पिछले वातावरण या जीवन शैली में अंतरशामिल हैं। इसके अलावा, रेटिना अनुसंधान में इन विट्रो मॉडल के उपयोग में कुछ कमियां भी हैं। रेटिना रोगों का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सेल कल्चर मॉडल में मानव मूल, प्राथमिक कोशिकाओं या स्टेम कोशिकाओं की सेल लाइनों का उपयोग शामिलहै। उपयोग किए गए सेल कल्चर मॉडल को दूषित, गलत पहचान, या 8,9,10,11 के संदर्भ में समस्याएं दिखाई गई हैं। हाल ही में, रेटिना ऑर्गेनॉइड तकनीक ने महत्वपूर्ण प्रगति दिखाई है। हालांकि, विट्रो में अत्यधिक जटिल रेटिना के निर्माण की कई सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, रेटिना ऑर्गेनोइड्स में विवो रेटिना में परिपक्व होने के समान शारीरिक और जैव रासायनिक विशेषताएं नहीं होती हैं। इस सीमा को दूर करने के लिए, रेटिना ऑर्गेनॉइड तकनीक को अधिक जैविक और सेलुलर विशेषताओं को एकीकृत करना चाहिए, जिसमें चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं, वाहिका और माइक्रोग्लिया 12,13,14,15 जैसी प्रतिरक्षा कोशिकाएं शामिल हैं।

ऑर्गेनोटाइपिक रेटिना एक्सप्लेंट ्स रेटिना रोगों जैसे मधुमेह रेटिनोपैथी और अपक्षयी रेटिनारोगों का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण के रूप में उभरे हैं। अन्य मौजूदा तकनीकों की तुलना में, रेटिना एक्सप्लेंट का उपयोग इन विट्रो रेटिना सेल संस्कृतियों का समर्थन करता है और विवो पशु मॉडल में भी एक ही जैव रासायनिक मापदंडों के तहत विभिन्न रेटिना कोशिकाओं के बीच क्रॉस-टॉक का अध्ययन करने के लिए एक अनूठी विशेषता जोड़कर और प्रणालीगत चर से स्वतंत्र है। खोज संस्कृतियां विभिन्न रेटिना कोशिकाओं को एक ही वातावरण में एक साथ रखने की अनुमति देती हैं, जिससे रेटिना इंटरसेलुलर इंटरैक्शन 20,21,22 के संरक्षण की अनुमति मिलती है। इसके अलावा, एक पिछले अध्ययन से पता चला है कि रेटिना खोज सुसंस्कृत रेटिना कोशिकाओंकी रूपात्मक संरचना और कार्यक्षमता को संरक्षित करने में सक्षम थे। इस प्रकार, रेटिना खोज विभिन्न प्रकार के रेटिना रोगों24,25,26 के लिए संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की जांच के लिए एक सभ्य मंच प्रदान कर सकती है। रेटिना खोज संस्कृतियां एक नियंत्रणीय तकनीक प्रदान करती हैं और मौजूदा मोथोड के लिए बहुत लचीली विकल्प हैं जो कई औषधीय जोड़तोड़ की अनुमति देती हैं और कई आणविकतंत्रों को उजागर कर सकती हैं।

इस पेपर का समग्र लक्ष्य इन विट्रो सेल संस्कृतियों और विवो पशु मॉडल के बीच एक उचित मध्यवर्ती मॉडल प्रणाली के रूप में रेटिना खोज तकनीक को प्रस्तुत करना है। यह तकनीक अलग-थलग कोशिकाओं की तुलना में रेटिना कार्यों की बेहतर तरीके से नकल कर सकती है। चूंकि विभिन्न रेटिना परतें बरकरार रहती हैं, रेटिना इंटरसेलुलर इंटरैक्शन का मूल्यांकन प्रयोगशाला में अच्छी तरह से नियंत्रित जैव रासायनिक स्थितियों के तहत और संवहनी प्रणाली के कामकाज से स्वतंत्र किया जा सकताहै।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों को ओकलैंड विश्वविद्यालय, रोचेस्टर, एमआई, यूएसए में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था और नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में जानवरों के उपयोग के लिए एसोसिएशन फॉर रिसर्च इन विजन एंड ओप्थाल्मोलॉजी (एआरवीओ) स्टेटमेंट द्वारा स्थापित दिशानिर्देशों का पालन किया गया था।

1. जानवरों की तैयारी

  1. जानवरों को प्रकाश-नियंत्रित वातावरण में एक निरंतर तापमान के तहत रखें। पशु आवास कक्ष के लिए तापमान सेटिंग्स को "प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड" द्वारा निर्धारित दिशानिर्देशों का पालन करना चाहिए। चूहों के लिए तापमान सीमा 18 डिग्री सेल्सियस और 26 डिग्री सेल्सियस के बीच है। आर्द्रता के स्तर को नियंत्रित रखें और लगभग 42% पर सेट करें।
  2. इस प्रयोग के लिए, नर C57BL / 6J चूहों का उपयोग करें (विवरण के लिए सामग्री की तालिका की जांच करें) जो 12 सप्ताह से अधिक उम्र के हैं (इस प्रोटोकॉल के लिए एक वयस्क माउस का उपयोग किया गया था)।
    नोट: प्रदर्शन के लिए इस प्रोटोकॉल में एक जंगली प्रकार के तनाव का उपयोग किया गया था, क्योंकि इसमें रेटिना को प्रभावित करने वाली कोई आनुवंशिक असामान्यता नहीं थी। हालांकि, रेटिना एक्सप्लेंट कल्चर के लिए आनुवंशिक रूप से हेरफेर किए गए उपभेदों सहित अन्य उपभेदों का उपयोग किया जा सकता है।
  3. पशु आवास कक्षों में प्रकाश नियंत्रण के माध्यम से 12 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र प्रदान करें।
  4. स्वास्थ्य और पर्याप्त भोजन और पानी के सेवन के लिए प्रत्येक जानवर का निरीक्षण सप्ताह के दौरान प्रति दिन दो बार और सप्ताहांत पर प्रति दिन एक बार करें। उन्हें ताजा भोजन और साफ पानी प्रदान करना सुनिश्चित करें।
  5. यदि सप्ताह के दौरान भोजन और पानी का स्तर कम है, तो पानी की बोतल को कुल्ला करें और इसे फिर से भरें। जब भी जरूरत हो ताजा भोजन जोड़ें। जानवरों के स्वास्थ्य के लिए रोजाना या आवश्यकतानुसार गंदे पिंजरों को बदलें।
    नोट: रेटिना में फोटोरिसेप्टर और प्रकाश-प्रेरित परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए, जानवरों की सुविधा में एक अंधेरे कमरे में स्थित एक विशेष अंधेरे बॉक्स में रात भर चूहों को अंधेरे-अनुकूलित करें।
  6. सीओ 2कक्ष से जुड़े सिलेंडरों में संपीड़ित सीओ2 गैस का उपयोग करके सीओ2 इनहेलेशन ओवरडोज द्वारा अपने घर के पिंजरे में जानवरों को इच्छामृत्यु करें। गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था जैसे इच्छामृत्यु की द्वितीयक विधि का उपयोग करके मृत्यु की पुष्टि करें।
  7. प्रक्रिया पूरी करने के बाद, एक उचित विधि द्वारा पशु मृत्यु की पुष्टि करें, जैसे कि कार्डियक और श्वसन गिरफ्तारी की पुष्टि करना या जानवर की निश्चित और फैली हुई पुतलियों का अवलोकन करना।

2. ऊतक तैयारी

  1. एक बार जब जानवर को इच्छामृत्यु कर दी जाती है, तो 70% इथेनॉल के साथ क्षेत्र को साफ करें। फिर, पलकों को एक हाथ से खोलें ताकि आंख दिखाई दे। जब तक ग्लोब बाहर न निकले, तब तक घुमावदार बल का उपयोग करके विपरीत हाथ से कक्षा के बेहतर और अवर भागों पर दबाव लागू करें।
  2. आंख को एन्यूक्लिएट करने के लिए, धीरे से आंख के पीछे के हिस्से पर बल को बंद करें, और निरंतर गति में ऊपर उठाएं। बल का उपयोग करके, ऑप्टिक तंत्रिका से नेत्रगोलक को पकड़ें। सभी चरणों के लिए निष्फल विच्छेदन उपकरणों का उपयोग करना सुनिश्चित करें और पूर्ण सड़न रोकनेवाली स्थितियों के तहत काम करें।
  3. पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (10,000 यू / एमएल) के साथ 1 एमएल बर्फ-ठंडा एचबीएसएस युक्त 1.5 एमएल ट्यूब में प्रत्येक नेत्रगोलक को डुबोएं। एचबीएसएस में नेत्रगोलक को 5 मिनट के लिए दो बार धोएं।
  4. नेत्रगोलक को पूर्ण मीडिया (10% एफबीएस, 2% बी 27, 1% एन 2, 1% एल-ग्लूटामाइन, और 1% पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन) युक्त 1.5-2 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।

3. ऊतक विच्छेदन

  1. रेटिना को एक ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के तहत सावधानीपूर्वक विच्छेदित करें, जैसा कि चित्र 1 में क्रमिक रूप से चित्रित किया गया है।
    1. नेत्रगोलक खोलने के लिए लिम्बस के चारों ओर एक परिधीय चीरा लगाएं। कॉर्निया की सीमा और (लिम्बल) चीरा के साथ गोलाकार विच्छेदन करके कॉर्निया को हटा दें, इसके बाद एक खाली आंख कप छोड़ते हुए पूर्ववर्ती खंड, लेंस और विट्रियस शरीर को हटा दें।
    2. ऑप्टिक तंत्रिका सिर के क्षेत्र को ठीक बल के साथ पकड़कर, आंख के बाहरी कोट को धीरे से छील लें। तंत्रिका रेटिना को चोट न पहुंचाने के लिए और यह सुनिश्चित करने के लिए कि रेटिना पूरी तरह से बरकरार रहे, बाहरी कोट को हटाने के दौरान बहुत ध्यान दें।
      नोट: रेटिना को रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) से सावधानीपूर्वक छील दिया जाना चाहिए, और ऑप्टिक तंत्रिका से रेटिना को अलग करने के लिए ऑप्टिक तंत्रिका सिर पर एक एकल कटौती की जानी चाहिए। ऑप्टिक तंत्रिका (ऑप्टिक तंत्रिका सिर) द्वारा छोड़े गए छेद की पहचान करके नेत्रहीन रूप से इसे सुनिश्चित करें।
    3. रेटिना को रेडियल रूप से चार समान आकार के टुकड़ों में विभाजित करें।
  2. रेटिना संस्कृति के उचित अभिविन्यास को सुनिश्चित करने के लिए रेटिना के छोटे टुकड़ों को संभालने के लिए नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
    1. एक विच्छेदित कैंची ब्लेड का उपयोग करके, रेटिना टुकड़े (सामग्री की तालिका) के ठीक नीचे खोलें।
    2. धीरे-धीरे एक खुली कैंची ब्लेड की नोक के साथ रेटिना टुकड़े को उठाएं, और धीरे से इसे संस्कृति प्लेट में स्थानांतरित करें।
  3. पृथक रेटिना से प्राप्त खोजों को अलग-अलग सेल कल्चर पर स्थानांतरित करें, जिसमें 12-वेल प्लेट में डाला जाता है, प्रत्येक में रेटिना एक्सप्लेंट मीडिया का 300 μL होता है, जिसमें रेटिना गैंग्लियन सेल (न्यूरोरेटिना) साइड का सामना होता है।
    नोट: सुनिश्चित करें कि मीडिया N2 और B27 पूरक के साथ DMEM मीडिया है। पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (10,000 यू / एमएल) को मीडिया में भी जोड़ें (सामग्री की तालिका)। रेटिना न्यूरोनल कोशिकाओं की कई परतों से बना है जो सिनैप्स के माध्यम से परस्पर जुड़े हुए हैं और रेटिना वर्णक उपकला की रंजित परत द्वारा बाहर से समर्थित हैं, जो काली परत है जिसे विच्छेदन के दौरान हटा दिया गया था।
  4. पिगमेंटेड एपिथेलियम के किसी भी अवशेष को हटा दें; हालांकि, ये अवशेष खोज के उचित अभिविन्यास की पहचान करने में मदद कर सकते हैं। सुनिश्चित करें कि पिगमेंटेड हिस्सा नीचे की ओर है और गैर-रंजित हिस्सा ऊपर की ओर है।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटरों में रेटिना एक्सप्लेंट कल्चर को इनक्यूबेट करें।
  6. सुनिश्चित करें कि रेटिना की सतह ऊपर की ओर है। यदि रेटिना टुकड़ा फ़्लिप या मुड़ा हुआ है, तो इसे धीरे से सही अभिविन्यास में समायोजित करने का प्रयास करें।
    नोट: संस्कृति प्लेट में रेटिना खोज के सही अभिविन्यास पर बहुत ध्यान दें। कल्चर प्लेट में किसी भी फ्लिपिंग या फोल्डिंग से बचें क्योंकि इसके परिणामस्वरूप संस्कृति में रेटिना कोशिकाओं के उचित विकास की विफलता होगी।

4. रेटिना एक्सप्लेंट कल्चर

  1. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटरों में रेटिना एक्सप्लेंट कल्चर (चरण 3.2-3.3 में तैयार) बनाए रखें।
  2. 2 सप्ताह के लिए हर दूसरे दिन एक दूसरे से आधे मीडिया को बदलें। इसे सावधानी से कुएं से 150 μL पाइप करके करें। फिर, कुएं में 150 μL ताजा मीडिया वापस जोड़ें। मीडिया को बदलते समय खोज को पलटने से बचें।
  3. कल्चर प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस डालने से पहले माइक्रोस्कोप के नीचे खोज को सावधानीपूर्वक जांचें। एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं और रेटिना वास्तुकला की अखंडता की जांच करें। सुनिश्चित करें कि खोज अभी भी सही ढंग से उन्मुख है। खोज की जांच करने के लिए 4x और 20x उद्देश्य लेंस दोनों का उपयोग करें।
    नोट: मीडिया में खोज के पूर्ण विसर्जन से बचें।

5. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

  1. 2 सप्ताह के बाद, मीडिया को हटाकर रेटिना एक्सप्लेंट को ठीक करें। ऐसा पहले 1x PBS के 200 μL से एक बार धोकर करें और फिर 0.1 M PBS, pH 7.4 में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 300 μL को खोज वाले कुएं में जोड़ें और इसे रात भर छोड़ दें।
    नोट: यह चरण प्लेट से संस्कृति सम्मिलित को हटाए बिना किया जा सकता है। खोजों को 500 μL शंक्वाकार ट्यूब में भी स्थानांतरित किया जा सकता है, और धोने और निर्धारण ट्यूब के अंदर किया जा सकता है।
  2. धोने के लिए खोज को 500 μL शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 1x PBS-2.5% Triton X का 300 μL होता है।
  3. एक शेकर (25 आरपीएम) पर मध्यम वेग का उपयोग करके ट्यूब में निश्चित खोजों को 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
  4. एंटीबॉडी इनक्यूबेशन से पहले कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 0.02% थिमेरोसल युक्त 1x ब्लॉकिंग बफर के 300 μL के साथ खोज को इंजेक्ट करके अपेक्षित निरर्थक प्रतिक्रियाओं को अवरुद्ध करें।
  5. एक शेकर पर मध्यम वेग का उपयोग करके रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ निश्चित खोजों को इनक्यूबेट करें।
    नोट: जीएसएल आई, बीएसएल आई एंटीबॉडी (लेक्टिन) (7: 1,000) के साथ धुंधला करके निश्चित खोज में रेटिना एंडोथेलियल कोशिकाओं का पता लगाएं। खरगोश ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) एंटीबॉडी (1: 250) के साथ धुंधला करके रेटिना खोजों में ग्लियल कोशिकाओं का पता लगाएं। खरगोश न्यून एंटीबॉडी (1: 250)29,30 के साथ खोज को धुंधला करके रेटिना न्यूरॉन्स का पता लगाएं। इनक्यूबेट s{Tual-Chalot, 2013 #117}{Tual-Chalot, 2013 #116}{Tual-Chalot, 2013 #116}ome लेक्टिन, NeuN संयोजन के साथ खोजें, और लेक्टिन, GFAP संयोजन के साथ दूसरों को इनक्यूबेट करें।
  6. अगले दिन, पिपेट के साथ आकांक्षा करके ट्यूबों से प्राथमिक एंटीबॉडी को हटा दें। एक शेकर पर मध्यम वेग का उपयोग करके 5 मिनट के लिए 1x PBS-2.5% Triton X के साथ खोजों को तीन बार धोएं।
  7. द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ें: बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (1: 500) (जीएफएपी और न्यूएन के लिए द्वितीयक) और टेक्सास रेड (7: 1,000) (लेक्टिन के लिए)। एक शेकर पर मध्यम वेग का उपयोग करके कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: द्वितीयक एंटीबॉडी हल्के संवेदनशील होते हैं, इसलिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्यूब को कवर करें।
  8. आकांक्षा द्वारा द्वितीयक एंटीबॉडी को हटा दें, और फिर 1x PBS-2.5% ट्राइटन एक्स के साथ 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
  9. एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके ट्यूब से एक ग्लास स्लाइड में खोज को स्थानांतरित करें। स्लाइड पर किसी भी अतिरिक्त तरल को निकालें, और फिर स्लाइड में DAPI के साथ माउंटिंग मीडिया की एक बूंद जोड़ें।
  10. ऊतक को कवरस्लिप के साथ कवर करें। कवरस्लिप और ऊतक के बीच किसी भी हवा के बुलबुले की अनुमति न दें।
  11. दाग वाली स्लाइड्स को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर ले जाएं, और छवियों को लेना शुरू करें। स्लाइड बॉक्स का उपयोग करके दाग वाली स्लाइडों को कवर करना महत्वपूर्ण है क्योंकि प्रतिदीप्ति धुंधला प्रकाश-संवेदनशील है।

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Representative Results

एक विस्तारित समय के लिए संस्कृति मीडिया में रेटिना एक्सप्लेंट के न्यूरोनल और संवहनी रेटिना कोशिकाओं का अस्तित्व
हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग करके रेटिना खोज की खेती करके, हम विभिन्न रेटिना कोशिकाओं को बनाए रखने में सफल रहे जो 2 सप्ताह तक व्यवहार्य थे। विभिन्न रेटिना कोशिकाओं की उपस्थिति को सत्यापित करने के लिए, न्यूरोनल सेल मार्कर (न्यूएन), ग्लियल सेल मार्कर (जीएफएपी), और संवहनी मार्कर (आइसोलेक्टिन-बी 4) का उपयोग करके रेटिना एक्सप्लेंट का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला किया गया था (चित्रा 2)। धुंधला पन अच्छी तरह से संगठित और अच्छी तरह से विकसित रेटिना न्यूरॉन्स और ग्लियल कोशिकाओं को दिखाता है। इसके अतिरिक्त, रेटिना रक्त वाहिकाएं संरचनात्मक रूप से बरकरार थीं, जैसा कि आइसोलेक्टिन-बी 4 धुंधला होने से संकेत मिलता है। रेटिना एक्सप्लेंट की रूपात्मक अखंडता, जैसा कि इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा प्रदर्शित किया गया है, ने संकेत दिया कि रेटिना एक्सप्लेंट कल्चर व्यवहार्य रेटिना कोशिकाओं को बनाए रखने में सफल रहा था जिसे प्रयोगात्मक रूप से एक मॉडल के रूप में उपयोग किया जा सकता था। एक्सप्लेंट का उपयोग करके अध्ययन की जाने वाली विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों का मूल्यांकन और विश्लेषण इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके कई सेलुलर मार्करों के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा किया जा सकता है। इम्यूनोस्टेनिंग विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों के बीच प्रत्येक सेलुलर मार्कर की विकृति के स्तर और विशिष्ट कोशिकाओं की संख्या, जैसे रेटिना गैंग्लियन कोशिकाओं या फोटोरिसेप्टर की संख्या के माप की अनुमति देता है।

प्रयोगात्मक परिणामों के लिए संस्कृति प्लेट में रेटिना खोज के सही अभिविन्यास का महत्व
कल्चर प्लेट में रेटिना एक्सप्लेंट का सही अभिविन्यास न्यूरोरेटिना को ऊपर की ओर करके प्राप्त किया जाता है। दूसरी ओर, रेटिना खोज की विफलता रेटिना ऊतक को पलटने या मोड़ने के परिणामस्वरूप हो सकती है, जिससे न्यूरोरेटिना का सामना नीचे की ओर होता है। पिछले प्रयोग (न्यूएन, जीएफएपी और आइसोलेक्टिन-बी 4) के रूप में विभिन्न रेटिना मार्करों का उपयोग करके 2 सप्ताह के बाद सुसंस्कृत रेटिना एक्सप्लेंट के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने से पता चला है कि उचित खोज अभिविन्यास की विफलता के परिणामस्वरूप न्यूरोवास्कुलर तत्व के उचित विकास की विफलता होती है (चित्रा 3)।

Figure 1
चित्र 1: रेटिना खोज बनाने के लिए नेत्रगोलक को विच्छेदित करने के चरण। (a) जानवर से निकाले जाने के तुरंत बाद एन्यूक्लिएटेड नेत्रगोलक मीडिया में डूब जाता है। (ख) नेत्रगोलक खोलने के लिए लिम्बस के साथ एक परिधीय चीरा लगाया जाता है। (ग) अंग चीरे के साथ विच्छेदन करके कॉर्निया को हटा दिया जाता है। (घ) ऑप्टिक तंत्रिका को महीन बल के साथ पकड़ने से, आंख के बाहरी कोट को धीरे से छील दिया जाता है। (ई) लेंस, विट्रियस और सिलियरी बॉडी को हटा दिया जाता है। (एफ) केवल तंत्रिका रेटिना पीछे रह जाता है। (छ) रेटिना में चार रेडियल चीरे लगाए जाते हैं ताकि अगले चरण में इसे काटा जा सके। (एच) रेटिना को दो या चार टुकड़ों में काटा जा सकता है और फिर सेल कल्चर प्लेट में स्थानांतरित किया जा सकता है जिसमें इंसर्ट और मीडिया होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: संरक्षित रेटिना संरचना के साथ सफल रेटिना खोज संस्कृति। रेटिना खोजों का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होना जो 2 सप्ताह तक संस्कृति में रहा था। खोजों को तय किया गया और (ए) रेटिना न्यूरॉन्स (हरे) के लिए न्यून और रक्त वाहिकाओं (लाल) के लिए आइसोलेक्टिन-बी 4, और (बी) ग्लियल कोशिकाओं (हरे) के लिए जीएफएपी और रक्त वाहिकाओं (लाल) के लिए आइसोलेक्टिन-बी 4 के साथ दाग दिया गया। धुंधला पन अच्छी तरह से विकसित रेटिना कोशिकाओं और रेटिना वाहिकाओं को दिखाता है। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: दोषपूर्ण, अल्प-विकसित रेटिना कोशिकाओं के साथ असफल रेटिना खोज संस्कृति। रेटिना खोजों का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होना जो दो सप्ताह तक संस्कृति में रहा था। खोजों को ग्लियाल कोशिकाओं (हरे) के लिए जीएफएपी और रक्त वाहिकाओं (लाल) के लिए आइसोलेक्टिन-बी 4 के साथ तय और दाग दिया गया था। तस्वीरों में दोषपूर्ण धुंधलापन और कम विकसित रेटिना कोशिकाओं और रेटिना वाहिकाओं को दिखाया गया है। रेटिना एक्सप्लेंट को मोड़ा गया था और संस्कृति प्लेट में सही ढंग से उन्मुख नहीं किया गया था। रेटिना के ऊपर की ओर होने के साथ खोज के उचित अभिविन्यास को सुनिश्चित करने के लिए बहुत ध्यान दिया जाना चाहिए। रेटिना खोज को सही अभिविन्यास में रखने में विफलता के परिणामस्वरूप खोज के उचित विकास की विफलता होगी। स्केल बार = 100 μm कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हमारी प्रयोगशाला पैथोफिजियोलॉजिकल परिवर्तनों का अध्ययन कर रही है जोवर्षों 31,32,33,34,35,36 के लिए रेटिना माइक्रोवैस्कुलर डिसफंक्शन को बढ़ावा देते हैं। रेटिना खोज उन तकनीकों में से एक है जो मधुमेह रेटिनोपैथी या अपक्षयी रेटिना रोगों जैसे रेटिना रोगों का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में उपयोग करने के लिए बहुत मूल्यवान हो सकती है। उपचारित समूह या समूहों के रूप में एक ही एकल रेटिना या जानवर से प्राप्त एक नियंत्रण समूह होने से इस तकनीक को विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों की अधिक विश्वसनीय तुलना प्रदान करने के मामले में एक बड़ा लाभ मिलता है।

रेटिना खोज तैयार करने के दौरान प्रमुख चुनौतियों में से एक रेटिना सतह के साथ कल्चर प्लेट में खोज या गलत अभिविन्यास की तह है। अन्य शोधकर्ताओं ने प्लेट37 में रेटिना को सही अभिविन्यास में रखने के लिए ट्रांसफरिंग पिपेट के भीतर ऊपर और नीचे करने का सुझाव दिया। हालांकि, अपने प्रोटोकॉल में, उन्होंने एक ही खोज के लिए पूरे रेटिना का उपयोग किया, लेकिन इस प्रोटोकॉल में, एक रेटिना को दो से चार टुकड़ों में काट दिया गया, जिसका अर्थ है कि टुकड़े छोटे हैं और उचित अभिविन्यास के लिए इस पैंतरेबाज़ी को करना मुश्किल है। एक रेटिना को दो से चार टुकड़ों में काटने से चार से आठ रेटिना टुकड़े एक ही जानवर से प्राप्त किए जा सकते हैं जिनका उपयोग एक प्रयोग के लिए किया जा सकता है। यह उन प्रयोगों की अनुमति देता है जिनमें नियंत्रण समूह और प्रयोगात्मक समूह एक ही जानवर से प्राप्त होते हैं।

हालांकि, रेटिना को छोटे टुकड़ों में काटने से इसे संभालना अधिक चुनौतीपूर्ण हो जाता है। इसलिए, हमने रेटिना संस्कृति के उचित अभिविन्यास को सुनिश्चित करने के लिए इन छोटे रेटिना टुकड़ों को संभालने के लिए एक तकनीक विकसित की। ऐसा करने के लिए, खुली विच्छेदन कैंची ब्लेड को रेटिना टुकड़े के ठीक नीचे रखा जाता है, जिसमें रेटिना की सतह ऊपर की ओर होती है। यदि रेटिना टुकड़ा फ़्लिप या मुड़ा हुआ है, तो इसे धीरे से सही अभिविन्यास में समायोजित किया जाता है। धीरे-धीरे, रेटिना टुकड़े को एक खुली कैंची ब्लेड की नोक से ऊंचा किया जाता है और धीरे से संस्कृति प्लेट में डाल दिया जाता है। यह सरल तकनीक सुनिश्चित करती है कि प्रत्येक रेटिना टुकड़ा रेटिना के साथ सही अभिविन्यास में है और रेटिना वाहिकाओं और न्यूरोग्लियल कोशिकाओं (चित्रा 2) का अध्ययन करने के लिए बेहतर परिणामों को बढ़ावा देता है। रेटिना खोज को न्यूरोरेटिना के साथ सही अभिविन्यास में रखने में विफलता के परिणामस्वरूप संस्कृति में रेटिना कोशिकाओं के उचित विकास की विफलता होगी, जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है। इस तकनीकी त्रुटि से बचने के लिए उचित प्रशिक्षण की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है।

यह प्रोटोकॉल एक वयस्क माउस रेटिना के ऑर्गेनोटाइपिक रेटिना एक्सप्लेंट का वर्णन करता है; हालांकि, तकनीक को पहले अपरिपक्व माउस रेटिना37 और मानव रेटिना38 दोनों के लिए भी वर्णित किया गया है। पिछले अध्ययन में, संवहनी विकास का अध्ययन करने के लिए रेटिना एक्सप्लेंट संस्कृतियों का वर्णन किया गया था, जिसमें एंडोथेलियल फ़ंक्शन मैनिपुलेशन को संभव बनाया गया था। रेटिना एक्सप्लेंट के रूपात्मक मूल्यांकन के एक उदाहरण के रूप में, रेटिना एक्सप्लेंट को 2 सप्ताह के लिए संस्कृति में छोड़ दिया गया था, और फिर इम्यूनोस्टेनिंग को न्यून (न्यूरोनल सेल मार्कर), जीएफएपी (ग्लियल सेल मार्कर), और आइसोलेक्टिन-बी 4 (संवहनी मार्कर) का उपयोग करके किया गया था। धुंधला होने से पता चला कि रेटिना कोशिकाएं और रक्त वाहिकाएं अच्छी तरह से विकसित थीं और खोज में अच्छी तरह से संरक्षित थीं (चित्रा 2)। हालांकि, खोज में अन्य रेटिना कोशिकाओं की व्यवहार्यता और कार्यक्षमता की जांच करने के लिए अधिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला डेटा प्राप्त किया जा सकता है।

एक्सप्लेंट कल्चर स्वयं रेटिना कोशिकाओं के लिए तनावपूर्ण हो सकता है। हालांकि, कोशिकाओं को अपेक्षाकृत सामान्य परिस्थितियों में इनक्यूबेट किया जा सकता है ताकि विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत होने वाले रूपात्मक परिवर्तन, जैसे कि हाइपरग्लेसेमिया या हाइपोक्सिया, की तुलना बेसलाइन स्थिति से की जा सके। इस प्रकार, खोज, विभिन्न रेटिना कोशिकाओं का मूल्यांकन करने और रेटिना रोगों की एक विस्तृत विविधता में एक साथ विभिन्न औषधीय एजेंटों या चिकित्सीय लक्ष्यों के लिए उनकी प्रतिक्रियाओं का परीक्षण करने के लिए एक अच्छा उपकरण का प्रतिनिधित्व करती है।

रेटिना नियोवैस्कुलराइजेशन इस्केमिक रेटिनोपैथी का एक प्रमुख संकेत है, जैसे कि रेटिनोपैथी ऑफ प्रीमेच्योरिटी और डायबिटिक रेटिनोपैथी। हम (चित्रा 2) और अन्य 27,39,40,41,42 2 सप्ताह तक सुसंस्कृत खोजों में बरकरार रेटिना वाहिका का निरीक्षण कर सकते हैं। इस प्रकार, रेटिना एक्सप्लेंट का उपयोग सामान्य और पैथोलॉजिकल रेटिना नियोवैस्कुलराइजेशन 41,42,43,44,45,46,47,48,49 दोनों के पैथोफिज़ियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए किया गया है। दिलचस्प बात यह है कि एक शोध समूह ने प्रोजियोजेनिक कारकों की जांच करते हुए माउस रेटिना खोजों में वीईजीएफ-प्रेरित संवहनी अंकुरण दर्ज किया जो प्रोलिफेरेटिव डायबिटिक रेटिनोपैथी43 में ऊंचा है। इसके अलावा, रेटिना एक्सप्लेंट को एक त्रि-आयामी जेल में एम्बेडेड किया गया है, जिससे रेटिना एंडोथेलियल कोशिकाओं के अंकुरण के अध्ययन के लिए अधिक विस्तृत स्थानिक अभिविन्यास 45,46,47 में अनुमति मिलती है।

रूपात्मक अध्ययनों के अलावा, रेटिना कार्यों50,51,52,53 का मूल्यांकन करने के लिए रेटिना खोजों का भी कुछ हद तक उपयोग किया जाता है। एक्स विवो इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम (ईआरजी) इमेजिंग को पृथक माउस रेटिना एक्सप्लेंट पर किया गया है, जिससे रॉड और शंकु फोटोरिसेप्टर 54,55,56,57 दोनों सहित विभिन्न रेटिना कोशिकाओं के विभिन्न कार्यों के अध्ययन की अनुमति मिलती है। दिलचस्प बात यह है कि, कैलबियाग एट अल ने बताया कि, उच्च ग्लूकोज उपचार के जवाब में, चूहों या चूहों से प्राप्त रेटिना खोज संस्कृतियों ने रेटिना परतोंकी तेजी से कम मोटाई दिखाई। हालांकि, रेटिना द्विध्रुवी कोशिकाएं, जो मधुमेह की स्थिति के लिए शुरुआती संवेदनशील कोशिकाओं में से हैं, ने न केवल उनकी आकृति विज्ञान बल्कि 2 सप्ताह58 तक संस्कृति में उनके इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों को भी रखा। सारांश में, हम मानते हैं कि यह प्रोटोकॉल आंखों के अनुसंधान में खोज उपयोग के लाभों को अनुकूलित करने के लिए अतिरिक्त भविष्य के अध्ययनों के लिए एक आधार या प्रारंभिक बिंदु हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम डॉ मोहम्मद अल-शबरावे को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) फंडिंग ग्रांट को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम वीडियो वर्णन के साथ हमारी मदद करने के लिए कैथी वोलोसीविक्ज़ को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम सर्जिकल माइक्रोस्कोप और रिकॉर्डिंग के उपयोग के दौरान उनकी मदद के लिए नेत्र अनुसंधान संस्थान के बाल चिकित्सा रेटिना अनुसंधान प्रयोगशाला, ओकलैंड विश्वविद्यालय के डॉ केन मिटन को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस वीडियो को डॉ खालिद एल्मासरी ने संपादित और निर्देशित किया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adult C57Bl/6J mice  The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA 664
All-in-One Fluorescence Microscope  KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A. BZ-X800
B27 supplements Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #17504-04
Blockade blocking solution  Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA B10710
DMEM F12 Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #11320033
Goat anti-Rabbit IgG. Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA F-2765
GSL I, BSL I (Isolectin) Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA B-1105-2
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS) Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #14175095
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades World Precision Instruments,FL 34240, USA  Straight (503365)
N2 supplements Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #17502-048
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA 140652
Paraformaldehyde 4% in PBS BBP, Ashland, MA, 01721 USA C25N107
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA 15140148
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA P36962
Rabbit Anti-NeuN Antibody Abcam.,Cambridge, UK ab177487
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody Dako,Carpinteria, CA 93013, USA. Z0334
Texas Red Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA SA-5006-1
TritonX BioRad Hercules, CA,  94547,USA 1610407

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चिकित्सा अंक 190
रेटिना न्यूरोवास्कुलर रोगों का अध्ययन करने के लिए एक <em>पूर्व विवो</em> मॉडल के रूप में वयस्क माउस रेटिना का रेटिना एक्सप्लांट
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Elmasry, K., Moustafa, M.,… More

Elmasry, K., Moustafa, M., Al-Shabrawey, M. Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases. J. Vis. Exp. (190), e63966, doi:10.3791/63966 (2022).

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