Summary
Este protocolo presenta y describe los pasos para el aislamiento, disección, cultivo y tinción de explantes de retina obtenidos de un ratón adulto. Este método es beneficioso como modelo ex vivo para estudiar diferentes enfermedades neurovasculares de la retina como la retinopatía diabética.
Abstract
Uno de los desafíos en la investigación de la retina es estudiar la diafonía entre diferentes células de la retina, como las neuronas de la retina, las células gliales y las células vasculares. Aislar, cultivar y mantener las neuronas de la retina in vitro tiene limitaciones técnicas y biológicas. El cultivo de explantes de retina puede superar estas limitaciones y ofrecer un modelo ex vivo único para estudiar la diafonía entre varias células de la retina con parámetros bioquímicos bien controlados e independientes del sistema vascular. Además, los explantes de retina son una herramienta de cribado eficaz para estudiar nuevas intervenciones farmacológicas en diversas enfermedades vasculares y neurodegenerativas de la retina, como la retinopatía diabética. Aquí, describimos un protocolo detallado para el aislamiento y cultivo de explantes de retina durante un período prolongado. El manuscrito también presenta algunos de los problemas técnicos durante este procedimiento que pueden afectar los resultados deseados y la reproducibilidad del cultivo de explante de retina. La inmunotinción de los vasos retinianos, las células gliales y las neuronas demostró capilares retinianos intactos y células neurogliales después de 2 semanas desde el comienzo del cultivo de explante retiniano. Esto establece los explantes de retina como una herramienta confiable para estudiar los cambios en la vasculatura retiniana y las células neurogliales en condiciones que imitan enfermedades de la retina como la retinopatía diabética.
Introduction
Se han presentado diferentes modelos para estudiar enfermedades de la retina, incluyendo modelos tanto in vivo como in vitro. El uso de animales en la investigación sigue siendo un tema de continuo debate ético y traslacional1. Los modelos animales que involucran roedores como ratones o ratas se utilizan comúnmente en la investigación de la retina 2,3,4. Sin embargo, han surgido preocupaciones clínicas debido a las diferentes funciones fisiológicas de la retina en roedores en comparación con los humanos, como la ausencia de la mácula o las diferencias en la visión del color5. El uso de ojos postmortem humanos para la investigación de la retina también tiene muchos problemas, incluyendo pero no limitado a las diferencias en los antecedentes genéticos de las muestras originales, el historial médico de los donantes y los entornos o estilos de vida previos de los donantes6. Además, el uso de modelos in vitro en la investigación de la retina también tiene algunos inconvenientes. Los modelos de cultivo celular utilizados para estudiar enfermedades de la retina incluyen la utilización de líneas celulares de origen humano, células primarias o células madre7. Se ha demostrado que los modelos de cultivo celular utilizados tienen problemas en términos de contaminación, identificación errónea o desdiferenciación 8,9,10,11. Recientemente, la tecnología de organoides retinianos ha mostrado un progreso significativo. Sin embargo, la construcción de retinas altamente complejas in vitro tiene varias limitaciones. Por ejemplo, los organoides retinianos no tienen las mismas características fisiológicas y bioquímicas que las retinas maduras in vivo. Para superar esta limitación, la tecnología de organoides retinianos debe integrar más características biológicas y celulares, incluidas las células musculares lisas, la vasculatura y las células inmunes como la microglía12,13,14,15.
Los explantes organotípicos de retina se han convertido en una herramienta confiable para el estudio de enfermedades retinianas como la retinopatía diabética y las enfermedades degenerativas de la retina16,17,18,19. En comparación con otras técnicas existentes, el uso de explantes retinianos apoya tanto los cultivos celulares de retina in vitro como los modelos animales in vivo actuales al agregar una característica única para estudiar la diafonía entre varias células de la retina bajo los mismos parámetros bioquímicos e independientes de variables sistémicas. Los cultivos de explante permiten que diferentes células de la retina se mantengan juntas en el mismo ambiente, permitiendo la preservación de las interacciones intercelulares retinianas20,21,22. Además, un estudio previo mostró que los explantes retinianos fueron capaces de preservar la estructura morfológica y la funcionalidad de las células retinianas cultivadas23. Por lo tanto, los explantes de retina pueden proporcionar una plataforma decente para investigar posibles dianas terapéuticas para una amplia variedad de enfermedades de la retina24,25,26. Los cultivos de explantes retinianos proporcionan una técnica controlable y son un sustituto muy flexible de los mothods existentes que permiten numerosas manipulaciones farmacológicas y pueden descubrir varios mecanismos moleculares27.
El objetivo general de este trabajo es presentar la técnica de explante de retina como un sistema modelo intermedio razonable entre cultivos celulares in vitro y modelos animales in vivo . Esta técnica puede imitar las funciones de la retina de una mejor manera que las células disociadas. Como varias capas retinianas permanecen intactas, las interacciones intercelulares retinianas pueden ser evaluadas en el laboratorio bajo condiciones bioquímicas bien controladas e independientes del funcionamiento del sistema vascular28.
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Protocol
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Oakland, Rochester, MI, EE.UU. y siguieron las pautas establecidas por la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) Declaración para el Uso de Animales en Investigación Oftálmica y de la Visión.
1. Preparación de animales
- Mantenga a los animales alojados bajo una temperatura constante en un ambiente con luz controlada. Los ajustes de temperatura para la sala de alojamiento de animales deben seguir las pautas establecidas por la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio". El rango de temperatura para ratones está entre 18 °C y 26 °C. Mantenga los niveles de humedad controlados y establecidos en aproximadamente 42%.
- Para este experimento, use ratones machos C57BL / 6J (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) que tengan más de 12 semanas de edad (se usó un ratón adulto para este protocolo).
NOTA: Se utilizó una cepa de tipo salvaje en este protocolo para la demostración, ya que no tenía ninguna anomalía genética que afectara a la retina. Sin embargo, se podrían usar otras cepas, incluidas las cepas manipuladas genéticamente, para el cultivo de explante de retina. - Proporcione ciclos de luz/oscuridad de 12 h a través del control de iluminación en las habitaciones de alojamiento de animales.
- Inspeccione la salud de cada animal y la ingesta adecuada de alimentos y agua dos veces al día durante la semana y una vez al día los fines de semana. Asegúrese de proporcionarles alimentos frescos y agua limpia.
- Si los niveles de comida y agua son bajos durante la semana, enjuague la botella de agua y vuelva a llenarla. Agregue alimentos frescos cuando sea necesario. Cambie las jaulas sucias diariamente o según sea necesario para la salud de los animales.
NOTA: Para estudiar los fotorreceptores y los cambios inducidos por la luz en la retina, adapte la oscuridad de los ratones durante la noche en una caja oscura especial ubicada en una habitación oscura en la instalación de animales. - Eutanasia de los animales en su jaula doméstica por sobredosis de inhalación de CO2 utilizando gas CO2 comprimido en cilindros conectados a una cámara deCO2. Llevar a cabo la confirmación de la muerte utilizando un método secundario de eutanasia, como la luxación cervical.
- Después de completar el procedimiento, confirme la muerte del animal mediante un método apropiado, como confirmar un paro cardíaco y respiratorio u observar las pupilas fijas y dilatadas del animal.
2. Preparación del tejido
- Una vez que el animal es sacrificado, limpie el área con etanol al 70%. Luego, abra los párpados con una mano para que el ojo sea visible. Aplique presión a las partes superior e inferior de la órbita con la mano opuesta usando pinzas curvas hasta que el globo sobresalga.
- Para enuclear el ojo, cierre suavemente los fórceps en la porción posterior del ojo y eléjelos en un movimiento continuo. Con fórceps, sostenga el globo ocular del nervio óptico. Asegúrese de usar herramientas de disección esterilizadas para todos los pasos y de trabajar en condiciones asépticas completas.
- Sumerja cada globo ocular en un tubo de 1,5 ml que contenga 1 ml de HBSS helado con penicilina-estreptomicina (10,000 U/ml). Lave el globo ocular en HBSS dos veces durante 5 minutos cada una.
- Transfiera el globo ocular a un tubo de 1.5-2 ml que contenga medios completos (10% FBS, 2% B27, 1% N2, 1% L-glutamina y 1% penicilina y estreptomicina).
3. Disección tisular
- Diseccionar la retina cuidadosamente bajo un microscopio quirúrgico, como se ilustra secuencialmente en la Figura 1.
- Haga una incisión circunferencial alrededor del limbo para abrir el globo ocular. Retire la córnea diseccionando circularmente a lo largo del borde de la córnea y la incisión (limbal), seguido de la extracción del segmento anterior, el cristalino y el cuerpo vítreo, dejando un ocular vacío.
- Al sostener la región de la cabeza del nervio óptico con pinzas finas, retire suavemente la capa externa del ojo. Preste mucha atención durante la extracción de la capa externa para no lesionar la retina neural y asegurarse de que la retina permanezca totalmente intacta.
NOTA: La retina debe separarse cuidadosamente del epitelio pigmentario de la retina (EPR), y se debe realizar un solo corte en la cabeza del nervio óptico para separar la retina del nervio óptico. Asegúrese visualmente de esto identificando el agujero dejado por el nervio óptico (la cabeza del nervio óptico). - Diseccionar la retina radialmente en cuatro piezas de igual tamaño.
- Siga los pasos a continuación para manipular los pequeños trozos de la retina para garantizar la orientación adecuada del cultivo de retina.
- Usando una hoja de tijera de disección, abra justo debajo de la pieza retiniana (Tabla de materiales).
- Levante lentamente la pieza retiniana con la punta de una hoja de tijera abierta y transfiérala suavemente a la placa de cultivo.
- Transfiera los explantes derivados de la retina aislada por separado a los insertos de cultivo celular en una placa de 12 pocillos, cada uno con 300 μL de medios de explante retinianos, con el lado de la célula ganglionar de la retina (neuroretina) hacia arriba.
NOTA: Asegúrese de que el medio sea DMEM con suplementos N2 y B27. Agregue penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL) a los medios también (Tabla de materiales). La retina está formada por múltiples capas de células neuronales interconectadas a través de sinapsis y apoyadas desde el exterior por la capa pigmentada del epitelio pigmentario de la retina, que es la capa negra que se eliminó durante la disección. - Retire cualquier remanente del epitelio pigmentado; Sin embargo, estos restos pueden ayudar a identificar la orientación adecuada del explante. Asegúrese de que la parte pigmentada esté hacia abajo y que la parte no pigmentada esté hacia arriba.
- Incubar el cultivo de explante retiniano en incubadoras humidificadas a 37 °C y 5% deCO2.
- Asegúrese de que la superficie de la retina esté orientada hacia arriba. Si la pieza retiniana está volteada o doblada, intente ajustarla suavemente a la orientación correcta.
NOTA: Preste mucha atención a la orientación correcta del explante retiniano en la placa de cultivo. Evite cualquier volteo o plegado del explante en la placa de cultivo, ya que esto resultará en el fracaso del crecimiento adecuado de las células de la retina en cultivo.
4. Cultivo de explante retiniano
- Mantener los cultivos de explante retiniano (preparados en los pasos 3.2-3.3) en incubadoras humidificadas a 37 °C y 5% deCO2.
- Cambie la mitad de los medios de cada pozo cada dos días durante 2 semanas. Haga esto pipeteando 150 μL del pozo con cuidado. Luego, agregue 150 μL de medios frescos al pozo. Evite voltear el explante al cambiar el medio.
- Revise el explante cuidadosamente bajo el microscopio antes de volver a colocar la placa de cultivo en la incubadora. Examinar la integridad de las células y la arquitectura de la retina bajo un microscopio de campo claro. Asegúrese de que el explante todavía está orientado correctamente. Utilice las lentes de objetivo 4x y 20x para examinar el explante.
NOTA: Evitar la inmersión completa del explante en el medio.
5. Inmunohistoquímica
- Después de 2 semanas, arregle el explante de retina retirando el medio. Haga esto lavando primero una vez con 200 μL de 1x PBS y luego agregando 300 μL de paraformaldehído al 4% en PBS 0.1 M, pH 7.4, al pocillo que contiene el explante y dejándolo toda la noche.
NOTA: Este paso se puede realizar sin quitar los insertos de cultivo de la placa. Los explantes también se pueden transferir a un tubo cónico de 500 μL, y el lavado y la fijación se pueden hacer dentro del tubo. - Transfiera el explante a un tubo cónico de 500 μL que contenga 300 μL de 1x PBS-2,5% Tritón X para lavado.
- Lave los explantes fijos en el tubo tres veces durante 5 minutos cada una usando velocidad media en un agitador (25 rpm).
- Bloquear las reacciones inespecíficas esperadas incubando el explante con 300 μL de tampón de bloqueo 1x que contiene timerosal al 0,02% durante 1 h a temperatura ambiente antes de la incubación de anticuerpos.
- Incubar los explantes fijos con los anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C utilizando velocidad media en un agitador.
NOTA: Detectar las células endoteliales de la retina en el explante fijo mediante tinción con anticuerpos GSL I, BSL I (lectina) (7:1.000). Detectar las células gliales en los explantes de retina mediante tinción con anticuerpos contra la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de conejo (1:250). Detectar las neuronas retinianas teñiendo el explante con el anticuerpo NeuN de conejo (1:250)29,30. Incubar s{Tual-Chalot, 2013 #117}{Tual-Chalot, 2013 #116}{Tual-Chalot, 2013 #116}ome explante con la lectina, combinación NeuN, e incubar otros con la lectina, combinación GFAP. - Al día siguiente, retire el anticuerpo primario de los tubos por aspiración con una pipeta. Lave los explantes con 1x PBS-2.5% Triton X tres veces durante 5 minutos cada una usando velocidad media en una coctelera.
- Agregue los anticuerpos secundarios: IgG anti-conejo de cabra (1:500) (secundaria para GFAP y NeuN) y Texas Red (7:1,000) (para la lectina). Incubar durante 1 h a temperatura ambiente utilizando velocidad media en un agitador.
NOTA: Los anticuerpos secundarios son sensibles a la luz, así que cubra el tubo con papel de aluminio. - Retire los anticuerpos secundarios por aspiración, y luego lave tres veces durante 5 minutos cada una con 1x PBS-2.5% Triton X.
- Transfiera el explante del tubo a un portaobjetos de vidrio utilizando una pipeta de transferencia. Retire cualquier exceso de líquido en la diapositiva y luego agregue una gota de medios de montaje con DAPI a la diapositiva.
- Cubra el pañuelo con un cubreobjetos. No permita que haya burbujas de aire entre el cubreobjetos y el pañuelo de papel.
- Lleve los portaobjetos teñidos al microscopio de fluorescencia y comience a tomar las imágenes. Es importante cubrir los portaobjetos teñidos con una caja portaobjetos, ya que la tinción de fluorescencia es sensible a la luz.
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Representative Results
Supervivencia de las células retinianas neuronales y vasculares del explante retiniano en medios de cultivo ex vivo durante un tiempo prolongado
Al cultivar un explante de retina utilizando nuestro protocolo, tuvimos éxito en el mantenimiento de diferentes células de la retina que eran viables hasta por 2 semanas. Para verificar la presencia de diferentes células retinianas, se realizó una tinción de inmunofluorescencia del explante retiniano utilizando un marcador celular neuronal (NeuN), un marcador de células gliales (GFAP) y un marcador vascular (isolectina-B4) (Figura 2). La tinción mostró neuronas retinianas y células gliales bien organizadas y bien desarrolladas. Además, los vasos sanguíneos de la retina estaban estructuralmente intactos, como lo indica la tinción de isolectina-B4. La integridad morfológica del explante retiniano, como lo demostró la inmunotinción, indicó que el cultivo de explante retiniano tuvo éxito en mantener células retinianas viables que podrían usarse experimentalmente como modelo. Las diferentes condiciones experimentales a estudiar utilizando el explante pueden ser evaluadas y analizadas por tinción de inmunofluorescencia para múltiples marcadores celulares utilizando el software ImageJ. La inmunotinción permite medir los niveles de inmunorreactividad de cada marcador celular y del número de células específicas, como el número de células ganglionares de la retina o fotorreceptores, entre varios grupos experimentales.
Importancia de la correcta orientación del explante retiniano en la placa de cultivo para los resultados experimentales
La correcta orientación del explante retiniano en la placa de cultivo se consigue incubando la neuroretina mirando hacia arriba. Por otro lado, la falla del explante retiniano puede resultar de voltear o doblar el tejido de la retina, lo que hace que la neurorretina mire hacia abajo. La tinción por inmunofluorescencia del explante retiniano cultivado después de 2 semanas utilizando diferentes marcadores retinianos como el experimento anterior (NeuN, GFAP e isolectina-B4) demostró que el fracaso de la orientación adecuada del explante resulta en el fracaso del desarrollo adecuado del elemento neurovascular (Figura 3).
Figura 1: Pasos de disección del globo ocular para crear el explante retiniano . (a) El globo ocular enucleado se sumerge en los medios inmediatamente después de ser retirado del animal. (b) Se hace una incisión circunferencial a lo largo del limbo para abrir el globo ocular. (c) La córnea se extrae disecando a lo largo de la incisión limbo. (d) Al sostener el nervio óptico con fórceps finos, la capa externa del ojo se despega suavemente. (e) Se extraen el cristalino, el vítreo y el cuerpo ciliar. (F) Sólo queda atrás la retina neural. (g) Se realizan cuatro incisiones radiales en la retina para facilitar que se corte en el siguiente paso. (h) La retina puede cortarse en dos o cuatro pedazos y luego transferirse a la placa de cultivo celular que contiene el inserto y el medio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cultivo exitoso de explante retiniano con estructura retiniana preservada. Tinción por inmunofluorescencia de los explantes retinianos que habían permanecido en cultivo durante 2 semanas. Los explantes se fijaron y tiñeron con (a) NeuN para las neuronas de la retina (verde) e isolectina-B4 para los vasos sanguíneos (rojo), y (b) GFAP para las células gliales (verde) e isolectina-B4 para los vasos sanguíneos (rojo). La tinción mostró células retinianas y vasos retinianos bien desarrollados. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cultivo de explante de retina fallido con células retinianas defectuosas y subdesarrolladas. Tinción por inmunofluorescencia de explantes retinianos que habían permanecido en cultivo durante dos semanas. Los explantes se fijaron y se tiñeron con GFAP para células gliales (verde) e isolectina-B4 para vasos sanguíneos (rojo). Las imágenes muestran tinciones defectuosas y células retinianas y vasos retinianos subdesarrollados. El explante retiniano estaba plegado y no estaba orientado correctamente en la placa de cultivo. Se debe prestar mucha atención para garantizar la orientación correcta del explante con la retina hacia arriba. Si no se coloca el explante retiniano en la orientación correcta, se producirá el fracaso del desarrollo adecuado del explante. Barra de escala = 100 μm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Nuestro laboratorio ha estado estudiando los cambios fisiopatológicos que promueven la disfunción microvascular retiniana durante años 31,32,33,34,35,36. Los explantes de retina son una de las técnicas que pueden ser de gran valor para utilizar como modelo para estudiar enfermedades de la retina como la retinopatía diabética o las enfermedades degenerativas de la retina. Tener un grupo de control derivado de la misma retina o animal único que el grupo o grupos tratados le da a esta técnica una gran ventaja en términos de proporcionar comparaciones más confiables de diferentes condiciones experimentales.
Uno de los principales desafíos durante la preparación del explante retiniano es el plegamiento del explante o la orientación incorrecta en la placa de cultivo con la superficie de la retina hacia abajo. Otros investigadores sugirieron pipetear la retina hacia arriba y hacia abajo dentro de la pipeta de transferencia para tenerla en la orientación correcta en la placa37. Sin embargo, en su protocolo, utilizaron toda la retina para un solo explante, pero en este protocolo, una sola retina se cortó en dos a cuatro piezas, lo que significa que las piezas son más pequeñas y es difícil hacer esta maniobra para la orientación adecuada. Cortar una sola retina en dos a cuatro pedazos permite obtener de cuatro a ocho piezas retinianas del mismo animal que podrían usarse para un experimento. Esto permite experimentos en los que el grupo de control y los grupos experimentales se derivan del mismo animal.
Sin embargo, cortar la retina en trozos pequeños hace que su manejo sea más difícil. Por lo tanto, desarrollamos una técnica para el manejo de estas pequeñas piezas retinianas para garantizar la orientación adecuada del cultivo de retina. Para hacer esto, la hoja de tijera de disección abierta se coloca justo debajo de la pieza retiniana, con la superficie de la retina hacia arriba. Si la pieza retiniana se voltea o se dobla, se ajusta suavemente a la orientación correcta. Lentamente, la pieza retiniana se eleva con la punta de una hoja de tijera abierta y se coloca suavemente en la placa de cultivo. Esta técnica simple asegura que cada pieza de la retina esté en la orientación correcta con la retina hacia arriba y promueve mejores resultados para estudiar los vasos retinianos y las células neurogliales (Figura 2). Si no se coloca el explante retiniano en la orientación correcta con la neuroretina hacia arriba, se producirá el fracaso del crecimiento adecuado de las células de la retina en cultivo, como se muestra en la Figura 3. Se recomienda encarecidamente una formación adecuada para evitar este error técnico.
Este protocolo describe un explante organotípico de retina de una retina de ratón adulto; Sin embargo, la técnica también se ha descrito previamente tanto para retinas de ratón inmaduras37 como para retinas humanas38. En un estudio previo, se describieron cultivos de explantes retinianos para estudiar el desarrollo vascular, en los cuales la manipulación de la función endotelial se hizo factible ex vivo27. Como ejemplo de la evaluación morfológica de un explante retiniano, el explante retiniano se dejó en cultivo durante 2 semanas, y luego se realizó inmunotinción utilizando NeuN (marcador celular neuronal), GFAP (marcador de células gliales) e isolectina-B4 (marcador vascular). La tinción mostró que las células de la retina y los vasos sanguíneos estaban bien desarrollados y bien conservados en el explante (Figura 2). Sin embargo, también se pueden obtener más datos de tinción inmunohistoquímica para verificar la viabilidad y funcionalidad de otras células de la retina en el explante.
El cultivo de explante en sí podría ser estresante para las células de la retina. Sin embargo, las células podrían incubarse en condiciones relativamente normales, de modo que los cambios morfológicos que ocurren en diversas condiciones experimentales, como la hiperglucemia o la hipoxia, podrían compararse con la condición basal. El explante, por lo tanto, representa una buena herramienta para evaluar varias células de la retina y probar sus respuestas a diferentes agentes farmacológicos o dianas terapéuticas simultáneamente en una amplia variedad de enfermedades de la retina.
La neovascularización retiniana es un signo cardinal de la retinopatía isquémica, como en la retinopatía del prematuro y la retinopatía diabética. Nosotros (Figura 2) y otros 27,39,40,41,42 pudimos observar vasculatura retiniana intacta en explantes cultivados hasta por 2 semanas. Así, el explante retiniano ha sido utilizado para estudiar la fisiopatología de la neovascularización retiniana tanto normal como patológica 41,42,43,44,45,46,47,48,49. Curiosamente, un grupo de investigación registró la brotación vascular inducida por VEGF en explantes retinianos de ratón mientras investigaba los factores proangiogénicos que están elevados en la retinopatía diabética proliferativa43. Además, los explantes retinianos se han incrustado en un gel tridimensional, lo que permite el estudio de la brotación de las células endoteliales de la retina en una orientación espaciotemporal más detallada45,46,47.
Además de los estudios morfológicos, los explantes retinianos también se utilizan en cierta medida para evaluar las funciones retinianas50,51,52,53. Se han realizado imágenes de electrorretinograma (ERG) ex vivo en explantes retinianos aislados de ratón, lo que permite el estudio de las diferentes funciones de una variedad de células retinianas, incluidos los fotorreceptores de bastones y conos54,55,56,57. Curiosamente, Calbiague et al. relataron que, en respuesta al tratamiento con glucosa alta, los cultivos de explantes retinianos derivados de ratones o ratas mostraron un espesor cada vez más reducido de las capas retinianas58. Sin embargo, las células bipolares de la retina, que se encuentran entre las primeras células sensibles a las condiciones diabéticas, mantuvieron no solo su morfología sino también sus propiedades electrofisiológicas en cultivo hasta por 2 semanas58. En resumen, creemos que este protocolo podría ser una base o un punto de partida para estudios futuros adicionales para optimizar los beneficios del uso de explantes en la investigación ocular.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer la subvención de financiación del Instituto Nacional de Salud (NIH) al Instituto Nacional del Ojo (R01 EY030054) al Dr. Mohamed Al-Shabrawey. Nos gustaría agradecer a Kathy Wolosiewicz por ayudarnos con la narración del video. Nos gustaría agradecer al Dr. Ken Mitton, del laboratorio de Investigación Pediátrica de la Retina del Instituto de Investigación del Ojo, Universidad de Oakland, por su ayuda durante el uso del microscopio quirúrgico y la grabación. Este video fue editado y dirigido por el Dr. Khaled Elmasry.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult C57Bl/6J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA | 664 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A. | BZ-X800 | |
| B27 supplements | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #17504-04 | |
| Blockade blocking solution | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | B10710 | |
| DMEM F12 | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #11320033 | |
| Goat anti-Rabbit IgG. | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | F-2765 | |
| GSL I, BSL I (Isolectin) | Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA | B-1105-2 | |
| Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #14175095 | |
| Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades | World Precision Instruments,FL 34240, USA | Straight (503365) | |
| N2 supplements | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #17502-048 | |
| Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | 140652 | |
| Paraformaldehyde 4% in PBS | BBP, Ashland, MA, 01721 USA | C25N107 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | 15140148 | |
| PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | P36962 | |
| Rabbit Anti-NeuN Antibody | Abcam.,Cambridge, UK | ab177487 | |
| Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody | Dako,Carpinteria, CA 93013, USA. | Z0334 | |
| Texas Red | Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA | SA-5006-1 | |
| TritonX | BioRad Hercules, CA, 94547,USA | 1610407 |
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