Summary
Dieses Protokoll stellt und beschreibt Schritte zur Isolierung, Dissektion, Kultivierung und Färbung von Netzhautexplantaten, die aus einer erwachsenen Maus gewonnen wurden. Diese Methode ist als Ex-vivo-Modell für die Untersuchung verschiedener neurovaskulärer Netzhauterkrankungen wie der diabetischen Retinopathie von Vorteil.
Abstract
Eine der Herausforderungen in der Netzhautforschung ist die Untersuchung des Cross-Talks zwischen verschiedenen Netzhautzellen wie Netzhautneuronen, Gliazellen und Gefäßzellen. Die Isolierung, Kultivierung und Erhaltung von Netzhautneuronen in vitro hat technische und biologische Einschränkungen. Die Kultivierung von Netzhautexplantaten kann diese Einschränkungen überwinden und bietet ein einzigartiges Ex-vivo-Modell , um den Austausch zwischen verschiedenen Netzhautzellen mit gut kontrollierten biochemischen Parametern und unabhängig vom Gefäßsystem zu untersuchen. Darüber hinaus sind Netzhautexplantate ein wirksames Screening-Instrument zur Untersuchung neuartiger pharmakologischer Interventionen bei verschiedenen retinalen vaskulären und neurodegenerativen Erkrankungen wie der diabetischen Retinopathie. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Isolation und Kultur von Netzhautexplantaten über einen längeren Zeitraum. Das Manuskript weist auch einige der technischen Probleme während dieses Verfahrens auf, die die gewünschten Ergebnisse und die Reproduzierbarkeit der Netzhautexplantatkultur beeinträchtigen können. Die Immunfärbung der Netzhautgefäße, Gliazellen und Neuronen zeigte intakte Netzhautkapillaren und Neurogliazellen nach 2 Wochen nach Beginn der Netzhautexplantatkultur. Dies etabliert Netzhautexplantate als zuverlässiges Werkzeug zur Untersuchung von Veränderungen im retinalen Gefäßsystem und in den Neurogliazellen unter Bedingungen, die Netzhauterkrankungen wie diabetische Retinopathie nachahmen.
Introduction
Verschiedene Modelle wurden vorgestellt, um Netzhauterkrankungen zu untersuchen, darunter sowohl in vivo als auch in vitro Modelle. Die Verwendung von Tieren in der Forschung ist immer noch Gegenstand ständiger ethischer und translationalerDebatten 1. Tiermodelle mit Nagetieren wie Mäusen oder Ratten werden häufig in der Netzhautforschung verwendet 2,3,4. Klinische Bedenken sind jedoch aufgrund der unterschiedlichen physiologischen Funktionen der Netzhaut bei Nagetieren im Vergleich zum Menschen aufgetreten, wie z. B. das Fehlen der Makula oder Unterschiede im Farbsehen5. Die Verwendung menschlicher postmortaler Augen für die Netzhautforschung hat ebenfalls viele Probleme, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Unterschiede in den genetischen Hintergründen der Originalproben, der Krankengeschichte der Spender und der früheren Umgebung oder des Lebensstils der Spender6. Darüber hinaus hat die Verwendung von In-vitro-Modellen in der Netzhautforschung auch einige Nachteile. Zellkulturmodelle, die zur Untersuchung von Netzhauterkrankungen verwendet werden, umfassen die Verwendung von Zelllinien menschlichen Ursprungs, Primärzellen oder Stammzellen7. Die verwendeten Zellkulturmodelle haben nachweislich Probleme in Bezug auf Kontamination, Fehlidentifizierung oder Dedifferenzierung 8,9,10,11. In jüngster Zeit hat die retinale Organoid-Technologie signifikante Fortschritte gezeigt. Der Aufbau hochkomplexer Netzhäute in vitro hat jedoch mehrere Einschränkungen. Zum Beispiel haben retinale Organoide nicht die gleichen physiologischen und biochemischen Eigenschaften wie reife in vivo Netzhäute. Um diese Einschränkung zu überwinden, muss die retinale Organoidtechnologie mehr biologische und zelluläre Merkmale integrieren, einschließlich glatter Muskelzellen, Gefäße und Immunzellen wie Mikroglia12,13,14,15.
Organotypische Netzhautexplantate haben sich als zuverlässiges Werkzeug zur Untersuchung von Netzhauterkrankungen wie diabetischer Retinopathie und degenerativen Netzhauterkrankungen erwiesen16,17,18,19. Im Vergleich zu anderen bestehenden Techniken unterstützt die Verwendung von Netzhautexplantaten sowohl in vitro retinale Zellkulturen als auch aktuelle in vivo Tiermodelle, indem ein einzigartiges Merkmal hinzugefügt wird, um das Cross-Talk zwischen verschiedenen Netzhautzellen unter den gleichen biochemischen Parametern und unabhängig von systemischen Variablen zu untersuchen. Die Explantatkulturen ermöglichen es, verschiedene Netzhautzellen in derselben Umgebung zusammen zu halten, was die Erhaltung retinaler interzellulärer Interaktionen ermöglicht20,21,22. Darüber hinaus zeigte eine frühere Studie, dass Netzhautexplantate in der Lage waren, die morphologische Struktur und Funktionalität der kultivierten Netzhautzellen zu erhalten23. Somit können Netzhautexplantate eine gute Plattform für die Untersuchung möglicher therapeutischer Ziele für eine Vielzahl von Netzhauterkrankungenbieten 24,25,26. Retinale Explantatkulturen bieten eine kontrollierbare Technik und sind ein sehr flexibler Ersatz für bestehende Mothoden, die zahlreiche pharmakologische Manipulationen ermöglichen und mehrere molekulare Mechanismen aufdecken können27.
Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit ist es, die retinale Explantattechnik als sinnvolles Zwischenmodellsystem zwischen in vitro Zellkulturen und in vivo Tiermodellen darzustellen. Diese Technik kann Netzhautfunktionen besser nachahmen als dissoziierte Zellen. Da verschiedene Netzhautschichten intakt bleiben, können die interzellulären Interaktionen der Netzhaut im Labor unter gut kontrollierten biochemischen Bedingungen und unabhängig von der Funktion des Gefäßsystems beurteilt werden28.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Oakland University, Rochester, MI, USA genehmigt und folgten den Richtlinien der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research.
1. Tierische Zubereitung
- Halten Sie die Tiere unter konstanter Temperatur in einer lichtkontrollierten Umgebung. Die Temperatureinstellungen für den Tierstallraum sollten den Richtlinien des "Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren" entsprechen. Der Temperaturbereich für Mäuse liegt zwischen 18 °C und 26 °C. Halten Sie die Luftfeuchtigkeit kontrolliert und auf etwa 42% eingestellt.
- Verwenden Sie für dieses Experiment männliche C57BL / 6J-Mäuse (Details finden Sie in der Materialtabelle ), die älter als 12 Wochen sind (für dieses Protokoll wurde eine erwachsene Maus verwendet).
HINWEIS: In diesem Protokoll wurde ein Wildtyp-Stamm für die Demonstration verwendet, da er keine genetischen Anomalien aufwies, die die Netzhaut betrafen. Man könnte jedoch andere Stämme, einschließlich genetisch manipulierter Stämme, für die Netzhautexplantatkultur verwenden. - Stellen Sie 12 h Hell-Dunkel-Zyklen über Lichtsteuerung in den Tierhaltungsräumen zur Verfügung.
- Untersuchen Sie jedes Tier zweimal täglich während der Woche und einmal täglich am Wochenende auf Gesundheit und ausreichende Nahrungs- und Wasseraufnahme. Stellen Sie sicher, dass Sie sie mit frischem Essen und sauberem Wasser versorgen.
- Wenn der Futter- und Wasserstand während der Woche niedrig ist, spülen Sie die Wasserflasche ab und füllen Sie sie wieder auf. Fügen Sie bei Bedarf frische Lebensmittel hinzu. Wechseln Sie verschmutzte Käfige täglich oder nach Bedarf für die Gesundheit der Tiere.
HINWEIS: Um die Photorezeptoren und lichtinduzierten Veränderungen in der Netzhaut zu untersuchen, passen Sie die Mäuse über Nacht in einer speziellen dunklen Box in einem dunklen Raum in der Tiereinrichtung dunkel an. - Euthanasieren Sie die Tiere in ihrem Heimkäfig durch CO 2 Inhalationsüberdosis mit komprimiertem CO 2 -Gas in Flaschen, die an eine CO2 -Kammer angeschlossen sind. Führen Sie die Sterbebestätigung mit einer sekundären Euthanasiemethode wie Zervixluxation durch.
- Nach Abschluss des Verfahrens bestätigen Sie den Tiertod durch eine geeignete Methode, z. B. die Bestätigung eines Herz- und Atemstillstands oder die Beobachtung fester und erweiterter Pupillen des Tieres.
2. Gewebevorbereitung
- Sobald das Tier eingeschläfert ist, reinigen Sie den Bereich mit 70% Ethanol. Öffnen Sie dann die Augenlider mit einer Hand, so dass das Auge sichtbar ist. Üben Sie mit der gegenüberliegenden Hand mit gebogenen Pinzetten Druck auf die oberen und unteren Teile der Umlaufbahn aus, bis der Globus hervorsteht.
- Um das Auge zu enukleieren, schließen Sie vorsichtig die Pinzette am hinteren Teil des Auges und heben Sie sie in einer kontinuierlichen Bewegung an. Halten Sie den Augapfel mit einer Pinzette vom Sehnerv ab. Stellen Sie sicher, dass Sie sterilisierte Dissektionswerkzeuge für alle Schritte verwenden und unter vollständig aseptischen Bedingungen arbeiten.
- Tauchen Sie jeden Augapfel in eine 1,5 ml Tube mit 1 ml eiskaltem HBSS mit Penicillin-Streptomycin (10.000 U / ml). Waschen Sie den Augapfel in HBSS zweimal für jeweils 5 Minuten.
- Übertragen Sie den Augapfel in ein 1,5-2 ml Röhrchen, das komplette Medien enthält (10% FBS, 2% B27, 1% N2, 1% L-Glutamin und 1% Penicillin und Streptomycin).
3. Gewebedissektion
- Sezieren Sie die Netzhaut vorsichtig unter einem Operationsmikroskop, wie in Abbildung 1 nacheinander dargestellt.
- Machen Sie einen umlaufenden Schnitt um den Limbus, um den Augapfel zu öffnen. Entfernen Sie die Hornhaut, indem Sie kreisförmig entlang der Hornhautgrenze und des (limbalen) Einschnitts sezieren, gefolgt von der Entfernung des vorderen Segments, der Linse und des Glaskörpers, wobei eine leere Augenmuschel zurückbleibt.
- Indem Sie die Region des Sehnervenkopfes mit einer feinen Pinzette halten, ziehen Sie die äußere Augenschicht sanft ab. Achten Sie bei der Entfernung der äußeren Hülle sehr darauf, die Netzhaut der Neuralhaut nicht zu verletzen und sicherzustellen, dass die Netzhaut vollständig intakt bleibt.
HINWEIS: Die Netzhaut muss vorsichtig vom retinalen Pigmentepithel (RPE) entfernt werden, und ein einziger Schnitt am Sehnervkopf muss durchgeführt werden, um die Netzhaut vom Sehnerv zu lösen. Stellen Sie dies visuell sicher, indem Sie das vom Sehnerv hinterlassene Loch (den Sehnervkopf) identifizieren. - Zerlegen Sie die Netzhaut radial in vier gleich große Stücke.
- Befolgen Sie die folgenden Schritte zur Handhabung der kleinen Teile der Netzhaut, um die richtige Ausrichtung der Netzhautkultur sicherzustellen.
- Öffnen Sie mit einer sezierenden Scherenklinge knapp unter dem Netzhautstück (Table of Materials).
- Heben Sie das Netzhautstück langsam mit der Spitze eines offenen Scherenblattes an und legen Sie es vorsichtig auf die Kulturplatte.
- Übertragen Sie die aus der isolierten Netzhaut gewonnenen Explantate separat auf Zellkultureinsätze in einer 12-Well-Platte, die jeweils 300 μL retinale Explantatmedien enthalten, wobei die retinale Ganglienzelle (Neuroretina) nach oben zeigt.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass es sich bei den Medien um DMEM-Medien mit N2- und B27-Ergänzungen handelt. Fügen Sie auch Penicillin-Streptomycin (10.000 U / ml) zu den Medien hinzu (Materialtabelle). Die Netzhaut besteht aus mehreren Schichten neuronaler Zellen, die über Synapsen miteinander verbunden sind und von außen durch die pigmentierte Schicht des retinalen Pigmentepithels gestützt werden, die die schwarze Schicht ist, die während der Dissektion entfernt wurde. - Entfernen Sie alle Reste des pigmentierten Epithels; Diese Überreste können jedoch helfen, die richtige Ausrichtung der Explantat zu identifizieren. Stellen Sie sicher, dass der pigmentierte Teil nach unten und der nicht pigmentierte Teil nach oben zeigt.
- Inkubation der Netzhautexplantatkultur in befeuchteten Inkubatoren bei 37 °C und 5% CO2.
- Stellen Sie sicher, dass die Netzhautoberfläche nach oben zeigt. Wenn das Netzhautstück umgedreht oder gefaltet wird, versuchen Sie, es vorsichtig auf die richtige Ausrichtung einzustellen.
HINWEIS: Achten Sie sehr auf die korrekte Ausrichtung der Netzhautexplantat in der Kulturplatte. Vermeiden Sie jegliches Umdrehen oder Falten der Explantat in der Kulturplatte, da dies zum Versagen des richtigen Wachstums der Netzhautzellen in Kultur führt.
4. Netzhautexplantatkultur
- Die Netzhautexplantatkulturen (hergestellt in den Schritten 3.2-3.3) werden in befeuchteten Inkubatoren bei 37 °C und 5 %CO2 gehalten.
- Wechseln Sie die Hälfte der Medien von jedem Brunnen jeden zweiten Tag für 2 Wochen. Pipettieren Sie dazu vorsichtig 150 μL aus dem Brunnen. Dann fügen Sie 150 μL frisches Medium wieder in den Brunnen hinzu. Vermeiden Sie es, die Explantate beim Wechseln des Mediums umzudrehen.
- Überprüfen Sie die Explantation sorgfältig unter dem Mikroskop, bevor Sie die Kulturplatte wieder in den Inkubator geben. Untersuchen Sie die Integrität der Zellen und die Netzhautarchitektur unter einem Hellfeldmikroskop. Stellen Sie sicher, dass die Explantat noch richtig ausgerichtet ist. Verwenden Sie sowohl die 4x- als auch die 20x-Objektivlinse, um die Explantat zu untersuchen.
HINWEIS: Vermeiden Sie das vollständige Eintauchen der Explantat in das Medium.
5. Immunhistochemie
- Nach 2 Wochen fixieren Sie die Netzhautexplantat, indem Sie das Medium entfernen. Tun Sie dies, indem Sie zuerst einmal mit 200 μL 1x PBS waschen und dann 300 μL 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PBS, pH 7,4, in die Vertiefung geben, die die Explantat enthält, und sie über Nacht stehen lassen.
HINWEIS: Dieser Schritt kann durchgeführt werden, ohne die Kultureinsätze von der Platte zu entfernen. Die Explantate können auch in ein 500 μL konisches Röhrchen überführt werden, und das Waschen und Fixieren kann im Inneren des Röhrchens erfolgen. - Die Explantat wird zum Waschen in ein 500 μL konisches Röhrchen mit 300 μL 1x PBS-2,5% Triton X überführt.
- Waschen Sie die festen Explantate dreimal für jeweils 5 min mit mittlerer Geschwindigkeit auf einem Shaker (25 U/min) in der Tube.
- Blockieren Sie die erwarteten unspezifischen Reaktionen, indem Sie die Explantat mit 300 μL 1x blockierendem Puffer mit 0,02% Thimerosal für 1 h bei Raumtemperatur vor der Antikörperinkubation inkubieren.
- Die fixierten Explantate mit den primären Antikörpern über Nacht bei 4 °C mit mittlerer Geschwindigkeit auf einem Shaker inkubieren.
HINWEIS: Nachweis der retinalen Endothelzellen in der fixierten Explantat durch Färbung mit GSL I, BSL I Antikörper (Lektin) (7:1.000). Nachweis der Gliazellen in den Netzhautexplantaten durch Färbung mit Kaninchen-Gliafibrillär-saurem Protein (GFAP) Antikörper (1:250). Detektieren Sie die retinalen Neuronen, indem Sie die Explantat mit Kaninchen-NeuN-Antikörper färben (1:250)29,30. Inkubieren Sie s{Tual-Chalot, 2013 #117}{Tual-Chalot, 2013 #116}{Tual-Chalot, 2013 #116}ome explantiert mit dem Lektin, NeuN-Kombination, und inkubieren Sie andere mit dem Lektin, GFAP-Kombination. - Am nächsten Tag entfernen Sie den primären Antikörper aus den Röhrchen durch Aspiration mit einer Pipette. Waschen Sie die Explantate mit 1x PBS-2,5% Triton X dreimal für jeweils 5 min mit mittlerer Geschwindigkeit auf einem Shaker.
- Fügen Sie die sekundären Antikörper hinzu: Goat Anti-Rabbit IgG (1:500) (sekundär für GFAP und NeuN) und Texas Red (7:1.000) (für das Lektin). 1 h bei Raumtemperatur mit mittlerer Geschwindigkeit auf einem Schüttler inkubieren.
HINWEIS: Die sekundären Antikörper sind lichtempfindlich, also bedecken Sie die Röhre mit Aluminiumfolie. - Entfernen Sie die sekundären Antikörper durch Aspiration und waschen Sie dann dreimal für jeweils 5 min mit 1x PBS-2,5% Triton X.
- Das Explantat aus dem Röhrchen mit einer Transferpipette auf einen Glasobjektträger überführen. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit auf dem Objektträger, und fügen Sie dann einen Tropfen Montagemedien mit DAPI zum Objektträger hinzu.
- Bedecken Sie das Gewebe mit einem Deckglas. Lassen Sie keine Luftblasen zwischen dem Deckglas und dem Gewebe zu.
- Bringen Sie die gefärbten Objektträger zum Fluoreszenzmikroskop und beginnen Sie mit der Aufnahme der Bilder. Es ist wichtig, die gefärbten Objektträger mit einer Objektträgerbox abzudecken, da die Fluoreszenzfärbung lichtempfindlich ist.
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Representative Results
Überleben der neuronalen und vaskulären Netzhautzellen der Netzhautexplantat in Kulturmedien ex vivo über einen längeren Zeitraum
Durch die Kultivierung einer Netzhautexplantat unter Verwendung unseres Protokolls gelang es uns, verschiedene Netzhautzellen zu erhalten, die bis zu 2 Wochen lebensfähig waren. Um das Vorhandensein verschiedener Netzhautzellen nachzuweisen, wurde eine Immunfluoreszenzfärbung der Netzhautexplantat mit einem neuronalen Zellmarker (NeuN), Gliazellmarker (GFAP) und vaskulären Marker (Isolectin-B4) durchgeführt (Abbildung 2). Die Färbung zeigte gut organisierte und gut entwickelte Netzhautneuronen und Gliazellen. Darüber hinaus waren die retinalen Blutgefäße strukturell intakt, wie die Isolectin-B4-Färbung zeigt. Die morphologische Integrität der Netzhautexplantat, wie durch die Immunfärbung gezeigt, zeigte, dass die retinale Explantatkultur erfolgreich war, um lebensfähige Netzhautzellen zu erhalten, die experimentell als Modell verwendet werden konnten. Die verschiedenen experimentellen Bedingungen, die mit der Explantat untersucht werden sollen, können durch Immunfluoreszenzfärbung für mehrere zelluläre Marker mit der ImageJ-Software bewertet und analysiert werden. Die Immunfärbung ermöglicht die Messung der Immunreaktivität jedes zellulären Markers und der Anzahl spezifischer Zellen, wie z. B. der Anzahl der retinalen Ganglienzellen oder Photorezeptoren, unter verschiedenen experimentellen Gruppen.
Bedeutung der korrekten Orientierung des Netzhautexplantats in der Kulturplatte für die experimentellen Ergebnisse
Die korrekte Ausrichtung der Netzhautexplantat in der Kulturplatte wird durch Inkubation der Neuroretina nach oben erreicht. Auf der anderen Seite kann ein Versagen der Netzhautexplantat durch Umdrehen oder Falten des Netzhautgewebes entstehen, wodurch die Neuroretina nach unten zeigt. Die Immunfluoreszenzfärbung der kultivierten Netzhautexplantat nach 2 Wochen unter Verwendung verschiedener Netzhautmarker wie das vorherige Experiment (NeuN, GFAP und Isolectin-B4) zeigte, dass das Versagen der richtigen Explantatausrichtung zum Versagen der richtigen Entwicklung des neurovaskulären Elements führt (Abbildung 3).
Abbildung 1: Schritte zum Sezieren des Augapfels, um die Netzhautexplantat zu erzeugen . (a) Der enukleierte Augapfel wird unmittelbar nach der Entfernung vom Tier in das Medium eingetaucht. (b) Ein umlaufender Schnitt wird entlang des Limbus gemacht, um den Augapfel zu öffnen. (c) Die Hornhaut wird durch Sezieren entlang des limbalen Schnitts entfernt. (d) Durch Halten des Sehnervs mit einer feinen Pinzette wird die äußere Augenschicht sanft abgezogen. (e) Die Linse, der Glaskörper und der Ziliarkörper werden entfernt. (F) Nur die neuronale Netzhaut bleibt zurück. (g) Vier radiale Schnitte werden in der Netzhaut gemacht, um das Schneiden im nächsten Schritt zu erleichtern. h) Die Netzhaut kann in zwei oder vier Stücke geschnitten und dann auf die Zellkulturplatte übertragen werden, die den Einsatz und das Medium enthält. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Erfolgreiche Netzhautexplantatkultur mit erhaltener Netzhautstruktur. Immunfluoreszenzfärbung der Netzhautexplantate, die 2 Wochen in Kultur geblieben waren. Die Explantate wurden fixiert und mit (a) NeuN für Netzhautneuronen (grün) und Isolectin-B4 für Blutgefäße (rot) und (b) GFAP für Gliazellen (grün) und Isolectin-B4 für Blutgefäße (rot) gefärbt. Die Färbung zeigte gut entwickelte Netzhautzellen und Netzhautgefäße. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Erfolglose Netzhautexplantatkultur mit defekten, unterentwickelten Netzhautzellen. Immunfluoreszenzfärbung von Netzhautexplantaten, die zwei Wochen in Kultur geblieben waren. Die Explantate wurden fixiert und mit GFAP für Gliazellen (grün) und Isolectin-B4 für Blutgefäße (rot) angefärbt. Die Bilder zeigen fehlerhafte Färbungen und unterentwickelte Netzhautzellen und Netzhautgefäße. Die Netzhautexplantat war gefaltet und in der Kulturplatte nicht richtig ausgerichtet. Große Aufmerksamkeit sollte der richtigen Ausrichtung der Explantat mit der Netzhaut nach oben gewidmet werden. Wenn die Netzhautexplantat nicht in die richtige Ausrichtung gebracht wird, führt dies zum Versagen der ordnungsgemäßen Entwicklung der Explantat. Maßstabsbalken = 100 μm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Unser Labor untersucht seitJahren die pathophysiologischen Veränderungen, die die retinale mikrovaskuläre Dysfunktion fördern, 31,32,33,34,35,36. Netzhautexplantate sind eine der Techniken, die als Modell für die Untersuchung von Netzhauterkrankungen wie diabetischer Retinopathie oder degenerativen Netzhauterkrankungen von großem Wert sein können. Eine Kontrollgruppe, die von derselben Netzhaut oder demselben Tier wie die behandelte Gruppe oder Gruppen stammt, bietet dieser Technik einen großen Vorteil im Hinblick auf zuverlässigere Vergleiche verschiedener Versuchsbedingungen.
Eine der größten Herausforderungen bei der Netzhautexplantatvorbereitung ist die Faltung der Explantat oder eine falsche Orientierung in der Kulturplatte mit der Netzhautoberfläche nach unten. Andere Forscher schlugen vor, die Netzhaut innerhalb der übertragenden Pipette auf und ab zu pipettieren, um sie in der richtigen Ausrichtung in der Platte37 zu haben. In ihrem Protokoll verwendeten sie jedoch die gesamte Netzhaut für eine einzelne Explantat, aber in diesem Protokoll wurde eine einzelne Netzhaut in zwei bis vier Stücke geschnitten, was bedeutet, dass die Stücke kleiner sind und es schwierig ist, dieses Manöver für die richtige Orientierung durchzuführen. Das Schneiden einer einzelnen Netzhaut in zwei bis vier Stücke ermöglicht es, vier bis acht Netzhautstücke von demselben Tier zu erhalten, das für ein Experiment verwendet werden könnte. Dies ermöglicht Experimente, bei denen die Kontrollgruppe und die Versuchsgruppen vom selben Tier stammen.
Das Schneiden der Netzhaut in kleine Stücke macht die Handhabung jedoch schwieriger. Daher haben wir eine Technik für den Umgang mit diesen kleinen Netzhautstücken entwickelt, um die richtige Ausrichtung der Netzhautkultur zu gewährleisten. Dazu wird die offene Sezierscherenklinge knapp unter dem Netzhautstück platziert, wobei die Netzhautfläche nach oben zeigt. Wird das Netzhautstück umgedreht oder gefaltet, wird es sanft auf die richtige Ausrichtung eingestellt. Langsam wird das Netzhautstück mit der Spitze einer offenen Scherenklinge angehoben und vorsichtig in die Kulturplatte gesteckt. Diese einfache Technik stellt sicher, dass jedes Netzhautstück in der richtigen Ausrichtung ist, wobei die Netzhaut nach oben zeigt, und fördert bessere Ergebnisse für die Untersuchung von Netzhautgefäßen und Neurogliazellen (Abbildung 2). Wenn die Netzhautexplantat nicht in die richtige Ausrichtung gebracht wird, wobei die Neuroretina nach oben zeigt, führt dies zu einem Versagen des richtigen Wachstums der Netzhautzellen in Kultur, wie in Abbildung 3 gezeigt. Eine angemessene Schulung wird dringend empfohlen, um diesen technischen Fehler zu vermeiden.
Dieses Protokoll beschreibt eine organotypische Netzhautexplantation einer erwachsenen Mausnetzhaut; Die Technik wurde jedoch auch zuvor sowohl für die unreife Netzhaut der Maus37 als auch für die menschliche Netzhaut38 beschrieben. In einer früheren Studie wurden retinale Explantatkulturen zur Untersuchung der vaskulären Entwicklung beschrieben, in denen die Manipulation der Endothelfunktion ex vivo27 möglich gemacht wurde. Als Beispiel für die morphologische Beurteilung einer retinalen Explantat wurde die retinale Explantat für 2 Wochen in Kultur belassen und dann eine Immunfärbung mit NeuN (neuronaler Zellmarker), GFAP (Gliazellmarker) und Isolectin-B4 (vaskulärer Marker) durchgeführt. Die Färbung zeigte, dass die Netzhautzellen und Blutgefäße in der Explantat gut entwickelt und gut erhalten waren (Abbildung 2). Es können jedoch mehr immunhistochemische Färbedaten gewonnen werden, um die Lebensfähigkeit und Funktionalität anderer Netzhautzellen in der Explantat zu überprüfen.
Die Explantatkultur selbst könnte für die Netzhautzellen belastend sein. Die Zellen konnten jedoch unter relativ normalen Bedingungen inkubiert werden, so dass die morphologischen Veränderungen, die unter verschiedenen experimentellen Bedingungen wie Hyperglykämie oder Hypoxie auftreten, mit dem Ausgangszustand verglichen werden konnten. Die Explantat stellt somit ein gutes Werkzeug dar, um verschiedene Netzhautzellen zu bewerten und ihre Reaktionen auf verschiedene pharmakologische Wirkstoffe oder therapeutische Ziele gleichzeitig bei einer Vielzahl von Netzhauterkrankungen zu testen.
Die retinale Neovaskularisation ist ein Kardinalmerkmal der ischämischen Retinopathie, wie bei Frühgeborenen-Retinopathie und diabetischer Retinopathie. Wir (Abbildung 2) und andere 27,39,40,41,42 konnten ein intaktes Netzhautgefäßsystem in kultivierten Explantaten bis zu 2 Wochen lang beobachten. So wurde die Netzhautexplantat verwendet, um die Pathophysiologie sowohl der normalen als auch der pathologischen retinalen Neovaskularisation 41,42,43,44,45,46,47,48,49 zu untersuchen. Interessanterweise erfasste eine Forschungsgruppe VEGF-induziertes Gefäßkeimen in Netzhautexplantaten von Mäusen und untersuchte die proangiogenen Faktoren, die bei proliferativer diabetischer Retinopathie erhöht sind43. Darüber hinaus wurden Netzhautexplantate in ein dreidimensionales Gel eingebettet, das die Untersuchung des Keimens von retinalen Endothelzellen in einer detaillierteren raumzeitlichen Orientierung ermöglicht45,46,47.
Zusätzlich zu morphologischen Studien werden Netzhautexplantate in gewissem Umfang auch zur Bewertung der Netzhautfunktionen verwendet50,51,52,53. Ex-vivo-Elektroretinogramme (ERG) wurden an isolierten Netzhautexplantaten der Maus durchgeführt, was die Untersuchung der verschiedenen Funktionen einer Vielzahl von Netzhautzellen ermöglicht, einschließlich der Stäbchen- und Zapfenphotorezeptoren54,55,56,57. Interessanterweise berichteten Calbiague et al., dass als Reaktion auf eine Behandlung mit hoher Glukose Netzhautexplantatkulturen, die entweder von Mäusen oder Ratten stammten, eine zunehmend reduzierte Dicke der Netzhautschichten zeigten58. Retinale bipolare Zellen, die zu den frühesten empfindlichen Zellen für diabetische Erkrankungen gehören, behielten jedoch nicht nur ihre Morphologie, sondern auch ihre elektrophysiologischen Eigenschaften bis zu 2 Wochen in Kultur58. Zusammenfassend glauben wir, dass dieses Protokoll eine Basis oder ein Ausgangspunkt für weitere zukünftige Studien sein könnte, um die Vorteile der Explantatanwendung in der Augenforschung zu optimieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken dem National Institute of Health (NIH) Funding Grant an das National Eye Institute (R01 EY030054) an Dr. Mohamed Al-Shabrawey. Wir danken Kathy Wolosiewicz für die Hilfe bei der Videoerzählung. Wir danken Dr. Ken Mitton vom Pediatric Retinal Research Lab des Eye Research Institute, Oakland University, für seine Hilfe bei der Verwendung des Operationsmikroskops und der Aufnahme. Dieses Video wurde von Dr. Khaled Elmasry geschnitten und inszeniert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult C57Bl/6J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA | 664 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A. | BZ-X800 | |
| B27 supplements | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #17504-04 | |
| Blockade blocking solution | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | B10710 | |
| DMEM F12 | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #11320033 | |
| Goat anti-Rabbit IgG. | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | F-2765 | |
| GSL I, BSL I (Isolectin) | Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA | B-1105-2 | |
| Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #14175095 | |
| Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades | World Precision Instruments,FL 34240, USA | Straight (503365) | |
| N2 supplements | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #17502-048 | |
| Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | 140652 | |
| Paraformaldehyde 4% in PBS | BBP, Ashland, MA, 01721 USA | C25N107 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | 15140148 | |
| PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | P36962 | |
| Rabbit Anti-NeuN Antibody | Abcam.,Cambridge, UK | ab177487 | |
| Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody | Dako,Carpinteria, CA 93013, USA. | Z0334 | |
| Texas Red | Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA | SA-5006-1 | |
| TritonX | BioRad Hercules, CA, 94547,USA | 1610407 |
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