Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Retinale explant van het netvlies van de volwassen muis als een ex vivo model voor het bestuderen van retinale neurovasculaire ziekten

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/63966
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2
1Eye Research Center and Department of Foundational Medical Studies, Oakland University William Beaumont School of Medicine, 2Eye Research Institute, Oakland University, 3Human Anatomy and Embryology Department, Mansoura Faculty of Medicine, Mansoura University

Summary

Dit protocol presenteert en beschrijft stappen voor de isolatie, dissectie, kweek en kleuring van retinale explantaten verkregen van een volwassen muis. Deze methode is gunstig als een ex vivo model voor het bestuderen van verschillende retinale neurovasculaire ziekten zoals diabetische retinopathie.

Abstract

Een van de uitdagingen in netvliesonderzoek is het bestuderen van de cross-talk tussen verschillende retinale cellen zoals retinale neuronen, gliacellen en vasculaire cellen. Het isoleren, cultiveren en onderhouden van retinale neuronen in vitro hebben technische en biologische beperkingen. Het kweken van retinale explantaten kan deze beperkingen overwinnen en een uniek ex vivo model bieden om de cross-talk tussen verschillende retinale cellen te bestuderen met goed gecontroleerde biochemische parameters en onafhankelijk van het vasculaire systeem. Bovendien zijn retinale explantaten een effectief screeningsinstrument voor het bestuderen van nieuwe farmacologische interventies bij verschillende retinale vasculaire en neurodegeneratieve ziekten zoals diabetische retinopathie. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de isolatie en cultuur van retinale explantaten voor een langere periode. Het manuscript presenteert ook enkele van de technische problemen tijdens deze procedure die de gewenste resultaten en reproduceerbaarheid van de retinale explantcultuur kunnen beïnvloeden. De immunostaining van de retinale vaten, gliacellen en neuronen toonde intacte retinale haarvaten en neurogliale cellen na 2 weken vanaf het begin van de retinale explantcultuur. Dit stelt retinale explantaten vast als een betrouwbaar hulpmiddel voor het bestuderen van veranderingen in de retinale vasculatuur en neurogliale cellen onder omstandigheden die retinale ziekten zoals diabetische retinopathie nabootsen.

Introduction

Er zijn verschillende modellen gepresenteerd om retinale ziekten te bestuderen, waaronder zowel in vivo als in vitro modellen. Het gebruik van dieren in onderzoek is nog steeds een kwestie van voortdurend ethisch en translationeel debat1. Diermodellen met knaagdieren zoals muizen of ratten worden vaak gebruikt in netvliesonderzoek 2,3,4. Er zijn echter klinische zorgen ontstaan vanwege de verschillende fysiologische functies van het netvlies bij knaagdieren in vergelijking met mensen, zoals de afwezigheid van de macula of verschillen in kleurenzicht5. Het gebruik van menselijke postmortale ogen voor retinaal onderzoek heeft ook veel problemen, waaronder maar niet beperkt tot verschillen in de genetische achtergronden van de originele monsters, de medische geschiedenis van de donoren en de eerdere omgevingen of levensstijlen van de donoren6. Bovendien heeft het gebruik van in vitro modellen in retinaal onderzoek ook enkele nadelen. Celkweekmodellen die worden gebruikt om retinale ziekten te bestuderen, omvatten het gebruik van cellijnen van menselijke oorsprong, primaire cellen of stamcellen7. Van de gebruikte celkweekmodellen is aangetoond dat ze problemen hebben in termen van besmet, verkeerd geïdentificeerd of gededifferentieerdzijn 8,9,10,11. Onlangs heeft retinale organoïde technologie aanzienlijke vooruitgang laten zien. De constructie van zeer complexe netvliezen in vitro heeft echter verschillende beperkingen. Retinale organoïden hebben bijvoorbeeld niet dezelfde fysiologische en biochemische kenmerken als volwassen in vivo netvliezen. Om deze beperking te overwinnen, moet retinale organoïde technologie meer biologische en cellulaire kenmerken integreren, waaronder gladde spiercellen, vasculatuur en immuuncellen zoals microglia 12,13,14,15.

Organotypische retinale explantaten zijn naar voren gekomen als een betrouwbaar hulpmiddel voor het bestuderen van retinale ziekten zoals diabetische retinopathie en degeneratieve retinale ziekten 16,17,18,19. In vergelijking met andere bestaande technieken ondersteunt het gebruik van retinale explantaten zowel in vitro retinale celculturen als de huidige in vivo diermodellen door een uniek kenmerk toe te voegen om de cross-talk tussen verschillende retinale cellen onder dezelfde biochemische parameters en onafhankelijk van systemische variabelen te bestuderen. De explantculturen maken het mogelijk om verschillende retinale cellen bij elkaar te houden in dezelfde omgeving, waardoor het behoud van retinale intercellulaire interacties mogelijk is 20,21,22. Bovendien toonde een eerdere studie aan dat retinale explantaten in staat waren om de morfologische structuur en functionaliteit van de gekweekte retinale cellen te behouden23. Retinale explantaten kunnen dus een fatsoenlijk platform bieden voor het onderzoeken van mogelijke therapeutische doelen voor een breed scala aan retinale ziekten 24,25,26. Retinale explantculturen bieden een controleerbare techniek en zijn een zeer flexibele vervanger voor bestaande motten die talrijke farmacologische manipulaties mogelijk maken en verschillende moleculaire mechanismen kunnen blootleggen27.

Het algemene doel van dit artikel is om de retinale explanttechniek te presenteren als een redelijk tussenmodelsysteem tussen in vitro celculturen en in vivo diermodellen. Deze techniek kan retinale functies op een betere manier nabootsen dan gedissocieerde cellen. Aangezien verschillende retinale lagen intact blijven, kunnen de retinale intercellulaire interacties in het laboratorium worden beoordeeld onder goed gecontroleerde biochemische omstandigheden en onafhankelijk van het functioneren van het vasculaire systeem28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de Oakland University, Rochester, MI, VS en volgden de richtlijnen die zijn opgesteld door de verklaring van de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visieonderzoek.

1. Voorbereiding van dieren

  1. Houd de dieren gehuisvest onder een constante temperatuur in een licht gecontroleerde omgeving. De temperatuurinstellingen voor de dierenverblijvende ruimte moeten voldoen aan de richtlijnen van de "Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren". Het temperatuurbereik voor muizen ligt tussen 18 °C en 26 °C. Houd de luchtvochtigheid onder controle en stel deze in op ongeveer 42%.
  2. Gebruik voor dit experiment mannelijke C57BL/6J-muizen (raadpleeg de tabel met materialen voor details) die ouder zijn dan 12 weken (een volwassen muis werd gebruikt voor dit protocol).
    OPMERKING: Een wild-type stam werd gebruikt in dit protocol voor de demonstratie, omdat het geen genetische afwijkingen had die het netvlies aantastten. Men zou echter andere stammen kunnen gebruiken, waaronder genetisch gemanipuleerde stammen, voor de retinale explantcultuur.
  3. Zorg voor 12 uur licht/donker cycli via lichtregeling in de dierenverblijven.
  4. Inspecteer elk dier op gezondheid en voldoende voedsel- en waterinname twee keer per dag gedurende de week en één keer per dag in het weekend. Zorg ervoor dat je ze voorziet van vers voedsel en schoon water.
  5. Als het voedsel- en watergehalte tijdens de week laag is, spoel dan de waterfles af en vul deze opnieuw. Voeg vers voedsel toe wanneer dat nodig is. Verander bevuilde kooien dagelijks of indien nodig voor de gezondheid van de dieren.
    OPMERKING: Om de fotoreceptoren en door licht geïnduceerde veranderingen in het netvlies te bestuderen, past u de muizen 's nachts aan in een speciale donkere doos in een donkere kamer in de dierenfaciliteit.
  6. Euthanaseer de dieren in hun thuiskooi door een overdosis CO 2-inademing met behulp van gecomprimeerd CO2-gas in cilinders die zijn aangesloten op een CO2-kamer. Voer overlijdensbevestiging uit met behulp van een secundaire euthanasiemethode zoals cervicale dislocatie.
  7. Bevestig na het voltooien van de procedure de dood van het dier met een geschikte methode, zoals het bevestigen van hart- en ademhalingsstilstand of het observeren van vaste en verwijde pupillen van het dier.

2. Weefselvoorbereiding

  1. Zodra het dier is geëuthanaseerd, reinigt u het gebied met 70% ethanol. Open vervolgens de oogleden met één hand zodat het oog zichtbaar is. Oefen druk uit op de superieure en inferieure delen van de baan met de tegenovergestelde hand met behulp van een gebogen tang totdat de bol uitsteekt.
  2. Om het oog te enucleeren, sluit u voorzichtig de tang op het achterste deel van het oog en verheft u deze in een continue beweging. Houd met behulp van een tang de oogbol van de oogzenuw. Zorg ervoor dat u gesteriliseerde dissectiegereedschappen gebruikt voor alle stappen en dat u onder volledige aseptische omstandigheden werkt.
  3. Dompel elke oogbol onder in een buis van 1,5 ml met 1 ml ijskoude HBSS met penicilline-streptomycine (10.000 U / ml). Was de oogbol in HBSS twee keer gedurende 5 minuten elk.
  4. Breng de oogbol over naar een buis van 1,5-2 ml met volledige media (10% FBS, 2% B27, 1% N2, 1% L-glutamine en 1% penicilline en streptomycine).

3. Weefseldissectie

  1. Ontleed het netvlies zorgvuldig onder een operatiemicroscoop, zoals achtereenvolgens geïllustreerd in figuur 1.
    1. Maak een omtrekincisie rond de limbus om de oogbol te openen. Verwijder het hoornvlies door cirkelvormig te ontleden langs de rand van het hoornvlies en de (limbale) incisie, gevolgd door het verwijderen van het voorste segment, de lens en het glasachtig lichaam, waardoor een lege oogschelp overblijft.
    2. Door het gebied van de oogzenuwkop met een fijne tang vast te houden, pelt u de buitenste laag van het oog voorzichtig af. Besteed veel aandacht tijdens het verwijderen van de buitenste laag om het neurale netvlies niet te verwonden en ervoor te zorgen dat het netvlies volledig intact blijft.
      OPMERKING: Het netvlies moet zorgvuldig worden afgepeld van het retinale pigmentepitheel (RPE) en een enkele snee aan de oogzenuwkop moet worden uitgevoerd om het netvlies los te maken van de oogzenuw. Zorg hier visueel voor door het gat te identificeren dat door de oogzenuw is achtergelaten (de oogzenuwkop).
    3. Ontleed het netvlies radiaal in vier stukken van gelijke grootte.
  2. Volg de onderstaande stappen voor het hanteren van de kleine stukjes van het netvlies om een goede oriëntatie van de retinale cultuur te garanderen.
    1. Gebruik een ontleedschaarblad om net onder het netvliesstuk (Materiaaltabel) te openen.
    2. Til het netvliesstuk langzaam op met de punt van een open schaarblad en breng het voorzichtig over op de kweekplaat.
  3. Breng de explantaten afgeleid van het geïsoleerde netvlies afzonderlijk over op celkweekinzetstukken in een 12-well plaat, elk met 300 μL retinale explantagemedia, met de retinale ganglioncel (neuroretina) kant naar boven gericht.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de media DMEM-media zijn met N2- en B27-supplementen. Voeg penicilline-streptomycine (10.000 U / ml) ook toe aan de media (tabel met materialen). Het netvlies wordt gevormd uit meerdere lagen neuronale cellen die met elkaar verbonden zijn via synapsen en van buitenaf worden ondersteund door de gepigmenteerde laag retinaal pigmentepitheel, de zwarte laag die tijdens de dissectie werd verwijderd.
  4. Verwijder eventuele overblijfselen van het gepigmenteerde epitheel; deze overblijfselen kunnen echter helpen bij het identificeren van de juiste oriëntatie van de explant. Zorg ervoor dat het gepigmenteerde deel naar beneden is gericht en dat het niet-gepigmenteerde deel naar boven is gericht.
  5. Incubeer de retinale explantcultuur in bevochtigde incubatoren bij 37 °C en 5% CO2.
  6. Zorg ervoor dat het netvliesoppervlak naar boven is gericht. Als het netvliesstuk is omgedraaid of gevouwen, probeer het dan voorzichtig aan te passen aan de juiste oriëntatie.
    OPMERKING: Besteed veel aandacht aan de juiste oriëntatie van de retinale explant in de kweekplaat. Vermijd het omdraaien of vouwen van de explant in de kweekplaat, omdat dit zal resulteren in het falen van de juiste groei van de retinale cellen in cultuur.

4. Retinale explantcultuur

  1. Onderhoud de retinale explantculturen (bereid in stap 3.2-3.3) in bevochtigde incubatoren bij 37 °C en 5% CO2.
  2. Verander de helft van de media van elke put om de andere dag gedurende 2 weken. Doe dit door voorzichtig 150 μL uit de put te pipetteren. Voeg vervolgens 150 μL verse media toe aan de put. Vermijd het omdraaien van de explant bij het vervangen van de media.
  3. Controleer de explant zorgvuldig onder de microscoop voordat u de kweekplaat terug in de incubator plaatst. Onderzoek de integriteit van de cellen en de retinale architectuur onder een brightfield microscoop. Zorg ervoor dat de explant nog steeds goed georiënteerd is. Gebruik zowel de 4x als de 20x objectieflenzen om de explant te onderzoeken.
    OPMERKING: Vermijd de volledige onderdompeling van de explant in de media.

5. Immunohistochemie

  1. Na 2 weken fixeert u de retinale explant door de media te verwijderen. Doe dit door eerst één keer te wassen met 200 μL 1x PBS en vervolgens 300 μL 4% paraformaldehyde in 0,1 M PBS, pH 7,4, toe te voegen aan de put met de explant en deze een nacht te laten staan.
    OPMERKING: Deze stap kan worden uitgevoerd zonder de kweekinzetstukken van de plaat te verwijderen. De explantaten kunnen ook worden overgebracht naar een conische buis van 500 μL en het wassen en fixeren kan in de buis worden gedaan.
  2. Breng de explant over in een conische buis van 500 μL met 300 μL 1x PBS-2,5% Triton X voor het wassen.
  3. Was de vaste explants drie keer in de buis gedurende 5 minuten elk met gemiddelde snelheid op een shaker (25 rpm).
  4. Blokkeer de verwachte niet-specifieke reacties door de explant te incuberen met 300 μL 1x blokkerende buffer met 0,02% thimerosal gedurende 1 uur bij kamertemperatuur voorafgaand aan de incubatie van het antilichaam.
  5. Incubeer de vaste explantaten met de primaire antilichamen 's nachts bij 4 °C met gemiddelde snelheid op een shaker.
    OPMERKING: Detecteer de retinale endotheelcellen in de vaste explant door kleuring met GSL I, BSL I-antilichaam (lectine) (7:1.000). Detecteer de gliacellen in de retinale explantaten door kleuring met konijn glial fibrillary acidic protein (GFAP) antilichaam (1:250). Detecteer de retinale neuronen door de explant te kleuren met konijn NeuN-antilichaam (1:250)29,30. Incubate s{Tual-Chalot, 2013 #117}{Tual-Chalot, 2013 #116}{Tual-Chalot, 2013 #116}ome explants met de lectine, NeuN combinatie, en incubeer anderen met de lectine, GFAP combinatie.
  6. Verwijder de volgende dag het primaire antilichaam uit de buizen door aspiratie met een pipet. Was de explants met 1x PBS-2,5% Triton X drie keer gedurende 5 minuten elk met gemiddelde snelheid op een shaker.
  7. Voeg de secundaire antilichamen toe: Goat anti-Rabbit IgG (1:500) (secundair voor GFAP en NeuN) en Texas Red (7:1.000) (voor het lectine). Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met gemiddelde snelheid op een shaker.
    OPMERKING: De secundaire antilichamen zijn lichtgevoelig, dus bedek de buis met aluminiumfolie.
  8. Verwijder de secundaire antilichamen door aspiratie en was vervolgens drie keer gedurende 5 minuten elk met 1x PBS-2,5% Triton X.
  9. Breng de explant van de buis over op een glazen schuif met behulp van een transferpipet. Verwijder overtollige vloeistof op de dia en voeg vervolgens één druppel montagemedia met DAPI toe aan de dia.
  10. Bedek het weefsel met een coverslip. Laat geen luchtbellen toe tussen de coverslip en het weefsel.
  11. Neem de gekleurde dia's naar de fluorescentiemicroscoop en begin met het maken van de foto's. Het is belangrijk om de gekleurde dia's te bedekken met een schuifdoos, omdat de fluorescentiekleuring lichtgevoelig is.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Overleving van de neuronale en vasculaire retinale cellen van de retinale explant in kweekmedia ex vivo gedurende een langere tijd
Door een retinale explant te kweken met behulp van ons protocol, waren we succesvol in het onderhouden van verschillende retinale cellen die tot 2 weken levensvatbaar waren. Om de aanwezigheid van verschillende retinale cellen te verifiëren, werd immunofluorescentiekleuring van de retinale explant uitgevoerd met behulp van een neuronale celmarker (NeuN), gliacelmarker (GFAP) en vasculaire marker (isolectine-B4) (figuur 2). De kleuring toonde goed georganiseerde en goed ontwikkelde retinale neuronen en gliacellen. Bovendien waren de retinale bloedvaten structureel intact, zoals aangegeven door de isolectine-B4-kleuring. De morfologische integriteit van de retinale explant, zoals aangetoond door de immunostaining, gaf aan dat de retinale explantcultuur succesvol was om levensvatbare retinale cellen te behouden die experimenteel als model konden worden gebruikt. De verschillende experimentele omstandigheden die met behulp van de explant moeten worden bestudeerd, kunnen worden geëvalueerd en geanalyseerd door immunofluorescentiekleuring voor meerdere cellulaire markers met behulp van ImageJ-software. Immunostaining maakt het mogelijk om de niveaus van immunoreactiviteit van elke cellulaire marker en van het aantal specifieke cellen, zoals het aantal retinale ganglioncellen of fotoreceptoren, te meten tussen verschillende experimentele groepen.

Belang van de juiste oriëntatie van de retinale explantaat in de kweekplaat voor de experimentele uitkomsten
De juiste oriëntatie van de retinale explant in de kweekplaat wordt bereikt door de neuroretina naar boven gericht te incuberen. Aan de andere kant kan falen van de retinale explant het gevolg zijn van het omdraaien of vouwen van het netvliesweefsel, waardoor neuroretina naar beneden gericht is. De immunofluorescentiekleuring van de gekweekte retinale explant na 2 weken met behulp van verschillende retinale markers zoals het vorige experiment (NeuN, GFAP en isolectine-B4) toonde aan dat het falen van de juiste explantoriëntatie resulteert in het falen van de juiste ontwikkeling van het neurovasculaire element (figuur 3).

Figure 1
Figuur 1: Stappen van het ontleden van de oogbol om de retinale explant te creëren. (a) De enucleated oogbol wordt ondergedompeld in de media onmiddellijk nadat deze uit het dier is verwijderd. b) Langs de limbus wordt een circumferentiële incisie gemaakt om de oogbol te openen. c) Het hoornvlies wordt verwijderd door het ontleden langs de limbale incisie. d) Door de oogzenuw met een fijne tang vast te houden, wordt de buitenste laag van het oog voorzichtig afgepeld. e) De lens, het glasvocht en het ciliaire lichaam worden verwijderd. (F) Alleen het neurale netvlies blijft achter. (g) Vier radiale incisies worden gemaakt in het netvlies om het snijden in de volgende stap te vergemakkelijken. (h) Het netvlies kan in twee of vier stukken worden gesneden en vervolgens worden overgebracht naar de celkweekplaat met het inzetstuk en de media. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Succesvolle retinale explantcultuur met geconserveerde retinale structuur. Immunofluorescentiekleuring van de retinale explantaten die 2 weken in cultuur waren gebleven. De explantaten werden gefixeerd en gekleurd met (a) NeuN voor retinale neuronen (groen) en isolectine-B4 voor bloedvaten (rood), en (b) GFAP voor gliacellen (groen) en isolectine-B4 voor bloedvaten (rood). De kleuring toonde goed ontwikkelde retinale cellen en retinale vaten. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Mislukte retinale explantatiecultuur met defecte, onderontwikkelde retinale cellen. Immunofluorescentiekleuring van retinale explantaten die twee weken in cultuur waren gebleven. De explantaten werden gefixeerd en gekleurd met GFAP voor gliacellen (groen) en isolectine-B4 voor bloedvaten (rood). De beelden tonen defecte kleuring en onderontwikkelde retinale cellen en retinale vaten. De retinale explant was gevouwen en was niet goed georiënteerd in de kweekplaat. Er moet veel aandacht worden besteed aan de juiste oriëntatie van de explant met het netvlies naar boven gericht. Het niet plaatsen van de retinale explant in de juiste richting zal resulteren in het falen van de juiste ontwikkeling van de explant. Schaalbalk = 100 μm Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ons lab bestudeert al jaren de pathofysiologische veranderingen die retinale microvasculaire disfunctie bevorderen 31,32,33,34,35,36. Retinale explantaten zijn een van de technieken die van grote waarde kunnen zijn om te gebruiken als model voor het bestuderen van retinale ziekten zoals diabetische retinopathie of degeneratieve retinale ziekten. Het hebben van een controlegroep die is afgeleid van hetzelfde enkele netvlies of dier als de behandelde groep of groepen geeft deze techniek een groot voordeel in termen van het bieden van betrouwbaardere vergelijkingen van verschillende experimentele omstandigheden.

Een van de grootste uitdagingen tijdens retinale explantvoorbereiding is het vouwen van de explant of verkeerde oriëntatie in de kweekplaat met het retinale oppervlak naar beneden gericht. Andere onderzoekers stelden voor om het netvlies op en neer te pipetteren in de overbrengende pipet om het in de juiste richting in de plaat te hebben37. In hun protocol gebruikten ze echter het hele netvlies voor een enkele explant, maar in dit protocol werd een enkel netvlies in twee tot vier stukken gesneden, wat betekent dat de stukjes kleiner zijn en het moeilijk is om deze manoeuvre uit te voeren voor de juiste oriëntatie. Door een enkel netvlies in twee tot vier stukken te snijden, kunnen vier tot acht retinale stukjes worden verkregen van hetzelfde dier dat voor een experiment kan worden gebruikt. Dit maakt experimenten mogelijk waarbij de controlegroep en experimentele groepen van hetzelfde dier zijn afgeleid.

Het snijden van het netvlies in kleine stukjes maakt de behandeling ervan echter uitdagender. Daarom hebben we een techniek ontwikkeld voor het hanteren van deze kleine retinale stukjes om een goede oriëntatie van de retinale cultuur te garanderen. Om dit te doen, wordt het open ontleedschaarblad net onder het netvliesstuk geplaatst, met het netvliesoppervlak naar boven gericht. Als het netvliesstuk wordt omgedraaid of gevouwen, wordt het voorzichtig aangepast aan de juiste richting. Langzaam wordt het netvliesstuk verhoogd met de punt van een open schaarblad en voorzichtig in de kweekplaat geplaatst. Deze eenvoudige techniek zorgt ervoor dat elk netvliesstuk zich in de juiste oriëntatie bevindt met het netvlies naar boven gericht en bevordert betere resultaten voor het bestuderen van retinale vaten en neurogliale cellen (figuur 2). Het niet plaatsen van de retinale explantaat in de juiste oriëntatie met de neuroretina naar boven gericht, zal resulteren in het falen van de juiste groei van de retinale cellen in cultuur, zoals weergegeven in figuur 3. Een goede training wordt ten zeerste aanbevolen om deze technische fout te voorkomen.

Dit protocol beschrijft een organotypische retinale explant van een volwassen muis netvlies; de techniek is echter ook eerder beschreven voor zowel onrijpe netvliezen37 als menselijke netvliezen38. In een eerdere studie werden retinale explantculturen beschreven voor het bestuderen van vasculaire ontwikkeling, waarbij endotheelfunctiemanipulatie ex vivo mogelijk werd gemaakt 27. Als voorbeeld van de morfologische beoordeling van een retinale explant, werd de retinale explant gedurende 2 weken in cultuur gelaten en vervolgens werd immunostaining uitgevoerd met behulp van NeuN (neuronale celmarker), GFAP (gliacelmarker) en isolectine-B4 (vasculaire marker). De kleuring toonde aan dat de retinale cellen en bloedvaten goed ontwikkeld en goed bewaard gebleven waren in de explantaat (figuur 2). Er kunnen echter meer immunohistochemische kleuringsgegevens worden verkregen om ook de levensvatbaarheid en functionaliteit van andere retinale cellen in de explant te controleren.

De explantcultuur zelf kan stressvol zijn voor de retinale cellen. De cellen konden echter onder relatief normale omstandigheden worden geïncubeerd, zodat de morfologische veranderingen die optraden onder verschillende experimentele omstandigheden, zoals hyperglykemie of hypoxie, konden worden vergeleken met de uitgangstoestand. De explant is dus een goed hulpmiddel voor het evalueren van verschillende retinale cellen en het testen van hun reacties op verschillende farmacologische middelen of therapeutische doelen tegelijkertijd in een breed scala aan retinale ziekten.

Retinale neovascularisatie is een kardinaal teken van ischemische retinopathie, zoals bij retinopathie van prematuriteit en diabetische retinopathie. Wij (figuur 2) en anderen 27,39,40,41,42 konden intacte retinale vasculatuur waarnemen in gekweekte explantaten gedurende maximaal 2 weken. Zo is de retinale explant gebruikt om de pathofysiologie van zowel normale als pathologische retinale neovascularisatie te bestuderen 41,42,43,44,45,46,47,48,49. Interessant is dat een onderzoeksgroep VEGF-geïnduceerde vasculaire kieming registreerde in retinale explantaten van muizen tijdens het onderzoeken van de proangiogene factoren die verhoogd zijn in proliferatieve diabetische retinopathie43. Bovendien zijn retinale explantaten ingebed in een driedimensionale gel, waardoor de kieming van retinale endotheelcellen in een meer gedetailleerde spatiotemporale oriëntatie kan worden bestudeerd 45,46,47.

Naast morfologische studies worden retinale explantaten ook tot op zekere hoogte gebruikt om retinale functies te evalueren 50,51,52,53. Ex vivo elektroretinogram (ERG) beeldvorming is uitgevoerd op geïsoleerde retinale explantaten van muizen, waardoor de verschillende functies van een verscheidenheid aan retinale cellen kunnen worden bestudeerd, waaronder zowel staaf- als kegelfotoreceptoren 54,55,56,57. Interessant is dat Calbiague et al. meldden dat, in reactie op hoge glucosebehandeling, retinale explantculturen afgeleid van muizen of ratten een steeds kleinere dikte van de retinale lagen vertoonden58. Retinale bipolaire cellen, die tot de vroegste gevoelige cellen voor diabetische aandoeningen behoren, behielden echter niet alleen hun morfologie, maar ook hun elektrofysiologische eigenschappen in cultuur gedurende maximaal 2 weken58. Samenvattend zijn wij van mening dat dit protocol een basis of een startpunt kan zijn voor aanvullende toekomstige studies om de voordelen van explantgebruik in oogonderzoek te optimaliseren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We willen graag de National Institute of Health (NIH) Funding Grant aan het National Eye Institute (R01 EY030054) bedanken voor Dr. Mohamed Al-Shabrawey. We willen Kathy Wolosiewicz bedanken voor haar hulp bij de videovertelling. We willen Dr. Ken Mitton van het Pediatric Retinal Research lab van het Eye Research Institute, Oakland University, bedanken voor zijn hulp bij het gebruik van de chirurgische microscoop en opname. Deze video is bewerkt en geregisseerd door Dr. Khaled Elmasry.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adult C57Bl/6J mice  The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA 664
All-in-One Fluorescence Microscope  KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A. BZ-X800
B27 supplements Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #17504-04
Blockade blocking solution  Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA B10710
DMEM F12 Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #11320033
Goat anti-Rabbit IgG. Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA F-2765
GSL I, BSL I (Isolectin) Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA B-1105-2
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS) Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #14175095
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades World Precision Instruments,FL 34240, USA  Straight (503365)
N2 supplements Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #17502-048
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA 140652
Paraformaldehyde 4% in PBS BBP, Ashland, MA, 01721 USA C25N107
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA 15140148
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA P36962
Rabbit Anti-NeuN Antibody Abcam.,Cambridge, UK ab177487
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody Dako,Carpinteria, CA 93013, USA. Z0334
Texas Red Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA SA-5006-1
TritonX BioRad Hercules, CA,  94547,USA 1610407

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gauthier, C., Griffin, G. Using animals in research, testing and teaching. Revue Scientifique et Technique. 24 (2), 735-745 (2005).
  2. Fletcher, E. L., et al. Animal models of retinal disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 100, 211-286 (2011).
  3. Bertschinger, D. R., et al. A review of in vivo animal studies in retinal prosthesis research. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (11), 1505-1517 (2008).
  4. Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 137-159 (2015).
  5. Sharma, K., Krohne, T. U., Busskamp, V. The rise of retinal organoids for vision research. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8484 (2020).
  6. Fradot, M., et al. Gene therapy in ophthalmology: Validation on cultured retinal cells and explants from postmortem human eyes. Human Gene Therapy. 22 (5), 587-593 (2011).
  7. Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
  8. Nardone, R. M. Curbing rampant cross-contamination and misidentification of cell lines. Biotechniques. 45 (3), 221-227 (2008).
  9. Horbach, S., Halffman, W. The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature. PLoS One. 12 (10), 0186281 (2017).
  10. MacLeod, R. A., et al. Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source. International Journal of Cancer. 83 (4), 555-563 (1999).
  11. Tamiya, S., Liu, L., Kaplan, H. J. Epithelial-mesenchymal transition and proliferation of retinal pigment epithelial cells initiated upon loss of cell-cell contact. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (5), 2755-2763 (2010).
  12. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: A window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  13. Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: Cultivation, differentiation, and transplantation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 638439 (2021).
  14. Zhang, X., Wang, W., Jin, Z. B. Retinal organoids as models for development and diseases. Cell Regeneration. 10 (1), 33 (2021).
  15. Bell, C. M., Zack, D. J., Berlinicke, C. A. Human organoids for the study of retinal development and disease. Annual Reviews of Vision Science. 6, 91-114 (2020).
  16. Mills, S. A., et al. Fractalkine-induced microglial vasoregulation occurs within the retina and is altered early in diabetic retinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (51), 2112561118 (2021).
  17. Louie, H. H., et al. Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. 202, 108384 (2021).
  18. Wu, X., Yan, N., Zhang, M. Retinal degeneration: Molecular mechanisms and therapeutic strategies. Current Medicinal Chemistry. 29 (40), 6125-6140 (2021).
  19. Armento, A., et al. Complement factor H loss in RPE cells causes retinal degeneration in a human RPE-porcine retinal explant co-culture model. Biomolecules. 11 (11), 1621 (2021).
  20. Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina. Clinical & Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).
  21. Pattamatta, U., McPherson, Z., White, A. A mouse retinal explant model for use in studying neuroprotection in glaucoma. Experimental Eye Research. 151, 38-44 (2016).
  22. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  23. Alarautalahti, V., et al. Viability of mouse retinal explant cultures assessed by preservation of functionality and morphology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (6), 1914-1927 (2019).
  24. Smedowski, A., et al. FluoroGold-labeled organotypic retinal explant culture for neurotoxicity screening studies. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 2487473 (2018).
  25. Bull, N. D., et al. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3309-3320 (2011).
  26. Beeson, C., et al. Small molecules that protect mitochondrial function from metabolic stress decelerate loss of photoreceptor cells in murine retinal degeneration models. Advances in Experimental Medicine and Biology. 854, 449-454 (2016).
  27. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nature Protocols. 5 (10), 1659-1665 (2010).
  28. Muller, B. Organotypic culture of adult mouse retina. Methods in Molecular Biology. 1940, 181-191 (2019).
  29. Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
  30. Garcia-Cabezas, M. A., John, Y. J., Barbas, H., Zikopoulos, B. Distinction of neurons, glia and endothelial cells in the cerebral cortex: An algorithm based on cytological features. Frontiers in Neuroanatomy. 10, 107 (2016).
  31. Elmasry, K., et al. Role of endoplasmic reticulum stress in 12/15-lipoxygenase-induced retinal microvascular dysfunction in a mouse model of diabetic retinopathy. Diabetologia. 61 (5), 1220-1232 (2018).
  32. Elmasry, K., et al. Epigenetic modifications in hyperhomocysteinemia: Potential role in diabetic retinopathy and age-related macular degeneration. Oncotarget. 9 (16), 12562-12590 (2018).
  33. Al-Shabrawey, M., et al. Role of NADPH oxidase and Stat3 in statin-mediated protection against diabetic retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (7), 3231-3238 (2008).
  34. Al-Shabrawey, M., et al. Increased expression and activity of 12-lipoxygenase in oxygen-induced ischemic retinopathy and proliferative diabetic retinopathy: Implications in retinal neovascularization. Diabetes. 60 (2), 614-624 (2011).
  35. Hussein, K. A., et al. Bone morphogenetic protein 2: A potential new player in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. 125, 79-88 (2014).
  36. Ibrahim, A. S., et al. Pigment epithelium-derived factor inhibits retinal microvascular dysfunction induced by 12/15-lipoxygenase-derived eicosanoids. Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (3), 290-298 (2015).
  37. Belhadj, S., et al. Long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (165), e61868 (2020).
  38. Kuo, C. Y. J., Louie, H. H., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. Characterization of a novel human organotypic retinal culture technique. Journal of Visualized Experiments. (172), e62046 (2021).
  39. Sawamiphak, S., et al. Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis. Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).
  40. Curatola, A. M., Moscatelli, D., Norris, A., Hendricks-Munoz, K. Retinal blood vessels develop in response to local VEGF-A signals in the absence of blood flow. Experimental Eye Research. 81 (2), 147-158 (2005).
  41. Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (5), 2347-2355 (2010).
  42. DeNiro, M., Alsmadi, O., Al-Mohanna, F. Modulating the hypoxia-inducible factor signaling pathway as a therapeutic modality to regulate retinal angiogenesis. Experimental Eye Research. 89 (5), 700-717 (2009).
  43. Murakami, T., et al. Time-lapse imaging of vitreoretinal angiogenesis originating from both quiescent and mature vessels in a novel ex vivo system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5529-5536 (2006).
  44. Unoki, N., et al. SDF-1/CXCR4 contributes to the activation of tip cells and microglia in retinal angiogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (7), 3362-3371 (2010).
  45. Knott, R. M., et al. A model system for the study of human retinal angiogenesis: activation of monocytes and endothelial cells and the association with the expression of the monocarboxylate transporter type 1 (MCT-1). Diabetologia. 42 (7), 870-877 (1999).
  46. Im, E., Venkatakrishnan, A., Kazlauskas, A. Cathepsin B regulates the intrinsic angiogenic threshold of endothelial cells. Molecular Biology of the Cell. 16 (8), 3488-3500 (2005).
  47. Shafiee, A., et al. Inhibition of retinal angiogenesis by peptides derived from thrombospondin-1. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (8), 2378-2388 (2000).
  48. Brown, K. C., et al. MG624, an α7-nAChR antagonist, inhibits angiogenesis via the Egr-1/FGF2 pathway. Angiogenesis. 15 (1), 99-114 (2012).
  49. Rezzola, S., et al. A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay. Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).
  50. Liu, D., et al. Overexpression of BMP4 protects retinal ganglion cells in a mouse model of experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 210, 108728 (2021).
  51. Januschowski, K., et al. Ex vivo biophysical characterization of a hydrogel-based artificial vitreous substitute. PLoS One. 14 (1), 0209217 (2019).
  52. Tolmachova, T., et al. Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo. Journal of Molecular Medicine. 91 (7), 825-837 (2013).
  53. Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Research. 101, 108-117 (2014).
  54. Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52855 (2015).
  55. Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: Performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 (21), 4821-4842 (2020).
  56. Kaikkonen, O., Turunen, T. T., Meller, A., Ahlgren, J., Koskelainen, A. Retinal temperature determination based on photopic porcine electroretinogram. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (2), 991-1002 (2022).
  57. Gospe, S. M., et al. 3rd al. Photoreceptors in a mouse model of Leigh syndrome are capable of normal light-evoked signaling. Journal of Biological Chemistry. 294 (33), 12432-12443 (2019).
  58. Calbiague, V. M., Vielma, A. H., Cadiz, B., Paquet-Durand, F., Schmachtenberg, O. Physiological assessment of high glucose neurotoxicity in mouse and rat retinal explants. Journal of Comparative Neurology. 528 (6), 989-1002 (2020).

Tags

Geneeskunde Nummer 190
Retinale explant van het netvlies van de volwassen muis als een <em>ex vivo</em> model voor het bestuderen van retinale neurovasculaire ziekten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elmasry, K., Moustafa, M.,… More

Elmasry, K., Moustafa, M., Al-Shabrawey, M. Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases. J. Vis. Exp. (190), e63966, doi:10.3791/63966 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter