Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina som en ex vivo-modell for å studere retinale nevrovaskulære sykdommer

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/63966
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2
1Eye Research Center and Department of Foundational Medical Studies, Oakland University William Beaumont School of Medicine, 2Eye Research Institute, Oakland University, 3Human Anatomy and Embryology Department, Mansoura Faculty of Medicine, Mansoura University

Summary

Denne protokollen presenterer og beskriver trinn for isolering, disseksjon, dyrking og farging av retinale eksplanter oppnådd fra en voksen mus. Denne metoden er gunstig som en ex vivo-modell for å studere forskjellige retinale nevrovaskulære sykdommer som diabetisk retinopati.

Abstract

En av utfordringene i retinaforskning er å studere krysspraten mellom forskjellige retinale celler som retinale nevroner, glialceller og vaskulære celler. Isolering, dyrking og opprettholdelse av retinale nevroner in vitro har tekniske og biologiske begrensninger. Dyrking av retinale eksplanter kan overvinne disse begrensningene og tilby en unik ex vivo-modell for å studere krysspraten mellom forskjellige retinale celler med godt kontrollerte biokjemiske parametere og uavhengig av det vaskulære systemet. Videre er retinale eksplanter et effektivt screeningsverktøy for å studere nye farmakologiske inngrep i ulike retinale vaskulære og neurodegenerative sykdommer som diabetisk retinopati. Her beskriver vi en detaljert protokoll for retinal explants isolasjon og kultur i en lengre periode. Manuskriptet presenterer også noen av de tekniske problemene under denne prosedyren som kan påvirke de ønskede resultatene og reproduserbarheten av retinal explantkulturen. Immunfargingen av retinalkarene, gliacellene og nevronene viste intakte retinale kapillærer og nevrogliaceller etter 2 uker fra begynnelsen av retinal eksplantkultur. Dette etablerer retinale eksplanter som et pålitelig verktøy for å studere endringer i retinal vaskulatur og neurogliale celler under forhold som etterligner retinale sykdommer som diabetisk retinopati.

Introduction

Ulike modeller har blitt presentert for å studere retinale sykdommer, inkludert både in vivo og in vitro modeller. Bruk av dyr i forskning er fortsatt gjenstand for kontinuerlig etisk og translasjonell debatt1. Dyremodeller som involverer gnagere som mus eller rotter brukes ofte i retinal forskning 2,3,4. Imidlertid har kliniske bekymringer oppstått på grunn av de forskjellige fysiologiske funksjonene til netthinnen hos gnagere sammenlignet med mennesker, for eksempel fravær av makula eller forskjeller i fargesyn5. Bruken av menneskelige postmortem øyne for retinal forskning har også mange problemer, inkludert men ikke begrenset til forskjeller i den genetiske bakgrunnen til de opprinnelige prøvene, givernes medisinske historie og givernes tidligere miljøer eller livsstil6. Videre har bruken av in vitro-modeller i retinal forskning også noen ulemper. Cellekulturmodeller som brukes til å studere retinale sykdommer inkluderer utnyttelse av cellelinjer av menneskelig opprinnelse, primære celler eller stamceller7. Cellekulturmodellene som brukes har vist seg å ha problemer når det gjelder å være forurenset, feilidentifisert eller dedifferensiert 8,9,10,11. Nylig har retinal organoidteknologi vist betydelig fremgang. Imidlertid har konstruksjonen av svært komplekse netthinner in vitro flere begrensninger. For eksempel har retinale organoider ikke de samme fysiologiske og biokjemiske egenskapene som modne in vivo retinas. For å overvinne denne begrensningen må retinal organoidteknologi integrere flere biologiske og cellulære egenskaper, inkludert glatte muskelceller, vaskulatur og immunceller som microglia12,13,14,15.

Organotypiske retinale eksplanter har dukket opp som et pålitelig verktøy for å studere retinale sykdommer som diabetisk retinopati og degenerative retinale sykdommer16,17,18,19. Sammenlignet med andre eksisterende teknikker, støtter bruken av retinale eksplanter både in vitro retinale cellekulturer og også nåværende in vivo dyremodeller ved å legge til en unik funksjon for å studere krysspraten mellom forskjellige retinale celler under de samme biokjemiske parametrene og uavhengig av systemiske variabler. Eksplantkulturene tillater at forskjellige retinale celler holdes sammen i samme miljø, noe som gjør det mulig å bevare retinale intercellulære interaksjoner20,21,22. Videre viste en tidligere studie at retinale eksplanter var i stand til å bevare den morfologiske strukturen og funksjonaliteten til de dyrkede retinale cellene23. Dermed kan retinale eksplanter gi en anstendig plattform for å undersøke mulige terapeutiske mål for et bredt spekter av retinale sykdommer24,25,26. Retinale eksplantkulturer gir en kontrollerbar teknikk og er svært fleksible erstatning for eksisterende mothods som tillater mange farmakologiske manipulasjoner og kan avdekke flere molekylære mekanismer27.

Det overordnede målet med denne artikkelen er å presentere retinal explant-teknikken som et rimelig mellommodellsystem mellom in vitro-cellekulturer og in vivo dyremodeller. Denne teknikken kan etterligne retinale funksjoner på en bedre måte enn dissosierte celler. Ettersom forskjellige retinale lag forblir intakte, kan retinale intercellulære interaksjoner vurderes i laboratoriet under godt kontrollerte biokjemiske forhold og uavhengig av vaskulært systemfunksjon28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Oakland University, Rochester, MI, USA og fulgte retningslinjene fastsatt av Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research.

1. Forberedelse av dyr

  1. Hold dyrene plassert under en konstant temperatur i et lyskontrollert miljø. Temperaturinnstillingene for dyrehuset skal følge retningslinjene fastsatt i "Veiledning for stell og bruk av forsøksdyr". Temperaturområdet for mus er mellom 18 °C og 26 °C. Hold fuktighetsnivået kontrollert og sett på ca 42%.
  2. For dette eksperimentet, bruk mannlige C57BL / 6J mus (sjekk materialtabellen for detaljer) som er mer enn 12 ukers alder (en voksen mus ble brukt til denne protokollen).
    MERK: En villtypestamme ble brukt i denne protokollen for demonstrasjonen, da den ikke hadde noen genetiske abnormiteter som påvirket netthinnen. Imidlertid kan man bruke andre stammer, inkludert genetisk manipulerte stammer, for retinal explantkulturen.
  3. Gi 12 timers lys / mørke sykluser via lysstyring i dyrehusrommene.
  4. Inspiser hvert dyr for helse og tilstrekkelig mat- og vanninntak to ganger per dag i løpet av uken og en gang per dag i helgene. Sørg for å gi dem fersk mat og rent vann.
  5. Hvis mat- og vannstanden er lav i løpet av uken, skyll vannflasken og fyll den på nytt. Tilsett fersk mat når det er nødvendig. Bytt skitne bur daglig eller etter behov for dyrenes helse.
    MERK: For å studere fotoreseptorene og lysinduserte endringer i netthinnen, mørk-tilpasse musene over natten i en spesiell mørk boks som ligger i et mørkt rom i dyreanlegget.
  6. Avliving av dyrene i hjemmeburet ved CO 2-inhalasjonsoverdose ved bruk av komprimert CO 2-gass i sylindere koblet til et CO2-kammer. Utfør dødsbekreftelse ved hjelp av en sekundær metode for eutanasi som cervikal dislokasjon.
  7. Etter å ha fullført prosedyren, bekreft dyrets død ved en passende metode, for eksempel å bekrefte hjerte- og åndedrettsstans eller observere faste og utvidede elever av dyret.

2. Forberedelse av vev

  1. Når dyret er avlivet, rengjør området med 70% etanol. Åpne deretter øyelokkene med en hånd slik at øyet er synlig. Påfør trykk på de øvre og nedre delene av banen med motsatt hånd ved hjelp av buede tang til kloden stikker ut.
  2. For å enucleate øyet, lukk forsiktig tangen på den bakre delen av øyet, og løft i en kontinuerlig bevegelse. Bruk tang, hold øyebollet fra optisk nerve. Sørg for å bruke steriliserte disseksjonsverktøy for alle trinnene og for å arbeide under fullstendige aseptiske forhold.
  3. Senk hvert øyeeplet i et 1,5 ml rør som inneholder 1 ml iskald HBSS med penicillin-streptomycin (10 000 U / ml). Vask øyebollet i HBSS to ganger i 5 minutter hver.
  4. Overfør øyeeplet til et 1,5-2 ml rør som inneholder komplette medier (10% FBS, 2% B27, 1% N2, 1% L-glutamin og 1% penicillin og streptomycin).

3. Vev disseksjon

  1. Disseker netthinnen forsiktig under et operasjonsmikroskop, som illustrert sekvensielt i figur 1.
    1. Lag et omkrets snitt rundt limbus for å åpne øyebollet. Fjern hornhinnen ved å dissekere sirkulært langs grensen til hornhinnen og (limbal) snittet, etterfulgt av å fjerne det fremre segmentet, linsen og glasslegemet, og etterlate en tom øyekopp.
    2. Ved å holde regionen av optisk nervehode med fine tang, fjern øyets ytre kappe forsiktig. Vær oppmerksom på fjerning av ytre kappe for ikke å skade nevrale retina og for å sikre at netthinnen forblir helt intakt.
      MERK: Netthinnen må forsiktig skrelles bort fra retinalpigmentepitelet (RPE), og et enkelt kutt ved optisk nervehode må utføres for å løsne netthinnen fra optisk nerve. Visuelt sikre dette ved å identifisere hullet igjen av optisk nerve (optisk nerve hodet).
    3. Disseker netthinnen radialt i fire like store stykker.
  2. Følg trinnene nedenfor for å håndtere de små bitene av netthinnen for å sikre riktig orientering av retinalkulturen.
    1. Bruk et dissekerende sakseblad, åpne like under retinalstykket (Table of Materials).
    2. Løft netthinnestykket sakte med spissen av et åpent sakseblad, og overfør det forsiktig til kulturplaten.
  3. Overfør eksplantene avledet fra den isolerte netthinnen separat til cellekulturinnlegg i en 12-brønnsplate, som hver inneholder 300 μL retinal explant media, med retinal ganglioncelle (neuroretina) side vendt opp.
    MERK: Sørg for at mediet er DMEM-medier med N2- og B27-tillegg. Tilsett penicillin-streptomycin (10 000 U/ml) til mediet også (materialtabell). Netthinnen er dannet av flere lag av nevronceller sammenkoblet via synapser og støttet fra utsiden av det pigmenterte laget av retinalpigmentepitel, som er det svarte laget som ble fjernet under disseksjonen.
  4. Fjern eventuelle rester av det pigmenterte epitelet; Imidlertid kan disse restene bidra til å identifisere riktig orientering av utstillingen. Forsikre deg om at den pigmenterte delen vender ned og at den ikke-pigmenterte delen vender oppover.
  5. Inkuber retinal eksplantkultur i fuktede inkubatorer ved 37 °C og 5 % CO2.
  6. Forsikre deg om at retinaloverflaten vender oppover. Hvis netthinnestykket vendes eller brettes, kan du prøve å justere det forsiktig til riktig retning.
    MERK: Vær oppmerksom på riktig orientering av retinal explant i kulturplaten. Unngå flipping eller folding av eksplanten i kulturplaten, da dette vil føre til svikt i riktig vekst av retinalcellene i kultur.

4. Retinal explant kultur

  1. Oppretthold retinale eksplantkulturer (tilberedt i trinn 3.2-3.3) i fuktede inkubatorer ved 37 °C og 5 % CO2.
  2. Bytt halvparten av media fra hver brønn annenhver dag i 2 uker. Gjør dette ved å pipettere 150 μL forsiktig fra brønnen. Tilsett deretter 150 μL ferske medier tilbake i brønnen. Unngå å snu forklaringen når du bytter medie.
  3. Kontroller eksplanten nøye under mikroskopet før du legger kulturplaten tilbake i inkubatoren. Undersøk integriteten til cellene og retinalarkitekturen under et lysfeltmikroskop. Forsikre deg om at eksplanten fortsatt er riktig orientert. Bruk både 4x og 20x objektivlinser for å undersøke explant.
    MERK: Unngå fullstendig nedsenking av utstillingen i mediet.

5. Immunhistokjemi

  1. Etter 2 uker, fikse retinal explant ved å fjerne media. Gjør dette ved først å vaske en gang med 200 μL 1x PBS og deretter tilsette 300 μL 4% paraformaldehyd i 0,1 M PBS, pH 7,4, til brønnen som inneholder eksplanten og la den stå over natten.
    MERK: Dette trinnet kan gjøres uten å fjerne kulturinnsatsene fra platen. Eksplantene kan også overføres til et 500 μL konisk rør, og vasking og fiksering kan gjøres inne i røret.
  2. Overfør eksplanten til et 500 μL konisk rør som inneholder 300 μL 1x PBS-2,5% Triton X for vask.
  3. Vask de faste eksplantene i røret tre ganger i 5 minutter hver med middels hastighet på en shaker (25 o / min).
  4. Blokker de forventede ikke-spesifikke reaksjonene ved å inkubere eksplanten med 300 μL 1x blokkerende buffer inneholdende 0,02 % thimerosal i 1 time ved romtemperatur før antistoffinkubasjonen.
  5. Inkuber de faste eksplantene med de primære antistoffene over natten ved 4 °C ved hjelp av middels hastighet på en shaker.
    MERK: Oppdag retinale endotelceller i den faste eksplanten ved å fargelegge med GSL I, BSL I-antistoff (lektin) (7: 1,000). Oppdag gliaceller i retinaleksplantene ved å fargelegge med kaninglial fibrillært surt protein (GFAP) antistoff (1:250). Oppdag retinale nevroner ved å fargelegge eksplanten med kanin NeuN-antistoff (1:250)29,30. Inkuber s{Tual-Chalot, 2013 #117}{Tual-Chalot, 2013 #116}{Tual-Chalot, 2013 #116}ome eksplanter med lektinet, NeuN-kombinasjonen, og inkubere andre med lektin, GFAP-kombinasjonen.
  6. Neste dag, fjern det primære antistoffet fra rørene ved aspirasjon med en pipette. Vask plantene med 1x PBS-2.5% Triton X tre ganger i 5 minutter hver med middels hastighet på en shaker.
  7. Legg til sekundære antistoffer: Geit anti-kanin IgG (1:500) (sekundær for GFAP og NeuN) og Texas Red (7: 1,000) (for lektinet). Inkuber i 1 time ved romtemperatur ved bruk av middels hastighet på en shaker.
    MERK: De sekundære antistoffene er lysfølsomme, så dekk røret med aluminiumsfolie.
  8. Fjern de sekundære antistoffene ved aspirasjon, og vask deretter tre ganger i 5 minutter hver med 1x PBS-2,5% Triton X.
  9. Overfør eksplanten fra røret til et glassglass ved hjelp av en overføringspipette. Fjern overflødig væske på lysbildet, og legg deretter til en dråpe monteringsmedier med DAPI i lysbildet.
  10. Dekk vevet med et deksel. Ikke tillat luftbobler mellom dekselet og vevet.
  11. Ta de fargede lysbildene til fluorescensmikroskopet, og begynn å ta bildene. Det er viktig å dekke de fargede lysbildene ved hjelp av en lysbildeboks, da fluorescensfargingen er lysfølsom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Overlevelse av nevronale og vaskulære retinale celler i retinal explant i kulturmedier ex vivo i lengre tid
Ved å dyrke en retinal explant ved hjelp av vår protokoll, lyktes vi med å opprettholde forskjellige retinale celler som var levedyktige i opptil 2 uker. For å verifisere tilstedeværelse av ulike retinale celler ble det utført immunfluorescensfarging av retinaleksplanten ved hjelp av nevroncellemarkør (NeuN), glialcellemarkør (GFAP) og vaskulær markør (isolektin-B4) (figur 2). Fargingen viste velorganiserte og velutviklede retinale nevroner og gliaceller. I tillegg var retinale blodkar strukturelt intakte, som indikert av isolektin-B4-fargingen. Den morfologiske integriteten til retinaleksplanten, som demonstrert ved immunostaining, indikerte at retinal explantkulturen var vellykket for å opprettholde levedyktige retinale celler som eksperimentelt kunne brukes som modell. De forskjellige eksperimentelle forholdene som skal studeres ved hjelp av eksplanten, kan evalueres og analyseres ved immunfluorescensfarging for flere cellulære markører ved hjelp av ImageJ-programvare. Immunostaining tillater måling av nivåene av immunreaktivitet for hver cellulær markør og antall spesifikke celler, for eksempel antall retinale ganglionceller eller fotoreceptorer, blant ulike eksperimentelle grupper.

Betydningen av riktig orientering av retinal explant i kulturplaten for eksperimentelle resultater
Den riktige orienteringen av retinal explant i kulturplaten oppnås ved å inkubere neuroretina vendt oppover. På den annen side kan svikt i retinal explant skyldes flipping eller folding av retinalvevet, noe som fører til at neuroretina vender nedover. Immunfluorescensfargingen av den dyrkede retinale eksplanten etter 2 uker ved bruk av forskjellige retinale markører som forrige eksperiment (NeuN, GFAP og isolectin-B4) viste at svikt i riktig eksplantorientering resulterer i svikt i riktig utvikling av det nevrovaskulære elementet (figur 3).

Figure 1
Figur 1: Trinn for dissekering av øyebollet for å lage retinal explant . (a) Det enukleerte øyebollet blir nedsenket i media umiddelbart etter at det er fjernet fra dyret. (b) Et omkretssnitt gjøres langs limbus for å åpne øyebollet. (c) Hornhinnen fjernes ved å dissekere langs det limbale snittet. (d) Ved å holde optisk nerve med fine tang, skrelles øyets ytre lag forsiktig av. (e) Linsen, glasslegemet og ciliærlegemet fjernes. (F) Bare nevrale netthinnen er igjen. (g) Fire radiale snitt er laget i netthinnen for å lette det å bli kuttet i neste trinn. (h) Netthinnen kan kuttes i to eller fire stykker og deretter overføres til cellekulturplaten som inneholder innsatsen og media. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Vellykket retinal eksplantkultur med bevart retinal struktur. Immunfluorescensfarging av retinale eksplanter som hadde holdt seg i kultur i 2 uker. Eksplantene ble fikset og farget med (a) NeuN for retinale nevroner (grønn) og isolektin-B4 for blodkar (rød), og (b) GFAP for gliaceller (grønn) og isolektin-B4 for blodkar (rød). Fargingen viste velutviklede retinale celler og retinale kar. Skala bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Mislykket retinal eksplantkultur med defekte, underutviklede retinale celler. Immunfluorescensfarging av retinale eksplanter som hadde holdt seg i kultur i to uker. Eksplantene ble fikset og farget med GFAP for gliaceller (grønn) og isolektin-B4 for blodkar (rød). Bildene viser defekte flekker og underutviklede retinale celler og retinale kar. Retinal explant ble brettet og var ikke orientert riktig i kulturplaten. Det bør legges stor vekt på å sikre riktig orientering av eksplanten med netthinnen vendt oppover. Unnlatelse av å sette retinalutstillingen i riktig retning vil føre til svikt i riktig utvikling av eksplanten. Skalalinje = 100 μm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vårt laboratorium har studert patofysiologiske endringer som fremmer retinal mikrovaskulær dysfunksjon i år 31,32,33,34,35,36. Retinal explants er en av teknikkene som kan være av stor verdi å bruke som modell for å studere retinal sykdommer som diabetisk retinopati eller degenerative retinal sykdommer. Å ha en kontrollgruppe avledet fra samme enkelt retina eller dyr som den behandlede gruppen eller gruppene, gir denne teknikken en stor fordel når det gjelder å gi mer pålitelige sammenligninger av forskjellige eksperimentelle forhold.

En av de største utfordringene under retinal explant forberedelse er folding av explant eller feil orientering i kulturplaten med retinal overflaten vendt nedover. Andre forskere foreslo å pipettere netthinnen opp og ned i den overførende pipetten for å ha den i riktig retning i platen37. Imidlertid brukte de i protokollen hele netthinnen for en enkelt eksplant, men i denne protokollen ble en enkelt retina kuttet i to til fire stykker, noe som betyr at brikkene er mindre, og det er vanskelig å gjøre denne manøveren for riktig orientering. Ved å kutte en enkelt netthinne i to til fire stykker, kan fire til åtte retinale stykker hentes fra samme dyr som kan brukes til et eksperiment. Dette tillater eksperimenter der kontrollgruppen og eksperimentelle grupper er avledet fra samme dyr.

Men å kutte netthinnen i små biter gjør håndteringen av den mer utfordrende. Derfor utviklet vi en teknikk for å håndtere disse små retinalbitene for å sikre riktig orientering av retinalkulturen. For å gjøre dette plasseres det åpne dissekeringssaksbladet like under retinalstykket, med retinaloverflaten vendt oppover. Hvis retinalstykket vendes eller brettes, justeres det forsiktig til riktig retning. Sakte løftes retinalstykket med spissen av et åpent sakseblad og legges forsiktig i kulturplaten. Denne enkle teknikken sikrer at hvert retinalstykke er i riktig retning med netthinnen vendt oppover og fremmer bedre resultater for å studere retinale kar og neurogliale celler (figur 2). Unnlatelse av å plassere retinal explant i riktig retning med neuroretina vendt oppover vil resultere i svikt i riktig vekst av retinale celler i kultur, som vist i figur 3. Riktig opplæring anbefales på det sterkeste for å unngå denne tekniske feilen.

Denne protokollen beskriver en organotypisk retinal explant av en voksen mus retina; Teknikken er imidlertid også tidligere beskrevet for både umodne museretinas37 og humane netthinner38. I en tidligere studie ble retinale eksplantkulturer beskrevet for å studere vaskulær utvikling, hvor endotelfunksjonsmanipulering ble gjort mulig ex vivo27. Som et eksempel på den morfologiske vurderingen av en retinal eksplant, ble retinal explant igjen i kultur i 2 uker, og deretter ble immunostaining utført ved hjelp av NeuN (neuronal cell), GFAP (glial cell) og isolectin-B4 (vaskulær markør). Fargingen viste at retinale celler og blodårer var velutviklede og godt bevart i eksplanten (figur 2). Imidlertid kan mer immunhistokjemi farging data oppnås for å kontrollere levedyktigheten og funksjonaliteten til andre retinale celler i explant også.

Eksplantkulturen i seg selv kan være stressende for retinalcellene. Cellene kunne imidlertid inkuberes under relativt normale forhold, slik at de morfologiske endringene som oppstod under forskjellige eksperimentelle forhold, som hyperglykemi eller hypoksi, kunne sammenlignes med baselinetilstanden. Utstillingen representerer dermed et godt verktøy for å evaluere ulike retinale celler og teste deres svar på forskjellige farmakologiske midler eller terapeutiske mål samtidig i et bredt spekter av retinale sykdommer.

Retinal neovaskularisering er et kardinaltegn på iskemisk retinopati, som i retinopati av prematuritet og diabetisk retinopati. Vi (figur 2) og andre 27,39,40,41,42 kunne observere intakt retinal vaskulatur i dyrkede eksplanter i opptil 2 uker. Dermed har retinal explant blitt brukt til å studere patofysiologien til både normal og patologisk retinal neovaskularisering 41,42,43,44,45,46,47,48,49. Interessant nok registrerte en forskningsgruppe VEGF-indusert vaskulær spiring i mus retinale eksplanter mens de undersøkte de proangiogene faktorene som er forhøyet i proliferativ diabetisk retinopati43. Videre har retinale eksplanter blitt innebygd i en tredimensjonal gel, noe som gjør det mulig å studere spiring av retinale endotelceller i en mer detaljert spatiotemporal orientering45,46,47.

I tillegg til morfologiske studier brukes retinale eksplanter også til en viss grad for å evaluere retinale funksjoner50,51,52,53. Ex vivo elektroretinogram (ERG) avbildning har blitt utført på isolerte mus retinale eksplanter, noe som gjør det mulig å studere de forskjellige funksjonene til en rekke retinale celler, inkludert både stang- og kjeglefotoreceptorer54,55,56,57. Interessant nok rapporterte Calbiague og medarbeidere at som svar på høy glukosebehandling viste retinale eksplantkulturer avledet fra enten mus eller rotter en stadig mindre tykkelse på retinallagene58. Imidlertid beholdt retinale bipolare celler, som er blant de tidligste følsomme cellene til diabetiske forhold, ikke bare deres morfologi, men også deres elektrofysiologiske egenskaper i kultur i opptil 2 uker58. Oppsummert tror vi at denne protokollen kan være en base eller et utgangspunkt for ytterligere fremtidige studier for å optimalisere fordelene med eksplantbruk i øyeforskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke National Institute of Health (NIH) finansieringstilskudd til National Eye Institute (R01 EY030054) til Dr. Mohamed Al-Shabrawey. Vi vil gjerne takke Kathy Wolosiewicz for å hjelpe oss med videofortellingen. Vi vil gjerne takke Dr. Ken Mitton fra Eye Research Institute's Pediatric Retinal Research lab, Oakland University, for hans hjelp under bruk av kirurgisk mikroskop og opptak. Denne videoen ble redigert og regissert av Dr. Khaled Elmasry.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adult C57Bl/6J mice  The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA 664
All-in-One Fluorescence Microscope  KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A. BZ-X800
B27 supplements Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #17504-04
Blockade blocking solution  Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA B10710
DMEM F12 Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #11320033
Goat anti-Rabbit IgG. Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA F-2765
GSL I, BSL I (Isolectin) Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA B-1105-2
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS) Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #14175095
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades World Precision Instruments,FL 34240, USA  Straight (503365)
N2 supplements Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #17502-048
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA 140652
Paraformaldehyde 4% in PBS BBP, Ashland, MA, 01721 USA C25N107
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA 15140148
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA P36962
Rabbit Anti-NeuN Antibody Abcam.,Cambridge, UK ab177487
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody Dako,Carpinteria, CA 93013, USA. Z0334
Texas Red Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA SA-5006-1
TritonX BioRad Hercules, CA,  94547,USA 1610407

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gauthier, C., Griffin, G. Using animals in research, testing and teaching. Revue Scientifique et Technique. 24 (2), 735-745 (2005).
  2. Fletcher, E. L., et al. Animal models of retinal disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 100, 211-286 (2011).
  3. Bertschinger, D. R., et al. A review of in vivo animal studies in retinal prosthesis research. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (11), 1505-1517 (2008).
  4. Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 137-159 (2015).
  5. Sharma, K., Krohne, T. U., Busskamp, V. The rise of retinal organoids for vision research. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8484 (2020).
  6. Fradot, M., et al. Gene therapy in ophthalmology: Validation on cultured retinal cells and explants from postmortem human eyes. Human Gene Therapy. 22 (5), 587-593 (2011).
  7. Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
  8. Nardone, R. M. Curbing rampant cross-contamination and misidentification of cell lines. Biotechniques. 45 (3), 221-227 (2008).
  9. Horbach, S., Halffman, W. The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature. PLoS One. 12 (10), 0186281 (2017).
  10. MacLeod, R. A., et al. Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source. International Journal of Cancer. 83 (4), 555-563 (1999).
  11. Tamiya, S., Liu, L., Kaplan, H. J. Epithelial-mesenchymal transition and proliferation of retinal pigment epithelial cells initiated upon loss of cell-cell contact. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (5), 2755-2763 (2010).
  12. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: A window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  13. Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: Cultivation, differentiation, and transplantation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 638439 (2021).
  14. Zhang, X., Wang, W., Jin, Z. B. Retinal organoids as models for development and diseases. Cell Regeneration. 10 (1), 33 (2021).
  15. Bell, C. M., Zack, D. J., Berlinicke, C. A. Human organoids for the study of retinal development and disease. Annual Reviews of Vision Science. 6, 91-114 (2020).
  16. Mills, S. A., et al. Fractalkine-induced microglial vasoregulation occurs within the retina and is altered early in diabetic retinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (51), 2112561118 (2021).
  17. Louie, H. H., et al. Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. 202, 108384 (2021).
  18. Wu, X., Yan, N., Zhang, M. Retinal degeneration: Molecular mechanisms and therapeutic strategies. Current Medicinal Chemistry. 29 (40), 6125-6140 (2021).
  19. Armento, A., et al. Complement factor H loss in RPE cells causes retinal degeneration in a human RPE-porcine retinal explant co-culture model. Biomolecules. 11 (11), 1621 (2021).
  20. Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina. Clinical & Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).
  21. Pattamatta, U., McPherson, Z., White, A. A mouse retinal explant model for use in studying neuroprotection in glaucoma. Experimental Eye Research. 151, 38-44 (2016).
  22. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  23. Alarautalahti, V., et al. Viability of mouse retinal explant cultures assessed by preservation of functionality and morphology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (6), 1914-1927 (2019).
  24. Smedowski, A., et al. FluoroGold-labeled organotypic retinal explant culture for neurotoxicity screening studies. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 2487473 (2018).
  25. Bull, N. D., et al. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3309-3320 (2011).
  26. Beeson, C., et al. Small molecules that protect mitochondrial function from metabolic stress decelerate loss of photoreceptor cells in murine retinal degeneration models. Advances in Experimental Medicine and Biology. 854, 449-454 (2016).
  27. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nature Protocols. 5 (10), 1659-1665 (2010).
  28. Muller, B. Organotypic culture of adult mouse retina. Methods in Molecular Biology. 1940, 181-191 (2019).
  29. Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
  30. Garcia-Cabezas, M. A., John, Y. J., Barbas, H., Zikopoulos, B. Distinction of neurons, glia and endothelial cells in the cerebral cortex: An algorithm based on cytological features. Frontiers in Neuroanatomy. 10, 107 (2016).
  31. Elmasry, K., et al. Role of endoplasmic reticulum stress in 12/15-lipoxygenase-induced retinal microvascular dysfunction in a mouse model of diabetic retinopathy. Diabetologia. 61 (5), 1220-1232 (2018).
  32. Elmasry, K., et al. Epigenetic modifications in hyperhomocysteinemia: Potential role in diabetic retinopathy and age-related macular degeneration. Oncotarget. 9 (16), 12562-12590 (2018).
  33. Al-Shabrawey, M., et al. Role of NADPH oxidase and Stat3 in statin-mediated protection against diabetic retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (7), 3231-3238 (2008).
  34. Al-Shabrawey, M., et al. Increased expression and activity of 12-lipoxygenase in oxygen-induced ischemic retinopathy and proliferative diabetic retinopathy: Implications in retinal neovascularization. Diabetes. 60 (2), 614-624 (2011).
  35. Hussein, K. A., et al. Bone morphogenetic protein 2: A potential new player in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. 125, 79-88 (2014).
  36. Ibrahim, A. S., et al. Pigment epithelium-derived factor inhibits retinal microvascular dysfunction induced by 12/15-lipoxygenase-derived eicosanoids. Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (3), 290-298 (2015).
  37. Belhadj, S., et al. Long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (165), e61868 (2020).
  38. Kuo, C. Y. J., Louie, H. H., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. Characterization of a novel human organotypic retinal culture technique. Journal of Visualized Experiments. (172), e62046 (2021).
  39. Sawamiphak, S., et al. Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis. Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).
  40. Curatola, A. M., Moscatelli, D., Norris, A., Hendricks-Munoz, K. Retinal blood vessels develop in response to local VEGF-A signals in the absence of blood flow. Experimental Eye Research. 81 (2), 147-158 (2005).
  41. Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (5), 2347-2355 (2010).
  42. DeNiro, M., Alsmadi, O., Al-Mohanna, F. Modulating the hypoxia-inducible factor signaling pathway as a therapeutic modality to regulate retinal angiogenesis. Experimental Eye Research. 89 (5), 700-717 (2009).
  43. Murakami, T., et al. Time-lapse imaging of vitreoretinal angiogenesis originating from both quiescent and mature vessels in a novel ex vivo system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5529-5536 (2006).
  44. Unoki, N., et al. SDF-1/CXCR4 contributes to the activation of tip cells and microglia in retinal angiogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (7), 3362-3371 (2010).
  45. Knott, R. M., et al. A model system for the study of human retinal angiogenesis: activation of monocytes and endothelial cells and the association with the expression of the monocarboxylate transporter type 1 (MCT-1). Diabetologia. 42 (7), 870-877 (1999).
  46. Im, E., Venkatakrishnan, A., Kazlauskas, A. Cathepsin B regulates the intrinsic angiogenic threshold of endothelial cells. Molecular Biology of the Cell. 16 (8), 3488-3500 (2005).
  47. Shafiee, A., et al. Inhibition of retinal angiogenesis by peptides derived from thrombospondin-1. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (8), 2378-2388 (2000).
  48. Brown, K. C., et al. MG624, an α7-nAChR antagonist, inhibits angiogenesis via the Egr-1/FGF2 pathway. Angiogenesis. 15 (1), 99-114 (2012).
  49. Rezzola, S., et al. A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay. Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).
  50. Liu, D., et al. Overexpression of BMP4 protects retinal ganglion cells in a mouse model of experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 210, 108728 (2021).
  51. Januschowski, K., et al. Ex vivo biophysical characterization of a hydrogel-based artificial vitreous substitute. PLoS One. 14 (1), 0209217 (2019).
  52. Tolmachova, T., et al. Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo. Journal of Molecular Medicine. 91 (7), 825-837 (2013).
  53. Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Research. 101, 108-117 (2014).
  54. Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52855 (2015).
  55. Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: Performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 (21), 4821-4842 (2020).
  56. Kaikkonen, O., Turunen, T. T., Meller, A., Ahlgren, J., Koskelainen, A. Retinal temperature determination based on photopic porcine electroretinogram. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (2), 991-1002 (2022).
  57. Gospe, S. M., et al. 3rd al. Photoreceptors in a mouse model of Leigh syndrome are capable of normal light-evoked signaling. Journal of Biological Chemistry. 294 (33), 12432-12443 (2019).
  58. Calbiague, V. M., Vielma, A. H., Cadiz, B., Paquet-Durand, F., Schmachtenberg, O. Physiological assessment of high glucose neurotoxicity in mouse and rat retinal explants. Journal of Comparative Neurology. 528 (6), 989-1002 (2020).

Tags

Medisin utgave 190
Retinal Explant of the Adult Mouse Retina som en <em>ex vivo-modell</em> for å studere retinale nevrovaskulære sykdommer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elmasry, K., Moustafa, M.,… More

Elmasry, K., Moustafa, M., Al-Shabrawey, M. Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases. J. Vis. Exp. (190), e63966, doi:10.3791/63966 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter