Summary
Denne protokol præsenterer og beskriver trin til isolering, dissektion, dyrkning og farvning af retinale eksplanter opnået fra en voksen mus. Denne metode er gavnlig som en ex vivo-model til undersøgelse af forskellige retinale neurovaskulære sygdomme såsom diabetisk retinopati.
Abstract
En af udfordringerne i nethindeforskning er at studere krydstalen mellem forskellige retinale celler såsom retinale neuroner, gliaceller og vaskulære celler. Isolering, dyrkning og opretholdelse af retinale neuroner in vitro har tekniske og biologiske begrænsninger. Dyrkning af retinale explants kan overvinde disse begrænsninger og tilbyde en unik ex vivo-model til at studere krydstalen mellem forskellige retinale celler med velkontrollerede biokemiske parametre og uafhængigt af det vaskulære system. Desuden er retinale explants et effektivt screeningsværktøj til at studere nye farmakologiske interventioner i forskellige retinale vaskulære og neurodegenerative sygdomme såsom diabetisk retinopati. Her beskriver vi en detaljeret protokol for nethindeudplantningers isolation og kultur i en længere periode. Manuskriptet præsenterer også nogle af de tekniske problemer under denne procedure, der kan påvirke de ønskede resultater og reproducerbarheden af retinal explant-kulturen. Immunostaining af retinale kar, gliaceller og neuroner viste intakte retinale kapillærer og neuroglialceller efter 2 uger fra begyndelsen af retinal explantkulturen. Dette etablerer retinale explants som et pålideligt værktøj til at studere ændringer i retinal vaskulaturen og neurogliale celler under forhold, der efterligner retinale sygdomme som diabetisk retinopati.
Introduction
Forskellige modeller er blevet præsenteret for at studere nethindesygdomme, herunder både in vivo- og in vitro-modeller. Brugen af dyr i forskning er stadig et spørgsmål om kontinuerlig etisk og translationel debat1. Dyremodeller, der involverer gnavere som mus eller rotter, anvendes almindeligvis i nethindeforskning 2,3,4. Imidlertid er der opstået kliniske bekymringer på grund af nethindens forskellige fysiologiske funktioner hos gnavere sammenlignet med mennesker, såsom fraværet af makula eller forskelle i farvesyn5. Brugen af menneskelige postmortem øjne til retinal forskning har også mange problemer, herunder men ikke begrænset til forskelle i de genetiske baggrunde for de originale prøver, donorernes medicinske historie og donorernes tidligere miljøer eller livsstil6. Desuden har brugen af in vitro-modeller i retinal forskning også nogle ulemper. Cellekulturmodeller, der bruges til at studere retinale sygdomme, omfatter udnyttelse af cellelinjer af menneskelig oprindelse, primære celler eller stamceller7. De anvendte cellekulturmodeller har vist sig at have problemer med hensyn til at være forurenet, fejlidentificeret eller dedifferentieret 8,9,10,11. For nylig har retinal organoidteknologi vist betydelige fremskridt. Konstruktionen af meget komplekse nethinder in vitro har imidlertid flere begrænsninger. For eksempel har retinale organoider ikke de samme fysiologiske og biokemiske egenskaber som modne in vivo nethinder. For at overvinde denne begrænsning skal retinal organoidteknologi integrere flere biologiske og cellulære træk, herunder glatte muskelceller, vaskulatur og immunceller som microglia12,13,14,15.
Organotypiske retinale explants er opstået som et pålideligt værktøj til at studere retinale sygdomme som diabetisk retinopati og degenerative retinale sygdomme16,17,18,19. Sammenlignet med andre eksisterende teknikker understøtter brugen af retinale explants både in vitro retinale cellekulturer og også aktuelle in vivo-dyremodeller ved at tilføje en unik funktion til at studere krydstalen mellem forskellige retinale celler under de samme biokemiske parametre og uafhængig af systemiske variabler. Explantkulturerne gør det muligt at holde forskellige retinale celler sammen i det samme miljø, hvilket gør det muligt at bevare retinale intercellulære interaktioner20,21,22. Desuden viste en tidligere undersøgelse, at retinale explants var i stand til at bevare den morfologiske struktur og funktionalitet af de dyrkede retinale celler23. Således kan retinale explants give en anstændig platform til at undersøge mulige terapeutiske mål for en lang række retinale sygdomme24,25,26. Retinale explantkulturer giver en kontrollerbar teknik og er meget fleksible erstatning for eksisterende møl, der tillader adskillige farmakologiske manipulationer og kan afdække flere molekylære mekanismer27.
Det overordnede mål med dette papir er at præsentere retinal explant-teknikken som et rimeligt mellemmodelsystem mellem in vitro-cellekulturer og in vivo-dyremodeller. Denne teknik kan efterligne retinale funktioner på en bedre måde end dissocierede celler. Da forskellige retinale lag forbliver intakte, kan de retinale intercellulære interaktioner vurderes i laboratoriet under velkontrollerede biokemiske forhold og uafhængigt af vaskulært systemfunktion28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Oakland University, Rochester, MI, USA og fulgte de retningslinjer, der blev fastlagt af Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research.
1. Tilberedning af dyr
- Hold dyrene anbragt under en konstant temperatur i et lysstyret miljø. Temperaturindstillingerne for staldrummet skal følge retningslinjerne i "Guide for pleje og brug af forsøgsdyr". Temperaturområdet for mus er mellem 18 °C og 26 °C. Hold fugtighedsniveauerne kontrolleret og indstillet til ca. 42%.
- Til dette forsøg skal du bruge C57BL/6J-hanmus (se materialetabellen for detaljer), der er mere end 12 uger gamle (en voksen mus blev brugt til denne protokol).
BEMÆRK: En vildtypestamme blev brugt i denne protokol til demonstrationen, da den ikke havde nogen genetiske abnormiteter, der påvirkede nethinden. Man kunne dog bruge andre stammer, herunder genetisk manipulerede stammer, til retinal explant-kulturen. - Giv 12 timers lys/mørke cyklusser via lysstyring i dyrestaldene.
- Undersøg hvert dyr for sundhed og tilstrækkeligt mad- og vandindtag to gange om dagen i løbet af ugen og en gang om dagen i weekenden. Sørg for at give dem frisk mad og rent vand.
- Hvis mad- og vandstanden er lav i løbet af ugen, skal du skylle vandflasken og genopfylde den. Tilsæt frisk mad, når det er nødvendigt. Skift snavsede bure dagligt eller efter behov for dyrenes sundhed.
BEMÆRK: For at studere fotoreceptorer og lysinducerede ændringer i nethinden skal du mørktilpasse musene natten over i en speciel mørk kasse placeret i et mørkt rum i dyreanlægget. - Aflive dyrene i deres bur ved CO 2 -indånding ved hjælp af komprimeret CO 2 -gas i cylindre forbundet til et CO2 -kammer. Udfør dødsbekræftelse ved hjælp af en sekundær metode til eutanasi, såsom cervikal dislokation.
- Efter afslutningen af proceduren skal du bekræfte dyrets død ved en passende metode, såsom bekræftelse af hjerte- og åndedrætsstop eller observation af faste og udvidede pupiller af dyret.
2. Vævspræparation
- Når dyret er aflivet, skal du rengøre området med 70% ethanol. Åbn derefter øjenlågene med den ene hånd, så øjet er synligt. Påfør tryk på de overlegne og ringere dele af kredsløbet med den modsatte hånd ved hjælp af buede tang, indtil kloden stikker ud.
- For at enukleere øjet skal du forsigtigt lukke tangen på den bageste del af øjet og hæve i en kontinuerlig bevægelse. Brug tang til at holde øjeæblet fra synsnerven. Sørg for at bruge steriliserede dissektionsværktøjer til alle trin og arbejde under fuldstændige aseptiske forhold.
- Hvert øjeæble nedsænkes i et 1,5 ml rør indeholdende 1 ml iskold HBSS med penicillin-streptomycin (10.000 U / ml). Vask øjeæblet i HBSS to gange i 5 minutter hver.
- Overfør øjeæblet til et 1,5-2 ml rør indeholdende komplette medier (10% FBS, 2% B27, 1% N2, 1% L-glutamin og 1% penicillin og streptomycin).
3. Vævsdissektion
- Disseker nethinden forsigtigt under et operativt mikroskop, som illustreret sekventielt i figur 1.
- Lav et omkredssnit omkring limbus for at åbne øjeæblet. Fjern hornhinden ved cirkulært at dissekere langs grænsen til hornhinden og det (limbale) snit, efterfulgt af at fjerne det forreste segment, linsen og glaslegemet og efterlade en tom øjenkop.
- Ved at holde området af det optiske nervehoved med fine tang, skræl forsigtigt det ydre lag af øjet. Vær meget opmærksom under fjernelsen af det ydre lag for ikke at skade den neurale nethinde og for at sikre, at nethinden forbliver helt intakt.
BEMÆRK: Nethinden skal forsigtigt skrælles væk fra retinal pigmentepitel (RPE), og et enkelt snit ved synsnervehovedet skal udføres for at løsne nethinden fra synsnerven. Sørg visuelt for dette ved at identificere hullet efterladt af synsnerven (det optiske nervehoved). - Disseker nethinden radialt i fire lige store stykker.
- Følg nedenstående trin for håndtering af de små stykker af nethinden for at sikre korrekt orientering af nethindekulturen.
- Brug et dissekerende saksblad til at åbne lige under nethindestykket (Materialetabel).
- Løft langsomt nethindestykket med spidsen af et åbent sakseblad, og overfør det forsigtigt til kulturpladen.
- Overfør explanterne afledt af den isolerede nethinde separat på cellekulturindsatser i en 12-brøndsplade, der hver indeholder 300 μL retinale explant-medier, med retinal ganglioncelle (neuroretina) side opad.
BEMÆRK: Sørg for, at medierne er DMEM-medier med N2- og B27-kosttilskud. Tilsæt også penicillin-streptomycin (10.000 U / ml) til mediet (materialetabel). Nethinden er dannet af flere lag af neuronale celler sammenkoblet via synapser og understøttet udefra af det pigmenterede lag af retinal pigmentepitel, som er det sorte lag, der blev fjernet under dissektionen. - Fjern eventuelle rester af det pigmenterede epitel; Disse rester kan dog hjælpe med at identificere den korrekte orientering af explanten. Sørg for, at den pigmenterede del vender nedad, og at den ikke-pigmenterede del vender opad.
- Inkubere retinal explant-kulturen i befugtede inkubatorer ved 37 °C og 5% CO2.
- Sørg for, at nethindeoverfladen vender opad. Hvis nethindestykket vendes eller foldes, skal du prøve at justere det forsigtigt til den korrekte retning.
BEMÆRK: Vær meget opmærksom på den korrekte orientering af retinal explant i kulturpladen. Undgå vending eller foldning af explanten i kulturpladen, da dette vil resultere i svigt i den korrekte vækst af retinale celler i kultur.
4. Retinal explant kultur
- Retinale explantkulturer (fremstillet i trin 3.2-3.3) i befugtede inkubatorer opretholdes ved 37 °C og 5 % CO2.
- Skift halvdelen af medierne fra hver brønd hver anden dag i 2 uger. Gør dette ved at pipettere 150 μL forsigtigt fra brønden. Tilsæt derefter 150 μL friske medier tilbage i brønden. Undgå at vende explanten, når du skifter medie.
- Kontroller explant omhyggeligt under mikroskopet, inden du sætter kulturpladen tilbage i inkubatoren. Undersøg cellernes integritet og retinalarkitekturen under et lysfeltmikroskop. Sørg for, at explanten stadig er orienteret korrekt. Brug både 4x og 20x objektive linser til at undersøge explanten.
BEMÆRK: Undgå fuldstændig nedsænkning af explant i medierne.
5. Immunohistokemi
- Efter 2 uger skal du rette retinal explant ved at fjerne mediet. Gør dette ved først at vaske en gang med 200 μL 1x PBS og derefter tilføje 300 μL 4% paraformaldehyd i 0,1 M PBS, pH 7,4, til brønden, der indeholder explanten, og lade den stå natten over.
BEMÆRK: Dette trin kan udføres uden at fjerne kulturindsatserne fra pladen. Explanterne kan også overføres til et 500 μL konisk rør, og vask og fiksering kan udføres inde i røret. - Explanten overføres til et 500 μL konisk rør indeholdende 300 μL 1x PBS-2,5% Triton X til vask.
- Vask de faste eksplanter i røret tre gange i 5 minutter hver ved hjælp af medium hastighed på en ryster (25 o / min).
- De forventede uspecifikke reaktioner blokeres ved at inkubere explanten med 300 μL 1x blokerende buffer indeholdende 0,02% thimerosal i 1 time ved stuetemperatur før antistofinkubationen.
- De faste eksplantationer inkuberes med de primære antistoffer natten over ved 4 °C ved hjælp af medium hastighed på en ryster.
BEMÆRK: Detekter retinale endotelceller i den faste explant ved farvning med GSL I, BSL I-antistof (lectin) (7:1.000). Detekter gliaceller i nethinden eksplanterne ved farvning med kaninglialfibrillært surt protein (GFAP) antistof (1:250). Detekter nethindeneuronerne ved at farve explanten med kanin NeuN-antistof (1:250)29,30. Inkubere s{Tual-Chalot, 2013 #117}{Tual-Chalot, 2013 #116}{Tual-Chalot, 2013 #116}ome explants med lectin, NeuN-kombinationen, og inkubere andre med lectin, GFAP-kombinationen. - Den næste dag fjernes det primære antistof fra rørene ved aspiration med en pipette. Vask explanterne med 1x PBS-2,5% Triton X tre gange i 5 minutter hver ved hjælp af medium hastighed på en shaker.
- Tilføj de sekundære antistoffer: Gedeanti-kanin IgG (1:500) (sekundær for GFAP og NeuN) og Texas Red (7:1.000) (for lektin). Inkuberes i 1 time ved stuetemperatur ved hjælp af medium hastighed på en ryster.
BEMÆRK: De sekundære antistoffer er lysfølsomme, så dæk røret med aluminiumsfolie. - Fjern de sekundære antistoffer ved aspiration, og vask derefter tre gange i 5 minutter hver med 1x PBS-2,5% Triton X.
- Overfør explanten fra røret til et glasglas ved hjælp af en overførselspipette. Fjern overskydende væske på diaset, og tilføj derefter en dråbe monteringsmedier med DAPI til diaset.
- Dæk vævet med en dækslip. Lad ikke luftbobler mellem dækslet og vævet.
- Tag de farvede dias til fluorescensmikroskopet, og begynd at tage billederne. Det er vigtigt at dække de farvede dias ved hjælp af en glideboks, da fluorescensfarvningen er lysfølsom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Overlevelse af de neuronale og vaskulære retinale celler i retinal explant i kulturmedier ex vivo i længere tid
Ved at dyrke en retinal explant ved hjælp af vores protokol lykkedes det os at opretholde forskellige retinale celler, der var levedygtige i op til 2 uger. For at verificere tilstedeværelsen af forskellige retinale celler blev immunfluorescensfarvning af retinal explant ved hjælp af en neuronal cellemarkør (NeuN), glialcellemarkør (GFAP) og vaskulær markør (isolectin-B4) udført (figur 2). Farvningen viste velorganiserede og veludviklede retinale neuroner og gliaceller. Derudover var retinale blodkar strukturelt intakte, som det fremgår af isolectin-B4-farvningen. Den morfologiske integritet af retinal explant, som demonstreret ved immunostaining, indikerede, at retinal explant-kulturen var vellykket til at opretholde levedygtige retinale celler, der eksperimentelt kunne anvendes som model. De forskellige eksperimentelle betingelser, der skal undersøges ved hjælp af explanten, kan evalueres og analyseres ved immunfluorescensfarvning for flere cellulære markører ved hjælp af ImageJ-software. Immunostaining tillader måling af immunreaktivitetsniveauerne for hver cellulær markør og af antallet af specifikke celler, såsom antallet af retinale ganglionceller eller fotoreceptorer, blandt forskellige eksperimentelle grupper.
Betydningen af korrekt orientering af retinal explant i kulturpladen for de eksperimentelle resultater
Den korrekte orientering af retinal explant i kulturpladen opnås ved at inkubere neuroretinaen opad. På den anden side kan svigt i retinal explant skyldes at vende eller folde retinalvævet, hvilket får neuroretina til at vende nedad. Immunofluorescensfarvningen af den dyrkede retinale explant efter 2 uger ved anvendelse af forskellige retinale markører som det foregående eksperiment (NeuN, GFAP og isolectin-B4) viste, at svigt i korrekt explantorientering resulterer i svigt i den korrekte udvikling af det neurovaskulære element (figur 3).
Figur 1: Trin til dissekering af øjeæblet for at skabe retinal explant. a) Det enukleerede øjeæble nedsænkes i medierne umiddelbart efter, at det er fjernet fra dyret. (b) Der foretages et omkredssnit langs limbus for at åbne øjeæblet. (c) Hornhinden fjernes ved dissekering langs det limbale snit. (d) Ved at holde synsnerven med fine tang skrælles øjets ydre lag forsigtigt af. e) Linsen, glaslegemet og ciliarylegemet fjernes. (F) Kun den neurale nethinde er tilbage. (g) Fire radiale snit er lavet i nethinden for at gøre det lettere at skære det i det næste trin. h) Nethinden kan skæres i to eller fire stykker og derefter overføres til cellekulturpladen, der indeholder indsatsen og mediet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Vellykket retinal explantkultur med bevaret retinal struktur. Immunofluorescensfarvning af retinale explanter, der havde opholdt sig i kultur i 2 uger. Eksplanterne blev fikseret og farvet med (a) NeuN for retinale neuroner (grøn) og isolectin-B4 for blodkar (rød) og (b) GFAP for gliaceller (grøn) og isolectin-B4 for blodkar (rød). Farvningen viste veludviklede retinale celler og retinale kar. Skala bar = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Mislykket retinal explant-kultur med defekte, underudviklede retinale celler. Immunofluorescensfarvning af retinale eksplanter, der havde opholdt sig i kultur i to uger. Explanterne blev fikseret og farvet med GFAP til gliaceller (grøn) og isolectin-B4 til blodkar (rød). Billederne viser defekt farvning og underudviklede retinale celler og nethindekar. Nethinden blev foldet og var ikke orienteret korrekt i kulturpladen. Der skal lægges stor vægt på at sikre den rette orientering af explant med nethinden vendt opad. Manglende evne til at sætte retinal explant i den rigtige retning vil resultere i manglende korrekt udvikling af explanten. Skala bar = 100 μm Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vores laboratorium har studeret de patofysiologiske ændringer, der fremmer retinal mikrovaskulær dysfunktion i år 31,32,33,34,35,36. Retinal explants er en af de teknikker, der kan være af stor værdi at bruge som model til at studere retinale sygdomme som diabetisk retinopati eller degenerative retinale sygdomme. At have en kontrolgruppe afledt af den samme enlige nethinde eller dyr som den behandlede gruppe eller grupper giver denne teknik en stor fordel med hensyn til at give mere pålidelige sammenligninger af forskellige forsøgsbetingelser.
En af de største udfordringer under forberedelse af retinal explant er foldningen af explant eller forkert orientering i kulturpladen med nethindeoverfladen nedad. Andre forskere foreslog at pipettere nethinden op og ned i den overførende pipette for at få den i den korrekte retning i pladen37. I deres protokol brugte de imidlertid hele nethinden til en enkelt explant, men i denne protokol blev en enkelt nethinde skåret i to til fire stykker, hvilket betyder, at stykkerne er mindre, og det er svært at udføre denne manøvre for den rette orientering. At skære en enkelt nethinde i to til fire stykker gør det muligt at få fire til otte nethindestykker fra det samme dyr, der kan bruges til et forsøg. Dette tillader forsøg, hvor kontrolgruppen og forsøgsgrupperne stammer fra det samme dyr.
Men at skære nethinden i små stykker gør håndteringen af den mere udfordrende. Derfor udviklede vi en teknik til håndtering af disse små nethindestykker for at sikre korrekt orientering af nethindekulturen. For at gøre dette placeres det åbne dissekerende sakseblad lige under nethindestykket, med nethindeoverfladen opad. Hvis nethindestykket vendes eller foldes, justeres det forsigtigt til den korrekte retning. Langsomt hæves nethindestykket med spidsen af et åbent saksblad og sættes forsigtigt i kulturpladen. Denne enkle teknik sikrer, at hvert nethindestykke er i den korrekte retning med nethinden vendt opad og fremmer bedre resultater for at studere retinale kar og neuroglialceller (figur 2). Manglende placering af retinal explant i den korrekte retning med neuroretinaen vendt opad vil resultere i manglende korrekt vækst af retinale celler i kultur, som vist i figur 3. Korrekt træning anbefales stærkt for at undgå denne tekniske fejl.
Denne protokol beskriver en organotypisk retinal explant af en voksen mus nethinden; Teknikken er dog også tidligere beskrevet for både umodne musenethinder37 og humane nethinder38. I en tidligere undersøgelse blev retinale explantkulturer beskrevet til undersøgelse af vaskulær udvikling, hvor endotelfunktionsmanipulation blev gjort mulig ex vivo27. Som et eksempel på den morfologiske vurdering af en retinal explant blev retinal explant efterladt i kultur i 2 uger, og derefter blev immunostaining udført ved anvendelse af NeuN (neuronal cellemarkør), GFAP (glialcellemarkør) og isolectin-B4 (vaskulær markør). Farvningen viste, at nethindecellerne og blodkarrene var veludviklede og velbevarede i explanten (figur 2). Imidlertid kan der opnås flere immunohistokemiske farvningsdata for også at kontrollere levedygtigheden og funktionaliteten af andre retinale celler i explanten.
Selve eksplantationskulturen kan være stressende for nethindecellerne. Cellerne kunne imidlertid inkuberes under relativt normale forhold, således at de morfologiske ændringer, der forekommer under forskellige eksperimentelle betingelser, såsom hyperglykæmi eller hypoxi, kunne sammenlignes med baseline-tilstanden. Explanten repræsenterer således et godt værktøj til evaluering af forskellige retinale celler og test af deres reaktioner på forskellige farmakologiske midler eller terapeutiske mål samtidigt i en lang række nethindesygdomme.
Retinal neovaskularisering er et kardinalt tegn på iskæmisk retinopati, såsom i retinopati af præmaturitet og diabetisk retinopati. Vi (figur 2) og andre 27,39,40,41,42 kunne observere intakt retinal vaskulatur i dyrkede explants i op til 2 uger. Således er retinal explant blevet brugt til at studere patofysiologien af både normal og patologisk retinal neovaskularisering 41,42,43,44,45,46,47,48,49. Interessant nok registrerede en forskergruppe VEGF-induceret vaskulær spiring i musehindeplanter, mens de undersøgte de proangiogene faktorer, der er forhøjet i proliferativ diabetisk retinopati43. Desuden er retinale explants blevet indlejret i en tredimensionel gel, hvilket giver mulighed for undersøgelse af spiring af retinale endotelceller i en mere detaljeret spatiotemporal orientering45,46,47.
Ud over morfologiske undersøgelser anvendes retinale explants også til en vis grad til at evaluere retinale funktioner50,51,52,53. Ex vivo elektroretinogram (ERG) billeddannelse er blevet udført på isolerede musehindeplanter, hvilket giver mulighed for undersøgelse af de forskellige funktioner i en række retinale celler, herunder både stang- og keglefotoreceptorer54,55,56,57. Interessant nok rapporterede Calbiague et al., at som reaktion på høj glukosebehandling viste retinale explantkulturer afledt af enten mus eller rotter en stadig mindre tykkelse af retinale lag58. Imidlertid holdt retinale bipolære celler, som er blandt de tidligste følsomme celler til diabetiske tilstande, ikke kun deres morfologi, men også deres elektrofysiologiske egenskaber i kultur i op til 2 uger58. Sammenfattende mener vi, at denne protokol kan være en base eller et udgangspunkt for yderligere fremtidige undersøgelser for at optimere fordelene ved explant-brug i øjenforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke National Institute of Health (NIH) Funding Grant til National Eye Institute (R01 EY030054) til Dr. Mohamed Al-Shabrawey. Vi vil gerne takke Kathy Wolosiewicz for at hjælpe os med videofortællingen. Vi vil gerne takke Dr. Ken Mitton fra Eye Research Institute's Pediatric Retinal Research Lab, Oakland University, for hans hjælp under brugen af det kirurgiske mikroskop og optagelse. Denne video blev redigeret og instrueret af Dr. Khaled Elmasry.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult C57Bl/6J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA | 664 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A. | BZ-X800 | |
| B27 supplements | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #17504-04 | |
| Blockade blocking solution | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | B10710 | |
| DMEM F12 | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #11320033 | |
| Goat anti-Rabbit IgG. | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | F-2765 | |
| GSL I, BSL I (Isolectin) | Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA | B-1105-2 | |
| Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #14175095 | |
| Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades | World Precision Instruments,FL 34240, USA | Straight (503365) | |
| N2 supplements | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #17502-048 | |
| Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | 140652 | |
| Paraformaldehyde 4% in PBS | BBP, Ashland, MA, 01721 USA | C25N107 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | 15140148 | |
| PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | P36962 | |
| Rabbit Anti-NeuN Antibody | Abcam.,Cambridge, UK | ab177487 | |
| Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody | Dako,Carpinteria, CA 93013, USA. | Z0334 | |
| Texas Red | Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA | SA-5006-1 | |
| TritonX | BioRad Hercules, CA, 94547,USA | 1610407 |
References
- Gauthier, C., Griffin, G. Using animals in research, testing and teaching. Revue Scientifique et Technique. 24 (2), 735-745 (2005).
- Fletcher, E. L., et al.
- Bertschinger, D. R., et al. A review of in vivo animal studies in retinal prosthesis research. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (11), 1505-1517 (2008).
- Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 137-159 (2015).
- Sharma, K., Krohne, T. U., Busskamp, V. The rise of retinal organoids for vision research. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8484 (2020).
- Fradot, M., et al. Gene therapy in ophthalmology: Validation on cultured retinal cells and explants from postmortem human eyes. Human Gene Therapy. 22 (5), 587-593 (2011).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- Nardone, R. M. Curbing rampant cross-contamination and misidentification of cell lines. Biotechniques. 45 (3), 221-227 (2008).
- Horbach, S., Halffman, W. The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature. PLoS One. 12 (10), 0186281 (2017).
- MacLeod, R. A., et al. Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source. International Journal of Cancer. 83 (4), 555-563 (1999).
- Tamiya, S., Liu, L., Kaplan, H. J. Epithelial-mesenchymal transition and proliferation of retinal pigment epithelial cells initiated upon loss of cell-cell contact. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (5), 2755-2763 (2010).
- O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: A window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
- Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: Cultivation, differentiation, and transplantation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 638439 (2021).
- Zhang, X., Wang, W., Jin, Z. B. Retinal organoids as models for development and diseases. Cell Regeneration. 10 (1), 33 (2021).
- Bell, C. M., Zack, D. J., Berlinicke, C. A. Human organoids for the study of retinal development and disease. Annual Reviews of Vision Science. 6, 91-114 (2020).
- Mills, S. A., et al. Fractalkine-induced microglial vasoregulation occurs within the retina and is altered early in diabetic retinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (51), 2112561118 (2021).
- Louie, H. H., et al. Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. 202, 108384 (2021).
- Wu, X., Yan, N., Zhang, M. Retinal degeneration: Molecular mechanisms and therapeutic strategies. Current Medicinal Chemistry. 29 (40), 6125-6140 (2021).
- Armento, A., et al. Complement factor H loss in RPE cells causes retinal degeneration in a human RPE-porcine retinal explant co-culture model. Biomolecules. 11 (11), 1621 (2021).
- Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina. Clinical & Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).
- Pattamatta, U., McPherson, Z., White, A. A mouse retinal explant model for use in studying neuroprotection in glaucoma. Experimental Eye Research. 151, 38-44 (2016).
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
- Alarautalahti, V., et al. Viability of mouse retinal explant cultures assessed by preservation of functionality and morphology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (6), 1914-1927 (2019).
- Smedowski, A., et al. FluoroGold-labeled organotypic retinal explant culture for neurotoxicity screening studies. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 2487473 (2018).
- Bull, N. D., et al. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3309-3320 (2011).
- Beeson, C., et al. Small molecules that protect mitochondrial function from metabolic stress decelerate loss of photoreceptor cells in murine retinal degeneration models. Advances in Experimental Medicine and Biology. 854, 449-454 (2016).
- Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nature Protocols. 5 (10), 1659-1665 (2010).
- Muller, B. Organotypic culture of adult mouse retina. Methods in Molecular Biology. 1940, 181-191 (2019).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
- Garcia-Cabezas, M. A., John, Y. J., Barbas, H., Zikopoulos, B. Distinction of neurons, glia and endothelial cells in the cerebral cortex: An algorithm based on cytological features. Frontiers in Neuroanatomy. 10, 107 (2016).
- Elmasry, K., et al. Role of endoplasmic reticulum stress in 12/15-lipoxygenase-induced retinal microvascular dysfunction in a mouse model of diabetic retinopathy. Diabetologia. 61 (5), 1220-1232 (2018).
- Elmasry, K., et al. Epigenetic modifications in hyperhomocysteinemia: Potential role in diabetic retinopathy and age-related macular degeneration. Oncotarget. 9 (16), 12562-12590 (2018).
- Al-Shabrawey, M., et al. Role of NADPH oxidase and Stat3 in statin-mediated protection against diabetic retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (7), 3231-3238 (2008).
- Al-Shabrawey, M., et al. Increased expression and activity of 12-lipoxygenase in oxygen-induced ischemic retinopathy and proliferative diabetic retinopathy: Implications in retinal neovascularization. Diabetes. 60 (2), 614-624 (2011).
- Hussein, K. A., et al. Bone morphogenetic protein 2: A potential new player in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. 125, 79-88 (2014).
- Ibrahim, A. S., et al. Pigment epithelium-derived factor inhibits retinal microvascular dysfunction induced by 12/15-lipoxygenase-derived eicosanoids. Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (3), 290-298 (2015).
- Belhadj, S., et al. Long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (165), e61868 (2020).
- Kuo, C. Y. J., Louie, H. H., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. Characterization of a novel human organotypic retinal culture technique. Journal of Visualized Experiments. (172), e62046 (2021).
- Sawamiphak, S., et al. Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis. Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).
- Curatola, A. M., Moscatelli, D., Norris, A., Hendricks-Munoz, K. Retinal blood vessels develop in response to local VEGF-A signals in the absence of blood flow. Experimental Eye Research. 81 (2), 147-158 (2005).
- Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (5), 2347-2355 (2010).
- DeNiro, M., Alsmadi, O., Al-Mohanna, F. Modulating the hypoxia-inducible factor signaling pathway as a therapeutic modality to regulate retinal angiogenesis. Experimental Eye Research. 89 (5), 700-717 (2009).
- Murakami, T., et al. Time-lapse imaging of vitreoretinal angiogenesis originating from both quiescent and mature vessels in a novel ex vivo system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5529-5536 (2006).
- Unoki, N., et al. SDF-1/CXCR4 contributes to the activation of tip cells and microglia in retinal angiogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (7), 3362-3371 (2010).
- Knott, R. M., et al. A model system for the study of human retinal angiogenesis: activation of monocytes and endothelial cells and the association with the expression of the monocarboxylate transporter type 1 (MCT-1). Diabetologia. 42 (7), 870-877 (1999).
- Im, E., Venkatakrishnan, A., Kazlauskas, A. Cathepsin B regulates the intrinsic angiogenic threshold of endothelial cells. Molecular Biology of the Cell. 16 (8), 3488-3500 (2005).
- Shafiee, A., et al. Inhibition of retinal angiogenesis by peptides derived from thrombospondin-1. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (8), 2378-2388 (2000).
- Brown, K. C., et al. MG624, an α7-nAChR antagonist, inhibits angiogenesis via the Egr-1/FGF2 pathway. Angiogenesis. 15 (1), 99-114 (2012).
- Rezzola, S., et al. A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay. Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).
- Liu, D., et al. Overexpression of BMP4 protects retinal ganglion cells in a mouse model of experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 210, 108728 (2021).
- Januschowski, K., et al. Ex vivo biophysical characterization of a hydrogel-based artificial vitreous substitute. PLoS One. 14 (1), 0209217 (2019).
- Tolmachova, T., et al. Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo. Journal of Molecular Medicine. 91 (7), 825-837 (2013).
- Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Research. 101, 108-117 (2014).
- Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52855 (2015).
- Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: Performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 (21), 4821-4842 (2020).
- Kaikkonen, O., Turunen, T. T., Meller, A., Ahlgren, J., Koskelainen, A. Retinal temperature determination based on photopic porcine electroretinogram. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (2), 991-1002 (2022).
- Gospe, S. M., et al. 3rd al. Photoreceptors in a mouse model of Leigh syndrome are capable of normal light-evoked signaling. Journal of Biological Chemistry. 294 (33), 12432-12443 (2019).
- Calbiague, V. M., Vielma, A. H., Cadiz, B., Paquet-Durand, F., Schmachtenberg, O. Physiological assessment of high glucose neurotoxicity in mouse and rat retinal explants. Journal of Comparative Neurology. 528 (6), 989-1002 (2020).
