Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

التحقيق في دوافع مكافحة المكافأة في سلوك الإدمان باستخدام طرق التعبير الجيني أحادي الخلية المحددة تشريحيا

Published: August 4, 2022 doi: 10.3791/64014
Automatic Translation
*1,2,3, *1, 1, 1
1Daniel Baugh Institute for Functional Genomics and Computational Biology, Department of Pathology, Anatomy, and Cell Biology, Thomas Jefferson University, 2Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 3Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

يوفر الجمع بين التشريح المجهري لالتقاط الليزر و RT-qPCR الموائع الدقيقة خصوصية تشريحية وتقنية حيوية في قياس النسخ في الخلايا العصبية المفردة والدبقية. قد يؤدي تطبيق الأساليب الإبداعية مع نهج بيولوجيا النظام للأمراض النفسية إلى اختراقات في الفهم والعلاج مثل فرضية الالتهاب العصبي المضادة للمكافأة في الإدمان.

Abstract

حفزت المعدلات المتزايدة لسلوك الإدمان الباحثين في مجال الصحة العقلية والأطباء على حد سواء على فهم مكافحة المكافأة والتعافي. هذا التحول بعيدا عن المكافأة والبدء يتطلب وجهات نظر ونماذج وفرضيات جديدة جنبا إلى جنب مع توسيع الأساليب المطبقة للتحقيق في الإدمان. هنا ، نقدم مثالا: نهج بيولوجيا الأنظمة للتحقيق في المكافأة المضادة التي تجمع بين التشريح المجهري لالتقاط الليزر (LCM) وتفاعلات سلسلة البوليميراز الكمية عالية الإنتاجية للنسخ العكسي للميكروفلويد (RT-qPCR). تم قياس ديناميكيات شبكة التعبير الجيني وتم تحديد المحرك الرئيسي لخلل التنظيم العصبي الحشوي في انسحاب الكحول والمواد الأفيونية ، التهاب الأعصاب. يوفر هذا المزيج من التقنيات خصوصية تشريحية ومظهرية بدقة خلية واحدة مع حساسية عالية الإنتاجية ومقاييس تعبير جيني محددة تسفر عن مجموعات بيانات مولدة للفرضيات وإمكانيات ميكانيكية تولد فرصا لرؤى وعلاجات جديدة.

Introduction

لا يزال الإدمان يمثل تحديا متزايدا في العالم المتقدم 1,2. على الرغم من التقدم العلمي والسريري الكبير ، تستمر معدلات الإدمان في الزيادة بينما تظل فعالية العلاجات المعمول بها مستقرة في أحسن الأحوال3،4،5. ومع ذلك ، فقد أدى التقدم في التكنولوجيا الحيوية والنهج العلمية إلى طرق وفرضيات جديدة لمزيد من التحقيق في الفيزيولوجيا المرضية للاعتماد على المواد6،7،8. في الواقع ، تشير التطورات الأخيرة إلى أن المفاهيم الجديدة ونماذج العلاج قد تؤدي إلى اختراقات ذات عواقب اجتماعية واقتصادية وسياسية9،10،11،12.

لقد حققنا في مكافحة المكافأة في سحب الكحول والاعتماد على المواد الأفيونية13،14،15،16. الأساليب أساسية لهذا النموذج17,18. يمكن للتشريح المجهري للالتقاط بالليزر (LCM) اختيار خلايا مفردة ذات خصوصية تشريحية عالية. هذه الوظيفة جزء لا يتجزأ من فرضية antireward للالتهاب العصبي حيث يمكن جمع وتحليل كل من الخلايا الدبقية والخلايا العصبية من نفس النواة العصبية في نفس الحيوان13،14،15،16،19. يمكن بعد ذلك قياس جزء ذي صلة من نسخ الخلايا المختارة باستخدام تفاعلات البوليميراز الكمية عالية الإنتاجية (RT-qPCR) التي توفر مجموعات بيانات عالية الأبعاد للتحليل الحسابي مما يؤدي إلى رؤى حول الشبكات الوظيفية20،21.

يؤدي قياس مجموعة فرعية من النسخ في الخلايا العصبية والدبقية في نواة دماغية معينة إلى إنشاء مجموعة بيانات قوية في كل من عدد العينات والجينات المقاسة وهي حساسة ومحددة. هذه الأدوات هي الأمثل لنهج علم الأعصاب في النظام للأمراض النفسية لأن الخلايا الدبقية ، وخاصة الخلايا النجمية والدبقية الصغيرة ، أظهرت دورا مركزيا في الأمراض العصبية والنفسية على مدى العقد الماضي22,23. يمكن لنهجنا قياس الاستجابة التعبيرية للخلايا الدبقية والخلايا العصبية بشكل متزامن عبر العديد من المستقبلات والروابط المشاركة في إشارات paracrine المحلية. في الواقع ، يمكن استنتاج الإشارات من مجموعات البيانات هذه باستخدام طرق كمية مختلفة مثل المنطق الضبابي24. علاوة على ذلك ، يمكن أن يوفر تحديد الأنماط الفرعية الخلوية في الخلايا العصبية أو الدبقية ووظيفتها نظرة ثاقبة حول كيفية تنظيم خلايا الدماغ في نوى معينة والاستجابة لها واختلالها على مستوى الخلية الواحدة. يمكن أيضا نمذجة ديناميكيات هذا النظام الوظيفي باستخدام تجارب السلاسل الزمنية16. أخيرا ، يمكن إزعاج النماذج الحيوانية تشريحيا أو دوائيا لإضفاء حالة ميكانيكية على نهج هذا النظام.

تجربة تمثيلية:
أدناه ، نقدم مثالا على تطبيق هذه الأساليب. بحثت هذه الدراسة في التعبير الجيني للخلايا العصبية والدبقية الصغيرة في النواة الانفرادية (NTS) استجابة لإدمان الكحول والانسحاب اللاحق16. تتألف مجموعات الفئران من 1) التحكم ، 2) المعتمد على الإيثانول (EtOH) ، 3) سحب 8 ساعات (Wd) ، 4) 32 ساعة Wd ، و 5) 176 ساعة Wd (الشكل 1 أ). بعد قطع الرأس السريع ، تم فصل سيقان الدماغ عن الدماغ الأمامي وتشريحها بالتبريد ، وتم تلطيخ الشرائح للخلايا العصبية الإيجابية للتيروزين هيدروكسيلاز (TH +) والخلايا الدبقية الصغيرة (الشكل 1 ب). تم استخدام LCM لجمع كل من TH + و TH- الخلايا العصبية والدبقية الصغيرة. كانت جميع الخلايا من NTS وتم تحليلها كعينات من تجمعات 10 خلايا. تم تشغيل أربع صفائف ديناميكية RT-qPCR 96 × 96 على منصة RT-qPCR بقياس 65 جينا (الشكل 1B-C). تمت تسوية البيانات باستخدام طريقة -ΔΔCt وتحليلها باستخدام R ، وتم التحقق من صحة اختيار الخلية الواحدة باستخدام العلامات الجزيئية (الشكل 1D-E). تم التحقق من التحقق الفني بشكل أكبر من خلال النسخ المتماثلة التقنية التي تم تحليلها داخل دفعة واحدة وعبر الدفعات (الشكل 2 والشكل 3). تم تنظيم الخلايا العصبية TH + و TH في أنماط ظاهرية فرعية مختلفة مع مجموعات جينية التهابية متشابهة ولكنها تختلف عن مجموعات مستقبلات حمض γ-aminobutyric (GABA) (R) (الشكل 4 والشكل 5). كانت الأنماط الظاهرية الفرعية التي كان لها تعبير مرتفع عن مجموعات الجينات الالتهابية ممثلة تمثيلا زائدا عند 32 ساعة Wd بينما ظل تعبير مستقبلات GABA (GABAR) منخفضا في انسحاب الكحول المطول (176 ساعة Wd). يساهم هذا العمل في فرضية مكافحة المكافأة للاعتماد على الكحول والمواد الأفيونية التي تخمن أن ردود الفعل الاعتراضية من الأحشاء في الانسحاب تساهم في عدم تنظيم النوى العصبية الحشوية والعاطفية (أي NTS واللوزة) مما يؤدي إلى عقابيل أكثر حدة لا إرادية وعاطفية ، والتي تساهم في الاعتماد على المواد (الشكل 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت هذه الدراسة وفقا لتوصيات لجنة رعاية واستخدام الحيوان (IACUC) بجامعة توماس جيفرسون. تمت الموافقة على البروتوكول من قبل جامعة توماس جيفرسون IACUC.

1. نموذج الحيوان

  1. منزل ذكر Sprague Dawley (>120 جم ، هارلان ، إنديانابوليس ، إنديانا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ثلاثة توائم الفئران بشكل فردي مع حرية الوصول إلى الإيثانول تشاو (2 الفئران) أو خليط التحكم تشاو (1 فأر).
    ملاحظة: استخدمت هذه التجربة التمثيلية بروتوكول ليبر ديكارلي لدراسة البيولوجيا العصبية لانسحاب الكحول25,26. تتكون ثلاثة توائم من الفئران من مجموعة من ثلاثة فئران يتم تغذيتها بنفس العدد من السعرات الحرارية ولكن ينتهي بها الأمر في أذرع مختلفة من الدراسة عند التضحية. الأذرع الثلاثة لهذه الدراسة هي: 1) التحكم ، 2) الاعتماد على الإيثانول (EtOH) ، و 3) الانسحاب (Wd) (الشكل 1 أ). هناك خمسة شروط إجمالية في هذه الدراسة حيث توجد ثلاث نقاط زمنية لانسحاب الكحول (الشكل 1 أ).
    1. كل يوم ، قم بقياس خليط الإيثانول وتشاو الذي يستهلكه فأر Wd واستبدل الكمية المستهلكة بنفس الكمية من خليط الإيثانول إلى وحدة تغذية الفئران EtOH. أضف الكمية المكافئة من السعرات الحرارية من خليط التحكم إلى وحدة تغذية فأر التحكم.
      ملاحظة: يبلغ متوسط استهلاك الإيثانول اليومي حوالي 12-16 جم / كجم بعد 3 أسابيع26.
    2. بعد استهلاك الإيثانول المستقر على المدى الطويل والاعتماد عليه (>5 أسابيع) ، حث على انسحاب الكحول الحاد في فئران Wd عن طريق إفراغ حاوية الطعام الخاصة به وتعبئتها بخليط التحكم. قم بإجراء ذلك بطريقة يتم فيها التضحية بجميع الفئران الثلاثة في نفس النقطة الزمنيةاليومية 21.
    3. في النقطة الزمنية المختارة مسبقا ، ضحي بجميع الفئران الثلاثة في الثلاثي في نفس النقطة الزمنية (Control و EtOH و Wd).

2. حصاد العينة

  1. حصاد الدماغ في نفس النقطة الزمنية اليومية لكل ثلاثة أضعاف الفئران في نقطة زمنية Wd المناسبة (8 ساعات ، 32 ساعة ، 176 ساعة).
    1. تحضير حمام الميثانول والثلج الجاف للتبريد السريع للأنسجة الطازجة للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. وضعت على الجانب.
    2. ضع الجرذ في خزان إيزوفلوران (5٪ في الأكسجين) لمدة ~ 30 ثانية أو حتى يحدث فقدان الوعي ، كما يتضح من انخفاض معدل التنفس وغياب النشاط الحركي. ضع رأس الجرذ في مقصلة حادة بشكل صحيح لقطع الرأس بسرعة.
    3. افتح جمجمة الحيوان لتشريح الدماغ باستخدام الملقط. قم بإزالة المخيخ من الدماغ الطازج باستخدام ماكينة حلاقة محمولة باليد عن طريق تقطيعه بشكل كبير والتخلص منه. عن طريق شق عرضي ، قم بتقطيع جذع الدماغ من الدماغ الأمامي.
      ملاحظة: يمكن استخدام ماكينة حلاقة محمولة باليد بشكل أكبر لتقسيم الدماغ الأمامي أو جذع الدماغ إلى نصفي الكرة الأيسر والأيمن وفقا للتصميم التجريبي. على سبيل المثال ، للتحقق من صحة النتائج من نصف الكرة الأرضية بطرق مختلفة ، تحقق من الاختلاف بين اليسار واليمين ، أو قم بزيادة عدد العينة.
    4. أضف درجة حرارة القطع المثلى (O.C.T.) متوسطة إلى عمق 3-4 سم تقريبا في قالب تضمين الأنسجة بحيث يمكن غمر عينة الأنسجة بالكامل. ضع الأنسجة والدماغ الأمامي و / أو جذع الدماغ في قالب تضمين الأنسجة وأضف المزيد من O.C.T. لتغطية عينة الأنسجة بالكامل.
    5. أضف قالب تضمين الأنسجة البلاستيكية الذي يحتوي على عينة الأنسجة (الدماغ الأمامي للفئران) في حمام التبريد من الثلج الجاف والميثانول لتجميد عينة الأنسجة على الفور. اترك عينة الأنسجة في قالب التضمين تبقى في حمام التبريد حتى يكتمل جمع الأنسجة ولكن ليس أكثر من 15 دقيقة.
      ملاحظة: احرص على منع انسكاب الميثانول في حاوية المناديل.
    6. قم بتخزين عينات الأنسجة بسرعة عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يقيس الموائع الدقيقة RT-qPCR التعبير الجيني عن طريق تضخيم وقياس نسخ mRNA. هذه النصوص غير مستقرة نسبيا ، لذلك يتم اتخاذ العديد من الخطوات في هذه العملية للحفاظ على العينة باردة قدر الإمكان لمنع تدهور mRNA.

3. التشريح بالتبريد

ملاحظة: نوى الخلايا العصبية للفئران حوالي 10 ميكرومتر. وبالتالي ، فإن 10 ميكرومتر هو سمك الشريحة الأمثل لهذا النموذج الحيواني. يتم ضبط سمك الشريحة وفقا للنموذج الحيواني للدراسة.

  1. من الفريزر -80 درجة مئوية ، أخرج قالب تضمين الأنسجة الذي يحتوي على جذع الدماغ المجمد وقم بإذابة العينة عند -20 درجة مئوية في cryostat لمدة 5-10 دقائق. قم بإجراء هذا التجميد والذوبان إلى -20 درجة مئوية مرة واحدة فقط للحفاظ على mRNA.
  2. باستخدام ماكينة حلاقة محمولة باليد ، قم بقص زوايا قالب التضمين البلاستيكي عموديا. قم بإزالة جذع الدماغ المضمن في O.C.T. من قالب تضمين الأنسجة البلاستيكية. على ظرف المبردة المحددة عند -20 درجة مئوية ، استخدم سائل درجة حرارة الغرفة O.C.T. كغراء لتركيب جذع الدماغ في المنبر إلى الاتجاه الذيلي للتشريح الإكليلي.
  3. قطع 10 ميكرومتر من عمليات التجميد الإكليلية في المنبر إلى الاتجاه الذيلي من جذع دماغ الفئران حتى يتم الوصول إلى الأقسام التي تحتوي على المنطقة محل الاهتمام (NTS). يبلغ ارتفاع وعرض عمليات التجميد هذه ~ 200 مم بناء على أبعاد قالب التضمين البلاستيكي.
  4. اجمع عمليات التجميد التي تبلغ 10 ميكرومتر من أنسجة جذع الدماغ والتي تشمل NTS ، أو أي منطقة أخرى ذات أهمية بناء على الدراسة ، عن طريق تركيب الذوبان على شرائح زجاجية عادية بدرجة حرارة الغرفة. بسرعة ، ضع هذه الشرائح مع أقسام في وعاء معدني للتبريد يقع فوق الثلج الجاف. في أسرع وقت ممكن ، ضع شرائح زجاجية تحتوي على عمليات تجميد في الفريزر -80 درجة مئوية للتخزين.
    ملاحظة: يمكن أن تتسع شريحة زجاجية واحدة لعمليات تجميد متعددة 10 ميكرومتر حيث أن العرض والارتفاع ~ 200 مم. وبالتالي ، يمكن أن تحتوي نفس الشريحة على عمليات تجميد ملطخة لأنواع خلايا متميزة.
    1. عند وجود عدة أقسام على الشريحة ، تأكد من فصلها بمقدار 100 مم من المساحة الفارغة. لإنشاء حد بين عمليات التجميد ، استخدم قلما كارها للماء. هذا يسمح لحلول الأجسام المضادة المختلفة بتلطيخ أنواع مختلفة من الخلايا على نفس الشريحة الزجاجية. حافظ على مساحة 20 مم للتشريح بالتبريد من حافة الشريحة الزجاجية.

4. تلطيخ المناعي للخلايا المفردة

  1. استخدم بروتوكول التألق المناعي السريع على عمليات التجميد في الدماغ لتسمية أنواع خلايا الدماغ المرغوبة (الخلايا العصبية ، الخلايا الدبقية الصغيرة ، الخلايا النجمية ، إلخ) لجمعها باستخدام المضاعف المشترك الأصغر.
    ملاحظة: تم تصميم بروتوكول تلطيخ الكيمياء الهيستولوجية المناعية المستخدم في هذه التجارب ليكون سريعا لمنع تدهور mRNA الزائد خلال هذه العملية.
    1. من الفريزر -80 درجة مئوية ، أخرج شرائح زجاجية تحتوي على 10 ميكرومتر من التجميد لجذع دماغ الفئران الذي يحتوي على NTS. اغمس الشرائح لمدة 30 ثانية في حمام الإيثانول بنسبة 75٪ لإصلاح الأنسجة المقطوعة بالتبريد. إزالة السائل الزائد.
    2. على أنسجة جذع الدماغ الثابتة المقطعة بالتبريد ، ضع 2٪ من ألبومين مصل البقر (BSA) في محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) لمدة 30 ثانية لمنع الارتباط غير المستهدف للأجسام المضادة. بعد ذلك ، اغسل مع PBS.
    3. ضع كمية كافية من محلول الأجسام المضادة الأولية لتغطية الأنسجة المقطوعة بالتبريد (الآن ثابتة ومسدودة). احتضان قسم الأنسجة في محلول الأجسام المضادة الأولية لمدة 2 دقيقة. اغسل المنديل بمحلول BSA 2٪ مرة واحدة. يحتوي محلول الأجسام المضادة الأساسي على 96٪ من محلول BSA-PBS للحجب ، و 3٪ من الأجسام المضادة الأولية ، ومثبط RNase 1٪. تم تخفيف الجسم المضاد الأولي بنسبة 1:25.
      ملاحظة: في هذه التجربة التمثيلية ، تتكون الأجسام المضادة الأولية من جسم مضاد ل NeuN وجسم مضاد مضاد ل Cd11β. تم تقسيم الخلايا العصبية أيضا إلى مجموعات فرعية TH + و TH ، لذلك احتوت محاليل الأجسام المضادة الأولية لتلطيخ الخلايا العصبية على 93٪ من محلول BSA PBS ، و 3٪ من الأجسام المضادة ل NeuN ، و 3٪ من الأجسام المضادة لهيدروكسيلاز التيروزين ، و 1٪ RNase Out.
    4. ضع كمية كافية من محلول الأجسام المضادة الثانوية (1: 200) لتغطية أنسجة جذع الدماغ. دع محلول الأجسام المضادة الثانوي يستحم الأنسجة. بعد 3 دقائق ، اغسل المنديل بمحلول BSA 2٪ مرة واحدة.
      ملاحظة: يتكون المحلول الذي يحتوي على الجسم المضاد الثانوي من 196.5 ميكرولتر من 2٪ BSA ، و 1 ميكرولتر من علامة الفلورسنت المضادة للفأر الماعز 555 نانومتر لنوع الخلية ، و 1 ميكرولتر حمار مضاد للأرانب Alexa 488 نانومتر لتلطيخ TH ، ومثبط RNase 2.5 ميكرولتر ، و 1.3 ميكرولتر من DAPI (1: 10000).

5. سلسلة تجفيف أنسجة الإيثانول والزيلين القياسية

  1. ضع الشرائح الزجاجية التي ترتكز عليها الأنسجة الملطخة بالتبريد في حمام إيثانول بنسبة 75٪ لمدة 30 ثانية ، متبوعا بوضعها في حمام إيثانول بنسبة 95٪ لمدة 30 ثانية ، وحمام إيثانول بنسبة 100٪ لمدة 30 ثانية ، وأخيرا إيثانول 100٪ لمدة 30 ثانية (في حاوية ثانية).
  2. بعد الانتهاء من سلسلة تجفيف الإيثانول ، صب حمامين جديدين 100٪ زيلين. ثم ضع الشرائح الزجاجية في حمام الزيلين الأول لمدة 1 دقيقة. قم بإزالة الشرائح بسرعة ووضعها في حمام الزيلين الطازج الآخر لمدة 4 دقائق.
  3. خذ شرائح زجاجية تحتوي على تشريح الأنسجة الملطخة والمجففة من الزيلين وضعها في وعاء مظلم ولكن جيد التهوية لمدة 5 دقائق حتى يجف في الهواء. بعد التجفيف بالهواء ، ضع الشرائح الزجاجية في مجفف لمدة 5 دقائق للتجفيف النهائي.

6. حدد خلايا مفردة باستخدام تشريح مجهري لالتقاط الليزر (LCM)

  1. أدخل شريحة زجاجية تحتوي على عمليات تجميد الأنسجة الملونة والثابتة والمجففة في حامل عينة مجهر LCM. استخدم المعالم التشريحية لتحديد المنطقة محل الاهتمام التي سيتم منها جمع الخلايا (NTS في هذا المثال التمثيلي).
  2. قم بتشغيل مضان المجهر وابحث عن نوع (أنواع) الخلايا الملطخة التي تهمك. تأكد من أن نواة الخلية المرغوبة في المنطقة محل الاهتمام ومعزولة عن نوى الخلايا الأخرى بمسافة >3 مم. حدد وسم خلية واحدة (إذا كانت التجربة حقيقية خلية واحدة) أو خلايا متعددة (إذا كانت التجربة تستدعي عينات مجمعة أحادية الخلية [أي مقياس خلية واحدة] كما هو موضح في هذه التجربة التمثيلية) لجمعها باستخدام برنامج LCM.
    ملاحظة: تم استخدام العينات المكونة من 10 خلايا في هذه التجربة التمثيلية. يتم ذلك لتقليل تباين التعبير الجيني بين العينات وزيادة عدد الخلايا المفردة التي تم تحليلها ، على الرغم من أن هذا لا يزال تجربة على نطاق خلية واحدة. يمكن إكمال تجارب الخلية الواحدة الحقيقية بهذه الطريقة20,27. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا اختيار أقسام الأنسجة الأكبر21.
  3. بعد تحديد الخلايا المطلوبة ، استخدم ذراع الروبوت LCM ، ضع غطاء LCM على المنطقة محل الاهتمام على تشريح الأنسجة المحدد.
  4. معايرة شدة واستهداف ليزر الأشعة تحت الحمراء (IR) باستخدام لقطات الاختبار.
    ملاحظة: يتم ذلك لكل عينة. يجب إجراء المعايرة على جزء من الغطاء ليس فوق الأنسجة مباشرة حتى لا يتم اختيار الأنسجة غير التجريبية عن طريق الخطأ.
    1. لمعايرة الشدة ، اضبط مدة وقوة وحجم طلقة ليزر الأشعة تحت الحمراء بحيث تذوب اللقطة فقط لاصق الغطاء بما يكفي لتحديد نواة خلوية واحدة وتكون أيضا قوية بما يكفي لإذابة الغطاء إلى المقطع بالتبريد على الشريحة. ستكون هذه القيم مختلفة لكل غطاء.
    2. قم بمعايرة الاستهداف عن طريق تحديد موضع الشعيرات المتصالبة بالليزر بدقة حيث ذاب الليزر الغطاء.
  5. اجمع الخلايا التي تم تحديدها عن طريق إطلاق ليزر الأشعة تحت الحمراء LCM لإذابة الغطاء على الأنسجة المقطوعة بالتبريد فوق تلك الخلايا. تأكد من رفع الخلايا المختارة فقط من شريحة الأنسجة باستخدام ذراع الروبوت لتحديد موقع الغطاء إلى منطقة مراقبة الجودة (QC) في مجهر LCM. لإزالة أي خلايا زائدة على الغطاء ، استخدم ليزر الأشعة فوق البنفسجية (UV) لطمس المادة الوراثية للخلايا الإضافية.
  6. سجل الخصوصية التشريحية باستخدام كاميرا برنامج LCM. التقط صورة للأنسجة المقطعة بالتبريد التي أزيلت منها الخلية (الخلايا).
  7. استخدم أطلس تشريحي (أطلس الدماغ الأمامي للفئران في هذا المثال) لتحديد مسافة شريحة الأنسجة هذه من bregma وتسجيل هذه المعلومات على أنها مسافة Z28. حدد الموقع في المستوى X و / أو Y من الصورة لترجمة الخلية المحددة بالكامل.
  8. بأيدي قفاز ، قم بإزالة غطاء LCM من منطقة مراقبة الجودة. بعد ذلك ، اربط جهاز استخراج العينة بغطاء المضاعف المشترك الأصغر. استخدم ماصة لتطبيق 5.5 ميكرولتر من محلول التحلل على الخلية (الخلايا) المحددة. ويشار إلى ذلك الآن باسم العينة.
    ملاحظة: يتكون محلول المحلول المؤقت للتحلل من مخزن مؤقت لإعادة التعليق 5 ميكرولتر مع 0.5 ميكرولتر من محسن التحلل.
  9. قم بتركيب أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 مل على جهاز استخراج العينة المتصل بغطاء المضاعف المشترك الأصغر. ضع هذا الترتيب على لوح تسخين بدرجة حرارة 75 درجة مئوية مع العينة ومحلول التحلل بالقرب من اللوحة. دع العينة تسخن لمدة 15 دقيقة.
  10. استخدم جهاز طرد مركزي منخفض السرعة عند 0.01-0.02 × جم لتدوير العينة ومحلول التحلل في قاع أنبوب الطرد المركزي الدقيق 0.5 مل. قم بتخزين العينة في -80 درجة مئوية حتى qPCR الموائع الدقيقة.

7. قم بتشغيل شريحة qPCR على RT-qPCR الموائع الدقيقة على النظام الأساسي

  1. لقياس التعبير الجيني للعينات أحادية الخلية ، قم بإجراء تضخيم مسبق للحمض النووي الريبوزي المرسال كما هو موضح أدناه.
    ملاحظة: لا يتضمن البروتوكول استخراج mRNA لأن العينات عبارة عن خلايا مفردة تحتوي على كمية منخفضة جدا من الحمض النووي الريبي (10 pg) ، والتي ستفقد أثناء خطوة عزل mRNA. يتم تحليل الخلايا المفردة ومتابعتها مباشرة للنسخ العكسي لتقليل فقد العينة.
    1. قم بإنشاء مجموعة أولية عن طريق إضافة بادئات جين mRNA qPCR (للأمام والخلف) لكل جين يتم فحصه في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. تأكد من أن التركيز النهائي لكل برايمر هو 500 نانومتر. يتم سرد البادئات في تجربة المثال هذه في الجدول التكميلي 116.
    2. ماصة 1 ميكرولتر من مزيج تفاعل cDNA 5x في كل بئر من لوحة PCR 96 بئر.
    3. دع العينات أحادية الخلية تذوب لفترة وجيزة (2-3 دقائق) عن طريق إزالتها من الفريزر -80 درجة مئوية وتركها في درجة حرارة الغرفة. استخدم جهاز طرد مركزي منخفض السرعة عند 0.01-0.02 × جم لتدوير العينات لمدة 20-30 ثانية. ماصة 5.5 ميكرولتر من كل عينة أحادية الخلية إلى بئر مختلفة في لوحة PCR المكونة من 96 بئرا.
      ملاحظة: يتم تحديد رقم العينة والنوع المراد وضعها في كل بئر قبل البدء في هذه الخطوة.
    4. تحتوي لوحة تفاعل البوليميراز المتسلسل المكونة من 96 بئرا الآن على مزيج تفاعل cDNA وعينة أحادية الخلية تضاف إلى كل بئر. ضع هذه اللوحة في دراجة حرارية لمدة 1.5 دقيقة عند 65 درجة مئوية لتنشيط مزيج تفاعل cDNA. قم بتدوير المحتويات باستخدام الطرد المركزي عالي السرعة عند 1300 × جم لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية وضع لوحة PCR على الثلج الرطب.
    5. في كل بئر في لوحة PCR ، ماصة 0.12 ميكرولتر من بروتين T4 Gene 32 ، و 0.73 ميكرولتر من مخزن تعليق الحمض النووي ، و 0.15 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لتخليق cDNA 10x. قم بتشغيل لوحة PCR من خلال البروتوكول التالي في الدراج الحراري: 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، 55 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة ، 60 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، وتعليق نهائي عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: بروتين T4 Gene 32 (بروتين ربط DNA أحادي الشريط (ssDNA)) مطلوب لتكرار البكتيريا T4 وإصلاحها. تم استخدام بروتين T4 Gene 32 في خطوة النسخ العكسي للبروتوكول لتحسين إنتاجية وكفاءة النسخ العكسي وزيادة إنتاجية منتج PCR.
    6. في كل بئر في لوحة PCR ، ماصة 7.5 ميكرولتر من مزيج Taq polymerase الرئيسي. بعد ذلك ، في كل بئر ، ماصة 1.5 ميكرولتر من تجمع التمهيدي الذي تم إنشاؤه في الخطوة 7.1.1. قم بتشغيل لوحة PCR من خلال خطوة التضخيم المسبق الخطية التالية في الدراج الحراري: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ؛ 22 دورة من: 96 درجة مئوية لمدة 5 ثوان و 60 درجة مئوية لمدة 4 دقائق.
    7. في كل بئر في لوحة PCR ، ماصة 1.2 ميكرولتر من exonuclease I ، 4.2 ميكرولتر من مخزن تعليق الحمض النووي و 0.6 ميكرولتر من 10x exonuclease I تفاعل المخزن المؤقت. قم بتشغيل لوحة PCR من خلال البروتوكول التالي في العجلة الحرارية: 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: يحفز Exonuclease إزالة النيوكليوتيدات من الحمض النووي الخطي أحادي الشريط في اتجاه 3 إلى 5. نحن نستخدم exonuclease لتنظيف العينات لإزالة البادئات غير المدمجة وأي cDNA مفرد تقطعت به السبل قد يكون موجودا بعد التضخيم المسبق.
    8. في كل بئر في لوحة PCR ، ماصة 54 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE. استخدم جهاز طرد مركزي عالي السرعة بسرعة 1300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لتدوير محتويات لوحة تفاعل البوليميراز المتسلسل.
    9. إذا كنت تخطط لمواصلة المرحلة التالية من البروتوكول ، فقم بتبريد لوحة تفاعل البوليميراز المتسلسل عند 4 درجات مئوية. إذا كان هناك أكثر من 12 ساعة بين الانتهاء من مرحلة التضخيم المسبق وبدء qPCR الموائع الدقيقة ، فقم بتغطية لوحة qPCR وضعها في مجمد -20 درجة مئوية.
  2. اصنع لوحة العينة (لوحة PCR جديدة ذات 96 بئرا) لشريحة qPCR كما هو موضح أدناه.
    1. إذا تم وضع لوحة PCR قبل التضخيم من الخطوة 7.1 في مجمد -20 درجة مئوية ، فقم بإزالته واتركه يذوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    2. في لوحة PCR جديدة من 96 بئرا ، ماصة في كل بئر 4.55 ميكرولتر من PCR supermix منخفض rox و 0.45 ميكرولتر من صبغة ربط الحمض النووي 20x. بعد ذلك ، ماصة 3 ميكرولتر من العينة المضخمة مسبقا من لوحة PCR المصنوعة في الخطوة 7.1. استخدم الطرد المركزي عالي السرعة عند 1300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لتدوير لوحة PCR ووضع لوحة عينة PCR على الجليد.
  3. اصنع لوحة فحص (لوحة PCR جديدة ذات 96 بئرا) لشريحة qPCR كما هو موضح أدناه.
    1. في لوحة PCR جديدة من 96 بئرا ، ماصة في كل بئر 1.25 ميكرولتر من مخزن تعليق الحمض النووي و 3.75 ميكرولتر من كاشف تحميل الفحص 2x. ثم ماصة التمهيدي qPCR المقابلة في 2.5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر التمهيدي. استخدم جهاز طرد مركزي عالي السرعة بسرعة 1300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لتدوير لوحة PCR ووضع لوحة فحص PCR على الجليد.
  4. قم بإعداد شريحة qPCR للتحميل في منصة RT-qPCR الموائع الدقيقة كما هو موضح أدناه.
    ملاحظة: شريحة qPCR هي عبارة عن منصة qPCR في الوقت الفعلي تعمل على مبادئ الموائع الدقيقة. شريحة qPCR هي في الأساس مصفوفة من 96 قناة عينة و 96 قناة أولية ل RNA qPCR (أي المقايسات) التي تتقاطع في 9216 غرفة (96 × 96). يتم الجمع بين عينة ومقايسة محددة في كل غرفة من المصفوفة التي يحدث فيها تفاعل qPCR في الوقت الفعلي. يتم إنشاء القراءة كقيم دورة العتبة (Ct) ومخططات التضخيم للبادئات المستخدمة.
    1. حقن سائل خط التحكم في شريحة qPCR للتحضير. أدخل شريحة qPCR في جهاز خلط الموائع الدقيقة. حدد البرنامج النصي الأولي (136x) وقم بتشغيل هذا البرنامج.
    2. عند اكتمال البرنامج بعد ~ 45 دقيقة ، قم بإزالة شريحة qPCR المجهزة. في رقاقة qPCR المعدة ، ماصة 6 ميكرولتر من التفاعل من لوحة عينة PCR إلى العينة المقابلة جيدا في شريحة qPCR.
    3. في رقاقة qPCR المعدة ، ماصة 6 ميكرولتر من التفاعل من لوحة فحص PCR في بئر الفحص المقابل في شريحة qPCR.
      ملاحظة: قد تتشكل فقاعات الهواء في الجزء السفلي من العينة وآبار الفحص في رقاقة qPCR ، والتي يمكن أن تمنع المحاليل من دخول قنوات الموائع الدقيقة. يمكن استخدام إبرة حادة لفرقعة أو إزالة فقاعات الهواء هذه قبل إدخال شريحة qPCR في جهاز خلط الموائع الدقيقة.
    4. أدخل شريحة qPCR في جهاز خلط الموائع الدقيقة. حدد البرنامج النصي لمزيج التحميل (136x) وقم بتشغيل هذا البرنامج.
  5. قم بتحميل شريحة qPCR في منصة RT-qPCR الموائع الدقيقة.
    1. قم بتشغيل منصة RT-qPCR الموائع الدقيقة وقم بتسخين المصباح (~ 20 دقيقة). قم بإزالة شريحة qPCR من جهاز خلط الموائع الدقيقة. انزع الملصق الواقي من أسفل شريحة qPCR.
    2. افتح منصة RT-qPCR الموائع الدقيقة وقم بتحميل شريحة qPCR في منصة RT-qPCR الموائع الدقيقة. قم بتشغيل بروتوكول تفاعل البوليميراز المتسلسل السريع 96 × 96 (30 دورة) على منصة RT-qPCR الموائع الدقيقة.
    3. قم بتشغيل برنامج جمع البيانات - انقر فوق بدء تشغيل جديد.
    4. تحقق من الرمز الشريطي للرقاقة ونوع الشريحة وانقر فوق التالي. انقر فوق ملف Chip Run وتصفح موقع الملف لتخزين جمع البيانات.
    5. انقر فوق نوع التطبيق وحدد التعبير الجيني ؛ حدد ROX للمرجع السلبي ، وحدد مسبار واحد وحدد EvaGreen لنوع المسبار.
    6. انقر لتحديد برنامج الدراجات الحرارية وحدد Biomark HD: ملف GE Fast 96x96 PCR + Melt v2.pcl.

8. تحليل البيانات

  1. قم بتحميل البيانات من رقاقة qPCR إلى برنامج التحليل لمراقبة الجودة كما هو موضح أدناه.
    1. قم بتنزيل برنامج تحليل البيانات. يمكن العثور على هذا على الموقع التالي: https://www.fluidigm.com/products-services/software #. قم بتشغيل البرنامج لتحليل تجربة الموائع الدقيقة RT-qPCR.
    2. داخل البرنامج ، افتح Chip Run. ثم افتح الملف ChipRun.bml الذي تم إنشاؤه بواسطة التجربة. ستظهر نافذة تحتوي على التفاصيل التجريبية ، بما في ذلك المرجع السلبي والمسبار والبرنامج الحراري PCR.
      ملاحظة: يمكن إجراء مراقبة الجودة (QC) وتحليل البيانات على الكمبيوتر المتصل بمنصة RT-qPCR الموائع الدقيقة أو عن طريق نقل ملف .bml إلى كمبيوتر مختلف عبر محرك أقراص محمول أو وسائل أخرى.
  2. حدد نموذج الإعداد كما هو موضح أدناه.
    ملاحظة: تنشئ هذه الخطوة قالبا مسمى للعينات والمقايسات (بادئات qPCR) لمراقبة الجودة (QC) وإجراءات تحليل البيانات.
    1. حدد مستكشف الشرائح > إعداد لوحة العينة وقم بإنشاء لوحة عينة جديدة. حدد نوع الحاوية المناسب وتنسيق الحاوية (SBS96 للوحة 96 بئرا المستخدمة في هذه التجربة التمثيلية).
    2. الصق نماذج التسميات في جدول بيانات البرنامج وفقا للتصميم التجريبي وحدد خريطة من قائمة المهام. حدد SBS96-Left.dsp. يتم الآن تعيين نموذج الإعداد. حدد عرض التفاصيل > تحليل لتحديث هذه التغييرات في الملف.
      ملاحظة: لن يتم حفظ أي تغييرات تم إجراؤها في هذا البرنامج حتى يتم النقر فوق الزر تحليل .
  3. تحديد عينات التحكم في البرنامج. حدد الخلايا لعينات التحكم بالنقر بزر الماوس الأيسر مع الاستمرار أثناء السحب عبر الخلايا للتحديد. يمكن تحديد الخلايا الفردية بالضغط مع الاستمرار على مفتاح Ctrl والنقر فوق الخلايا الفردية. بالنسبة للعينات القياسية للحمض النووي الريبي (سلسلة التخفيف) ، أدخل اسم العينة وتركيز الحمض النووي الريبي المستخدم. انقر فوق تحليل للحفظ.
  4. حدد إعداد الكاشف على غرار الخطوة 8.2 أعلاه ولكن بأسماء مقايسة RT-qPCR ، أي أسماء الجينات التي تم فحصها. حدد إعداد لوحة الكاشف وقم بإنشاء لوحة فحص جديدة. حدد نوع الحاوية المناسبة وتنسيقها (SBS96 للوحة 96 بئرا). الصق أسماء الفحص حسب التصميم التجريبي وانقر فوق تحليل للحفظ.
  5. ابدأ عملية مراقبة جودة المستخدم (QC) كما هو موضح أدناه.
    ملاحظة: استخدمت هذه التجربة التمثيلية طريقة عتبة وقت الدورة (Ct). أي أن العينات التي لم تصل إلى إشارة عتبة محددة بواسطة البرنامج (تلقائي عالمي) أو يدويا (مستخدم عام) سيتم اعتبارها ردود فعل فاشلة وغير مدرجة في مجموعة البيانات.
    1. حدد طريقة عرض التحليل > إطار المهمة. في جزء إعدادات التحليل، قم بتغيير الإعدادات إلى تلقائي عمومي (يحسب تلقائيا عتبة يتم تطبيقها على الشريحة بأكملها) أو عمومي المستخدم. اضبط تصحيح خط الأساس على مشتق خطي. إذا تم استخدام User Global، فيجب تحديد حد الفشل يدويا كما هو الحال في التجربة التمثيلية.
    2. استخدمت هذه التجربة التمثيلية قاعدة مراقبة الجودة على النحو التالي: إذا كان معدل فشل الفحص أو العينة الفردية 70٪ أو أكثر ، فقد فشل هذا الصف أو العمود بأكمله في مجموعة البيانات.
    3. راجع يدويا كل تفاعل في شريحة 96 × 96. تصور منحنيات التضخيم ومنحنيات الذوبان لمعرفة ما إذا كان كل تفاعل يتبع نمط qPCR المتوقع. إذا كان منحنى التضخيم أو الذوبان لا يتطابق مع ما هو متوقع ، ففشل هذا التفاعل.
  6. بعد مراقبة الجودة ، قم بتصدير البيانات عن طريق تحديد ملف > تصدير وحفظ مجموعة البيانات كملف .csv.
  7. قم بتقليم مجموعة البيانات لأن ملف .csv المصدر يحتوي على مصفوفة Pass-Fail ومصفوفة بقيم Ct خام. استخدم مصفوفة Pass-Fail لاستبدال أي خلايا فاشلة في مجموعة البيانات ب NA.
  8. قم بتنزيل أحدث إصدار من برنامج R مفتوح المصدر ، ثم قم بتنزيل تطبيق R-Studio. قم بتحميل مجموعة البيانات التي تمت تسويتها إلى R. تحليل البيانات حسب ملاءمتها للدراسة.
  9. قم بتطبيع مجموعة البيانات باستخدام طريقة -ΔΔCt كما هو موضح أدناه.
    ملاحظة: يمكن استخدام التمركز الوسيط أو تطبيع الجينات في التدبير المنزلي عبر صف عينة لإنشاء قيمة -ΔCt . في التجربة التمثيلية ، تم استخدام التمركز الوسيط والتحقق من صحته عن طريق تطبيع الجينات في التدبير المنزلي. يمكن القيام بذلك بتنسيق .csv أو عن طريق التحميل إلى برنامج تحليل البيانات.
    1. بالنسبة للتمركز المتوسط، احسب متوسط قيمة Ct المحسوبة من جميع قيم Ct لعينة فردية (تجمع مكون من 10 خلايا). ثم اطرح جميع قيم Ct الفردية من هذه القيمة الوسيطة. ينتج عن هذا قيمة -ΔCt .
    2. لتطبيع جين التدبير المنزلي ، احسب متوسط التعبير عن جينات التدبير المنزلي (Actb و Gapdh و Ldha في التجربة التمثيلية) لكل عينة واستخدم هذه القيمة باعتبارها القيمة التي يمكن من خلالها طرح قيم Ct الفردية.
    3. لإنشاء قيمة -ΔΔC t ، خذ وسيط كل عمود فحص ، والذي يحتوي الآن على قيمة -ΔCt. اطرح وسيط الفحص من كل قيمة -ΔC t لإنتاج قيمة -ΔΔCt.
  10. احسب درجات z لكل قيمة -ΔΔCt باستخدام دالة المقياس في R. استخدم وظيفة الخريطة الحرارية R أو برنامج منفصل لإنشاء خريطة حرارية.
  11. استخدم دالة ارتباط بيرسون لحساب ارتباطات بيرسون بين كل جين. استخدم وظيفة الذوبان في R لتنظيم مجموعة البيانات للوظائف الأخرى. تصدير هذه البيانات وتحميلها في برنامج شبكة الارتباط الجيني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم إجراء التحقق من صحة مجموعة الخلية الواحدة بصريا أثناء إجراءات LCM. يتم تقييم نوى الخلية في محطة مراقبة الجودة. يمكن تحديد نوع الخلية عن طريق انبعاث الفلوروفور الموسوم لهذا النوع من الخلايا ومورفولوجيتها العامة. إذا تم اختيار خلايا غير مرغوب فيها على الغطاء ، فيمكن تدمير مادتها الوراثية باستخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية في محطة مراقبة الجودة. مزيد من التحقق من الصحة عن طريق التحليل الجزيئي ضروري أيضا. في هذا المثالالتمثيلي 16 ، تم اختيار نوعين من الخلايا العصبية - التيروزين هيدروكسيلاز (Th) الموجب (+) و Th السالب (-) ، بالإضافة إلى الخلايا الدبقية الصغيرة. يوضح الشكل 1D أن العينات التي من المفترض أن تكون خلايا عصبية أظهرت تعبيرا مرتفعا ذا دلالة إحصائية للعلامة العصبية ، NeuN. في الوقت نفسه ، كان للعينات الدبقية الصغيرة ارتفاع كبير في علامات الخلايا الدبقية الصغيرة ، CD34 و Cx3xr1 ، مما يشير إلى أن اختيار العينة تم إجراؤه بدقة عالية. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت عينات الخلايا العصبية Th + تعبيرا مرتفعا بشكل ملحوظ عن Th مقارنة بعينات الخلايا العصبية Th- وعينات الخلايا الدبقية الصغيرة بينما أظهرت الخلايا العصبية Th- تعبيرا مرتفعا بشكل ملحوظ عن GCG (جين ترميز preproglucagon) مما يشير إلى أن هذه العينات العصبية Th- غنية بالخلايا العصبية التي تستخدم GLP-1 كناقل عصبي (الشكل 1D ). أظهر مقياس حسابي أكثر عالمية يعرف باسم تحليل التمييز الخطي أن هذه الأنواع الثلاثة من الخلايا لها ملفات تعريف تعبير جيني مختلفة عبر جميع الجينات ال 65 المقاسة بالخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة التي تنفصل على طول المحور السيني و Th + و Th- عينات الخلايا العصبية التي تنقسم على طول المحور ص (الشكل 1 ه).

كما تم التحقق من جودة البيانات باستخدام مكررات تقنية داخل وبين الدفعات (الشكل 2 والشكل 3). يقوم التحكم داخل الدفعة بجودة البيانات من تلك الدفعة المحددة. إذا لم تتم محاذاة النسخ المتماثلة داخل الدفعة، فيمكن إجراء تجربة أخرى لرقاقة qPCR من نفس العينة ولوحات الفحص التي تم تصنيعها لتشغيل الدفعة الأولى. تضمن النسخ المتماثلة بين الدفعات إمكانية مقارنة البيانات من جميع الدفعات. هذا أمر بالغ الأهمية للتجارب التي يتم فيها فحص أعداد كبيرة من العينات التي تتطلب دفعات متعددة مثل هذا المثال التمثيلي. كان هناك قيمة شاذة واحدة في هذه التجربة كعينة 40 في الدفعة 4 (الشكل 3). ومع ذلك ، تمت محاذاة العينة 40 في الدفعات 1 و 2 و 3 بشكل صحيح ، والنسخ الأخرى من الدفعة 4 محاذاة مع الدفعات 1 و 2 و 3 مما يشير إلى أن هذا كان تفاعلا سيئا معزولا ، والذي حدث في هذا التكرار الواحد. تتطلب المقارنة عبر الدفعات أيضا تقنيات تطبيع البيانات المناسبة. استخدمت هذه التجربة التمركز الوسيط ، على الرغم من أن جينات التدبير المنزلي (Actb ، Gapdh ، Ldha) ، تم فحصها أيضا في هذه التجربة وكانت بمثابة عنصر تحكم لطريقة التمركز الوسيط. أي أن كلتا الطريقتين أسفرت عن مجموعات بيانات متشابهة للغاية مما يشير إلى جودة بيانات عالية.

يعرض الشكل 4 خريطة حرارية لعينات الخلايا العصبية المخصبة GLP-1 التي يتم تنظيمها حسب النمط الظاهري الخلوي. لا يوضح هذا الشكل أهمية الأنماط الفرعية الخلوية في البيولوجيا العصبية فحسب ، بل يوضح أيضا كيف تتغير نسب الأنماط الفرعية من خلال انسحاب الكحول. تظهر الخريطة الحرارية أن النمط الفرعي A ، الذي يعبر بشكل كبير عن مجموعة الجينات الالتهابية 1 ، يزداد في النسبة عند النقطة الزمنية 8 h Wd ويصل إلى الحد الأقصى عند 32 ساعة Wd. بحلول 176 ساعة Wd ، يعمل هذا النمط الفرعي الالتهابي على تطبيع انتشاره مرة أخرى للسيطرة عليه. يوضح النمط الفرعي B ، الذي يعبر بشكل كبير عن مجموعة جينات GABAR 2 ، قمعا شاملا في التعبير عن مجموعة الجينات هذه من خلال حالة 176 h Wd. توضح هذه النتائج كيف يصبح هذا النوع من الخلايا العصبية GLP-1 مفرط الاستثارة عن طريق زيادة الفينويب الالتهابي وتقليل مستوى التعبير عن GABARs في النمط الفرعي GABA في نفس الوقت أثناء انسحاب الكحول. يجمع الشكل 5 التعبير الجيني للعينات الفردية في متوسطات بحيث يمكن تصور التعبير عن مجموعات الجينات وموقع بروتين نسخة الجين هذه خلال السلسلة الزمنية.

Figure 1
الشكل 1: التصميم التجريبي واختيار الخلية الواحدة. (أ) تم تعيين ثلاثة توائم الفئران عشوائيا لأحد شروط العلاج الخمسة. (ب) توليد بيانات النسخ أحادية الخلية. (ج) تمثيل كرتوني للجينات التي تم فحصها ووظيفتها. لم يتم فحص الجينات باللون الأخضر. يتم استخدام رمز الجين الرسمي. د: التعبير الجيني لواسمات نوع الخلية. تظهر أشرطة الخطأ الخطأ القياسي. الخلايا العصبية مقارنة بالخلايا الدبقية الصغيرة ، قيم p = 0.0273 ، 3.94 × 10-10 ، 7.73 × 10-12 ، على التوالي. أظهرت الخلايا العصبية Th + تعبيرا مرتفعا عن Th مقارنة بالخلايا العصبية Th- (p = 4.56 x 10-11) والخلايا الدبقية الصغيرة (p = 2.95678 x 10-15). أظهرت الخلايا العصبية Th- تعبيرا مرتفعا عن GCG مقارنة بالخلايا العصبية Th + (p = 0.0106) والخلايا الدبقية الصغيرة (p = 0.0435) مما يشير إلى أنها خلايا عصبية GLP-1 +. * p < 0.05 ، ***p < 4 × 10-10. (ه) يظهر التحليل التمييزي الخطي لجميع العينات الفرق عبر جميع الجينات المقاسة بين أنواع الخلايا الثلاثة التي تم جمعها في فضاء ثنائي الأبعاد. المسافة المركزية بين الخلايا العصبية NE والخلايا العصبية GLP-1 = 3.30 ، الخلايا العصبية NE والخلايا الدبقية الصغيرة = 1.57 ، الخلايا العصبية GLP-1 والخلايا الدبقية الصغيرة = 2.92. تم تعديل هذا الرقم من O'Sullivan et al. 202116. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: مخططات النسخ المتماثل الفنية لقيم Ct الخام داخل دفعة. يعرض كل رسم بياني قيم Ct الخام للنسخ المتماثلة التقنية داخل الشريحة المرسومة ضد بعضها البعض مما يدل على السلامة التجريبية التقنية. تم تعديل هذا الرقم من O'Sullivan et al. 202116. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: مخططات تكرارية تقنية لقيم Ct الخام بين الدفعات. يعرض كل رسم بياني قيم Ct الخام للنسخ المتماثلة التقنية بين الشرائح المرسومة ضد بعضها البعض مما يدل على أن جميع الدفعات قابلة للمقارنة مع بعضها البعض. تم تعديل هذا الرقم من O'Sullivan et al. 202116. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: خريطة حرارية لعينات الخلايا العصبية المخصبة GLP-1. تعرض الخريطة الحرارية الأنماط الظاهرية الخلوية لعينات الخلايا العصبية المخصبة GLP-1 من خلال سلسلة زمنية لسحب الكحول. تمثل الصفوف عينات مجمعة مكونة من 10 خلايا مع مجموعات من النمط الفرعي الخلوي المسمى بأحرف كبيرة. تمثل الأعمدة درجة z لقيم التعبير الجيني -ΔΔCt على مقياس ألوان من -1 إلى +1 لهذا الجين في تلك العينة. يتم تصنيف مجموعات الجينات حسب الرقم. تم تعديل هذا الرقم من O'Sullivan et al. 202116. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: التعبير الجيني للنمط الفوقي في عينات الخلايا العصبية المخصبة GLP-1. تعرض المخططات الخلوية مربعات تمثل التعبير الجيني النسبي (متوسط درجة z لقيم -ΔΔCt ) للأنماط الظاهرية الفرعية الموضحة في خريطة التمثيل اللوني في الشكل 4. تم إنشاء المخططات باستخدام الإصدار 3.8.0 من Cytoscape وتم حساب درجات z باستخدام دالة المقياس في الإصدار R 3.5.2. -ΔΔCt تظهر الملصقات الموجودة على اليمين المربعات التي تتوافق مع الجين واللون الذي يمثل التعبير (الأزرق هو تعبير منخفض والأصفر هو تعبير مرتفع). يمثل موقع الصندوق توطين أو وظيفة ناتج البروتين من نسخة الجين هذه. تشير الأرقام الخضراء إلى مجموعات فرعية داخل الأنماط الظاهرية الفرعية. تم تعديل هذا الرقم من O'Sullivan et al. 202116. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 6
الشكل 6: الدائرة المبهمية البينية ، المحور العصبي الحشوي العاطفي ، ومخطط نموذج عملية الخصم للإدمان. (أ) تنقل الكائنات المبهمية الحسية حالة الأمعاء ، التي تتأثر بشدة بالميكروفلورا المعوية ، والأعضاء المحيطية الأخرى إلى النواة المسالك المنفردة (NTS). يتم نقل هذه المعلومات لاحقا إلى اللوزة وتؤثر على الحالات العاطفية. (ب) تمثيل كاريكاتوري مبسط يوضح الأدوار التكاملية للنواة القطعية المنفردة (NTS) والنواة المركزية للوزة (CeA) في العاطفة والإجهاد والتنظيم الذاتي. يتم تسليط الضوء على نوعين فرعيين من الخلايا العصبية ، GLP-1 و NE. يتم حذف العديد من الاتصالات التشريحية والوظيفية من أجل الوضوح. الاختصارات: NE = بافراز ؛ GLP-1 = الببتيد الشبيه بالجلوكاجون 1 ؛ GABA = حمض γ أمينوبتيريك ؛ محور HPA = محور الغدة النخامية الكظرية ؛ CRF = هرمون إفراز الكورتيكوتروبين. (ج) التعرض للكحول و / أو المواد الأفيونية له إجراءان: تحفيز المكافأة ، عبر مسار الدوبامين المتوسط ، وتثبيط مكافحة المكافأة. هذه الإجراءات تحفز تعاطي المخدرات عن طريق التعزيز الإيجابي. (د) انسحاب الكحول و / أو المواد الأفيونية له إجراءان: تثبيط المكافأة ، عن طريق تثبيط مسار الدوبامين المتوسط (غير موضح) وتحفيز مكافحة المكافأة. تقترح هذه الدراسة أن الالتهاب العصبي الحشوي العاطفي هو نقطة نهاية في التحفيز المضاد للمكافأة ، على الرغم من أن هذه الفرضية تستدعي مزيدا من الاختبارات. هذه الإجراءات ، مهما كانت الآلية ، تحفز الاعتماد على المواد عن طريق التعزيز السلبي. تم تعديل هذا الرقم من O'Sullivan et al. 202116. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول التكميلي 1: البادئات ل RT-qPCR الموائع الدقيقة. يتم سرد جميع أزواج التمهيدي لتضخيم mRNA جنبا إلى جنب مع طول amplicon التي يشكلها كل زوج التمهيدي. تم تعديل هذا الجدول من O'Sullivan et al. 202116. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لا يزال اضطراب تعاطي الكحول مرضا صعبا للعلاج. تعاملت مجموعتنا مع هذا الاضطراب من خلال التحقيق في العمليات المضادة للمكافأة من منظور علم الأعصاب للأنظمة. قمنا بقياس تغيرات التعبير الجيني في الخلايا العصبية NTS المفردة والخلايا الدبقية الصغيرة في سلسلة زمنية لانسحاب الكحول16. تم اختيار NTS لدوره البارز في خلل التنظيم اللاإرادي الذي يحدث في متلازمة انسحاب الكحول. نحن نجمع بين المضاعف المشترك الأصغر مع RT-qPCR أحادي الخلية مما يسمح بقياس أعداد قوية من العينات والجينات بتكلفة منخفضة مع حساسية وخصوصية تشريحية وجزيئية (الشكل 1B-C). تم تحديد الخلايا المفردة واختيارها بواسطة تلطيخ IHC ، وتم التحقق من صحة مجموعات النمط الفرعي الخلوي هذه بالتعبير الجزيئي (الشكل 1D-E). ومع ذلك ، فإن بعض العينات العصبية المخصبة GLP-1 (TH- الخلايا العصبية) عبرت بشكل معتدل عن Th (الشكل 4). تم إنشاء النمط الظاهري للخلية عند اختيار الخلية بناء على التصور الفلوري ، وتم استخدام هذا المعيار للدراسة كتجميع جزيئي يعتمد على التعبير عن جين واحد ، Th ، فشل في تحديد أنماط التعبير التي توحي بالنمط الظاهري الخلوي16. وبالتالي ، فإن النتائج تميز الأنماط الفرعية الدبقية والعصبية الرئيسية NTS وديناميكياتها في انسحاب الكحول.

تصف هذه المخطوطة طريقة لنسخ الخلية الواحدة ، ومن الضروري اتباع جميع الخطوات الواردة في البروتوكول كما هو موضح. قد تكون هناك حاجة إلى بعض التعديلات عند العمل مع أنسجة أعضاء أو أنواع خلايا مختلفة. أحد تحديات هذا البروتوكول هو الحفاظ على جودة الحمض النووي الريبي وسلامته خلال المضاعف المشترك الأصغر. لقد وضعنا بروتوكولات لتلطيخ IHC و LCM و RT-qPCR الموائع الدقيقة لمواجهة التحديات كما هو مفصل أعلاه. باختصار ، تتضمن هذه العمليات إضافة مثبط RNase إلى جميع محاليل التلوين لمنع تدهور الحمض النووي الريبي ، وبروتوكول تلطيخ سريع لمنع تدهور الحمض النووي الريبي المحتمل ، ومعالجة الشرائح ل LCM مباشرة بعد تلطيخ IHC والجفاف والحفاظ على ظروف البرد المناسبة كلما أمكن ذلك أثناء معالجة العينات أو نقلها.

يتم إجراء فحص النسخ على خلايا مفردة محللة بدون عزل الحمض النووي الريبي ، يليه النسخ العكسي ، والتضخيم المسبق ، و qPCR. تتمثل خطوة التضخيم المسبق في تضخيم جزيئات cDNA إلى مستويات يمكن اكتشافها ل qPCR بشكل انتقائي. هناك العديد من القيود على خطوة التضخيم المسبق. وتشمل هذه النسخ الجينية التي لا يمكن تضخيمها ، مما سيؤدي إلى عدم الكشف في RT-qPCR الموائع الدقيقة. هناك أيضا إمكانية تكوين ديمر التمهيدي حيث يحتوي تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل على جميع البادئات للفحص التجريبي. أي أن تكوين dimers مع تسلسل أمامي وعكسي لزوج تمهيدي واحد ومع جميع التسلسلات الأمامية والعكسية في التجربة أمر ممكن. وبالتالي ، ينصح بإجراء اختبار تمهيدي باستخدام التحكم التجريبي الإيجابي مثل معايير الحمض النووي الريبي.

يعد تصميم رقاقة RT-qPCR جانبا مهما آخر من هذا البروتوكول لمراقبة الجودة وتأثيرات الدفعات. تتكون الضوابط الإيجابية من الحمض النووي الريبي القياسي من الحيوان والعضو الذي يتم فحصه (دماغ الفئران في هذا المثال التمثيلي). يمكن بعد ذلك تحميل سلسلة تخفيف الحمض النووي الريبي في كل شريحة ويجب أن توضح الإشارة الكمية المناسبة لكل جين تم فحصه. يمكن استخدام الماء كعنصر تحكم سلبي. تعد عناصر التحكم هذه ضرورية للتطبيع السليم الذي يتحكم في تأثيرات الدفعات التي قد تحدث عند دمج البيانات من رقائق مختلفة. تمت مناقشة هذا بالتفصيل في الخطوة 8.

في التجربة التمثيلية الموضحة هنا ، تم تطبيق هذه الطرق لتوليد الفرضيات وتوفير نظرة ثاقبة للآلية الممكنة. تم إجراء الدراسة في سياق عمل آخر وتوفر معلومات مهمة لفرضية مكافحة المكافأة الاعتراضية13. باختصار ، يخمن هذا النموذج أن مضادات المكافأة يتم تحفيزها في انسحاب المادة عن طريق الإشارات البينية من المبهم عبر NTS إلى اللوزة وأن الركيزة الأولية لهذا المضاد للمكافأة هي التهاب عصبي (الشكل 6). يدعم هذا العمل هذه الفرضية من خلال تحديد التغيرات الالتهابية في التعبير الجيني في الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة عند انسحاب الكحول.

نقطة الضعف الرئيسية في هذه الدراسة هي افتقارها إلى الادعاءات الآلية. ومع ذلك ، يمكن استخدام هذه الطرق لتحديد آلية بعد إجراء تجربة أساسية مثل هذه التجربة. على سبيل المثال ، يمكن أن يظهر تدخل النموذج الحيواني أو الاضطرابات ، مثل بضع المبهم تحت الحجاب الحاجز أو خروج المغلوب الجيني ، آليات تشريحية أو وراثية لمنظمات الالتهابات. يمكن أن تساهم الدراسات المستقبلية التي تتبع هذا النهج في تطوير فرضية مكافحة المكافأة البينية ، والتي تهدف إلى تنفيذ هذه الأفكار في الممارسة السريرية لعلاج الإدمان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

تم تمويل العمل المقدم هنا من خلال NIH HLB U01 HL133360 الممنوحة ل JS و RV ، NIDA R21 DA036372 الممنوحة ل JS و EVB ، T32 AA-007463 الممنوحة ل Jan Hoek لدعم SJO'S ، والمعهد الوطني لإدمان الكحول وتعاطي الكحول: R01 AA018873.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20X DNA Binding Dye Fluidigm 100-7609 NA
2x GE Assay Loading Reagent Fluidigm 85000802-R NA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text) Fluidigm BMK-M-96.96 NA
Anti-Cd11β Antibody Genway Biotech CCEC48 Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60 EMD Millipore MAB377 Neuronal Stain
Anti-tyrosine hydroxylase antibody abcam ab112 Stain for TH+ neurons
ArcturusXT Laser Capture Microdissection System Arcturus NA NA
Biomark HD Fluidigm NA RT-qPCR platform
Bovine Serum Antigen Sigma-Aldrich B4287
CapSure Macro LCM Caps ThermoFisher Scientific  LCM0211 NA
CellDirect One-Step qRT-PCR Kit ThermoFisher Scientific 11753500 Lysis buffer solution components
CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer Kit ThermoFisher Scientific 11739010 Invitrogen
DAPI ThermoFisher Scientific 62248 Nucleus Stain
DNA Suspension Buffer TEKnova T0221
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific R37118 Seconadry Antibody
Exonuclease I New Englnad BioLabs, Inc. M0293S NA
ExtracSure Sample Extraction Device ThermoFisher Scientific LCM0208 NA
FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope Slides ThermoFisher Scientific 22-037-246 Plain glass slides
GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube ThermoFisher Scientific N8010611
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 ThermoFisher Scientific A28180 Seconadry Antibody
IFC Controller Fluidigm NA NA
RNaseOut ThermoFisher Scientific 10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox Bio-Rad PN 172-5211 NA
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit ThermoFisher Scientific 11754250 Contains VILO and SuperScript
T4 Gene 32 Protein New Englnad BioLabs, Inc. M0300S NA
TaqMan PreAmp Master Mix ThermoFisher Scientific 4391128 NA
TE Buffer TEKnova T0225 NA
TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mL USA Scientific 1402-9700 NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Substance Use and Mental Health Indicators in the United States: Results from the 2019 National Survey on Drug Use and Health. , Available from: https://www.samhsa.gov/data/ (2020).
  2. Prevalence of Serious Mental Illness (SMI). NIH. 49, Available from: https://www.nimh.nih.gov/health/statistics/mental-illness.shtml (2020).
  3. Mattick, R. P., Kimber, J., Breen, C., Davoli, M. Buprenorphine maintenance versus placebo or methadone maintenance for opioid dependence. Cochrane Database of Systematic Reviews. Mattick, R. P. , John Wiley & Sons, Ltd. (2008).
  4. Mattick, R. P., Breen, C., Kimber, J., Davoli, M. Methadone maintenance therapy versus no opioid replacement therapy for opioid dependence. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 2009 (3), (2009).
  5. Miller, P. M., Book, S. W., Stewart, S. H. Medical treatment of alcohol dependence: A systematic review. International Journal of Psychiatry in Medicine. 42 (3), 227-266 (2012).
  6. Holmes, E. A., et al. The Lancet Psychiatry Commission on psychological treatments research in tomorrow's science. The Lancet. Psychiatry. 5 (3), 237-286 (2018).
  7. Ford, C. L., Young, L. J. Translational opportunities for circuit-based social neuroscience: advancing 21st century psychiatry. Current Opinion in Neurobiology. 68, 1-8 (2021).
  8. Holmes, E. A., Craske, M. G., Graybiel, A. M. Psychological treatments: A call for mental-health science. Nature. 511 (7509), 287-289 (2014).
  9. Miranda, A., Taca, A. Neuromodulation with percutaneous electrical nerve field stimulation is associated with reduction in signs and symptoms of opioid withdrawal: a multisite, retrospective assessment. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 44 (1), 56-63 (2018).
  10. Metz, V. E., et al. Effects of ibudilast on the subjective, reinforcing, and analgesic effects of oxycodone in recently detoxified adults with opioid dependence. Neuropsychopharmacology. 42 (9), 1825-1832 (2017).
  11. Heinzerling, K. G., et al. placebo-controlled trial of targeting neuroinflammation with ibudilast to treat methamphetamine use disorder. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (2), 238-248 (2020).
  12. Bogenschutz, M. P., et al. Psilocybin-assisted treatment for alcohol dependence: A proof-of-concept study. Journal of Psychopharmacology. 29 (3), 289-299 (2015).
  13. O'Sullivan, S. J., Schwaber, J. S. Similarities in alcohol and opioid withdrawal syndromes suggest common negative reinforcement mechanisms involving the interoceptive antireward pathway. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 125, 355-364 (2021).
  14. O'Sullivan, S. J. Single-cell systems neuroscience: A growing frontier in mental illness. Biocell. 46 (1), 7-11 (2022).
  15. O'Sullivan, S. J., et al. Single-cell glia and neuron gene expression in the central amygdala in opioid withdrawal suggests inflammation with correlated gut dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
  16. O'Sullivan, S. J., McIntosh-Clarke, D., Park, J., Vadigepalli, R., Schwaber, J. S. Single cell scale neuronal and glial gene expression and putative cell phenotypes and networks in the nucleus tractus solitarius in an alcohol withdrawal time series. Frontiers in Systems Neuroscience. 15, 739790 (2021).
  17. O'Sullivan, S. J., Reyes, B. A. S., Vadigepalli, R., Van Bockstaele, E. J., Schwaber, J. S. Combining laser capture microdissection and microfluidic qpcr to analyze transcriptional profiles of single cells: A systems biology approach to opioid dependence. Journal of Visualized Experiments. (157), e60612 (2020).
  18. Achanta, S., Vadigepalli, R. Single cell high-throughput qRT-PCR protocol. Protocols.io. , (2020).
  19. O'Sullivan, S. J. The interoceptive antireward pathway and gut dysbiosis in addiction. Journal of Psychiatry, Depression & Anxiety. 7 (40), 1-5 (2021).
  20. Park, J., et al. Single-cell transcriptional analysis reveals novel neuronal phenotypes and interaction networks involved in the central circadian clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
  21. Staehle, M. M., et al. Diurnal patterns of gene expression in the dorsal vagal complex and the central nucleus of the amygdala - Non-rhythm-generating brain regions. Frontiers in Neuroscience. 14, 375 (2020).
  22. Réus, G. Z., et al. The role of inflammation and microglial activation in the pathophysiology of psychiatric disorders. Neuroscience. 300, 141-154 (2015).
  23. Zhang, X., et al. Role of astrocytes in major neuropsychiatric disorders. Neurochemical Research. 46 (10), 2715-2730 (2021).
  24. Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (1), 87-98 (2015).
  25. Lieber, C. S., DeCarli, L. M. An experimental model of alcohol feeding and liver injury in the baboon. Journal of Medical Primatology. 3 (3), 153-163 (1974).
  26. Lieber, C. S., Decarli, L. M. Animal models of chronic ethanol toxicity. Methods in Enzymology. 233, 585-594 (1994).
  27. Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24 (6), 930-941 (2014).
  28. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , Academic Press. Elsevier Inc. (1982).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 186 ، التعبير الجيني أحادي الخلية ، التشريح المجهري لالتقاط الليزر ، qPCR الموائع الدقيقة ، الإدمان ، المحور العصبي الحشوي العاطفي ، التهاب الأعصاب ، مضاد المكافأة
التحقيق في دوافع مكافحة المكافأة في سلوك الإدمان باستخدام طرق التعبير الجيني أحادي الخلية المحددة تشريحيا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

O'Sullivan, S. J., Srivastava, A.,… More

O'Sullivan, S. J., Srivastava, A., Vadigepalli, R., Schwaber, J. S. Investigating Drivers of Antireward in Addiction Behavior with Anatomically Specific Single-Cell Gene Expression Methods. J. Vis. Exp. (186), e64014, doi:10.3791/64014 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter