Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Undersøke drivere av antibelønning i avhengighetsadferd med anatomisk spesifikke enkeltcellede genuttrykksmetoder

Published: August 4, 2022 doi: 10.3791/64014
Automatic Translation
*1,2,3, *1, 1, 1
1Daniel Baugh Institute for Functional Genomics and Computational Biology, Department of Pathology, Anatomy, and Cell Biology, Thomas Jefferson University, 2Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 3Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Kombinasjonen av laserfangstmikrodisseksjon og mikrofluidisk RT-qPCR gir anatomisk og bioteknisk spesifisitet ved måling av transkriptomet i enkeltneuroner og glia. Bruk av kreative metoder med et systems biologiske tilnærming til psykiatrisk sykdom kan føre til gjennombrudd i forståelse og behandling som nevroinflammasjonsantibelønningshypotesen i avhengighet.

Abstract

Økende grad av avhengighetsadferd har motivert både psykiatriske forskere og klinikere til å forstå antireward og utvinning. Dette skiftet bort fra belønning og begynnelse krever nye perspektiver, paradigmer og hypoteser sammen med en utvidelse av metodene som brukes til å undersøke avhengighet. Her gir vi et eksempel: En systembiologisk tilnærming for å undersøke antibelønning som kombinerer laserfangstmikrodisseksjon (LCM) og høy gjennomstrømning mikrofluidisk revers transkripsjon kvantitative polymerasekjedereaksjoner (RT-qPCR). Genuttrykksnettverksdynamikk ble målt og en nøkkeldriver for nevrovisceral dysregulering i alkohol- og opioidabstinens, nevroinflammasjon, ble identifisert. Denne kombinasjonen av teknologier gir anatomisk og fenotypisk spesifisitet ved enkeltcelleoppløsning med høy gjennomstrømningsfølsomhet og spesifikke genuttrykkstiltak som gir både hypotesegenererende datasett og mekanistiske muligheter som genererer muligheter for ny innsikt og behandlinger.

Introduction

Avhengighet er fortsatt en økende utfordring i den utviklede verden 1,2. Til tross for store vitenskapelige og kliniske fremskritt, fortsetter avhengighetsgraden å øke, mens effekten av etablerte behandlinger forblir stabil i beste fall 3,4,5. Fremskritt innen bioteknologi og vitenskapelige tilnærminger har imidlertid ført til nye metoder og hypoteser for å undersøke patofysiologien til stoffavhengighet 6,7,8. Faktisk tyder den siste utviklingen på at nye konsepter og behandlingsparadigmer kan føre til gjennombrudd med sosiale, økonomiske og politiske konsekvenser 9,10,11,12.

Vi undersøkte antireward ved seponering av alkohol- og opioidavhengighet13,14,15,16. Metoder står sentralt i dette paradigmet17,18. Laser capture microdissection (LCM) kan velge enkeltceller med høy anatomisk spesifisitet. Denne funksjonaliteten er integrert i hypotesen om nevroinflammasjonsantibelønning, da både glia og nevroner kan samles inn og analyseres fra samme nevronale subnukleus i samme dyr 13,14,15,16,19. En relevant del av transkriptomet til utvalgte celler kan deretter måles med høy gjennomstrømning mikrofluidisk revers transkripsjon kvantitative polymerasekjedereaksjoner (RT-qPCR) som gir høydimensjonale datasett for beregningsanalyse som gir innsikt i funksjonelle nettverk20,21.

Måling av en delmengde av transkriptomet i nevroner og glia i en bestemt hjernekjerne genererer et datasett som er robust i både prøvenummer og gener målt og er følsomt og spesifikt. Disse verktøyene er optimale for et systems nevrovitenskapelige tilnærming til psykiatrisk sykdom fordi glia, hovedsakelig astrocytter og mikroglia, har vist en sentral rolle i nevrologisk og psykiatrisk sykdom det siste tiåret22,23. Vår tilnærming kan måle den ekspressive responsen av glia og nevroner samtidig på tvers av mange reseptorer og ligander involvert i lokal parakrin signalering. Faktisk kan signalering utledes fra disse datasettene ved hjelp av forskjellige kvantitative metoder som fuzzy logic24. Videre kan identifisering av cellulære subfenotyper i nevroner eller glia og deres funksjon gi innsikt i hvordan hjerneceller i bestemte kjerner organiserer, reagerer på og dysregulerer på enkeltcellenivå. Dynamikken i dette funksjonelle systemet kan også modelleres med tidsserieeksperimenter16. Til slutt kan dyremodeller forstyrres anatomisk eller farmakologisk for å gi en mekanistisk tilstand til dette systemets tilnærming.

Representativt eksperiment:
Nedenfor gir vi et eksempel på anvendelsen av disse metodene. Denne studien undersøkte rottenevron- og mikroglia-genuttrykk i den ensomme kjernen (NTS) som respons på alkoholavhengighet og påfølgende seponering16. Rottekohorter besto av 1) Kontroll, 2) Etanolavhengig (EtOH), 3) 8 timers uttak (Wd), 4) 32 t Wd og 5) 176 t Wd (figur 1A). Etter rask halshugging ble hjernestammene skilt fra forhjernen og kryoseksjonen, og skiver ble farget for tyrosinhydroksylasepositive (TH +) nevroner og mikroglia (figur 1B). LCM ble brukt til å samle både TH + og TH-nevroner og microglia. Alle cellene var fra NTS og analysert som prøver av 10-cellers bassenger. Fire 96 x 96 mikrofluidiske RT-qPCR dynamiske arrays ble kjørt på RT-qPCR-plattformen som måler 65 gener (figur 1B-C). Data ble normalisert ved hjelp av en -ΔΔCt-metode og analysert ved hjelp av R, og enkeltcelleseleksjon ble validert med molekylære markører (figur 1D-E). Teknisk validering ble videre verifisert av tekniske repliker analysert i en enkelt batch og på tvers av batcher (figur 2 og figur 3). TH+ og TH-nevroner organisert i forskjellige subfenotyper med lignende inflammatoriske genklynger, men forskjellige γ-aminosmørsyre (GABA) reseptorklynger (R) (figur 4 og figur 5). Subfenotyper som hadde forhøyet ekspresjon av inflammatoriske genklynger ble overrepresentert ved 32 timers Wd, mens GABA-reseptor (GABAR)-ekspresjon forble lav ved langvarig alkoholabstinens (176 timer Wd). Dette arbeidet bidrar til antibelønningshypotesen om alkohol- og opioidavhengighet, som formoder at interceptiv tilbakemelding fra innvollene i tilbaketrekning bidrar til dysreguleringen av viscerale-emosjonelle nevronkjerner (dvs. NTS og amygdala) som resulterer i mer alvorlige autonome og emosjonelle sekveler, noe som bidrar til rusavhengighet (figur 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne studien ble utført i samsvar med anbefalingene fra Animal Care and Use Committee (IACUC) fra Thomas Jefferson University. Protokollen ble godkjent av Thomas Jefferson University IACUC.

1. Dyr modell

  1. Hushann Sprague Dawley (>120 g, Harlan, Indianapolis, IN, USA) rottetrillinger individuelt med fri tilgang til etanol-chow (2 rotter) eller kontroll-chow-blanding (1 rotte).
    MERK: Dette representative eksperimentet benyttet Lieber-DeCarli-protokollen for å studere nevrobiologien til alkoholabstinens25,26. Rottetrillinger består av en trerottekohort som skal mates med samme antall kalorier, men ender opp i forskjellige armer av studien ved offer. De tre armene for denne studien er: 1) Kontroll, 2) Etanolavhengig (EtOH) og 3) Seponering (Wd) (figur 1A). Det er fem totale forhold i denne studien, da det er tre tidspunkter for alkoholabstinens (figur 1A).
    1. Annenhver dag måler du etanol-chow-blandingen som forbrukes av Wd-rotta og erstatter mengden som forbrukes med samme mengde etanolblanding til EtOH-rottemateren. Tilsett den ekvivalente kalorimengden kontrollblanding til materen til kontrollrotten.
      MERK: Gjennomsnittlig daglig etanolforbruk er rundt 12-16 g / kg etter 3 uker26.
    2. Etter stabilt langsiktig etanolforbruk og avhengighet (>5 uker), indusere akutt alkoholabstinens hos Wd rotte ved å tømme matbeholderen og fylle den med kontrollblanding. Utfør dette på en slik måte at alle tre rottene ofres på samme sirkadiske tidspunkt21.
    3. På det forhåndsvalgte tidspunktet ofrer du alle tre rottene i trillingen samtidig (Control, EtOH og Wd).

2. Prøvehøsting

  1. Høst hjernen på samme sirkadiske tidspunkt for hver rotte triplett på riktig Wd tidspunkt (8 t, 32 timer, 176 timer).
    1. Forbered et metanol- og tørrisbad for rask avkjøling av ferskt vev for å bevare RNA-integritet. Sett til siden.
    2. Sett rotten i isoflurantank (5% i oksygen) i ~ 30 s eller til bevissthetstap oppstår, som indikert av redusert respirasjonsfrekvens og fravær av motoraktivitet. Sett rottehodet i en riktig skjerpet giljotin for raskt å halshugge.
    3. Åpne dyrets hodeskalle for å dissekere ut hjernen ved hjelp av tang. Fjern lillehjernen fra den friske hjernen med en håndholdt barberhøvel ved grov skiver og kast den. Ved tverrgående snitt, skjær hjernestammen fra forhjernen.
      MERK: En håndholdt barberhøvel kan brukes videre til å hemi-sekt forhjernen eller hjernestammen i venstre og høyre halvkule i henhold til eksperimentell design. For eksempel, for å validere funn fra en halvkule med forskjellige metoder, undersøke venstre-høyre divergens eller øke prøvenummeret.
    4. Legg til optimal skjæretemperatur (O.C.T.) middels til ca. 3-4 cm dybde i vevsformen slik at vevsprøven kan senkes helt ned. Plasser vevet, forhjernen og/eller hjernestammen i vevsformen og tilsett mer O.C.T. for å dekke vevsprøven fullt ut.
    5. Tilsett plastvevets innebyggingsform som inneholder vevsprøven (rotteforhjernen) i kjølebadet med tørris og metanol for umiddelbart å fryse vevsprøven. La vevsprøven i den innebygde formen forbli i kjølebadet til vevssamlingen er fullført, men ikke lenger enn 15 minutter.
      MERK: Vær forsiktig så du forhindrer at metanol søler inn i vevbeholderen.
    6. Oppbevar vevsprøver raskt ved -80 °C.
      MERK: Mikrofluidisk RT-qPCR måler genuttrykk ved å forsterke og måle mRNA-transkripsjoner. Disse transkripsjonene er relativt ustabile, så mange skritt blir tatt i denne prosessen for å holde prøven så kald som mulig for å forhindre mRNA-nedbrytning.

3. Kryoseksjonering

MERK: En rotte nevronkjerner er ca. 10 μm. Dermed er 10 μm den optimale skivetykkelsen for denne dyremodellen. Skivetykkelsen justeres i henhold til dyremodellen for studien.

  1. Fra fryseren på -80 °C tar du ut vevsformen som inneholder frossen hjernestamme og tiner prøven ved -20 °C i kryostat i 5-10 minutter. Utfør denne fryse-tine til -20 ° C bare en gang for mRNA-bevaring.
  2. Med en håndholdt barberhøvel kutter du vertikalt hjørnene på plastformen. Fjern hjernestammen som er innebygd i O.C.T. fra plastvevets innebyggingsform. På bunnen av kryostat satt til -20 °C, bruk romtemperert væske O.C.T. som lim for å montere hjernestammen i rostral til kaudal retning for koronal kryoseksjonering.
  3. Klipp 10 μm koronale kryoseksjoner i rostral til kaudal retning fra rottehjernestammen til seksjoner som inneholder interesseområdet (NTS) er nådd. Høyden og bredden på disse kryoseksjonene er ~ 200 mm basert på dimensjonene til plastformen.
  4. Samle 10 μm kryoseksjoner av hjernestammevev som inkluderer NTS, eller annen region av interesse basert på studien, ved å tine montering på romtemperatur vanlig glass lysbilder. Plasser raskt disse lysbildene med seksjoner i en kjølemetallpanne som ligger på toppen av tørris. Så snart som mulig, plasser glassglass som inneholder kryoseksjoner i -80 °C fryser for oppbevaring.
    MERK: Et enkelt glassglass kan passe til flere 10 μm kryoseksjoner da bredden og høyden er ~ 200 mm. Dermed kan det samme lysbildet inneholde kryoseksjoner som er farget for forskjellige celletyper.
    1. Når flere seksjoner er på lysbildet, må du sørge for at de er atskilt med 100 mm tomt rom. For å lage en kant mellom kryoseksjonene, bruk en hydrofob penn. Dette muliggjør forskjellige antistoffløsninger for å fargelegge for forskjellige celletyper på samme glassglass. Oppretthold 20 mm plass til kryoseksjonen fra kanten av glassglasset.

4. Immunofluorescensfarging av enkeltceller

  1. Bruk hurtigfargingsimmunfluorescensprotokoll på hjernekryoseksjoner for å merke ønskede hjernecelletyper (nevroner, mikroglia, astrocytt, etc.) for innsamling ved hjelp av LCM.
    MERK: Den immunhistokjemiske fargeprotokollen som ble brukt til disse forsøkene, ble designet for å være rask for å forhindre overflødig mRNA-nedbrytning under denne prosessen.
    1. Fra fryseren på -80 °C tar du ut glassglass som inneholder 10 μm kryoseksjoner av rottehjernestammen som inneholder NTS. Dypp glir i 30 s i 75% etanolbad for å fikse kryoseksjonert vev. Fjern overflødig væske.
    2. Til det faste kryoseksjonerte hjernestammevevet, bruk 2% bovint serumalbumin (BSA) i fosfatbuffersaltvann (PBS) i 30 s for å blokkere ikke-målrettet binding av antistoffer. Etterpå vasker du med PBS.
    3. Påfør nok mengde primær antistoffløsning for å dekke kryoseksjonert vev (nå fast og blokkert). Inkuber vevsseksjonen i primær antistoffløsning i 2 minutter. Vask vevet med 2% BSA-løsning en gang. Den primære antistoffoppløsningen inneholder 96% av BSA-PBS-løsningen for blokkering, 3% primært antistoff og 1% RNasehemmer. Primært antistoff ble fortynnet i forholdet 1:25.
      MERK: I dette representative eksperimentet består primære antistoffer av anti-NeuN antistoff og anti-Cd11β antistoff. Nevroner ble videre delt inn i TH + og TH-undergrupper, så primære antistoffløsninger for nevronfarging inneholdt 93% av BSA PBS-løsningen, 3% anti-NeuN-antistoff, 3% anti-tyrosinhydroksylaseantistoff og 1% RNase Out.
    4. Påfør nok mengde sekundær antistoff (1:200) løsning for å dekke hjernestammen vev. La den sekundære antistoffløsningen bade vevet. Etter 3 minutter, vask vevet med 2% BSA-løsning en gang.
      MERK: Oppløsningen som inneholdt det sekundære antistoffet var sammensatt av 196,5 μL 2% BSA, 1 μL geit anti-mus 555 nm fluorescerende tag for celletype, 1 μL esel anti-kanin Alexa 488 nm for TH-farging, 2,5 μL RNase-hemmer og 1,3 μL DAPI (1:10000).

5. Standard etanol og xylen vev dehydrering serien

  1. Plasser glassglass som det fargede kryoseksjonerte vevet hviler på i et 75% etanolbad i 30 s, etterfulgt av å plassere i 95% etanolbad i 30 s, et 100% etanolbad i 30 s, og til slutt en 100% etanol både i 30 s (i en annen beholder).
  2. Etter å ha fullført etanoldehydreringsserien, hell to friske 100% xylenbad. Legg deretter glassglassene i det første xylenbadet i 1 min. Fjern raskt og legg skliene i det andre friske xylenbadet i 4 minutter.
  3. Ta glassglass som inneholder farget og dehydrert vevskryoseksjoner ut av xylen og legg i en mørk, men ventilert beholder i 5 minutter for å lufttørke. Etter lufttørking, legg glassglass i en tørkemiddel i 5 minutter for endelig tørking.

6. Velg enkeltceller ved hjelp av laserfangstmikrodisseksjon (LCM)

  1. Sett glassglass som inneholder fargede, faste og dehydrerte vevskryoseksjoner inn i LCM-mikroskopprøveholderen. Bruk anatomiske landemerker til å finne interesseområdet som cellesamlingen skal finne sted fra (NTS i dette representative eksemplet).
  2. Slå på mikroskopfluorescens og finn farget celletype (r) av interesse. Sørg for at kjernen til den ønskede cellen er i interesseområdet og isoleres fra kjernene til andre celler med en avstand på >3 mm. Identifiser og merk en celle (hvis eksperimentet er ekte enkeltcelle) eller flere celler (hvis eksperimentet krever samlede enkeltcelleprøver [dvs. enkeltcelleskala] som demonstrert i dette representative eksperimentet) for å samle inn ved hjelp av LCM-programvaren.
    MERK: Prøver bestående av 10-celle bassenger ble brukt i dette representative eksperimentet. Dette gjøres for å redusere genuttrykksvariabiliteten mellom prøver og øke antall enkeltceller som analyseres, selv om dette fortsatt er et enkeltcelleskalaeksperiment. Ekte enkeltcelleeksperimenter kan fullføres med denne metoden20,27. I tillegg kan større vevsseksjoner også velges21.
  3. Etter at de ønskede cellene er valgt, bruk LCM-robotarmen, plasser LCM-hetten på interesseområdet på den markerte vevskryoseksjonen.
  4. Kalibrer intensiteten og målrettingen av den infrarøde (IR) laseren ved hjelp av testskudd.
    MERK: Dette gjøres for hver prøve. Kalibrering bør utføres på en del av hetten som ikke er direkte over vevet for ikke å feilaktig velge ikke-eksperimentelt vev.
    1. For å kalibrere intensiteten, juster varigheten, styrken og størrelsen på IR-laserskuddet slik at et skudd bare smelter lokklimet nok til å velge en enkelt cellekjerne og er også sterk nok til å smelte hetten til kryoseksjonen på lysbildet. Disse verdiene vil være forskjellige for hver cap.
    2. Kalibrer målrettingen ved å lokalisere lasertrådkorset nøyaktig der laseren smeltet hetten.
  5. Samle cellene som er identifisert ved å skyte LCM infrarød laser for å smelte hetten på kryoseksjonert vev over disse cellene. Forsikre deg om at bare utvalgte celler ble løftet fra vevsskiven ved å bruke robotarmen til å lokalisere hetten til kvalitetskontrollområdet (QC) i LCM-mikroskopet. For å fjerne overflødige celler på hetten, bruk ultrafiolett (UV) laser for å utslette det genetiske materialet til de ekstra cellene.
  6. Ta opp anatomisk spesifisitet med LCM-programvarekameraet. Ta et bilde av kryoseksjonert vev som cellen (e) ble fjernet fra.
  7. Bruk et anatomisk atlas (et atlas over rotteforhjernen i dette eksemplet) for å bestemme avstanden til denne vevsskiven fra bregma og registrer denne informasjonen som Z-avstanden28. Bestem plasseringen i X- og/eller Y-planet fra bildet for å lokalisere den valgte cellen fullstendig.
  8. Med hanskede hender fjerner du LCM-hetten fra QC-området. Deretter fester du prøveutvinningsenheten til LCM-hetten. Bruk en pipette til å påføre 5,5 μL lysisbuffer på de valgte cellene. Dette omtales nå som utvalget.
    MERK: Lysisbufferløsningen består av 5 μL resuspenderingsbuffer sammen med 0,5 μL lysisforsterker.
  9. Monter et 0,5 ml mikrosentrifugerør på prøveekstraksjonsenheten som er festet til LCM-hetten. Plasser dette arrangementet på en 75 °C kokeplate med prøven og lysisbufferen nærmere platen. La prøven varme i 15 min.
  10. Bruk en lavhastighets sentrifuge ved 0,01-0,02 x g for å spinne prøven og lysisbufferen ned i bunnen av 0,5 ml mikrosentrifugerøret. Oppbevar prøven ved -80 °C til mikrofluidisk qPCR.

7. Kjør qPCR-brikke på en mikrofluidisk RT-qPCR på plattform

  1. For å måle genuttrykk for enkeltcelleprøver, utfør mRNA-forforsterkning som beskrevet nedenfor.
    MERK: Protokollen involverer ikke mRNA-ekstraksjon, da prøvene er enkeltceller som inneholder en svært lav mengde RNA (10 pg), som vil gå tapt under mRNA-isolasjonstrinnet. Enkeltcellene lyses og videreføres direkte for revers transkripsjon for å minimere prøvetapet.
    1. Lag et primerbasseng ved å legge til mRNA qPCR-genprimerne (fremover og bakover) for hvert gen som analyseres i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Sørg for at den endelige konsentrasjonen av hver primer er 500 nM. Primere i dette eksempeleksperimentet er listet opp i tilleggstabell 116.
    2. Pipette 1 μL 5x cDNA-reaksjonsblanding i hver brønn i en 96-brønns PCR-plate.
    3. La enkeltcelleprøver tine kort (2-3 min) ved å fjerne dem fra fryseren på -80 °C og la dem sitte i romtemperatur. Bruk en lavhastighets sentrifuge ved 0,01-0,02 x g for å spinne ned prøvene i 20-30 s. Pipette 5,5 μL av hver enkeltcelleprøve til en annen brønn i PCR-platen med 96 brønner.
      MERK: Prøvenummeret og typen som skal settes inn i hver brønn, bestemmes før du begynner på dette trinnet.
    4. PCR-platen med 96 brønner har nå cDNA-reaksjonsblandingen og en enkeltcelleprøve tilsatt hver brønn. Plasser denne platen i en termosykler i 1,5 minutter ved 65 °C for å aktivere cDNA-reaksjonsblandingen. Spinn ned innholdet ved hjelp av høyhastighets sentrifugering ved 1,300 x g i 1 min ved 4 °C og legg PCR-platen på våt is.
    5. Inn i hver brønn i PCR-platen, pipette 0,12 μL T4 Gene 32 Protein, 0,73 μL DNA-suspensjonsbuffer og 0,15 μL 10x cDNA-syntese master mix. Kjør PCR-platen gjennom følgende protokoll i termosykleren: 25 °C i 5 min, 50 °C i 30 min, 55 °C i 25 min, 60 °C i 5 min, 70 °C i 10 minutter og et siste hold ved 4 °C.
      MERK: T4 Gene 32 protein (et enkeltstrenget DNA (ssDNA) bindende protein) er nødvendig for bakteriofag T4 replikasjon og reparasjon. T4 Gene 32-proteinet ble brukt i omvendt transkripsjonstrinn av protokollen for å forbedre utbyttet og effektiviteten av revers transkripsjon og for å øke PCR-produktutbyttet.
    6. Inn i hver brønn i PCR-platen, pipette 7,5 μL Taq polymerase master mix. Etter dette, i hver brønn, pipette 1,5 μL av primerbassenget opprettet i trinn 7.1.1. Kjør PCR-platen gjennom følgende lineære forforsterkningstrinn i termosykleren: 95 °C i 10 minutter; 22 sykluser på: 96 °C i 5 s og 60 °C i 4 minutter.
    7. Inn i hver brønn i PCR-platen, pipette 1,2 μL eksonuklease I, 4,2 μL DNA-suspensjonsbuffer og 0,6 μL 10x eksonuklease I reaksjonsbuffer. Kjør PCR-platen gjennom følgende protokoll i termosykleren: 37 °C i 30 min, 80 °C i 15 minutter.
      MERK: Exonuclease katalyserer fjerning av nukleotider fra lineært enkeltstrenget DNA i 3 'til 5' retning. Vi bruker eksonuklease for prøveopprydding for fjerning av ikke-inkorporerte primere og eventuelt enkeltstrenget cDNA som kan være tilstede etter forforsterkning.
    8. Inn i hver brønn i PCR-platen, pipette 54 μL TE-buffer. Bruk en høyhastighets sentrifuge ved 1,300 x g i 5 minutter ved 4 °C for å spinne ned innholdet i PCR-platen.
    9. Hvis du planlegger å fortsette med neste fase av protokollen, må du kjøle PCR-platen ved 4 °C. Hvis det er mer enn 12 timer mellom fullføring av forforsterkningsfasen og oppstart av mikrofluidisk qPCR, dekk til qPCR-platen og sett den i en fryser på -20 °C.
  2. Lag prøveplaten (ny 96-brønns PCR-plate) for qPCR-brikke som beskrevet nedenfor.
    1. Hvis PCR-platen før forsterkning fra trinn 7.1 ble plassert i en fryser på -20 °C, fjern og la den tine i romtemperatur i 10 minutter.
    2. Inn i en ny 96-brønns PCR-plate, pipette inn i hver brønn 4,55 μL PCR supermix lav rox og 0,45 μL 20x DNA-bindende fargestoff. Deretter pipetter 3 μL forforsterket prøve fra PCR-platen laget i trinn 7.1. Bruk høyhastighets sentrifugering ved 1,300 x g i 5 minutter ved 4 °C for å spinne ned PCR-platen og plassere PCR-prøveplaten på is.
  3. Lag en analyseplate (en ny 96-brønns PCR-plate) for qPCR-brikke som beskrevet nedenfor.
    1. Inn i en ny 96-brønns PCR-plate, pipetter inn i hver brønn 1,25 μL DNA-suspensjonsbuffer og 3,75 μL 2x analyselastereagens. Pipetter deretter den tilsvarende qPCR-primeren ved 2,5 μL 10 μM primer. Bruk høyhastighets sentrifuge ved 1,300 x g i 5 minutter ved 4 ° C for å spinne ned PCR-platen og plassere PCR-analyseplaten på is.
  4. Forbered qPCR-brikken for lasting i den mikrofluidiske RT-qPCR-plattformen som beskrevet nedenfor.
    MERK: qPCR-brikken er en sanntids qPCR-plattform som fungerer på mikrofluidiske prinsipper. qPCR-brikken er i hovedsak en matrise med 96 prøvekanaler og 96 RNA qPCR-primerkanaler (dvs. analyser) som krysser i 9,216 (96 x 96) kamre. En prøve og en spesifikk analyse kombineres i hvert kammer i matrisen der en sanntids qPCR-reaksjon oppstår. Avlesningen genereres som terskelsyklusverdier (Ct) og forsterkningsplott for primerne som brukes.
    1. Injiser kontrolllinjevæske inn i qPCR-brikken for grunning. Sett qPCR-brikken inn i den mikrofluidiske blandeanordningen. Velg prime (136x) skriptet og kjør dette programmet.
    2. Når programmet er fullført etter ~45 min, fjern den primede qPCR-brikken. Inn i den primede qPCR-brikken pipetter 6 μL av reaksjonen fra PCR-prøveplaten inn i den tilsvarende prøvebrønnen i qPCR-brikken.
    3. Inn i den primede qPCR-brikken pipetter 6 μL av reaksjonen fra PCR-analyseplaten til den tilsvarende analysebrønnen i qPCR-brikken.
      MERK: Det kan dannes luftbobler i bunnen av prøven og analysebrønner i qPCR-brikken, noe som kan forhindre at løsningene kommer inn i mikrofluidiske ledninger. En skarp nål kan brukes til å sprette eller fjerne disse luftboblene før qPCR-brikken settes inn i den mikrofluidiske blandeenheten.
    4. Sett qPCR-brikken inn i den mikrofluidiske blandeanordningen. Velg load mix (136x) skriptet og kjør dette programmet.
  5. Last qPCR-brikken inn i den mikrofluidiske RT-qPCR-plattformen.
    1. Slå på den mikrofluidiske RT-qPCR-plattformen og varm opp pæren (~ 20 min). Fjern qPCR-brikken fra den mikrofluidiske blandeenheten. Skrell det beskyttende klistremerket fra bunnen av qPCR-brikken.
    2. Åpne den mikrofluidiske RT-qPCR-plattformen og last qPCR-brikken inn i den mikrofluidiske RT-qPCR-plattformen. Kjør den raske 96 x 96 PCR-protokollen (30 sykluser) på den mikrofluidiske RT-qPCR-plattformen.
    3. Start datainnsamlingsprogramvaren - klikk på Start en ny kjøring.
    4. Bekreft strekkoden og chiptype-klikk på Neste. Klikk på Chip Run-filen og bla gjennom filplasseringen for datainnsamlingslagringen.
    5. Klikk på Application Type og velg Gene Expression; velg ROX for passiv referanse, velg Single Probe og velg EvaGreen for sondetype.
    6. Klikk for å velge termisk sykling programmet og velg Biomark HD: GE Fast 96x96 PCR + Melt v2.pcl fil.

8. Dataanalyse

  1. Last opp data fra qPCR-brikken som kjøres til analyseprogramvaren for QC som beskrevet nedenfor.
    1. Last ned dataanalyseprogramvaren. Dette finner du på følgende nettside: https://www.fluidigm.com/products-services/software#. Start programvaren for å analysere det mikrofluidiske RT-qPCR-eksperimentet.
    2. I programvaren åpner du Chip Run. Deretter åpner du filen ChipRun.bml som ble opprettet av eksperimentet. Et vindu vises med eksperimentelle detaljer, inkludert passiv referanse, sonde og PCR termisk program.
      MERK: Kvalitetskontroll (QC) og dataanalyse kan gjøres på datamaskinen som er koblet til den mikrofluidiske RT-qPCR-plattformen eller ved å overføre .bml-filen til en annen datamaskin via en flash-stasjon eller på annen måte.
  2. Definer eksempeloppsettet som beskrevet nedenfor.
    MERK: Dette trinnet oppretter en merket mal for prøver og analyser (qPCR-primere) for prosedyrene for kvalitetskontroll (QC) og dataanalyse.
    1. Velg Chip Explorer > Sample Plate Setup og opprett en ny prøveplate. Velg riktig containertype og containerformat (SBS96 for en 96-brønns plate som ble brukt i dette representative eksperimentet).
    2. Lim inn eksempeletikettene i programvareregnearket i henhold til eksperimentell design, og velg Kart fra Oppgave-menyen. Velg SBS96-Left.dsp. Eksempeloppsettet er nå tilordnet. Velg Detaljvisning > Analyser for å oppdatere disse endringene i filen.
      MERK: Eventuelle endringer som gjøres i denne programvaren, lagres ikke før du klikker på Analyser-knappen .
  3. Definer kontrolleksemplene i programvaren. Merk cellene for kontrolleksemplene ved å klikke og holde nede mens du drar gjennom cellene for merking. Individuelle celler kan velges ved å trykke og holde nede Ctrl-tasten og klikke på individuelle celler. For RNA-standardprøvene (fortynningsserien) skriver du inn prøvenavnet og RNA-konsentrasjonen som brukes. Klikk på Analyser for å lagre.
  4. Definer detektoroppsettet på samme måte som trinn 8.2 ovenfor, men med RT-qPCR-analysenavn, dvs. navnene på genene som er analysert. Velg Detector Plate Setup og opprett en ny analyseplate. Velg riktig containertype og -format (SBS96 for en plate med 96 brønner). Lim inn analysenavnene i henhold til eksperimentell design og klikk på Analyser for å lagre.
  5. Start prosessen for brukerkvalitetskontroll (QC) som beskrevet nedenfor.
    MERK: Dette representative eksperimentet brukte en terskelmetode for syklustid (Ct). Det vil si at prøver som ikke nådde et terskelsignal definert av programvaren (Auto Global) eller manuelt (User Global) vil bli ansett som mislykkede reaksjoner og ikke inkludert i datasettet.
    1. Velg Analysevisning > oppgaveramme. I ruten for analyseinnstillinger endrer du innstillingene til Auto Global (beregner automatisk en terskel som brukes på hele brikken) eller User Global. Sett grunnlinjekorreksjonen til lineært derivat. Hvis User Global brukes, må feilterskelen bestemmes manuelt som i representanteksperimentet.
    2. Dette representative eksperimentet brukte en QC-regel på følgende måte: Hvis en individuell analyse eller prøve hadde en feilfrekvens på 70 % eller mer, mislyktes hele raden eller kolonnen i datasettet.
    3. Gjennomgå hver reaksjon manuelt i 96 x 96-brikken. Visualiser forsterkningskurvene og smeltekurvene for å vurdere om hver reaksjon fulgte det forventede qPCR-mønsteret. Hvis forsterkningen eller smeltekurven ikke stemmer overens med det som forventes, mislykkes den reaksjonen.
  6. Etter QC eksporterer du dataene ved å velge File > Export og lagrer datasettet som en .csv fil.
  7. Beskjær datasettet siden den eksporterte .csv-filen har både en Pass-Fail-matrise og en matrise med rå Ct-verdier. Bruk Pass-Fail-matrisen til å erstatte eventuelle mislykkede celler i datasettet med NA.
  8. Last ned den mest oppdaterte versjonen av R-programvaren med åpen kildekode, og last deretter ned R-Studio-programmet. Last opp det normaliserte datasettet til R. Analyser data som passer for studien.
  9. Normaliser datasettet ved hjelp av -ΔΔCt-metoden som beskrevet nedenfor.
    MERK: Median sentrering eller housekeeping gen normalisering kan brukes over en prøverad for å generere en -ΔCt-verdi . I det representative eksperimentet ble median sentrering brukt og validert ved housekeeping gen normalisering. Dette kan gjøres i .csv format eller ved å laste opp til en dataanalyseprogramvare.
    1. For median sentrering, beregne median Ct-verdi beregnet ut fra alle Ct-verdiene for en individuell prøve (10-cellet basseng). Trekk deretter alle individuelle Ct-verdier fra denne medianverdien. Dette gir en -ΔCt-verdi .
    2. For housekeeping gen normalisering, beregne gjennomsnittlig uttrykk for housekeeping gener (Actb, Gapdh, og Ldha i det representative eksperimentet) for hver prøve og bruke denne verdien som den som skal trekke de enkelte Ct-verdiene.
    3. Hvis du vil generere en -ΔΔC t-verdi, tar du medianen for hver analysekolonne, som nå inneholder -ΔCt-verdien. Trekk analysemedianen fra hver -ΔC t-verdi for å produsere en -ΔΔCt-verdi.
  10. Beregn z-score for hver -ΔΔCt-verdi ved hjelp av skalafunksjonen i R. Bruk R-varmekartfunksjonen eller en egen programvare for å generere et varmekart.
  11. Bruk Pearson-korrelasjonsfunksjonen til å beregne Pearson-korrelasjoner mellom hvert gen. Bruk smeltefunksjonen i R til å organisere datasettet for annen funksjonalitet. Eksporter disse dataene og last dem opp i en nettverksprogramvare for genkorrelasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Validering av enkeltcellesamling utføres visuelt under LCM-prosedyrer. Cellekjerner vurderes på QC-stasjonen. Celletypen kan bestemmes ved utslipp av merket fluorofor for den celletypen og dens generelle morfologi. Hvis ikke-ønskede celler er valgt på hetten, kan deres genetiske materiale ødelegges med en UV-laser på QC-stasjonen. Ytterligere validering ved molekylær analyse er også nødvendig. I dette representative eksemplet16 ble to typer nevroner valgt - tyrosinhydroksylase (Th) positiv (+) og Th negativ (-), i tillegg til mikroglia. Figur 1D viser at prøver ment å være nevroner viste statistisk signifikant forhøyet uttrykk for nevronmarkøren, NeuN. Samtidig hadde mikrogliaprøver signifikant heving av mikrogliamarkørene, CD34 og Cx3xr1, noe som tyder på at prøveseleksjon ble utført med høy kvalitet. I tillegg viste Th+ nevronprøver signifikant forhøyet uttrykk for Th sammenlignet med Th-nevronale prøver og mikrogliaprøver, mens Th-nevroner viste signifikant forhøyet uttrykk for GCG (et preproglukagonkodende gen) noe som tyder på at disse Th-nevronprøvene er beriket med nevroner som bruker GLP-1 som en nevrotransmitter (figur 1D ). Et mer globalt beregningsmål kjent som lineær diskriminerende analyse viste at disse tre celletypene hadde forskjellige genuttrykksprofiler på tvers av alle 65 gener målt med nevroner og mikroglia som separerte langs x-aksen og Th+ og Th-nevronale prøver som delte seg langs y-aksen (figur 1E).

Kvaliteten på dataene ble også validert med intra- og inter-batch tekniske replikasjoner (figur 2 og figur 3). Replikerer kontroll internt i partiet for kvaliteten på data fra den bestemte bunken. Hvis intra-batch-repliker ikke justeres, kan et annet qPCR-brikkeeksperiment utføres fra samme prøve og analyseplater som ble laget for å kjøre den første batchen. Replikeringer mellom grupper sikrer at data fra tvers av grupper kan sammenlignes. Dette er avgjørende for eksperimenter der et stort antall prøver analyseres og krever flere batcher som dette representative eksemplet. Det var en outlier i dette eksperimentet som prøve 40 i batch 4 (figur 3). Imidlertid er prøve 40 i batcher 1, 2 og 3 riktig justert, og den andre replikerer fra batch 4 justert med batches 1, 2 og 3, noe som tyder på at dette var en isolert dårlig reaksjon, som skjedde i denne replikken. Sammenligning på tvers av partier krever også riktige datanormaliseringsteknikker. Dette eksperimentet brukte median sentrering, selv om housekeeping gener (Actb, Gapdh, Ldha), ble også analysert i dette eksperimentet og fungerte som en kontroll for median-sentreringsmetoden. Det vil si at begge metodene ga svært analoge datasett som ytterligere tyder på høy datakvalitet.

Figur 4 viser et varmekart over GLP-1-berikede nevronprøver som er organisert etter cellulær subfenotype. Denne figuren viser ikke bare betydningen av cellulære subfenotyper i nevrobiologi, men demonstrerer også hvordan forholdet mellom subfenotyper endres gjennom alkoholabstinens. Varmekartet viser at subfenotype A, som i stor grad uttrykker den inflammatoriske genklyngen 1, øker i forholdet ved 8 timers Wd-tidspunktet og når maksimalt ved 32 timer Wd. Ved 176 timer Wd normaliserer denne inflammatoriske subfenotypen sin prevalens tilbake til kontroll. Subfenotype B, som i stor grad uttrykker GABAR-genklynge 2, demonstrerer en generell undertrykkelse i ekspresjonen av denne genklyngen ved 176 timers Wd-tilstanden. Disse funnene viser hvordan denne GLP-1 nevroncelletypen blir hyperexcitable ved å øke sin inflammatoriske subphenoype og samtidig redusere ekspresjonsnivået av GABARS i sin GABA-subfenotype under alkoholuttak. Figur 5 kombinerer genuttrykket av individuelle prøver i gjennomsnitt slik at uttrykket av klynger av gener og plasseringen av proteinet til den gentransskripten kan visualiseres gjennom hele tidsserien.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentelt design og encellet seleksjon. (A) Rottetrillinger ble randomisert til en av de fem behandlingstilstandene. (B) Generering av enkeltcelletranskriptomdata. (C) Tegneseriefremstilling av gener analysert og deres funksjon. Gener i grønt ble ikke analysert. Offisielt gensymbol brukes. (D) Genuttrykk av celletypemarkører. Feilfelt viser standardfeil. Nevroner sammenlignet med mikroglia, p-verdier = henholdsvis 0,0273, 3,94 x 10-10, 7,73 x 10-12. Th+-nevroner viste forhøyet Th-uttrykk sammenlignet med Th-nevroner (p = 4,56 x 10-11) og mikroglia (p = 2,95678 x 10-15). Th-nevroner viste forhøyet uttrykk for GCG sammenlignet med Th+-nevroner (p = 0,0106) og mikroglia (p = 0,0435) som indikerer at de er GLP-1+-nevroner. *p < 0,05, ***p < 4 x 10-10. (E) Lineær diskriminerende analyse av alle prøver viser forskjellen på tvers av alle gener målt mellom de tre celletyper samlet i et todimensjonsrom. Centroid avstand mellom NE-nevroner og GLP-1-nevroner = 3,30, NE-nevroner og mikroglia = 1,57, GLP-1-nevroner og mikroglia = 2,92. Dette tallet er modifisert fra O'Sullivan et al. 202116. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Teknisk replikere plott av rå Ct-verdier i en batch. Hver graf viser rå Ct-verdier for intrachip tekniske replikasjoner plottet mot hverandre og demonstrerer teknisk eksperimentell integritet. Dette tallet er modifisert fra O'Sullivan et al. 202116. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Teknisk replikere plott av rå Ct-verdier mellom batcher. Hver graf viser rå Ct-verdier for interchip tekniske replikasjoner plottet mot hverandre og viser at alle batcher er sammenlignbare med hverandre. Dette tallet er modifisert fra O'Sullivan et al. 202116. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Varmekart over GLP-1-berikede nevronprøver. Varmekart viser cellulære subfenotyper av GLP-1-berikede nevronprøver gjennom en tidsserie for alkoholabstinens. Rader representerer 10-cellers samlede prøver med cellulære subfenotypeklynger merket med store bokstaver. Kolonner representerer z-score på -ΔΔCt genuttrykksverdier på en -1 til +1 fargeskala for det genet i den prøven. Genklynger er merket med nummer. Dette tallet er modifisert fra O'Sullivan et al. 202116. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Suphenotype genuttrykk i GLP-1 berikede nevronprøver. Cellulære diagrammer viser bokser som representerer relativ genuttrykk (gjennomsnittlig z-score på -ΔΔCt-verdier ) av subfenotyper vist i varmekartet i figur 4. Diagrammene ble konstruert ved hjelp av Cytoscape versjon 3.8.0 og z-score ble beregnet ved hjelp av skalafunksjonen i R versjon 3.5.2. -ΔΔCt-etiketter til høyre viser hvilke bokser som tilsvarer hvilket gen og fargen som representerer uttrykk (blått er lavt uttrykk og gult er høyt uttrykk). Plasseringen av boksen representerer lokaliseringen eller funksjonen til proteinproduktet fra det gentransskriptet. Grønne tall indikerer undergrupper innenfor underfenomener. Dette tallet er modifisert fra O'Sullivan et al. 202116. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Interoceptiv vagal krets, visceral-emosjonell neurakse og skjematisk av motstander-prosessmodell for avhengighet. (A) Interoceptive vagale afferenter videresender tarmens tilstand, som er sterkt påvirket av tarmmikroflora og andre perifere organer til nucleus tractus solitarius (NTS). Denne informasjonen blir deretter videresendt til amygdala og påvirker følelsesmessige tilstander. (B) En forenklet tegneseriefremstilling som viser de integrerende rollene til kjernen tractus solitarius (NTS) og den sentrale kjernen til amygdala (CeA) i følelser, stress og autonom regulering. To neuronale subtyper, GLP-1 og NE nevroner er uthevet. Mange anatomiske og funksjonelle forbindelser er utelatt for klarhet. Forkortelser: NE = noradrenalin; GLP-1 = glukagonlignende peptid 1; GABA = γ-aminosmørsyre; HPA-akse = hypothalamus-hypofyse-binyre-aksen; CRF = kortikotropinfrigjørende hormon. (C) Eksponering for alkohol og/eller opioider har to handlinger: stimulere belønning, via mesolimbic dopaminbanen, og hemme antireward. Disse tiltakene motiverer rusmiddelbruk via positiv forsterkning. (D) Alkohol- og/eller opioidabstinens har to handlinger: hemme belønning, ved å hemme den mesolimbiske dopaminveien (ikke vist) og stimulere antibelønning. Denne studien foreslår at visceral-emosjonell nevroinflammasjon er et endepunkt i antibelønningsstimulering, selv om denne hypotesen garanterer ytterligere testing. Disse handlingene, uansett mekanisme, motiverer stoffavhengighet via negativ forsterkning. Dette tallet er modifisert fra O'Sullivan et al. 202116. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tilleggstabell 1: Primere for mikrofluidisk RT-qPCR. Alle primerpar for mRNA-forsterkning er oppført sammen med amplikonlengden dannet av hvert primerpar. Denne tabellen er endret fra O'Sullivan et al. 202116. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Alkoholbruk lidelse er fortsatt en utfordrende sykdom å behandle. Vår gruppe har nærmet seg denne lidelsen ved å undersøke antireward prosesser med et system nevrovitenskap perspektiv. Vi målte genuttrykksendringer i enkeltnevroner og mikroglia i en alkoholabstinenstidsserie16. NTS ble valgt for sin fremtredende rolle i den autonome dysreguleringen som oppstår i alkoholavbruddssyndrom. Vi kombinerer LCM med encellet mikrofluidisk RT-qPCR, noe som gjør det mulig å måle robust antall prøver og gener til lave kostnader med anatomisk og molekylær følsomhet og spesifisitet (figur 1B-C). Enkeltceller ble identifisert og selektert ved IHC-farging, og disse cellulære subfenotypegruppene ble validert med molekylær ekspresjon (figur 1D-E). Noen GLP-1-berikede nevronprøver (TH-nevroner) uttrykte imidlertid moderat Th (figur 4). Etableringen av cellefenotype ble gjort ved cellevalg basert på fluorescerende visualisering, og dette kriteriet ble brukt for studien som molekylær gruppering basert på ekspresjonen av et enkelt gen, Th, klarte ikke å definere uttrykksmønstre som tyder på en cellulær fenotype16. Dermed karakteriserer resultatene store NTS mikrogliale og nevronale subfenotyper og deres dynamikk i alkoholabstinens.

Dette manuskriptet beskriver en metode for encellet transkriptomikk, og det er viktig at alle trinnene i protokollen følges som beskrevet. Noen modifikasjoner kan være nødvendig når du arbeider med et annet organvev eller celletyper. En av utfordringene med denne protokollen er å opprettholde RNA-kvalitet og integritet under LCM. Vi har etablert protokoller for IHC-farging, LCM og mikrofluidisk RT-qPCR for å løse utfordringene som beskrevet ovenfor. Kort sagt, disse prosessene inkluderer tilsetning av RNase-hemmer til alle fargeløsninger for å forhindre RNA-nedbrytning, en hurtigfargingsprotokoll for å forhindre mulig RNA-nedbrytning, behandling av lysbilder for LCM umiddelbart etter IHC-farging og dehydrering og opprettholde riktige kalde forhold når det er mulig under prøvebehandling eller overføring.

Transkriptomikkanalysen utføres på lyserte enkeltceller uten RNA-isolasjon, etterfulgt av revers transkripsjon, forforsterkning og qPCR. Forforsterkningstrinnet er å forsterke cDNA-molekyler til detekterbare nivåer for qPCR selektivt. Det er flere begrensninger i forforsterkningstrinnet. Disse inkluderer gentranskripsjoner som ikke forsterkes, noe som ikke vil resultere i påvisning i mikrofluidisk RT-qPCR. Det er også mulighet for primerdimerdannelse da PCR-reaksjonen inneholder alle primere for eksperimentell analyse. Det vil si at dannelsen av dimere med en fremre og omvendt sekvens av et enkelt primerpar og med alle fremover- og reverssekvensene i forsøket er mulig. Derfor anbefales primertesting ved hjelp av positiv eksperimentell kontroll som RNA-standarder.

RT-qPCR-brikkedesignet er et annet viktig aspekt ved denne protokollen for kvalitetskontroll og batcheffekter. Positive kontroller består av standard RNA fra dyret og organet som analyseres (rottehjerne i dette representative eksemplet). En RNA-fortynningsserie kan deretter lastes inn i hver brikke og skal demonstrere riktig kvantitativt signal for hvert gen som analyseres. Vann kan brukes som en negativ kontroll. Disse kontrollene er avgjørende for riktig normalisering som kontrollerer for batcheffekter som kan oppstå når du kombinerer data fra forskjellige brikker. Dette er nærmere omtalt i trinn 8.

I det representative eksperimentet som er vist her, ble disse metodene brukt for hypotesegenerering og innsikt i mulig mekanisme. Studien ble utført i sammenheng med et annet arbeid og gir viktig informasjon for den interceptive antireward-hypotesen13. Kort fortalt antar denne modellen at antibelønning stimuleres ved substansabstinens ved interoceptiv signalering fra vagus via NTS til amygdala, og at det første substratet for denne antibelønningen er nevroinflammasjon (figur 6). Dette arbeidet støtter denne hypotesen ved å etablere de inflammatoriske endringene i genuttrykk i nevroner og mikroglia ved alkoholuttak.

En stor svakhet ved denne studien er mangelen på mekanistiske påstander. Imidlertid kan disse metodene brukes til å bestemme en mekanisme etter at et grunnlinjeeksperiment som dette er utført. For eksempel kan en dyremodellintervensjon eller forstyrrelser, for eksempel en subdiafragmatisk vagotomi eller gen knockout, demonstrere anatomiske eller genetiske mekanismer for inflammatoriske regulatorer. Fremtidige studier som tar denne tilnærmingen kan bidra til utviklingen av den interoceptive antireward-hypotesen, som tar sikte på å implementere disse innsiktene i klinisk praksis for avhengighetsbehandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Arbeidet som presenteres her ble finansiert gjennom NIH HLB U01 HL133360 tildelt JS og RV, NIDA R21 DA036372 tildelt JS og EVB, T32 AA-007463 tildelt Jan Hoek til støtte for SJO'S, og National Institute of Alcoholism and Alcohol Abuse: R01 AA018873.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20X DNA Binding Dye Fluidigm 100-7609 NA
2x GE Assay Loading Reagent Fluidigm 85000802-R NA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text) Fluidigm BMK-M-96.96 NA
Anti-Cd11β Antibody Genway Biotech CCEC48 Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60 EMD Millipore MAB377 Neuronal Stain
Anti-tyrosine hydroxylase antibody abcam ab112 Stain for TH+ neurons
ArcturusXT Laser Capture Microdissection System Arcturus NA NA
Biomark HD Fluidigm NA RT-qPCR platform
Bovine Serum Antigen Sigma-Aldrich B4287
CapSure Macro LCM Caps ThermoFisher Scientific  LCM0211 NA
CellDirect One-Step qRT-PCR Kit ThermoFisher Scientific 11753500 Lysis buffer solution components
CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer Kit ThermoFisher Scientific 11739010 Invitrogen
DAPI ThermoFisher Scientific 62248 Nucleus Stain
DNA Suspension Buffer TEKnova T0221
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific R37118 Seconadry Antibody
Exonuclease I New Englnad BioLabs, Inc. M0293S NA
ExtracSure Sample Extraction Device ThermoFisher Scientific LCM0208 NA
FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope Slides ThermoFisher Scientific 22-037-246 Plain glass slides
GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube ThermoFisher Scientific N8010611
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 ThermoFisher Scientific A28180 Seconadry Antibody
IFC Controller Fluidigm NA NA
RNaseOut ThermoFisher Scientific 10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox Bio-Rad PN 172-5211 NA
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit ThermoFisher Scientific 11754250 Contains VILO and SuperScript
T4 Gene 32 Protein New Englnad BioLabs, Inc. M0300S NA
TaqMan PreAmp Master Mix ThermoFisher Scientific 4391128 NA
TE Buffer TEKnova T0225 NA
TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mL USA Scientific 1402-9700 NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Substance Use and Mental Health Indicators in the United States: Results from the 2019 National Survey on Drug Use and Health. , Available from: https://www.samhsa.gov/data/ (2020).
  2. Prevalence of Serious Mental Illness (SMI). NIH. 49, Available from: https://www.nimh.nih.gov/health/statistics/mental-illness.shtml (2020).
  3. Mattick, R. P., Kimber, J., Breen, C., Davoli, M. Buprenorphine maintenance versus placebo or methadone maintenance for opioid dependence. Cochrane Database of Systematic Reviews. Mattick, R. P. , John Wiley & Sons, Ltd. (2008).
  4. Mattick, R. P., Breen, C., Kimber, J., Davoli, M. Methadone maintenance therapy versus no opioid replacement therapy for opioid dependence. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 2009 (3), (2009).
  5. Miller, P. M., Book, S. W., Stewart, S. H. Medical treatment of alcohol dependence: A systematic review. International Journal of Psychiatry in Medicine. 42 (3), 227-266 (2012).
  6. Holmes, E. A., et al. The Lancet Psychiatry Commission on psychological treatments research in tomorrow's science. The Lancet. Psychiatry. 5 (3), 237-286 (2018).
  7. Ford, C. L., Young, L. J. Translational opportunities for circuit-based social neuroscience: advancing 21st century psychiatry. Current Opinion in Neurobiology. 68, 1-8 (2021).
  8. Holmes, E. A., Craske, M. G., Graybiel, A. M. Psychological treatments: A call for mental-health science. Nature. 511 (7509), 287-289 (2014).
  9. Miranda, A., Taca, A. Neuromodulation with percutaneous electrical nerve field stimulation is associated with reduction in signs and symptoms of opioid withdrawal: a multisite, retrospective assessment. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 44 (1), 56-63 (2018).
  10. Metz, V. E., et al. Effects of ibudilast on the subjective, reinforcing, and analgesic effects of oxycodone in recently detoxified adults with opioid dependence. Neuropsychopharmacology. 42 (9), 1825-1832 (2017).
  11. Heinzerling, K. G., et al. placebo-controlled trial of targeting neuroinflammation with ibudilast to treat methamphetamine use disorder. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (2), 238-248 (2020).
  12. Bogenschutz, M. P., et al. Psilocybin-assisted treatment for alcohol dependence: A proof-of-concept study. Journal of Psychopharmacology. 29 (3), 289-299 (2015).
  13. O'Sullivan, S. J., Schwaber, J. S. Similarities in alcohol and opioid withdrawal syndromes suggest common negative reinforcement mechanisms involving the interoceptive antireward pathway. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 125, 355-364 (2021).
  14. O'Sullivan, S. J. Single-cell systems neuroscience: A growing frontier in mental illness. Biocell. 46 (1), 7-11 (2022).
  15. O'Sullivan, S. J., et al. Single-cell glia and neuron gene expression in the central amygdala in opioid withdrawal suggests inflammation with correlated gut dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
  16. O'Sullivan, S. J., McIntosh-Clarke, D., Park, J., Vadigepalli, R., Schwaber, J. S. Single cell scale neuronal and glial gene expression and putative cell phenotypes and networks in the nucleus tractus solitarius in an alcohol withdrawal time series. Frontiers in Systems Neuroscience. 15, 739790 (2021).
  17. O'Sullivan, S. J., Reyes, B. A. S., Vadigepalli, R., Van Bockstaele, E. J., Schwaber, J. S. Combining laser capture microdissection and microfluidic qpcr to analyze transcriptional profiles of single cells: A systems biology approach to opioid dependence. Journal of Visualized Experiments. (157), e60612 (2020).
  18. Achanta, S., Vadigepalli, R. Single cell high-throughput qRT-PCR protocol. Protocols.io. , (2020).
  19. O'Sullivan, S. J. The interoceptive antireward pathway and gut dysbiosis in addiction. Journal of Psychiatry, Depression & Anxiety. 7 (40), 1-5 (2021).
  20. Park, J., et al. Single-cell transcriptional analysis reveals novel neuronal phenotypes and interaction networks involved in the central circadian clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
  21. Staehle, M. M., et al. Diurnal patterns of gene expression in the dorsal vagal complex and the central nucleus of the amygdala - Non-rhythm-generating brain regions. Frontiers in Neuroscience. 14, 375 (2020).
  22. Réus, G. Z., et al. The role of inflammation and microglial activation in the pathophysiology of psychiatric disorders. Neuroscience. 300, 141-154 (2015).
  23. Zhang, X., et al. Role of astrocytes in major neuropsychiatric disorders. Neurochemical Research. 46 (10), 2715-2730 (2021).
  24. Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (1), 87-98 (2015).
  25. Lieber, C. S., DeCarli, L. M. An experimental model of alcohol feeding and liver injury in the baboon. Journal of Medical Primatology. 3 (3), 153-163 (1974).
  26. Lieber, C. S., Decarli, L. M. Animal models of chronic ethanol toxicity. Methods in Enzymology. 233, 585-594 (1994).
  27. Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24 (6), 930-941 (2014).
  28. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , Academic Press. Elsevier Inc. (1982).

Tags

Nevrovitenskap utgave 186 encellet genuttrykk laserfangstmikrodisseksjon mikrofluidisk qPCR avhengighet visceral-emosjonell neurakse nevroinflammasjon antibelønning
Undersøke drivere av antibelønning i avhengighetsadferd med anatomisk spesifikke enkeltcellede genuttrykksmetoder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

O'Sullivan, S. J., Srivastava, A.,… More

O'Sullivan, S. J., Srivastava, A., Vadigepalli, R., Schwaber, J. S. Investigating Drivers of Antireward in Addiction Behavior with Anatomically Specific Single-Cell Gene Expression Methods. J. Vis. Exp. (186), e64014, doi:10.3791/64014 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter