Summary
激光捕获显微切割和微流体RT-qPCR的组合为测量单个神经元和神经胶质细胞中的转录组提供了解剖学和生物技术特异性。将创造性方法与系统生物学方法应用于精神疾病可能会导致理解和治疗的突破，例如成瘾中的神经炎症抗奖励假说。
Abstract
成瘾行为率的增加促使心理健康研究人员和临床医生都了解反奖励和康复。这种从奖励和开始的转变需要新的视角，范式和假设，以及用于调查成瘾的方法的扩展。在这里，我们提供了一个示例：一种系统生物学方法来研究抗奖励，该方法结合了激光捕获显微切割（LCM）和高通量微流体逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）。测量了基因表达网络动力学，并确定了酒精和阿片类药物戒断中神经内脏失调的关键驱动因素，即神经炎症。这种技术组合以单细胞分辨率提供解剖学和表型特异性，具有高通量灵敏度和特异性基因表达测量，产生假设生成数据集和机制可能性，为新的见解和治疗创造机会。
Introduction
成瘾在发达国家仍然是一个日益严峻的挑战1，2。尽管科学和临床取得了重大进展，但成瘾率继续增加，而既定治疗方法的疗效最多保持稳定3，4，5。然而，生物技术和科学方法的进步导致了进一步研究物质依赖病理生理学的新方法和假设6，7，8。事实上，最近的发展表明，新的概念和治疗范式可能会导致具有社会，经济和政治后果的突破9，10，11，12。
我们调查了酒精戒断和阿片类药物依赖中的抗奖励13，14，15，16。方法是这种范式的核心17，18。激光捕获显微切割（LCM）可以选择具有高解剖特异性的单个细胞。此功能是神经炎症抗奖励假说不可或缺的一部分，因为神经胶质细胞和神经元都可以从同一动物的同一神经元亚核中收集和分析13，14，15，16，19。然后可以使用高通量微流体逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）测量所选细胞转录组的相关部分，为计算分析提供高维数据集，从而深入了解功能网络20，21。
测量特定脑核中神经元和神经胶质细胞中的转录组子集会生成一个数据集，该数据集在样本数量和测量的基因方面都是稳健的，并且具有敏感性和特异性。这些工具是系统治疗精神疾病的神经科学方法的最佳选择，因为神经胶质细胞，主要是星形胶质细胞和小胶质细胞，在过去十年中已在神经和精神疾病中发挥核心作用22，23。我们的方法可以测量神经胶质细胞和神经元在参与局部旁分泌信号传导的众多受体和配体上的表达反应。实际上，可以使用各种定量方法（例如模糊逻辑24）从这些数据集中推断信号。此外，识别神经元或神经胶质细胞中的细胞亚表型及其功能可以深入了解特定细胞核中的脑细胞如何在单细胞水平上组织、响应和失调。该功能系统的动力学也可以通过时间序列实验16进行建模。最后，动物模型可以在解剖学或药理学上受到干扰，为该系统的方法提供机械条件。
代表性实验：
下面，我们提供了这些方法的应用示例。本研究调查了大鼠神经元和小胶质细胞基因在孤立核（NTS）中对酒精依赖和随后的戒断的反应16。大鼠队列包括1）对照，2）乙醇依赖性（EtOH），3）8小时戒断（Wd），4）32小时Wd和5）176小时Wd（图1A）。快速斩首后，将脑干与前脑分离并冷冻切片，并对酪氨酸羟化酶阳性（TH +）神经元和小胶质细胞切片进行染色（图1B）。LCM用于收集TH+和TH-神经元以及小胶质细胞。所有细胞均来自NTS，并作为10个细胞池的样本进行分析。在测量65个基因的RT-qPCR平台上运行四个96 x 96微流体RT-qPCR动态阵列（图1B-C）。使用-ΔΔCt方法对数据进行归一化并使用R进行分析，并使用分子标记验证单细胞选择（图1D-E）。通过单批次和跨批次分析的技术重复进一步验证了技术验证（图2和图3）。TH+和TH-神经元组织成不同的亚表型，具有相似的炎症基因簇，但γ-氨基丁酸（GABA）受体（R）簇不同（图4和图5）。炎症基因簇表达升高的亚表型在32小时Wd时过度代表，而GABA受体（GABAR）表达在长期酒精戒断（176小时Wd）中保持低。这项工作有助于酒精和阿片类药物依赖的反奖励假说，该假说推测戒断时来自内脏的拦截反馈有助于内脏 - 情绪神经元核（即NTS和杏仁核）的失调，导致更严重的自主神经和情绪后遗症，从而导致物质依赖（图6）。
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Protocol
这项研究是根据托马斯杰斐逊大学动物护理和使用委员会（IACUC）的建议进行的。该协议由托马斯杰斐逊大学IACUC批准。
1. 动物模型
- 家雄性Sprague Dawley（>120克，Harlan，印第安纳波利斯，印第安纳波利斯，美国）大鼠三胞胎单独使用乙醇食物（2只大鼠）或对照食物混合物（1只大鼠）。
注意：该代表性实验采用利伯-德卡利协议来研究酒精戒断的神经生物学25，26。大鼠三胞胎由三只大鼠组成，它们被喂食相同数量的卡路里，但最终在牺牲时进入研究的不同组。本研究的三个分支是：1）对照，2）乙醇依赖性（EtOH）和3）戒断（Wd）（图1A）。本研究共有五种情况，因为有三个酒精戒断时间点（图1A）。- 每隔一天，测量Wd大鼠消耗的乙醇 - 食物混合物，并用相同量的乙醇混合物替换消耗的量到EtOH大鼠喂食器中。向对照大鼠的饲养器中加入等量的对照混合物。
注意：3周后，平均每日乙醇消耗量约为12-16克/千克26. - 在稳定的长期乙醇消耗和依赖（>5周）之后，通过清空他或她的食物容器并用对照混合物填充来诱导Wd大鼠的急性酒精戒断。以这样的方式执行此操作，即在相同的昼夜节律时间点21 处死所有三只大鼠。
- 在预先选择的时间点，在同一时间点（对照，EtOH和Wd）处死三胞胎中的所有三只大鼠。
- 每隔一天，测量Wd大鼠消耗的乙醇 - 食物混合物，并用相同量的乙醇混合物替换消耗的量到EtOH大鼠喂食器中。向对照大鼠的饲养器中加入等量的对照混合物。
2. 样品采集
- 在适当的Wd时间点（8小时，32小时，176小时）为每只大鼠三胞胎在同一昼夜节律时间点收获大脑。
- 准备甲醇和干冰浴，用于快速冷却新鲜组织以保持RNA完整性。放在一边。
- 将大鼠放入异氟烷罐（5%氧气）中~30秒或直到发生意识丧失，如呼吸频率降低和缺乏运动活动所示。将鼠头放入适当削尖的断头台中，迅速斩首。
- 打开动物的头骨，用镊子解剖出大脑。用手持剃须刀从新鲜大脑中取出小脑，通过粗略切片并将其丢弃。通过横向切口，从前脑切开脑干。
注意：根据实验设计，可以使用手持剃须刀进一步将前脑或脑干半切成左右半球。例如，要使用不同方法验证一个半球的发现，请调查左右分歧或增加样本数量。 - 在组织包埋模具中加入最佳切割温度（O.C.T.）介质至约3-4厘米深度，以便组织样品可以完全浸入。将组织、前脑和/或脑干放入组织包埋模具中，并添加更多 O.C.T. 以完全覆盖组织样本。
- 将含有组织样品（大鼠前脑）的塑料组织包埋模具加入干冰和甲醇的冷却浴中，立即冷冻组织样品。让包埋模具中的组织样品保留在冷却浴中，直到组织收集完成，但不超过15分钟。
注意：小心防止甲醇溢出到纸巾容器中。 - 在-80°C下快速储存组织样品。
注意：微流体RT-qPCR通过扩增和测量mRNA转录物来测量基因表达。这些转录本相对不稳定，因此在此过程中采取了许多步骤来保持样品尽可能冷，以防止mRNA降解。
3. 冷冻切片
注意：大鼠神经元核约为10μm。因此，10 μm是该动物模型的最佳切片厚度。根据研究的动物模型调整切片厚度。
- 从-80°C冰箱中取出含有冷冻脑干的组织包埋模具，并在低温恒温器中-20°C解冻样品5-10分钟。仅将冻融至-20°C进行一次以保存mRNA。
- 用手持剃须刀垂直切割塑料嵌入模具的角落。从塑料组织包埋模具中取出嵌入O.C.T.的脑干。在设置为-20°C的低温恒温器的卡盘上，使用室温液体O.C.T.作为胶水将脑干安装在喙部至尾部方向进行冠状冷冻切片。
- 从大鼠脑干到尾部方向切割10μm冠状冷冻切片，直到到达包含感兴趣区域（NTS）的部分。这些冷冻切片的高度和宽度为~200毫米，具体取决于塑料嵌入模具的尺寸。
- 通过解冻安装到室温普通载玻片上，收集包括NTS或其他感兴趣区域的脑干组织的10μm冷冻切片。快速，将这些带有切片的载玻片放入位于干冰顶部的冷却金属锅中。尽快将含有冷冻切片的载玻片放入-80°C冰箱中储存。
注意：单个载玻片可以安装多个 10 μm 冷冻切片，因为宽度和高度为 ~200 mm。因此，同一载玻片可以包含针对不同细胞类型染色的冷冻切片。- 当幻灯片上有多个部分时，请确保它们之间有 100 毫米的空白空间。要在冷冻切片之间创建边框，请使用疏水笔。这允许不同的抗体溶液在同一载玻片上对不同的细胞类型进行染色。从载玻片边缘保持 20 mm 的冷冻切片空间。
4. 单细胞免疫荧光染色
- 在脑冷冻切片上使用快速染色免疫荧光方案标记所需的脑细胞类型（神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞等），以便使用 LCM 进行收集。
注意：用于这些实验的免疫组织化学染色方案设计为快速，以防止在此过程中过量的mRNA降解。- 从-80°C冰箱中取出含有10μm冷冻切片的大鼠脑干含有NTS的载玻片。将载玻片浸入75%乙醇浴中30秒以固定冷冻切片组织。去除多余的液体。
- 对于固定的冷冻切片脑干组织，将 2% 牛血清白蛋白 （BSA） 在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中应用 30 秒，以阻断抗体的非靶向结合。之后，用PBS清洗。
- 应用足够量的一抗溶液以覆盖冷冻切片组织（现已固定并封闭）。将组织切片在一抗溶液中孵育2分钟。用2%BSA溶液清洗纸巾一次。一抗溶液含有 96% 的用于阻断的 BSA-PBS 溶液、3% 的一抗和 1% 的 RNase 抑制剂。一抗以1：25的比例稀释。
注意：在这个代表性的实验中，一抗由抗NeuN抗体和抗Cd11β抗体组成。神经元进一步细分为TH+和TH-亚组，因此用于神经元染色的一抗溶液含有93%的BSA PBS溶液，3%的抗NeuN抗体，3%的抗酪氨酸羟化酶抗体和1%的RNase Out。 - 应用足量的二抗（1：200）溶液覆盖脑干组织。让二抗溶液浸泡组织。3分钟后，用2%BSA溶液洗涤纸巾一次。
注意：含有二抗的溶液由 196.5 μL 2% BSA、1 μL 山羊抗小鼠 555 nm 细胞类型荧光标签、1 μL 驴抗兔 Alexa 488 nm 用于 TH 染色、2.5 μL RNase 抑制剂和 1.3 μL DAPI （1：10000） 组成。
5.标准乙醇和二甲苯组织脱水系列
- 将彩色冷冻切片组织置于75%乙醇浴中放置的载玻片30秒，然后放入95%乙醇浴中30秒，100%乙醇浴30秒，最后100%乙醇浴30秒（在第二个容器中）。
- 完成乙醇脱水系列后，倒入两个新鲜的100%二甲苯浴。然后，将载玻片置于第一个二甲苯浴中1分钟。快速取出载玻片并将载玻片放入另一个新鲜的二甲苯浴中4分钟。
- 从二甲苯中取出含有染色和脱水组织冷冻切片的载玻片，放入黑暗但通风的容器中风干5分钟。空气干燥后，将载玻片放入干燥器中5分钟以进行最终干燥。
6. 使用激光捕获显微切割 （LCM） 选择单个细胞
- 将含有染色、固定和脱水组织冷冻切片的载玻片插入LCM显微镜样品架。使用解剖标志来定位将进行细胞采集的感兴趣区域（在此代表性示例中为 NTS）。
- 打开显微镜荧光并找到感兴趣的染色细胞类型。确保所需细胞的细胞核位于感兴趣的区域，并且与其他细胞的细胞核隔离了>3毫米的距离。识别并标记一个细胞（如果实验是真正的单细胞）或多个细胞（如果实验需要混合的单细胞样品[即单细胞规模]，如本代表性实验所示），以使用LCM软件进行收集。
注意：在此代表性实验中使用了由10个细胞池组成的样品。这样做是为了减少样品之间的基因表达变异性并增加分析的单细胞数量，尽管这仍然是一个单细胞规模的实验。真正的单细胞实验可以用这种方法20，27完成。此外，还可以选择较大的组织切片21。 - 选择所需细胞后，使用 LCM 机械臂，将 LCM 帽放在标记的组织冷冻切片上的感兴趣区域。
- 使用测试镜头校准红外 （IR） 激光的强度和目标。
注意：这是针对每个样品完成的。校准应在不直接在组织上方的盖子部分上进行，以免错误地选择非实验组织。- 要校准强度，请调整红外激光射击的持续时间、强度和大小，使注射仅熔化盖子粘合剂以选择单个细胞核，并且强度也足以将盖子熔化到载玻片上的冷冻切片上。对于每个上限，这些值将不同。
- 通过精确定位激光十字准线来校准目标，激光熔化瓶盖的位置。
- 通过发射LCM红外激光收集鉴定的细胞，将帽熔化到这些细胞上的冷冻切片组织上。通过使用机械臂将盖子定位到LCM显微镜的质量控制（QC）区域，确保仅从组织切片中取出选定的细胞。要去除帽上多余的细胞，请使用紫外（UV）激光消除多余细胞的遗传物质。
- 使用 LCM 软件相机记录解剖特异性。拍摄从中取出细胞的冷冻切片组织的照片。
- 使用解剖图谱（在本例中为大鼠前脑图谱）确定该组织切片与前膛的距离，并将此信息记录为Z 距离 28。从照片中确定 X 和/或 Y 平面中的位置，以完全定位所选单元格。
- 戴手套，从QC区域取下LCM盖。接下来，将样品提取装置固定在LCM盖上。使用移液器将 5.5 μL 裂解缓冲液涂于所选细胞上。这现在称为示例。
注意：裂解缓冲液由 5 μL 重悬缓冲液和 0.5 μL 裂解增强剂组成。 - 将 0.5 mL 微量离心管安装到连接到 LCM 盖的样品提取装置上。将此布置置于75°C加热板上，样品和裂解缓冲液更靠近板。让样品加热15分钟。
- 使用0.01-0.02 x g 的低速离心机将样品和裂解缓冲液向下旋转到 0.5 mL 微量离心管底部。将样品储存在-80°C直至微流体qPCR。
7. 在平台上的微流控RT-qPCR上运行qPCR芯片
- 要测量单细胞样品的基因表达，请按如下所述进行mRNA预扩增。
注意：该方案不涉及mRNA提取，因为样品是含有非常低量的RNA（10 pg）的单细胞，这些RNA将在mRNA分离步骤中丢失。裂解单细胞并直接进行逆转录，以最大限度地减少样品损失。- 通过将每个被检测基因的 mRNA qPCR 基因引物（正向和反向）添加到 1.5 mL 微量离心管中来创建引物库。确保每个引物的最终浓度为500 nM。本实施例实验中的引物列于 补充表116中。
- 将 1 μL 5x cDNA 反应混合物移液到 96 孔 PCR 板的每个孔中。
- 通过将其从-80°C冰箱中取出并让其在室温下静置，让单细胞样品短暂解冻（2-3分钟）。使用0.01-0.02 x g 的低速离心机将样品旋转20-30秒。 将每个单细胞样品的5.5 μL移液到96孔PCR板中的不同孔中。
注意：在开始此步骤之前，确定要放入每个孔中的样品数量和类型。 - 96孔PCR板现在具有cDNA反应混合物，并向每个孔中添加单细胞样品。将该板放入65°C的热循环仪中1.5分钟以激活cDNA反应混合物。在4°C下以1，300× g 高速离心1分钟旋转内容物，并将PCR板放在湿冰上。
- 向 PCR 板的每个孔中移液 0.12 μL T4 基因 32 蛋白、0.73 μL DNA 悬浮缓冲液和 0.15 μL 10x cDNA 合成预混液。在热循环仪中通过以下方案运行PCR板：25°C5分钟，50°C30分钟，55°C25分钟，60°C5分钟，70°C10分钟，最终保持在4°C。
注意：噬菌体T4复制和修复需要T4基因32蛋白（单链DNA（ssDNA）结合蛋白）。将T4基因32蛋白用于方案的逆转录步骤，以提高逆转录的产量和效率，并提高PCR产物产量。 - 向PCR板的每个孔中移液7.5μLTaq聚合酶预混液。之后，在每个孔中，移液1.5μL在步骤7.1.1中创建的引物池。在热循环仪中通过以下线性预扩增步骤运行PCR板：95°C10分钟;22个循环：96°C5秒和60°C4分钟。
- 向PCR板的每个孔中移液1.2 μL核酸外切酶I、4.2 μLDNA悬浮缓冲液和0.6 μL 10x核酸外切酶I反应缓冲液。在热循环仪中通过以下方案运行PCR板：37°C30分钟，80°C15分钟。
注意：核酸外切酶催化从3'至5'方向的线性单链DNA中去除核苷酸。我们使用核酸外切酶进行样品净化，以去除预扩增后可能存在的未掺入引物和任何单链cDNA。 - 向PCR板的每个孔中移液54μLTE缓冲液。在4°C下以1，300× g 的高速离心机旋转5分钟以旋转PCR板的内容物。
- 如果计划继续方案的下一阶段，请将PCR板冷藏在4°C。 如果在预扩增阶段完成和微流控qPCR开始之间超过12小时，则盖上qPCR板并将其放入-20°C冰箱中。
- 如下所述制作用于qPCR芯片的样品板（新的96孔PCR板）。
- 如果将步骤7.1的预扩增PCR板置于-20°C冰箱中，则取出并在室温下解冻10分钟。
- 到新的 96 孔 PCR 板中，移液到每个孔中 4.55 μL PCR 超级混合物低 rox 和 0.45 μL 20x DNA 结合染料。然后，从步骤7.1中制备的PCR板中移取3 μL预扩增的样品。在4°C下以1，300× g 高速离心5分钟，以旋转PCR板并将PCR样品板放在冰上。
- 如下所述，为qPCR芯片制作检测板（新的96孔PCR板）。
- 到新的 96 孔 PCR 板中，移液到每个孔中 1.25 μL DNA 悬浮缓冲液和 3.75 μL 2x 检测上样试剂中。然后，在 2.5 μL 10 μM 引物中移取相应的 qPCR 引物。在4°C下以1，300×g高速离心5分钟，以旋转PCR板并将PCR测定板放在冰上。
- 准备 qPCR 芯片以加载到微流体 RT-qPCR 平台中，如下所述。
注意：qPCR 芯片是一种基于微流体原理工作的实时 qPCR 平台。qPCR 芯片本质上是 96 个样品通道和 96 个 RNA qPCR 引物通道（即测定）的矩阵，它们在 9，216 （96 x 96） 腔室中相交。在发生实时qPCR反应的阵列的每个腔室中组合样品和特定测定。读数以所用引物的阈值循环（Ct）值和扩增图的形式生成。- 将对照管路流体注入qPCR芯片进行启动。将qPCR芯片插入微流体混合装置中。选择素数 （136x） 脚本并运行此程序。
- 当程序在~45分钟后完成时，取出引物qPCR芯片。进入引物的qPCR芯片中，将6μL的反应物从PCR样品板移液到qPCR芯片中的相应样品孔中。
- 放入引物的qPCR芯片中，将6μL的反应物从PCR检测板移液到qPCR芯片中的相应测定孔中。
注意：qPCR芯片中的样品和测定孔的底部可能会形成气泡，这可以防止溶液进入微流体导管。在将qPCR芯片插入微流体混合装置之前，可以使用锋利的针头弹出或去除这些气泡。 - 将qPCR芯片插入微流体混合装置中。选择负载组合 （136x） 脚本并运行此程序。
- 将qPCR芯片加载到微流控RT-qPCR平台中。
- 打开微流体RT-qPCR平台并预热灯泡（~20分钟）。从微流体混合装置中取出qPCR芯片。从qPCR芯片底部撕下保护贴纸。
- 打开微流控RT-qPCR平台，将qPCR芯片加载到微流控RT-qPCR平台中。在微流控 RT-qPCR 平台上运行快速 96 x 96 PCR 方案（30 个循环）。
- 启动数据收集软件 - 单击 开始新运行。
- 验证芯片条形码和芯片类型 - 单击 下一步。单击 芯片运行 文件并浏览数据收集存储的文件位置。
- 单击 应用程序类型 ，然后选择 基因表达;选择 ROX 作为被动参考，选择 单探头 ，然后选择 EvaGreen 作为探头类型。
- 单击以选择热循环程序，然后选择 Biomark HD：GE快速96x96 PCR+Melt v2.pcl文件。
8. 数据分析
- 如下所述，将数据从 qPCR 芯片运行上传到 QC 分析软件以进行 QC。
- 下载数据分析软件。这可以在以下网站上找到：https://www.fluidigm.com/products-services/software#。启动软件以分析微流体RT-qPCR实验。
- 在软件中，打开 芯片运行。然后，打开实验创建的 ChipRun.bml 文件。将出现一个窗口，其中包含实验详细信息，包括被动参比、探针和 PCR 热程序。
注意：质量控制（QC）和数据分析可以在连接到微流体RT-qPCR平台的计算机上完成，也可以通过闪存驱动器或其他方式将.bml文件传输到 另一台计算机 。
- 定义示例设置，如下所述。
注意：此步骤为质量控制（QC）和数据分析程序创建样品和检测（qPCR引物）的标记模板。- 选择 芯片浏览器>样品板设置 并创建新的样品板。选择合适的容器类型和容器格式（SBS96用于此代表性实验中使用的96孔板）。
- 根据实验设计将示例标签粘贴到软件电子表格中，然后从“任务”菜单中选择“ 映射 ”。选择 SBS96-Left.dsp。示例设置现已映射。选择 “详细信息视图”>“分析 ”以更新文件中的这些更改。
注意：在单击 “分析 ”按钮之前，不会保存此软件中所做的任何更改。
- 在软件中定义控制样本。通过左键单击并按住来选择对照样本的单元格，同时拖动单元格以进行选择。可以通过按住 Ctrl 键并单击单个单元格来选择单个单元格。对于RNA标准样品（稀释系列），请输入样品名称和使用的RNA浓度。单击 分析 以保存。
- 定义与上述步骤8.2类似的检测器设置，但使用RT-qPCR测定名称，即所测定基因的名称。选择 检测板设置 并创建新的检测板。选择合适的容器类型和格式（SBS96 用于 96 孔板）。根据实验设计粘贴检测名称，然后单击 “分析 ”以保存。
- 开始用户质量控制 （QC） 过程，如下所述。
注意：该代表性实验使用循环时间（Ct）阈值方法。也就是说，未达到软件（自动全局）或手动（用户全局）定义的阈值信号的样品将被视为反应失败，不会包含在数据集中。- 选择 “分析视图”>任务框架。在分析设置窗格中，将设置更改为自动全局（自动计算应用于整个芯片的阈值）或用户全局。将基线校正设置为线性导数。如果使用用户全局，则必须手动确定失败阈值，如代表性试验中所示。
- 该代表性实验使用QC规则如下：如果单个测定或样品的失败率为70%或更高，则数据集中的整行或整列都失败。
- 手动查看 96 x 96 芯片中的每个反应。可视化扩增曲线和熔解曲线，以判断每个反应是否遵循预期的qPCR模式。如果扩增或熔解曲线与预期不匹配，则该反应失败。
- 按照 QC，通过选择“ 文件>导出 ”导出数据，并将数据集另存为.csv文件。
- 修剪数据集，因为导出的.csv文件同时具有通过-失败矩阵和具有原始 Ct 值的矩阵。使用通过-失败矩阵将数据集中的任何失败单元格替换为 NA。
- 下载最新版本的开源 R 软件，然后下载 R-Studio 应用程序。将规范化数据集上传到 R.分析适合研究的数据。
- 使用 -ΔΔCt 方法规范化数据集，如下所述。
注意：中位数居中或管家基因归一化可用于跨样本行以生成 -ΔCt 值。在代表性实验中，使用中位数居中并通过管家基因归一化进行验证。这可以以.csv格式或通过上传到数据分析软件来完成。- 对于中位数居中，计算根据单个样本（10 细胞池）的所有 Ct 值计算得出的中值。然后，从该中位数中减去所有单独的 Ct 值。这将产生一个 -ΔCt 值。
- 对于管家基因归一化，计算每个样本的管家基因（代表性实验中的Actb， Gapdh和 Ldha ）的平均表达，并使用此值作为减去单个Ct值的值。
- 要生成 -ΔΔC t 值，请取每个测定柱的中位数，该色谱柱现在包含 -ΔCt 值。从每个 -ΔC t 值中减去测定中位数以产生 -ΔΔCt 值。
- 使用 R 中的刻度函数计算每个 -ΔΔCt 值的 z 得分。使用 R 热图函数或单独的软件生成热图。
- 使用皮尔逊相关函数计算每个基因之间的皮尔逊相关性。使用 R 中的熔体函数组织数据集以获取其他功能。导出这些数据并将其上传到基因相关网络软件中。
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Representative Results
在LCM程序期间，单细胞收集的验证是目视进行的。在QC站评估细胞核。细胞类型可以通过该细胞类型的标记荧光团的发射及其一般形态来确定。如果在盖子上选择了不需要的细胞，则可以在QC站用紫外激光破坏它们的遗传物质。还需要通过分子分析进行进一步验证。在这个代表性的例子16中，除了小胶质细胞之外，还选择了两种类型的神经元——酪氨酸羟化酶（Th）阳性（+）和Th阴性（-）。 图1D 表明，本应是神经元的样本表现出神经元标记 NeuN 的统计学显着升高表达。同时，小胶质细胞样品的小胶质细胞标志物 CD34 和 Cx3xr1 显着升高，表明样品选择以高保真度进行。此外 ，与Th -神经元样品和小胶质细胞样品相比，Th+神经元样品表现出Th的表达显着升高，而Th-神经元表现出 GCG （前胰高血糖素编码基因）的表达显着升高，这表明这些Th-神经元样品富含使用GLP-1作为神经递质的神经元（图1D).一种称为线性判别分析的更全面的计算测量表明，这三种细胞类型在所有 65 个基因中具有不同的基因表达谱，其中神经元和小胶质细胞沿 x 轴分离，Th+ 和 Th- 神经元样本沿 y 轴分裂（图 1E）。
数据质量也通过批次内和批次间技术重复进行了验证（图2 和 图3）。批处理内复制对该特定批处理的数据质量的控制。如果批次内重复不一致，则可以从用于运行第一批的相同样品和检测板中进行另一个qPCR芯片实验。批次间复制可确保可以比较跨批次的数据。这对于需要多个批次的大量样品分析的实验至关重要，例如这个代表性示例。该实验中有一个异常值作为批次 40 中的样本 40（图 3）。然而，批次 1、2 和 3 中的样品 40 正确对齐，批次 4 的其他重复与批次 1、2 和 3 对齐，这表明这是一个孤立的不良反应，发生在这一次重复中。跨批次比较还需要适当的数据规范化技术。该实验使用中位数居中，尽管在该实验中也测定了管家基因（Actb， Gapdh， Ldha），并作为中位数居中方法的对照。也就是说，这两种方法都产生了高度相似的数据集，进一步表明数据质量很高。
图4显示了按细胞亚表型组织的GLP-1富集神经元样本的热图。该图不仅证明了细胞亚表型在神经生物学中的重要性，而且还证明了亚表型的比例如何通过酒精戒断而变化。热图显示，高度表达炎症基因簇1的亚表型A在8 h Wd时间点的比例增加，并在32 h Wd达到最大值。到176小时Wd，这种炎症亚表型正在使其患病率恢复正常。高度表达GABAR基因簇2的亚表型B表明，在176 h Wd条件下，该基因簇的表达受到总体抑制。这些发现证明了这种GLP-1神经元细胞类型如何通过增加其炎症亚表型并同时降低酒精戒断期间GABA亚表型中GABAR的表达水平而变得过度兴奋。图5将单个样品的基因表达组合成平均值，以便在整个时间序列中可视化基因簇的表达和该基因转录本的蛋白质位置。
图1：实验设计和单细胞选择。 （A）将大鼠三胞胎随机分配到五种治疗条件之一。（B）单细胞转录组数据生成。（C）所测定基因及其功能的卡通表示。绿色基因未进行检测。使用官方基因符号。（D）细胞类型标记的基因表达。误差线显示标准误差。神经元与小胶质细胞相比，p值分别= 0.0273，3.94 x 10-10，7.73 x 10-12。与Th-神经元（p = 4.56 x 10-11）和小胶质细胞（p = 2.95678 x 10-15）相比，Th+神经元表现出升高的Th表达。与Th+神经元（p = 0.0106）和小胶质细胞（p = 0.0435）相比，Th-神经元显示出GCG的表达升高，表明它们是GLP-1+神经元。*p < 0.05，***p < 4 x 10-10。（E）对所有样本的线性区分分析显示了在二维空间中收集的三种细胞类型之间测量的所有基因的差异。NE神经元和GLP-1神经元之间的质心距离= 3.30，NE神经元和小胶质细胞= 1.57，GLP-1神经元和小胶质细胞之间的质心距离= 2.92。该数字已修改自奥沙利文等人，202116。请点击此处查看此图的大图。
图 2：批次内原始 Ct 值的技术重复图。每个图表都显示芯片内技术重复的原始Ct值，这些重复相互绘制，证明了技术实验的完整性。该数字已修改自奥沙利文等人，202116。请点击此处查看此图的大图。
图 3：批次之间原始 Ct 值的技术重复图。 每个图表显示芯片间技术重复的原始Ct值，这些重复相互绘制，表明所有批次彼此可比。该数字已修改自奥沙利文等人，202116。请点击此处查看此图的大图。
图 4：GLP-1 富集神经元样本的热图。热图通过酒精戒断时间序列显示富含GLP-1的神经元样本的细胞亚表型。行表示 10 个细胞合并的样本，其中细胞亚表型簇用大写字母标记。列表示该样本中该基因在 -1 到 +1 色标上的 -ΔΔCt 基因表达值的 z 得分。基因簇按编号标记。该数字已修改自奥沙利文等人，202116。请点击此处查看此图的大图。
图 5：GLP-1 富集神经元样本中的表型基因表达。细胞图显示的框表示图4热图所示亚表型的相对基因表达（平均z得分为-ΔΔCt值）。这些图表是使用Cytoscape版本3.8.0构建的，z分数是使用R版本3.5.2中的尺度函数计算的。-ΔΔCt标签右边显示哪些框对应于哪个基因，颜色代表表达（蓝色表示低表达，黄色表示高表达）。盒子的位置代表来自该基因转录本的蛋白质产物的定位或功能。绿色数字表示亚表型内的亚组。该数字已修改自奥沙利文等人，202116。请点击此处查看此图的大图。
图6：内感受迷走神经回路，内脏 - 情绪神经轴，以及成瘾的对手过程模型示意图。 （A）内感受性迷走神经传入将受肠道菌群高度影响的肠道状态和其他外周器官传递到孤立束核（NTS）。这些信息随后被传递到杏仁核并影响情绪状态。（B）一个简化的卡通表示，显示了孤核（NTS）和杏仁核中央核（CeA）在情绪，压力和自主调节中的整合作用。突出显示了两种神经元亚型，GLP-1 和 NE 神经元。为了清楚起见，省略了许多解剖学和功能连接。缩写：NE = 去甲肾上腺素;GLP-1=胰高血糖素样肽1;GABA = γ-氨基丁酸;HPA轴=下丘脑-垂体-肾上腺轴;CRF = 促肾上腺皮质激素释放激素。（C）酒精和/或阿片类药物暴露有两个作用：通过中脑边缘多巴胺途径 刺激 奖励，并抑制抗奖励。这些行为通过正强化 来 激励物质使用。（D）酒精和/或阿片类药物戒断有两个作用：抑制奖励，通过抑制中脑边缘多巴胺途径（未显示）和刺激抗奖励。这项研究提出，内脏情绪神经炎症是抗奖励刺激的终点，尽管这一假设值得进一步测试。这些行为，无论机制如何，都通过负强化 来 激发物质依赖。该数字已修改自奥沙利文等人，202116。 请点击此处查看此图的大图。
补充表1：微流体RT-qPCR的引物。 列出所有用于mRNA扩增的引物对以及每个引物对形成的扩增子长度。此表已修改自奥沙利文等人 202116。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
酒精使用障碍仍然是一种具有挑战性的疾病。我们的团队通过从系统神经科学的角度研究反奖励过程来研究这种疾病。我们测量了酒精戒断时间序列16中单个NTS神经元和小胶质细胞的基因表达变化。选择NTS是因为其在酒精戒断综合征中发生的自主神经失调中的突出作用。我们将LCM与单细胞微流体RT-qPCR相结合，允许以低成本测量稳定数量的样品和基因，具有解剖学和分子敏感性和特异性（图1B-C）。通过IHC染色鉴定和选择单细胞，并通过分子表达验证这些细胞亚表型分组（图1D-E）。然而，一些GLP-1富集的神经元样本（TH-神经元）适度表达Th（图4）。基于荧光可视化的细胞选择在细胞选择时建立了细胞表型，并且该标准用于研究，因为基于单个基因Th表达的分子分组未能定义提示细胞表型16的表达模式。因此，结果表征了主要的NTS小胶质细胞和神经元亚表型及其在酒精戒断中的动力学。
本手稿描述了一种单细胞转录组学的方法，并且必须按照所述遵循协议中的所有步骤。当处理不同的器官组织或细胞类型时，可能需要进行一些修改。该方案的挑战之一是在LCM期间保持RNA质量和完整性。我们已经建立了IHC染色，LCM和微流体RT-qPCR的协议，以应对上述挑战。简而言之，这些过程包括向所有染色溶液中添加RNase抑制剂以防止RNA降解，快速染色方案以防止可能的RNA降解，在IHC染色和脱水后立即处理LCM载玻片，并在样品处理或转移过程中尽可能保持适当的低温条件。
转录组学测定在没有RNA分离的情况下对裂解的单细胞进行，然后进行逆转录，预扩增和qPCR。预扩增步骤是选择性地将cDNA分子扩增到qPCR的可检测水平。预扩增步骤有几个限制。这些包括无法扩增的基因转录本，这将导致在微流体RT-qPCR中无法检测到。由于PCR反应包含用于实验测定的所有引物，因此也有可能形成引物二聚体。也就是说，在实验中形成具有单个引物对的正向和反向序列以及所有正向和反向序列的二聚体是可能的。因此，建议使用RNA标准品等阳性实验对照进行引物检测。
RT-qPCR芯片设计是该协议质量控制和批次效应的另一个关键方面。阳性对照由来自被测定的动物和器官的标准RNA组成（在这个代表性例子中是大鼠脑）。然后可以将RNA稀释系列加载到每个芯片中，并且应该为所测定的每个基因展示适当的定量信号。水可用作阴性对照。这些控件对于适当的归一化至关重要，这些规范化控制了组合来自不同芯片的数据时可能发生的批处理效果。步骤 8 中对此进行了详细讨论。
在这里显示的代表性实验中，这些方法被用于假设生成并提供对可能机制的见解。该研究是在另一项工作的背景下进行的，并为拦截反奖励假说13提供了重要信息。简而言之，该模型推测抗奖励是通过从迷走神经通过NTS 到 杏仁核的内感受信号刺激物质戒断的，并且这种抗奖励的初始底物是神经炎症（图6）。这项工作通过确定酒精戒断时神经元和小胶质细胞中基因表达的炎症变化来支持这一假设。
这项研究的一个主要弱点是缺乏机械论主张。但是，这些方法可用于在执行诸如此类的基线实验后确定机制。例如，动物模型干预或扰动，例如膈下迷走神经切断术或基因敲除术，可以证明炎症调节因子的解剖学或遗传机制。采用这种方法的未来研究可能有助于内感受性抗奖励假说的发展，该假说旨在将这些见解实施到成瘾治疗的临床实践中。
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Disclosures
提交人声明，他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这里介绍的工作由NIH HLB U01 HL133360授予JS和RV，NIDA R21 DA036372授予JS和EVB，T32 AA-007463授予Jan Hoek以支持SJO'S，以及国家酒精中毒和酒精滥用研究所：R01 AA018873资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | abcam | ab112 | Stain for TH+ neurons |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer Kit | ThermoFisher Scientific | 11739010 | Invitrogen |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | R37118 | Seconadry Antibody |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A28180 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | NA |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
| TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mL | USA Scientific | 1402-9700 | NA |
References
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