Summary
레이저 포획 미세 해부와 미세 유체 RT-qPCR의 조합은 단일 뉴런 및 아교 세포에서 전사체를 측정 할 때 해부학 적 및 생물 공학적 특이성을 제공합니다. 정신 질환에 대한 시스템의 생물학적 접근 방식으로 창의적인 방법을 적용하면 중독에 대한 신경 염증 보상 가설과 같은 이해와 치료의 돌파구로 이어질 수 있습니다.
Abstract
중독 행동의 증가율은 정신 건강 연구자와 임상의 모두가 안티 보상과 회복을 이해하도록 동기를 부여했습니다. 보상과 시작에서 벗어나는 이러한 전환은 중독을 조사하는 데 적용되는 방법의 확장과 함께 새로운 관점, 패러다임 및 가설을 필요로합니다. 여기에서는 레이저 포획 미세 해부(LCM)와 고처리량 미세유체 역전사 정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)을 결합한 안티보상을 조사하기 위한 시스템 생물학 접근 방식을 제공합니다. 유전자 발현 네트워크 역학을 측정하고 알코올 및 오피오이드 금단에서 신경 내장 조절 장애의 주요 동인인 신경 염증을 확인했습니다. 이러한 기술의 조합은 높은 처리량 감도 및 특정 유전자 발현 측정과 함께 단일 세포 분해능에서 해부학적 및 표현형 특이성을 제공하여 가설 생성 데이터 세트와 새로운 통찰력 및 치료 기회를 생성하는 기계론적 가능성을 모두 제공합니다.
Introduction
중독은 선진국에서 여전히 증가하는 도전으로 남아 있습니다 1,2. 주요 과학 및 임상 발전에도 불구하고 중독률은 계속 증가하는 반면 기존 치료법의 효능은 기껏해야 안정적으로 유지됩니다 3,4,5. 그러나 생명 공학과 과학적 접근의 발전으로 물질 의존의 병태 생리학을 추가로 조사하기위한 새로운 방법과 가설이 생겨났습니다 6,7,8. 실제로, 최근의 발전은 새로운 개념과 치료 패러다임이 사회적, 경제적, 정치적 결과를 가져 오는 돌파구로 이어질 수 있음을 시사합니다 9,10,11,12.
우리는 알코올 및 오피오이드 의존13,14,15,16의 중단에 대한 보상에 대한 반보상을 조사했습니다. 방법은이 패러다임17,18의 핵심입니다. 레이저 포획 미세 해부(LCM)는 해부학적 특이성이 높은 단일 세포를 선택할 수 있습니다. 이 기능은 신경교와 뉴런 모두 동일한 동물13,14,15,16,19의 동일한 뉴런 하핵에서 수집 및 분석될 수 있기 때문에 신경염증 항보상 가설에 필수적입니다. 그런 다음 선택된 세포의 전사체의 관련 부분을 고처리량 미세유체 역전사 정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)으로 측정하여 기능적 네트워크(20,21)에 대한 통찰력을 제공하는 전산 분석을 위한 고차원 데이터 세트를 제공할 수 있습니다.
특정 뇌핵의 뉴런과 아교세포에서 전사체의 하위 집합을 측정하면 샘플 수와 측정된 유전자 모두에서 견고하고 민감하고 특이적인 데이터 세트가 생성됩니다. 이러한 도구는 주로 성상 세포와 미세 아교 세포와 같은 아교 세포가 지난 10 년 동안 신경 및 정신 질환에서 중심적인 역할을 입증했기 때문에 정신 질환에 대한 시스템의 신경 과학적 접근 방식에 최적입니다22,23. 우리의 접근 방식은 국소 파라크린 신호 전달에 관여하는 수많은 수용체와 리간드에서 동시에 신경교와 뉴런의 표현 반응을 측정할 수 있습니다. 실제로, 시그널링은 퍼지 로직(24)과 같은 다양한 정량적 방법을 사용하여 이들 데이터세트로부터 추론될 수 있다. 또한, 뉴런 또는 아교 세포에서 세포 하위 표현형과 그 기능을 식별하면 특정 핵의 뇌 세포가 단일 세포 수준에서 어떻게 조직, 반응 및 조절 장애에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 기능 시스템의 역학은 시계열 실험16으로도 모델링 할 수 있습니다. 마지막으로, 동물 모델은이 시스템의 접근 방식에 기계 론적 조건을 부여하기 위해 해부학 적 또는 약리학 적으로 교란 될 수 있습니다.
대표적인 실험:
아래에서는 이러한 방법의 적용 예를 제공합니다. 이 연구는 알코올 의존 및 후속 금단에 대한 반응으로 단독 핵 (NTS)에서 쥐 신경 및 미세 아교 세포 유전자 발현을 조사했습니다16. 쥐 코호트는 1) 대조군, 2) 에탄올 의존성 (EtOH), 3) 8 시간 철수 (Wd), 4) 32 시간 Wd 및 5) 176 h Wd로 구성되었습니다 (그림 1A). 빠른 참수 후, 뇌간을 전뇌에서 분리하고 냉동 절제하고, 티로신 하이드록실라제 양성(TH +) 뉴런과 미세아교세포에 대해 절편을 염색했습니다(그림 1B). LCM은 TH+ 및 TH- 뉴런과 미세아교세포 모두를 수집하는데 사용되었다. 모든 세포는 NTS에서 추출하고 10 세포 풀의 샘플로 분석했습니다. 4개의 96 x 96 마이크로유체 RT-qPCR 동적 어레이를 65개의 유전자를 측정하는 RT-qPCR 플랫폼에서 실행했습니다(그림 1B-C). 데이터는 -ΔΔCt 방법을 사용하여 정규화하고 R을 사용하여 분석했으며 단일 세포 선택은 분자 마커로 검증되었습니다 (그림 1D-E). 기술 검증은 단일 배치 내에서 그리고 배치 전반에 걸쳐 분석된 기술 복제에 의해 추가로 검증되었습니다(그림 2 및 그림 3). TH+ 및 TH- 뉴런은 유사한 염증성 유전자 클러스터를 갖지만 γ-아미노부티르산(GABA) 수용체(R) 클러스터가 다른 서로 다른 하위 표현형으로 구성됩니다(그림 4 및 그림 5). 염증성 유전자 클러스터의 발현이 상승한 하위 표현형은 32시간 Wd에서 과대 발현된 반면 GABA 수용체(GABAR) 발현은 장기간 알코올 금단(176시간 Wd)에서 낮게 유지되었습니다. 이 연구는 알코올 및 오피오이드 의존성에 대한 보상 반대 가설에 기여하며, 이는 금단 시 내장의 차단 피드백이 내장-정서적 뉴런 핵(즉, NTS 및 편도체)의 조절 장애에 기여하여 물질 의존에 기여하는 더 심각한 자율 및 정서적 후유증을 초래한다고 추측합니다(그림 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 연구는 토마스 제퍼슨 대학의 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 권고에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 Thomas Jefferson University IACUC의 승인을 받았습니다.
1. 동물 모델
- 하우스 수컷 Sprague Dawley (>120 g, Harlan, Indianapolis, IN, USA) 쥐 세 쌍둥이는 에탄올 차우 (2 마리) 또는 대조군 차우 혼합물 (1 쥐)에 자유롭게 접근 할 수 있습니다.
참고 :이 대표적인 실험은 알코올 금단25,26의 신경 생물학을 연구하기 위해 Lieber-DeCarli 프로토콜을 사용했습니다. 쥐 세 쌍둥이는 동일한 수의 칼로리를 섭취하는 3 마리의 쥐 코호트로 구성되지만 희생시 연구의 다른 팔에 들어갑니다. 이 연구의 세 가지 부문은 1) 대조군, 2) 에탄올 의존성 (EtOH) 및 3) 철수 (Wd)입니다 (그림 1A). 이 연구에는 3 개의 알코올 금단 시점이 있으므로 총 5 가지 조건이 있습니다 (그림 1A).- 격일로, Wd 래트가 소비한 에탄올-차우 혼합물을 측정하고 소비된 양을 동일한 양의 에탄올 혼합물로 EtOH 래트 공급기로 교체한다. 동등한 양의 대조군 혼합물을 대조군 쥐의 피더에 추가하십시오.
알림: 평균 일일 에탄올 소비량은 3 주 후 약 12-16 g / kg입니다26. - 안정적인 장기 에탄올 섭취 및 의존성 (>5 주) 후, Wd 쥐의 음식 용기를 비우고 대조 혼합물로 채워서 급성 알코올 금단을 유도합니다. 세 마리의 쥐 모두가 동일한 일주기 시점21에서 희생되는 방식으로 이것을 수행하십시오.
- 미리 선택된 시점에서, 삼중항에 있는 3마리의 쥐를 동시에 희생시킨다(Control, EtOH, 및 Wd).
- 격일로, Wd 래트가 소비한 에탄올-차우 혼합물을 측정하고 소비된 양을 동일한 양의 에탄올 혼합물로 EtOH 래트 공급기로 교체한다. 동등한 양의 대조군 혼합물을 대조군 쥐의 피더에 추가하십시오.
2. 샘플 수확
- 적절한 Wd 시점(8h, 32h, 176h)에서 각 쥐 삼중항에 대해 동일한 일주기 시점에서 뇌를 수확한다.
- RNA 무결성을 보존하기 위해 신선한 조직의 급속 냉각을 위해 메탄올 및 드라이 아이스 욕조를 준비하십시오. 옆에 두십시오.
- 쥐를 이소 플루 란 탱크 (산소 중 5 %)에 ~ 30 초 동안 또는 호흡 수 감소 및 운동 활동 부재로 표시된 대로 의식 상실이 발생할 때까지 두십시오. 쥐 머리를 적절하게 날카롭게 한 단두대에 넣어 빠르게 참수하십시오.
- 동물의 두개골을 열어 집게를 사용하여 뇌를 해부하십시오. 심한 슬라이스로 휴대용 면도기로 신선한 뇌에서 소뇌를 제거하고 폐기하십시오. 횡단 절개로 전뇌에서 뇌간을 자릅니다.
알림: 휴대용 면도기를 사용하여 실험 설계에 따라 전뇌 또는 뇌간을 왼쪽 및 오른쪽 반구로 반분할 수 있습니다. 예를 들어, 서로 다른 방법으로 한 반구의 결과를 검증하려면 왼쪽-오른쪽 발산을 조사하거나 표본 수를 늘리십시오. - 조직 샘플이 완전히 잠길 수 있도록 조직 매립 금형에 최적의 절단 온도(O.C.T.) 매체를 약 3-4cm 깊이까지 추가합니다. 조직, 전뇌 및/또는 뇌간을 조직 매립 몰드에 넣고 O.C.T.를 더 추가하여 조직 샘플을 완전히 덮습니다.
- 조직 샘플(쥐 전뇌)이 포함된 플라스틱 조직 매립 몰드를 드라이아이스와 메탄올의 냉각조에 추가하여 조직 샘플을 즉시 동결시킵니다. 매립 몰드의 조직 샘플을 조직 수집이 완료될 때까지 냉각 수조에 그대로 두되 15분을 넘지 않도록 합니다.
알림: 메탄올이 티슈 용기에 쏟아지지 않도록 주의하십시오. - 조직 샘플을 -80°C에서 신속하게 보관합니다.
참고: 미세유체 RT-qPCR은 mRNA 전사체를 증폭하고 측정하여 유전자 발현을 측정합니다. 이러한 전사체는 상대적으로 불안정하므로 mRNA 분해를 방지하기 위해 샘플을 가능한 한 차갑게 유지하기 위해이 과정에서 많은 단계가 수행됩니다.
3. 냉동 제거
참고: 쥐 뉴런 핵은 약 10μm입니다. 따라서 10μm가 이 동물 모델에 대한 최적의 슬라이스 두께입니다. 슬라이스 두께는 연구를 위한 동물 모델에 따라 조정된다.
- -80°C 냉동고에서 얼어붙은 뇌간이 들어 있는 티슈 매립 몰드를 꺼내 -20°C에서 냉동 유지 장치에서 5-10분 동안 해동합니다. mRNA 보존을 위해 이러한 동결-해동을 단 1회만 -20°C로 수행한다.
- 휴대용 면도기로 플라스틱 임베딩 금형의 모서리를 수직으로 자릅니다. 플라스틱 조직 내장 금형에서 O.C.T.에 내장된 뇌간을 제거합니다. -20 ° C로 설정된 저온 유지 장치의 척에서 실온 액체 O.C.T.를 접착제로 사용하여 관상 동맥 냉동 절제를 위해 주둥이에서 꼬리 방향으로 뇌간을 장착합니다.
- 관심 영역(NTS)을 포함하는 섹션에 도달할 때까지 쥐 뇌간에서 주둥이에서 꼬리 방향으로 10μm 관상 냉동 절개를 자릅니다. 이 극저온 절편의 높이와 너비는 플라스틱 임베딩 금형의 치수를 기준으로 ~200mm입니다.
- NTS 또는 연구를 기반으로 한 다른 관심 영역을 포함하는 뇌간 조직의 10μm 냉동 절편을 실온 일반 유리 슬라이드에 해동 장착하여 수집합니다. 섹션이 있는 이 슬라이드를 드라이아이스 위에 있는 냉각 금속 팬에 빠르게 놓습니다. 가능한 한 빨리 냉동 절개가 포함된 유리 슬라이드를 -80°C 냉동고에 넣어 보관하십시오.
알림: 단일 유리 슬라이드는 너비와 높이가 ~ 10mm이므로 여러 개의 200μm 냉동 절편에 맞을 수 있습니다. 따라서 동일한 슬라이드에는 별개의 세포 유형에 대해 염색된 냉동 절개가 포함될 수 있습니다.- 슬라이드에 여러 섹션이 있는 경우 100mm의 빈 공간으로 분리되어 있는지 확인합니다. 냉동 절편 사이에 테두리를 만들려면 소수성 펜을 사용하십시오. 이를 통해 동일한 유리 슬라이드에서 서로 다른 세포 유형에 대해 서로 다른 항체 용액을 염색할 수 있습니다. 유리 슬라이드 가장자리에서 냉동 절제를위한 20mm의 공간을 유지하십시오.
4. 단일세포의 면역형광염색
- 뇌 저온 절개에 대한 신속한 염색 면역 형광 프로토콜을 사용하여 LCM을 사용하여 수집하기 위해 원하는 뇌 세포 유형(뉴런, 미세아교세포, 성상 세포 등)을 라벨링합니다.
참고: 이러한 실험에 사용된 면역조직화학 염색 프로토콜은 이 과정에서 과도한 mRNA 분해를 방지하기 위해 신속하게 설계되었습니다.- -80°C 냉동고에서 NTS를 함유한 쥐 뇌간의 10μm 냉동 절개가 포함된 유리 슬라이드를 꺼냅니다. 30 초 동안 슬라이드를 75 % 에탄올 욕조에 담그면 냉동 절단 된 조직이 고정됩니다. 과도한 액체를 제거하십시오.
- 고정된 냉동 절개된 뇌간 조직에 항체의 비표적 결합을 차단하기 위해 인산염 완충 식염수(PBS)에 2% 소 혈청 알부민(BSA)을 30초 동안 적용합니다. 그런 다음 PBS로 씻으십시오.
- 냉동 절개된 조직(현재 고정 및 차단)을 덮을 수 있도록 충분한 양의 1차 항체 용액을 적용합니다. 조직 절편을 1차 항체 용액에서 2분 동안 배양합니다. 2 % BSA 용액으로 티슈를 한 번 씻으십시오. 1차 항체 용액은 차단을 위한 BSA-PBS 용액의 96%, 1차 항체 3%, RNase 억제제 1%를 함유한다. 1차 항체는 1:25 비율로 희석하였다.
참고: 이 대표적인 실험에서 1차 항체는 항-NeuN 항체와 항-Cd11β 항체로 구성됩니다. 뉴런은 TH+ 및 TH- 서브그룹으로 더 세분화되었으므로 뉴런 염색을 위한 1차 항체 용액은 BSA PBS 용액의 93%, 항-NeuN 항체 3%, 항-티로신 하이드록실라제 항체 3% 및 1% RNase Out을 함유했습니다. - 뇌간 조직을 덮을 수 있도록 충분한 양의 2차 항체(1:200) 용액을 적용합니다. 2 차 항체 용액이 조직을 목욕하게하십시오. 3분 후 2% BSA 용액으로 티슈를 한 번 씻습니다.
참고: 2차 항체를 함유하는 용액은 196.5 μL의 2% BSA, 1 μL의 염소 항-마우스 세포 유형에 대한 555 nm 형광 태그, TH 염색을 위한 1 μL 당나귀 항-토끼 알렉사 488 nm, 2.5 μL RNase 억제제, 및 1.3 μL의 DAPI(1:10000)로 구성되었다.
5. 표준 에탄올 및 크실렌 조직 탈수 시리즈
- 염색 된 냉동 절단 된 티슈가 놓여있는 유리 슬라이드를 75 % 에탄올 배스에 30 초 동안 놓은 다음 95 % 에탄올 배스에 30 초, 100 % 에탄올 배스에 30 초, 마지막으로 100 % 에탄올을 30 초 동안 놓습니다 (두 번째 용기에).
- 에탄올 탈수 시리즈를 완료 한 후 두 개의 신선한 100 % 자일 렌 욕조를 붓습니다. 그런 다음 유리 슬라이드를 첫 번째 크실렌 욕조에 1분 동안 놓습니다. 슬라이드를 빠르게 제거하고 다른 신선한 크실렌 욕조에 4분 동안 넣습니다.
- 크실렌에서 염색 및 탈수 된 조직 냉동 절개가 포함 된 유리 슬라이드를 꺼내 어둡지 만 통풍이 잘되는 용기에 5 분 동안 넣어 자연 건조시킵니다. 공기 건조 후 최종 건조를 위해 유리 슬라이드를 데시케이터에 5분 동안 두십시오.
6. 레이저 포획 미세 해부(LCM)를 사용하여 단일 세포 선택
- 염색, 고정 및 탈수 조직 냉동 절개가 포함된 유리 슬라이드를 LCM 현미경 샘플 홀더에 삽입합니다. 해부학적 랜드마크를 사용하여 세포 수집이 수행될 관심 영역을 찾습니다(이 대표적인 예에서는 NTS).
- 현미경 형광을 켜고 관심 있는 염색된 세포 유형을 찾습니다. 원하는 세포의 핵이 관심 영역에 있고 다른 세포의 핵과 >3mm 거리만큼 분리되어 있는지 확인하십시오. LCM 소프트웨어를 사용하여 수집할 하나의 셀(실험이 실제 단일 셀인 경우) 또는 여러 셀(실험에서 풀링된 단일 셀 샘플[즉, 단일 셀 스케일]이 필요한 경우)을 식별하고 표시합니다.
참고: 10-셀 풀로 구성된 샘플이 이 대표적인 실험에 사용되었습니다. 이는 샘플 간의 유전자 발현 가변성을 줄이고 분석되는 단일 세포의 수를 늘리기 위해 수행되지만 여전히 단일 세포 규모 실험으로 남아 있습니다. 진정한 단일 세포 실험은이 방법20,27로 완료 할 수 있습니다. 추가적으로, 더 큰 조직 절편이 또한 선택될 수 있다(21). - 원하는 세포를 선택한 후 LCM 로봇 암을 사용하여 표시된 조직 냉동 절개의 관심 영역에 LCM 캡을 놓습니다.
- 테스트 샷을 사용하여 적외선(IR) 레이저의 강도와 타겟팅을 보정합니다.
참고: 이 작업은 각 샘플에 대해 수행됩니다. 실험이 아닌 조직을 실수로 선택하지 않도록 조직 바로 위에 있지 않은 캡 부분에서 보정을 수행해야합니다.- 강도를 보정하려면 IR 레이저 샷의 지속 시간, 강도 및 크기를 조정하여 샷이 단일 세포 핵을 선택할 수 있을 만큼 캡 접착제만 녹이고 슬라이드의 냉동 절개까지 캡을 녹일 수 있을 만큼 충분히 강하도록 합니다. 이러한 값은 각 한도마다 다릅니다.
- 레이저가 캡을 녹인 위치를 정확하게 파악하여 타겟팅을 보정합니다.
- LCM 적외선 레이저를 발사하여 식별 된 세포를 모아 해당 세포 위의 냉동 절단 된 조직에 캡을 녹입니다. LCM 현미경의 품질 관리(QC) 영역에 캡을 배치하기 위해 로봇 팔을 사용하여 선택한 세포만 조직 절편에서 들어 올려졌는지 확인합니다. 캡의 과도한 세포를 제거하려면 자외선(UV) 레이저를 사용하여 여분의 세포의 유전 물질을 제거하십시오.
- LCM 소프트웨어 카메라로 해부학적 특이성을 기록합니다. 세포가 제거 된 냉동 절단 조직의 사진을 찍습니다.
- 해부학적 아틀라스(이 예에서는 쥐 전뇌의 아틀라스)를 사용하여 브레그마에서 이 조직 슬라이스의 거리를 결정하고 이 정보를 Z 거리(28)로 기록합니다. 사진에서 X 및/또는 Y 평면의 위치를 결정하여 선택한 셀의 위치를 완전히 파악합니다.
- 장갑을 낀 손으로 QC 영역에서 LCM 캡을 제거합니다. 그런 다음 시료 추출 장치를 LCM 캡에 고정합니다. 피펫을 사용하여 선택한 셀에 5.5μL의 용해 완충액을 적용합니다. 이제 이를 샘플이라고 합니다.
알림: 용해 완충액은 5μL 재현탁 완충액과 0.5μL의 용해 강화제로 구성됩니다. - 0.5mL 마이크로 원심분리 튜브를 LCM 캡에 부착된 시료 추출 장치에 장착합니다. 이 배열을 샘플과 용해 버퍼가 플레이트에 더 가까운 75°C 핫플레이트에 놓습니다. 샘플을 15분 동안 가열합니다.
- 0.01-0.02 x g 의 저속 원심분리기를 사용하여 시료와 용해 완충액을 0.5mL 미세 원심분리 튜브의 바닥으로 회전시킵니다. 마이크로유체가 qPCR이 될 때까지 샘플을 -80°C에서 저장한다.
7. 플랫폼에서 미세유체 RT-qPCR에서 qPCR 칩 실행
- 단일 세포 샘플에 대한 유전자 발현을 측정하려면 아래에 설명된 대로 mRNA 사전 증폭을 수행합니다.
참고: 샘플은 mRNA 분리 단계에서 손실되는 매우 적은 양의 RNA(10pg)를 포함하는 단일 세포이므로 프로토콜은 mRNA 추출을 포함하지 않습니다. 단일 세포는 용해되고 샘플 손실을 최소화하기 위해 역전사를 위해 직접 진행됩니다.- 분석 중인 모든 유전자에 대한 mRNA qPCR 유전자 프라이머(정방향 및 역방향)를 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 추가하여 프라이머 풀을 만듭니다. 각 프라이머의 최종 농도가 500 nM인지 확인하십시오. 본 실험에서 실시예 1의 프라이머는 보충표 116에 열거되어 있다.
- 5x cDNA 반응 1μL를 96웰 PCR 플레이트의 모든 웰에 피펫팅하여 혼합합니다.
- 단일 세포 샘플을 -80°C 냉동고에서 꺼내 실온에 두어 잠깐(2-3분) 해동시킵니다. 0.01-0.02 x g 에서 저속 원심분리기를 사용하여 샘플을 20-30초 동안 스핀다운합니다. 각 단일 세포 샘플 5.5μL를 96웰 PCR 플레이트의 다른 웰에 피펫팅합니다.
알림: 각 웰에 넣을 샘플 번호와 유형은 이 단계를 시작하기 전에 결정됩니다. - 이제 96웰 PCR 플레이트에는 cDNA 반응 혼합물과 단일 세포 샘플이 각 웰에 추가되었습니다. 이 플레이트를 65°C에서 1.5분 동안 열순환기에 넣어 cDNA 반응 혼합물을 활성화합니다. 4°C에서 1분 동안 1,300 x g 의 고속 원심분리를 사용하여 내용물을 스핀다운하고 PCR 플레이트를 젖은 얼음 위에 놓습니다.
- PCR 플레이트의 각 웰에 0.12 μL의 T4 Gene 32 단백질, 0.73 μL의 DNA 현탁 완충액, 및 0.15 μL의 10x cDNA 합성 마스터 믹스를 피펫팅합니다. 열순환기에서 다음 프로토콜을 통해 PCR 플레이트를 실행합니다: 5분 동안 25°C, 30분 동안 50°C, 25분 동안 55°C, 5분 동안 60°C, 10분 동안 70°C, 및 4°C에서 최종 유지.
참고: T4 유전자 32 단백질(단일 가닥 DNA(ssDNA) 결합 단백질)은 박테리오파지 T4 복제 및 복구에 필요합니다. T4 Gene 32 단백질을 역전사의 수율 및 효율을 개선하고 PCR 산물 수율을 증가시키기 위해 프로토콜의 역전사 단계에서 사용하였다. - PCR 플레이트의 각 웰에 7.5 μL의 Taq 중합효소 마스터 믹스를 피펫팅한다. 이어서, 각 웰에 1.5 μL의 프라이머 풀을 7.1.1 단계에서 만들었다. 열순환기에서 다음의 선형 예비증폭 단계를 통해 PCR 플레이트를 실행한다: 10분 동안 95°C; 22 사이클 : 5 초 동안 96 ° C 및 4 분 동안 60 ° C.
- PCR 플레이트의 각 웰에 1.2 μL의 엑소뉴클레아제 I, 4.2 μL의 DNA 현탁액 완충액 및 0.6 μL의 10x 엑소뉴클레아제 I 반응 완충액을 피펫팅하였다. 열순환기에서 다음 프로토콜을 통해 PCR 플레이트를 실행합니다: 30분 동안 37°C, 15분 동안 80°C.
참고: 엑소뉴클레아제는 3'에서 5' 방향으로 선형 단일 가닥 DNA에서 뉴클레오티드 제거를 촉매합니다. 우리는 사전 증폭 후에 존재할 수 있는 통합되지 않은 프라이머 및 단일 가닥 cDNA의 제거를 위한 샘플 세척을 위해 엑소뉴클레아제를 사용합니다. - 각 웰을 PCR 플레이트에 넣고, 54 μL의 TE 완충액을 피펫팅한다. 1,300 x g 의 고속 원심분리기를 사용하여 4°C에서 5분 동안 PCR 플레이트의 내용물을 스핀다운합니다.
- 프로토콜의 다음 단계를 계속할 계획이라면 PCR 플레이트를 4°C에서 냉장 보관합니다. 사전 증폭 단계의 완료와 미세유체 qPCR의 시작 사이에 12시간 이상이 있는 경우, qPCR 플레이트를 덮고 -20°C 냉동고에 넣는다.
- 아래에 설명된 대로 qPCR 칩용 샘플 플레이트(새로운 96-웰 PCR 플레이트)를 만듭니다.
- 단계 7.1로부터의 사전 증폭 PCR 플레이트를 -20°C 냉동고에 넣은 경우, 제거하고 실온에서 10분 동안 해동시켰다.
- 새로운 96웰 PCR 플레이트에 넣고 각 웰에 4.55μL의 PCR 슈퍼믹스 저록스와 0.45μL의 20x DNA 결합 염료를 피펫팅합니다. 이어서, 단계 7.1에서 만들어진 PCR 플레이트로부터 미리 증폭된 샘플 3 μL를 피펫팅한다. 4°C에서 5분 동안 1,300 x g 의 고속 원심분리를 사용하여 PCR 플레이트를 스핀다운하고 PCR 샘플 플레이트를 얼음 위에 놓습니다.
- 아래에 설명된 대로 qPCR 칩에 대한 분석 플레이트(새로운 96웰 PCR 플레이트)를 만듭니다.
- 새로운 96웰 PCR 플레이트에 피펫팅하여 각 웰에 1.25μL의 DNA 현탁액 버퍼와 3.75μL의 2x 분석 로딩 시약을 넣습니다. 이어서, 상응하는 qPCR 프라이머를 10 μM 프라이머 중 2.5 μL로 피펫팅한다. 1,300 x g의 고속 원심분리기를 사용하여 4°C에서 5분 동안 PCR 플레이트를 스핀다운하고 PCR 분석 플레이트를 얼음 위에 놓습니다.
- 하기에 설명된 바와 같이 마이크로유체 RT-qPCR 플랫폼에 로딩하기 위한 qPCR 칩을 준비합니다.
참고: qPCR 칩은 미세유체 원리에 따라 작동하는 실시간 qPCR 플랫폼입니다. qPCR 칩은 본질적으로 9,216(96 x 96) 챔버에서 교차하는 96개의 샘플 채널과 96개의 RNA qPCR 프라이머 채널(즉, 분석)의 매트릭스입니다. 샘플과 특정 분석은 실시간 qPCR 반응이 발생하는 어레이의 각 챔버에서 결합됩니다. 판독값은 사용된 프라이머에 대한 임계값 주기(Ct) 값 및 증폭 플롯으로 생성됩니다.- 프라이밍을 위해 제어 라인 유체를 qPCR 칩에 주입합니다. qPCR 칩을 미세유체 혼합 장치에 삽입합니다. 프라임(136x) 스크립트를 선택하고 이 프로그램을 실행합니다.
- ~45분 후에 프로그램이 완료되면 프라이밍된 qPCR 칩을 제거합니다. 프라이밍된 qPCR 칩을 넣고, PCR 샘플 플레이트로부터의 반응물 6 μL를 qPCR 칩의 상응하는 샘플 웰 내로 피펫팅한다.
- 프라이밍된 qPCR 칩을 넣고, PCR 분석 플레이트로부터의 반응물 6 μL를 qPCR 칩에 상응하는 분석 웰로 피펫팅한다.
참고: qPCR 칩의 샘플 및 분석 웰 바닥에 기포가 형성되어 용액이 미세유체 도관으로 들어가는 것을 방지할 수 있습니다. qPCR 칩을 미세유체 혼합 장치에 삽입하기 전에 날카로운 바늘을 사용하여 이러한 기포를 터뜨리거나 제거할 수 있습니다. - qPCR 칩을 미세유체 혼합 장치에 삽입합니다. 로드 혼합(136x) 스크립트를 선택하고 이 프로그램을 실행합니다.
- qPCR 칩을 미세유체 RT-qPCR 플랫폼에 로드합니다.
- 미세유체 RT-qPCR 플랫폼을 켜고 전구를 예열합니다(~20분). 마이크로유체 혼합 장치에서 qPCR 칩을 제거합니다. qPCR 칩 하단에서 보호 스티커를 떼어냅니다.
- 마이크로유체 RT-qPCR 플랫폼을 열고 qPCR 칩을 마이크로유체 RT-qPCR 플랫폼에 로드합니다. 미세유체 RT-qPCR 플랫폼에서 고속 96 x 96 PCR 프로토콜(30 사이클)을 실행합니다.
- 데이터 수집 소프트웨어를 시작하고 새 실행 시작을 클릭합니다.
- 칩 바코드를 확인하고 칩 유형을 클릭하고 다음을 클릭합니다. Chip Run 파일을 클릭하고 데이터 수집 저장소의 파일 위치를 찾습니다.
- 응용 프로그램 유형을 클릭하고 유전자 발현을 선택하십시오. 수동 참조로 ROX를 선택하고 단일 프로브를 선택하고 프로브 유형으로 EvaGreen을 선택합니다.
- 열 순환 프로그램을 클릭하여 선택하고 Biomark HD: GE Fast 96x96 PCR+Melt v2.pcl 파일을 선택합니다.
8. 데이터 분석
- 아래 설명된 대로 qPCR 칩 실행의 데이터를 QC용 분석 소프트웨어로 업로드합니다.
- 데이터 분석 소프트웨어를 다운로드합니다. 이것은 다음 웹 사이트에서 찾을 수 있습니다: https://www.fluidigm.com/products-services/software#. 소프트웨어를 실행하여 미세유체 RT-qPCR 실험을 분석합니다.
- 소프트웨어 내에서 Chip Run을 엽니다. 그런 다음 실험에서 만든 ChipRun.bml 파일을 엽니다. 수동 참조, 프로브 및 PCR 열 프로그램을 포함한 실험 세부 정보가 포함된 창이 나타납니다.
참고: 품질 관리(QC) 및 데이터 분석은 미세유체 RT-qPCR 플랫폼에 연결된 컴퓨터에서 수행하거나 플래시 드라이브 또는 기타 수단을 통해 .bml 파일을 다른 컴퓨터로 전송하여 수행할 수 있습니다.
- 아래 설명된 대로 샘플 설정을 정의합니다.
참고: 이 단계에서는 품질 관리(QC) 및 데이터 분석 절차를 위한 샘플 및 분석(qPCR 프라이머)의 라벨링된 템플릿을 생성합니다.- 칩 탐색기 > 샘플 플레이트 설정을 선택하고 새 샘플 플레이트를 만듭니다. 적절한 용기 유형과 용기 형식을 선택한다(본 대표실험에 사용된 96웰 플레이트의 경우 SBS96).
- 실험 설계에 따라 샘플 레이블을 소프트웨어 스프레드시트에 붙여넣고 작업 메뉴에서 맵을 선택합니다. SBS96-Left.dsp를 선택합니다. 이제 샘플 설정이 매핑됩니다. 자세히 보기 > 분석을 선택하여 파일에서 이러한 변경 내용을 업데이트합니다.
참고: 이 소프트웨어의 변경 사항은 분석 버튼을 클릭할 때까지 저장되지 않습니다.
- 소프트웨어에서 제어 샘플을 정의합니다. 선택할 셀을 드래그하는 동안 왼쪽 버튼을 클릭하고 길게 눌러 제어 샘플의 셀을 선택합니다. 개별 셀은 Ctrl 키를 누른 상태에서 개별 셀을 클릭하여 선택할 수 있습니다. RNA 표준 샘플(희석 시리즈)의 경우 샘플 이름과 사용된 RNA 농도를 입력합니다. 분석을 클릭하여 저장합니다.
- 위의 8.2단계와 유사하지만 RT-qPCR 분석 이름, 즉 분석된 유전자의 이름을 사용하여 검출기 설정을 정의합니다. 검출기 플레이트 설정을 선택하고 새 분석 플레이트 를 생성합니다. 적절한 용기 유형과 형식을 선택합니다(96웰 플레이트의 경우 SBS96). 실험 설계에 따라 분석 이름을 붙여넣고 분석을 클릭하여 저장합니다.
- 아래 설명된 대로 사용자 품질 관리(QC) 프로세스를 시작합니다.
참고: 이 대표적인 실험에서는 사이클 타임(Ct) 임계값 방법을 사용했습니다. 즉, 소프트웨어(Auto Global) 또는 수동(사용자 글로벌)에 의해 정의된 임계값 신호에 도달하지 않은 샘플은 실패한 반응으로 간주되어 데이터 세트에 포함되지 않습니다.- 작업 프레임> 분석 보기를 선택합니다. 분석 설정 창에서 설정을 Auto Global(전체 칩에 적용되는 임계값을 자동으로 계산) 또는 User Global로 변경합니다. 기준선 보정을 선형 도함수로 설정합니다. 사용자 전역을 사용하는 경우 대표 실험에서와 같이 실패 임계값을 수동으로 결정해야 합니다.
- 이 대표적인 실험은 다음과 같이 QC 규칙을 사용했습니다: 개별 분석 또는 샘플의 실패율이 70% 이상인 경우 데이터 세트의 전체 행 또는 열이 실패했습니다.
- 96 x 96 칩의 각 반응을 수동으로 검토합니다. 증폭 곡선과 용융 곡선을 시각화하여 각 반응이 예상되는 qPCR 패턴을 따르는지 확인합니다. 증폭 또는 용융 곡선이 예상과 일치하지 않으면 해당 반응에 실패합니다.
- QC 후 파일 > 내보내기 를 선택하여 데이터를 내보내고 데이터 세트를 .csv 파일로 저장합니다.
- 내보낸 .csv 파일에는 Pass-Fail 행렬과 원시 Ct 값이 있는 행렬이 모두 있으므로 데이터 세트를 정리합니다. Pass-Fail 행렬을 사용하여 데이터 세트의 모든 실패한 셀을 NA로 바꿉니다.
- 최신 버전의 오픈 소스 R 소프트웨어를 다운로드한 다음, R-Studio 애플리케이션을 다운로드합니다. 정규화된 데이터 세트를 R에 업로드합니다. 연구에 적합한 데이터를 분석합니다.
- 아래에 설명된 대로 -ΔΔCt 방법을 사용하여 데이터 세트를 정규화합니다.
참고: 중앙값 센터링 또는 하우스키핑 유전자 정규화를 샘플 행에서 사용하여 -ΔCt 값을 생성할 수 있습니다. 대표적인 실험에서는 하우스키핑 유전자 정상화에 의해 중앙값 중심을 사용하고 검증하였다. 이 작업은 .csv 형식으로 또는 데이터 분석 소프트웨어에 업로드하여 수행할 수 있습니다.- 중앙값 중심화의 경우 개별 표본(10셀 풀)에 대한 모든 Ct 값에서 계산된 중앙값 Ct 값을 계산합니다. 그런 다음 이 중앙값에서 모든 개별 Ct 값을 뺍니다. 이것은 -ΔCt 값을 산출한다.
- 하우스키핑 유전자 정규화의 경우 각 샘플에 대한 하우스키핑 유전자(대표 실험에서 Actb, Gapdh 및 Ldha )의 평균 발현을 계산하고 이 값을 개별 Ct 값을 뺄 값으로 사용합니다.
- -ΔΔC t 값을 생성하려면 이제 -ΔCt 값을 포함하는 각 분석 열의 중앙값을 취합니다. 각 -ΔC t 값에서 분석 중앙값을 빼서 -ΔΔCt 값을 생성합니다.
- R의 스케일 함수를 사용하여 각 -ΔΔCt 값에 대한 z-점수를 계산합니다. R 히트 맵 함수 또는 별도의 소프트웨어를 사용하여 히트 맵을 생성합니다.
- 피어슨 상관 함수를 사용하여 각 유전자 간의 피어슨 상관 관계를 계산합니다. R에서 melt 함수를 사용하여 다른 기능을 위해 데이터 세트를 구성합니다. 이 데이터를 내보내고 유전자 상관 네트워크 소프트웨어에 업로드하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
단일 셀 수집의 검증은 LCM 절차 중에 시각적으로 수행됩니다. 세포핵은 QC 스테이션에서 평가됩니다. 세포 유형은 그 세포 유형 및 그의 일반적인 형태에 대한 태그된 형광단의 방출에 의해 결정될 수 있다. 캡에서 원하지 않는 세포가 선택되면 QC 스테이션에서 UV 레이저로 유전 물질을 파괴 할 수 있습니다. 분자 분석을 통한 추가 검증도 필요합니다. 이 대표적인 실시예16에서, 미세아교세포 이외에 티로신 하이드록실라제(Th) 양성(+) 및 Th 음성(-)의 두 가지 유형의 뉴런이 선택되었다. 도 1D 는 뉴런이 되도록 의도된 샘플이 뉴런 마커인 NeuN 의 통계적으로 유의한 상승된 발현을 입증했음을 입증한다. 동시에, 미세아교세포 샘플은 미세아교세포 마커인 CD34 및 Cx3xr1 의 상당한 상승을 가졌으며, 이는 샘플 선택이 높은 충실도로 수행되었음을 시사합니다. 또한, Th+ 뉴런 샘플은 Th-뉴런 샘플 및 미세아교세포 샘플 에 비해 Th 의 유의하게 상승된 발현을 입증한 반면, Th-뉴런은 GCG (프리프로글루카곤 코딩 유전자)의 유의하게 상승된 발현을 나타냈으며, 이는 이러한 Th-뉴런 샘플이 GLP-1을 신경 전달 물질로 사용하는 뉴런으로 풍부함을 시사합니다(그림 1D ). 선형 차별 분석으로 알려진 보다 글로벌한 계산 측정에 따르면 이 세 가지 세포 유형은 x축을 따라 분리되는 뉴런과 미세아교세포와 y축을 따라 분열하는 Th+ 및 Th-뉴런 샘플로 측정된 65개 유전자 모두에서 서로 다른 유전자 발현 프로필을 가지고 있습니다(그림 1E).
데이터의 품질은 또한 내부 및 배치 간 기술 복제를 통해 검증되었습니다(그림 2 및 그림 3). 배치 내 복제는 해당 특정 배치의 데이터 품질에 대한 제어를 복제합니다. 배치 내 반복실험이 정렬되지 않으면 첫 번째 배치를 실행하기 위해 만들어진 동일한 샘플 및 분석 플레이트에서 다른 qPCR 칩 실험을 수행할 수 있습니다. 배치 간 반복실험은 여러 배치의 데이터를 비교할 수 있도록 합니다. 이는 이 대표적인 예와 같이 여러 배치가 필요한 많은 수의 샘플을 분석하는 실험에 매우 중요합니다. 이 실험에는 배치 4의 샘플 40으로 하나의 이상치가있었습니다 (그림 3). 그러나 배치 1, 2 및 3의 샘플 40은 올바르게 정렬되었고 배치 4의 다른 반복실험은 배치 1, 2 및 3과 정렬되어 이것이 이 반복에서 발생한 고립된 나쁜 반응임을 시사합니다. 일괄 처리 간에 비교하려면 적절한 데이터 정규화 기술도 필요합니다. 이 실험은 하우스 키핑 유전자 (Actb, Gapdh, Ldha)도이 실험에서 분석되어 중앙값 중심화 방법의 대조군으로 사용되었지만 중앙값 중심을 사용했습니다. 즉, 두 방법 모두 높은 데이터 품질을 시사하는 매우 유사한 데이터 세트를 생성했습니다.
도 4 는 세포 서브표현형에 의해 조직되어 있는 GLP-1 농축 뉴런 샘플의 히트맵을 표시한다. 이 그림은 신경 생물학에서 세포 아형 표현형의 중요성을 보여줄뿐만 아니라 알코올 금단을 통해 아형 비율이 어떻게 변하는 지 보여줍니다. 히트 맵은 염증성 유전자 클러스터 1을 고도로 발현하는 하위 표현형 A가 8 h Wd 시점에서 비율이 증가하고 32 h Wd에서 최대에 도달한다는 것을 보여줍니다. 176 h Wd까지,이 염증성 하위 표현형은 유병률을 정상화하여 대조군으로 되돌립니다. GABAR 유전자 클러스터 2를 고도로 발현하는 서브 표현형 B는 176 h Wd 조건에서이 유전자 클러스터의 발현에서 전반적인 억제를 입증합니다. 이러한 발견은 이 GLP-1 뉴런 세포 유형이 염증성 서브페노이프를 증가시키고 동시에 알코올 금단 기간 동안 GABA 아표현형에서 GABAR의 발현 수준을 감소시킴으로써 어떻게 과흥분하게 되는지를 보여줍니다. 그림 5 는 개별 샘플의 유전자 발현을 평균으로 결합하여 유전자 클러스터의 발현과 해당 유전자 전사체의 단백질 위치를 시계열 전체에서 시각화할 수 있습니다.
그림 1: 실험 설계 및 단일 세포 선택. (A) 랫트 삼중항을 5가지 처리 조건 중 하나에 무작위로 할당하였다. (b) 단일 세포 전사체 데이터 생성. (C) 분석 된 유전자와 그 기능의 만화 표현. 녹색의 유전자는 분석되지 않았다. 공식 유전자 기호가 사용됩니다. (d) 세포형 마커의 유전자 발현. 오차 막대는 표준 오차를 표시합니다. 뉴런과 미세아교세포 비교, p-값 = 각각 0.0273, 3.94 x 10-10, 7.73 x 10-12. Th+ 뉴런은 Th-뉴런(p=4.56 x 10-11) 및 미세아교세포(p=2.95678 x 10-15)에 비해 상승된 Th 발현을 보였다. Th-뉴런은 Th+ 뉴런(p=0.0106) 및 미세아교세포(p=0.0435)에 비해 GCG의 상승된 발현을 나타내어 이들이 GLP-1+ 뉴런임을 나타낸다. *p < 0.05, ***p < 4 x 10-10. (e) 모든 샘플의 선형 차별 분석은 2차원 공간에서 수집된 3개의 세포 유형 사이에서 측정된 모든 유전자에 걸친 차이를 표시한다. NE 뉴런과 GLP-1 뉴런 사이의 중심 거리 = 3.30, NE 뉴런과 미세아교세포 = 1.57, GLP-1 뉴런과 미세아교세포 = 2.92. 이 수치는 O'Sullivan et al. 202116. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 배치 내에서 원시 Ct 값의 기술 반복 플롯. 각 그래프는 기술 실험 무결성을 입증하는 서로에 대해 플롯된 칩 내 기술 반복에 대한 원시 Ct 값을 표시합니다. 이 수치는 O'Sullivan et al. 202116. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 배치 간 원시 Ct 값의 기술 반복 플롯. 각 그래프는 서로에 대해 플롯된 칩 간 기술 반복실험에 대한 원시Ct 값을 표시하여 모든 배치가 서로 비교할 수 있음을 보여줍니다. 이 수치는 O'Sullivan et al. 202116. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: GLP-1 농축 뉴런 샘플의 히트 맵. 히트 맵은 알코올 금단 시계열을 통해 GLP-1 농축 뉴런 샘플의 세포 하위 표현형을 표시합니다. 행은 대문자로 레이블이 지정된 세포 하위 표현형 클러스터가 있는 10셀 풀링된 샘플을 나타냅니다. 열은 해당 샘플에서 해당 유전자에 대한 -ΔΔCt 유전자 발현 값의 z-점수를 -1 내지 +1 색상 척도로 나타낸다. 유전자 클러스터는 번호로 표시됩니다. 이 수치는 O'Sullivan et al. 202116. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: GLP-1이 풍부한 뉴런 샘플에서의 표현형 유전자 발현. 세포 다이어그램은 그림 4의 히트맵에 표시된 하위 표현형의 상대적 유전자 발현(-ΔΔCt 값의 평균 z-점수)을 나타내는 상자를 표시합니다. 다이어그램은 Cytoscape 버전 3.8.0을 사용하여 구성되었으며 z 점수는 R 버전 3.5.2의 스케일 함수를 사용하여 계산되었습니다. 오른쪽의 -ΔΔCt 라벨은 어떤 상자가 어떤 유전자에 해당하는지 보여주고 색상은 발현을 나타냅니다 (파란색은 낮은 발현, 노란색은 높은 발현). 상자의 위치는 해당 유전자 전사체로부터의 단백질 생성물의 국소화 또는 기능을 나타낸다. 녹색 숫자는 하위 표현형 내의 하위 그룹을 나타냅니다. 이 수치는 O'Sullivan et al. 202116. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 인터셉티브 미주 회로, 내장-정서적 신경 축 및 중독의 상대-과정 모델의 개략도. (A) 인터셉티브 미주 구 심성은 장내 미생물 및 기타 말초 기관의 영향을 많이받는 장의 상태를 핵 tractus solitarius (NTS)로 전달합니다. 이 정보는 이후에 편도체로 전달되어 감정 상태에 영향을 미칩니다. (B) 감정, 스트레스 및 자율 조절에서 핵 tractus solitarius (NTS)와 편도체의 중심 핵 (CeA)의 통합 적 역할을 보여주는 단순화 된 만화 표현. 두 개의 뉴런 아형, GLP-1 및 NE 뉴런이 강조 표시됩니다. 많은 해부학 적 및 기능적 연결은 명확성을 위해 생략됩니다. 약어 : NE = 노르 에피네프린; GLP-1 = 글루카곤-유사 펩티드 1; GABA = γ- 아미노 부티르산; HPA 축 = 시상 하부체-뇌하수체-부신 축; CRF = 코르티코트로핀 방출 호르몬. (C) 알코올 및/또는 오피오이드 노출에는 중변연계 도파민 경로를 통한 보상 자극과 항보상 억제의 두 가지 작용이 있습니다. 이러한 행동은 긍정적 인 강화를 통해 물질 사용에 동기를 부여합니다. (D) 알코올 및/또는 오피오이드 금단에는 두 가지 작용이 있습니다: 중변연계 도파민 경로(표시되지 않음)를 억제하여 보상을 억제하고 반보상을 자극합니다. 이 연구는 내장 - 정서적 신경 염증이 보상 자극의 종말점이라고 제안하지만,이 가설은 추가 테스트가 필요합니다. 메커니즘이 무엇이든 이러한 행동은 부정적인 강화를 통해 물질 의존에 동기를 부여합니다. 이 수치는 O'Sullivan et al. 202116. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 미세유체 RT-qPCR용 프라이머. mRNA 증폭을 위한 모든 프라이머 쌍은 각각의 프라이머 쌍에 의해 형성된 앰플리콘 길이와 함께 나열된다. 이 표는 O'Sullivan et al. 202116. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
알코올 사용 장애는 치료하기 어려운 질병으로 남아 있습니다. 우리 그룹은 시스템 신경 과학적 관점에서 보상 방지 과정을 조사함으로써이 장애에 접근했습니다. 우리는 알코올 금단 시계열16에서 단일 NTS 뉴런과 미세아교세포의 유전자 발현 변화를 측정했습니다. NTS는 알코올 금단 증후군에서 발생하는 자율 조절 장애에서 두드러진 역할을 위해 선택되었습니다. 자사는 LCM을 단일 세포 미세유체 RT-qPCR과 결합하여 해부학적 및 분자 민감도와 특이성으로 저렴한 비용으로 강력한 수의 샘플과 유전자를 측정할 수 있습니다(그림 1B-C). 단일-세포를 IHC 염색에 의해 확인 및 선택하고, 이들 세포 서브페노타입 그룹을 분자 발현으로 검증하였다 (도 1D-E). 그러나, 일부 GLP-1 농축 뉴런 샘플(TH-뉴런)은 적당히 발현된 Th를 나타내었다(도 4). 세포 표현형의 확립은 형광 시각화에 기초한 세포 선택에서 이루어졌으며,이 기준은 단일 유전자 Th의 발현에 기초한 분자 그룹화로 연구에 사용되었으며, 세포 표현형16을 암시하는 발현 패턴을 정의하지 못했습니다. 따라서, 결과는 주요 NTS 소교 세포 및 신경 아세포 아표현형과 알코올 금단에서의 역학을 특성화한다.
이 원고는 단일 세포 전사체학의 방법을 설명하고 있으며 프로토콜의 모든 단계를 설명된 대로 따라야 합니다. 다른 장기 조직이나 세포 유형으로 작업 할 때 약간의 수정이 필요할 수 있습니다. 이 프로토콜의 과제 중 하나는 LCM 동안 RNA 품질과 무결성을 유지하는 것입니다. 당사는 위에서 설명한 문제를 해결하기 위해 IHC 염색, LCM 및 미세유체 RT-qPCR에 대한 프로토콜을 수립했습니다. 간략하게, 이러한 공정에는 RNA 분해를 방지하기 위한 모든 염색 용액에 RNase 억제제 첨가, 가능한 RNA 분해를 방지하기 위한 빠른 염색 프로토콜, IHC 염색 및 탈수 직후 LCM용 슬라이드 처리, 샘플 처리 또는 이송 중에 가능할 때마다 적절한 저온 조건 유지가 포함됩니다.
전사체학 분석은 RNA 분리 없이 용해된 단일 세포에서 수행된 후 역전사, 사전 증폭 및 qPCR이 수행됩니다. 사전-증폭 단계는 cDNA 분자를 qPCR에 대해 검출가능한 수준으로 선택적으로 증폭하는 것이다. 사전 증폭 단계에는 몇 가지 제한이 있습니다. 여기에는 증폭에 실패한 유전자 전사체가 포함되며, 이는 미세유체 RT-qPCR에서 검출되지 않습니다. 또한 PCR 반응이 실험 분석을 위한 모든 프라이머를 포함하기 때문에 프라이머 이량체 형성 가능성도 있습니다. 즉, 단일 프라이머 쌍의 정방향 및 역방향 서열과 실험의 모든 정방향 및 역방향 서열을 갖는 이량 체의 형성이 가능하다. 따라서 RNA 표준물질과 같은 양성 실험 대조군을 사용한 프라이머 검사가 권장됩니다.
RT-qPCR 칩 설계는 품질 관리 및 배치 효과를 위한 이 프로토콜의 또 다른 중요한 측면입니다. 양성 대조군은 분석 중인 동물 및 기관(이 대표적인 예에서 쥐 뇌)의 표준 RNA로 구성됩니다. 그런 다음 RNA 희석 시리즈를 각 칩에 로드할 수 있으며 분석된 각 유전자에 대해 적절한 정량적 신호를 입증해야 합니다. 물은 음성 대조군으로 사용할 수 있습니다. 이러한 컨트롤은 서로 다른 칩의 데이터를 결합할 때 발생할 수 있는 배치 효과를 제어하는 적절한 정규화에 중요합니다. 이에 대해서는 8단계에서 자세히 설명합니다.
여기에 표시된 대표적인 실험에서 이러한 방법은 가설 생성 및 가능한 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 데 적용되었습니다. 이 연구는 다른 연구의 맥락에서 수행되었으며 차단 적 보상 가설13에 대한 중요한 정보를 제공합니다. 간단히 말해서,이 모델은 NTS를 통해 미주에서 편도체로의 인터셉티브 신호 전달에 의해 물질 금단에서 반 보상이 자극되며이 항 보상의 초기 기질은 신경 염증이라고 추측합니다 (그림 6). 이 연구는 알코올 금단 시 뉴런과 미세아교세포에서 유전자 발현의 염증 변화를 확립함으로써 이 가설을 뒷받침합니다.
이 연구의 가장 큰 약점은 기계론적 주장이 없다는 것입니다. 그러나 이러한 방법은 이와 같은 기본 실험이 수행된 후 메커니즘을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 동물 모델 개입 또는 섭동, 예를 들어 횡격막 혈관 절개술 또는 유전자 녹아웃은 염증 조절제의 해부학적 또는 유전적 메커니즘을 입증할 수 있습니다. 이 접근 방식을 취하는 향후 연구는 중독 치료를 위한 임상 실습에 이러한 통찰력을 구현하는 것을 목표로 하는 인터셉티브 안티보상 가설의 개발에 기여할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
여기에 제시된 작업은 JS 및 RV에 수여 된 NIH HLB U01 HL133360, JS 및 EVB에 수여 된 NIDA R21 DA036372, SJO 'S를 지원하기 위해 Jan Hoek에게 수여 된 T32 AA-007463 및 국립 알코올 중독 및 알코올 남용 연구소 : R01 AA018873을 통해 자금을 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | abcam | ab112 | Stain for TH+ neurons |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer Kit | ThermoFisher Scientific | 11739010 | Invitrogen |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | R37118 | Seconadry Antibody |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A28180 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | NA |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
| TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mL | USA Scientific | 1402-9700 | NA |
References
- Substance Use and Mental Health Indicators in the United States: Results from the 2019 National Survey on Drug Use and Health. , Available from: https://www.samhsa.gov/data/ (2020).
- Prevalence of Serious Mental Illness (SMI). NIH. 49, Available from: https://www.nimh.nih.gov/health/statistics/mental-illness.shtml (2020).
- Mattick, R. P., Kimber, J., Breen, C., Davoli, M. Buprenorphine maintenance versus placebo or methadone maintenance for opioid dependence. Cochrane Database of Systematic Reviews. Mattick, R. P. , John Wiley & Sons, Ltd. (2008).
- Mattick, R. P., Breen, C., Kimber, J., Davoli, M. Methadone maintenance therapy versus no opioid replacement therapy for opioid dependence. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 2009 (3), (2009).
- Miller, P. M., Book, S. W., Stewart, S. H. Medical treatment of alcohol dependence: A systematic review. International Journal of Psychiatry in Medicine. 42 (3), 227-266 (2012).
- Holmes, E. A., et al. The Lancet Psychiatry Commission on psychological treatments research in tomorrow's science. The Lancet. Psychiatry. 5 (3), 237-286 (2018).
- Ford, C. L., Young, L. J. Translational opportunities for circuit-based social neuroscience: advancing 21st century psychiatry. Current Opinion in Neurobiology. 68, 1-8 (2021).
- Holmes, E. A., Craske, M. G., Graybiel, A. M. Psychological treatments: A call for mental-health science. Nature. 511 (7509), 287-289 (2014).
- Miranda, A., Taca, A. Neuromodulation with percutaneous electrical nerve field stimulation is associated with reduction in signs and symptoms of opioid withdrawal: a multisite, retrospective assessment. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 44 (1), 56-63 (2018).
- Metz, V. E., et al. Effects of ibudilast on the subjective, reinforcing, and analgesic effects of oxycodone in recently detoxified adults with opioid dependence. Neuropsychopharmacology. 42 (9), 1825-1832 (2017).
- Heinzerling, K. G., et al. placebo-controlled trial of targeting neuroinflammation with ibudilast to treat methamphetamine use disorder. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (2), 238-248 (2020).
- Bogenschutz, M. P., et al. Psilocybin-assisted treatment for alcohol dependence: A proof-of-concept study. Journal of Psychopharmacology. 29 (3), 289-299 (2015).
- O'Sullivan, S. J., Schwaber, J. S. Similarities in alcohol and opioid withdrawal syndromes suggest common negative reinforcement mechanisms involving the interoceptive antireward pathway. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 125, 355-364 (2021).
- O'Sullivan, S. J. Single-cell systems neuroscience: A growing frontier in mental illness. Biocell. 46 (1), 7-11 (2022).
- O'Sullivan, S. J., et al. Single-cell glia and neuron gene expression in the central amygdala in opioid withdrawal suggests inflammation with correlated gut dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
- O'Sullivan, S. J., McIntosh-Clarke, D., Park, J., Vadigepalli, R., Schwaber, J. S. Single cell scale neuronal and glial gene expression and putative cell phenotypes and networks in the nucleus tractus solitarius in an alcohol withdrawal time series. Frontiers in Systems Neuroscience. 15, 739790 (2021).
- O'Sullivan, S. J., Reyes, B. A. S., Vadigepalli, R., Van Bockstaele, E. J., Schwaber, J. S. Combining laser capture microdissection and microfluidic qpcr to analyze transcriptional profiles of single cells: A systems biology approach to opioid dependence. Journal of Visualized Experiments. (157), e60612 (2020).
- Achanta, S., Vadigepalli, R. Single cell high-throughput qRT-PCR protocol. Protocols.io. , (2020).
- O'Sullivan, S. J. The interoceptive antireward pathway and gut dysbiosis in addiction. Journal of Psychiatry, Depression & Anxiety. 7 (40), 1-5 (2021).
- Park, J., et al. Single-cell transcriptional analysis reveals novel neuronal phenotypes and interaction networks involved in the central circadian clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
- Staehle, M. M., et al. Diurnal patterns of gene expression in the dorsal vagal complex and the central nucleus of the amygdala - Non-rhythm-generating brain regions. Frontiers in Neuroscience. 14, 375 (2020).
- Réus, G. Z., et al. The role of inflammation and microglial activation in the pathophysiology of psychiatric disorders. Neuroscience. 300, 141-154 (2015).
- Zhang, X., et al. Role of astrocytes in major neuropsychiatric disorders. Neurochemical Research. 46 (10), 2715-2730 (2021).
- Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (1), 87-98 (2015).
- Lieber, C. S., DeCarli, L. M. An experimental model of alcohol feeding and liver injury in the baboon. Journal of Medical Primatology. 3 (3), 153-163 (1974).
- Lieber, C. S., Decarli, L. M. Animal models of chronic ethanol toxicity. Methods in Enzymology. 233, 585-594 (1994).
- Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24 (6), 930-941 (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , Academic Press. Elsevier Inc. (1982).
