Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Undersöka drivkrafter för antireward i beroendebeteende med anatomiskt specifika encelliga genuttrycksmetoder

Published: August 4, 2022 doi: 10.3791/64014
Automatic Translation
*1,2,3, *1, 1, 1
1Daniel Baugh Institute for Functional Genomics and Computational Biology, Department of Pathology, Anatomy, and Cell Biology, Thomas Jefferson University, 2Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 3Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Kombinationen av laserfångande mikrodissektion och mikrofluidisk RT-qPCR ger anatomisk och bioteknisk specificitet vid mätning av transkriptomet i enskilda neuroner och glia. Att tillämpa kreativa metoder med ett systems biologiska förhållningssätt till psykiatrisk sjukdom kan leda till genombrott i förståelse och behandling såsom neuroinflammation antireward-hypotesen vid missbruk.

Abstract

Ökande nivåer av missbruksbeteende har motiverat både forskare inom psykisk hälsa och kliniker att förstå antireward och återhämtning. Detta skifte bort från belöning och början kräver nya perspektiv, paradigmer och hypoteser tillsammans med en utvidgning av de metoder som tillämpas för att undersöka missbruk. Här ger vi ett exempel: En systembiologisk metod för att undersöka antireward som kombinerar laserinfångningsmikrodissektion (LCM) och mikrofluidiska kvantitativa transkriptionskvantitativa polymeraskedjereaktioner (RT-qPCR) med hög genomströmning. Genuttrycksnätverksdynamik mättes och en viktig drivkraft för neurovisceral dysreglering vid alkohol- och opioidabstinens, neuroinflammation, identifierades. Denna kombination av tekniker ger anatomisk och fenotypisk specificitet vid encellsupplösning med hög genomströmningskänslighet och specifika genuttrycksmått som ger både hypotesgenererande datamängder och mekanistiska möjligheter som genererar möjligheter till nya insikter och behandlingar.

Introduction

Beroende är fortfarande en växande utmaning i den utvecklade världen 1,2. Trots stora vetenskapliga och kliniska framsteg fortsätter beroendegraden att öka medan effekten av etablerade behandlingar förblir stabil i bästa fall 3,4,5. Framsteg inom bioteknik och vetenskapliga tillvägagångssätt har dock lett till nya metoder och hypoteser för att ytterligare undersöka patofysiologin för substansberoende 6,7,8. Den senaste utvecklingen tyder faktiskt på att nya begrepp och behandlingsparadigmer kan leda till genombrott med sociala, ekonomiska och politiska konsekvenser 9,10,11,12.

Vi undersökte antireward vid uttag av alkohol- och opioidberoende13,14,15,16. Metoder är centrala för detta paradigm17,18. Laserfångande mikrodissektion (LCM) kan välja enstaka celler med hög anatomisk specificitet. Denna funktionalitet är integrerad i neuroinflammation antireward-hypotesen eftersom både glia och neuroner kan samlas in och analyseras från samma neuronala subnukleus i samma djur 13,14,15,16,19. En relevant del av transkriptomet för utvalda celler kan sedan mätas med mikrofluidiska omvända transkriptionskvantitativa polymeraskedjereaktioner (RT-qPCR) med hög genomströmning som ger högdimensionella datamängder för beräkningsanalys som ger insikter i funktionella nätverk20,21.

Att mäta en delmängd av transkriptomet i nervceller och glia i en specifik hjärnkärna genererar en dataset som är robust i både provantal och uppmätta gener och är känslig och specifik. Dessa verktyg är optimala för ett systems neurovetenskapliga tillvägagångssätt för psykiatrisk sjukdom eftersom glia, främst astrocyter och microglia, har visat en central roll i neurologisk och psykiatrisk sjukdom under det senaste decenniet22,23. Vårt tillvägagångssätt kan mäta det uttrycksfulla svaret från glia och neuroner samtidigt över många receptorer och ligander som är involverade i lokal parakrin signalering. Faktum är att signalering kan härledas från dessa datamängder med hjälp av olika kvantitativa metoder som fuzzy logic24. Vidare kan identifieringen av cellulära subfenotyper i neuroner eller glia och deras funktion ge insikt i hur hjärnceller i specifika kärnor organiserar, svarar på och dysreglerar på encellsnivå. Dynamiken i detta funktionella system kan också modelleras med tidsserieexperiment16. Slutligen kan djurmodeller störas anatomiskt eller farmakologiskt för att ge ett mekanistiskt tillstånd till detta systems tillvägagångssätt.

Representativt experiment:
Nedan ger vi ett exempel på tillämpningen av dessa metoder. Denna studie undersökte råttneuronala och mikroglia-genuttryck i den ensamma kärnan (NTS) som svar på alkoholberoende och efterföljande tillbakadragande16. Råttkohorter omfattade 1) Kontroll, 2) Etanolberoende (EtOH), 3) 8 h abstinens (Wd), 4) 32 h Wd och 5) 176 h Wd (Figur 1A). Efter snabb halshuggning separerades hjärnstammar från framhjärnan och kryosektionerades, och skivor färgades för tyrosinhydroxylaspositiva (TH +) neuroner och mikroglia (figur 1B). LCM användes för att samla in både TH+ och TH- neuroner och microglia. Alla celler var från NTS och analyserades som prover av 10-cellspooler. Fyra 96 x 96 mikrofluidiska RT-qPCR dynamiska arrays kördes på RT-qPCR-plattformen som mäter 65 gener (figur 1B-C). Data normaliserades med hjälp av en -ΔΔCt-metod och analyserades med R, och encellsval validerades med molekylära markörer (figur 1D-E). Teknisk validering verifierades ytterligare av tekniska replikat som analyserades inom en enda sats och mellan satser (figur 2 och figur 3). TH + och TH- neuroner organiserade i olika subfenotyper med liknande inflammatoriska genkluster men olika γ-aminosmörsyra (GABA) receptor (R) kluster (Figur 4 och Figur 5). Subfenotyper som hade förhöjt uttryck av inflammatoriska genkluster var överrepresenterade vid 32 h Wd medan GABA-receptor (GABAR) uttryck förblev lågt vid långvarig alkoholabstinens (176 h Wd). Detta arbete bidrar till antireward-hypotesen om alkohol- och opioidberoende som antar att avlyssnande återkoppling från inälvorna i abstinens bidrar till dysreglering av visceral-emotionella neuronala kärnor (dvs. NTS och amygdala) vilket resulterar i allvarligare autonoma och känslomässiga följder, vilket bidrar till substansberoende (Figur 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denna studie genomfördes i enlighet med rekommendationerna från Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Thomas Jefferson University. Protokollet godkändes av Thomas Jefferson University IACUC.

1. Djurmodell

  1. Hushane Sprague Dawley (>120 g, Harlan, Indianapolis, IN, USA) råtttrillingar individuellt med fri tillgång till etanol-chow (2 råttor) eller kontroll-chow-blandning (1 råtta).
    OBS: Detta representativa experiment använde Lieber-DeCarli-protokollet för att studera neurobiologin för alkoholabstinens25,26. Råtttrillingar består av en kohort med tre råttor som ska matas med samma antal kalorier men hamnar i olika armar av studien vid offer. De tre armarna för denna studie är: 1) Kontroll, 2) Etanolberoende (EtOH) och 3) Abstinens (Wd) (Figur 1A). Det finns fem totala förhållanden i denna studie eftersom det finns tre tidpunkter för alkoholabstinens (figur 1A).
    1. Mät varannan dag etanol-chow-blandningen som konsumeras av Wd-råttan och ersätt den mängd som förbrukas med samma mängd etanolblandning till EtOH-råttmataren. Tillsätt motsvarande kalorimängd kontrollblandning till kontrollråttans matare.
      OBS: Den genomsnittliga dagliga etanolförbrukningen är cirka 12-16 g / kg efter 3 veckor26.
    2. Efter stabil långvarig etanolkonsumtion och beroende (>5 veckor), inducera akut alkoholabstinens hos Wd råtta genom att tömma hans eller hennes matbehållare och fylla den med kontrollblandning. Utför detta på ett sådant sätt att alla tre råttorna offras vid samma cirkadiska tidpunkt21.
    3. Vid den förvalda tidpunkten, offra alla tre råttorna i trillingen vid samma tidpunkt (Control, EtOH och Wd).

2. Provtagning

  1. Skörda hjärnan vid samma cirkadiska tidpunkt för varje råtttrilling vid rätt Wd-tidpunkt (8 h, 32 h, 176 h).
    1. Förbered ett metanol- och torrisbad för snabb kylning av färsk vävnad för att bevara RNA-integriteten. Sätt åt sidan.
    2. Sätt råttan i isoflurantank (5% i syre) i ~ 30 s eller tills medvetslöshet uppstår, vilket indikeras av den reducerade andningsfrekvensen och frånvaron av motorisk aktivitet. Sätt råtthuvudet i en ordentligt slipad giljotin för att snabbt halshugga.
    3. Öppna djurets skalle för att dissekera ut hjärnan med hjälp av pincett. Ta bort lillhjärnan från den färska hjärnan med en handhållen rakhyvel genom grov skivning och kassera den. Genom tvärgående snitt, skära hjärnstammen från framhjärnan.
      OBS: En handhållen rakhyvel kan användas ytterligare för att hemi-sektera framhjärnan eller hjärnstammen i vänster och höger halvklot enligt experimentell design. Till exempel för att validera fynd från en halvklot med olika metoder, undersöka vänster-höger divergens eller öka provantalet.
    4. Lägg till optimal skärtemperatur (O.C.T.) medium till cirka 3-4 cm djup i vävnadsinbäddningsformen så att vävnadsprovet kan nedsänkas helt. Placera vävnaden, framhjärnan och/eller hjärnstammen i vävnadsinbäddningsformen och tillsätt mer O.C.T. för att helt täcka vävnadsprovet.
    5. Tillsätt plastvävnadens inbäddningsform som innehåller vävnadsprovet (råttans framhjärna) i kylbadet av torris och metanol för att omedelbart frysa vävnadsprovet. Låt vävnadsprovet i inbäddningsformen ligga kvar i kylbadet tills vävnadsuppsamlingen är klar men inte längre än 15 min.
      OBS: Var noga med att förhindra att metanol spills ut i vävnadsbehållaren.
    6. Förvara vävnadsprover snabbt vid -80 °C.
      OBS: Mikrofluidisk RT-qPCR mäter genuttryck genom att förstärka och mäta mRNA-transkript. Dessa transkript är relativt instabila, så många steg tas i denna process för att hålla provet så kallt som möjligt för att förhindra mRNA-nedbrytning.

3. Kryosektion

OBS: En råtta neuronala kärnor är ungefär 10 μm. Således är 10 μm den optimala skivtjockleken för denna djurmodell. Skivtjockleken justeras enligt djurmodellen för studien.

  1. Från frysen -80 °C, ta ut vävnadsinbäddningsformen som innehåller frusen hjärnstam och tina provet vid -20 °C i kryostat i 5-10 min. Utför denna frys-tina till -20 °C endast en gång för mRNA-konservering.
  2. Med en handhållen rakhyvel skär du vertikalt hörnen på plastinbäddningsformen. Ta bort hjärnstammen inbäddad i O.C.T. från plastvävnadens inbäddningsform. På chucken på kryostaten inställd på -20 ° C, använd rumstemperaturvätska O.C.T. som lim för att montera hjärnstammen i rostral till kaudal riktning för koronal kryosektion.
  3. Skär 10 μm koronala kryosektioner i rostral till kaudal riktning från råttans hjärnstam tills sektioner som innehåller intresseområdet (NTS) har uppnåtts. Höjden och bredden på dessa kryosektioner är ~ 200 mm baserat på dimensionerna på plastinbäddningsformen.
  4. Samla in 10 μm kryosektioner av hjärnstamsvävnad som inkluderar NTS, eller annan region av intresse baserat på studien, genom att tina montera på vanliga glasskivor i rumstemperatur. Placera snabbt dessa bilder med sektioner i en kylmetallpanna som ligger ovanpå torris. Placera så snart som möjligt glasskivor som innehåller kryosektioner i frysen på -80 °C för förvaring.
    OBS: En enda glasskiva kan passa flera 10 μm kryosektioner eftersom bredden och höjden är ~ 200 mm. Således kan samma bild innehålla kryosektioner som är färgade för distinkta celltyper.
    1. När flera sektioner är på bilden, se till att de är åtskilda av 100 mm tomt utrymme. För att skapa en gräns mellan kryosektionerna, använd en hydrofob penna. Detta gör det möjligt för olika antikroppslösningar att färga för olika celltyper på samma glasskiva. Behåll 20 mm utrymme för kryosektionen från kanten av glasskivan.

4. Immunofluorescensfärgning av enstaka celler

  1. Använd snabbt färgningsimmunfluorescensprotokoll på hjärnkryosektioner för att märka önskade hjärncelltyper (neuroner, mikroglia, astrocyt, etc.) för insamling med LCM.
    OBS: Immunohistokemifärgningsprotokollet som användes för dessa experiment var utformat för att vara snabbt för att förhindra överskott av mRNA-nedbrytning under denna process.
    1. Ta ut glasskivor som innehåller 10 μm kryosektioner av råtthjärnstammen som innehåller NTS från frysen vid -80 °C. Doppa glasrutschbanor i 30 s i 75% etanolbad för att fixera kryosektionsvävnad. Ta bort överflödig vätska.
    2. Applicera 2% bovint serumalbumin (BSA) i fosfatbuffertsaltlösning (PBS) i 30 s för att blockera oriktad bindning av antikroppar på den fasta kryosektionsvävnaden. Tvätta sedan med PBS.
    3. Applicera tillräckligt med primär antikroppslösning för att täcka den kryosektionerade vävnaden (nu fixerad och blockerad). Inkubera vävnadssektionen i primär antikroppslösning i 2 minuter. Tvätta vävnaden med 2% BSA-lösning en gång. Den primära antikroppslösningen innehåller 96% av BSA-PBS-lösningen för blockering, 3% primär antikropp och 1% RNas-hämmare. Primär antikropp späddes ut i förhållandet 1:25.
      OBS: I detta representativa experiment består primära antikroppar av anti-NeuN-antikropp och anti-Cd11β-antikropp. Neuroner delades vidare in i TH + och TH-undergrupper, så primära antikroppslösningar för neuronal färgning innehöll 93% av BSA PBS-lösningen, 3% anti-NeuN-antikropp, 3% anti-tyrosinhydroxylasantikropp och 1% RNase Out.
    4. Applicera tillräckligt med sekundär antikroppslösning (1:200) för att täcka hjärnstamsvävnaden. Låt den sekundära antikroppslösningen bada vävnaden. Tvätta vävnaden med 2% BSA-lösning en gång efter 3 minuter.
      OBS: Lösningen innehållande den sekundära antikroppen bestod av 196,5 μL 2% BSA, 1 μL get-anti-mus 555 nm fluorescerande tagg för celltyp, 1 μL åsna anti-kanin Alexa 488 nm för TH-färgning, 2,5 μL RNas-hämmare och 1,3 μL DAPI (1: 10000).

5. Standardserier för uttorkning av etanol och xylenvävnad

  1. Placera glasskivor på vilka den färgade kryosektionsvävnaden vilar i ett 75% etanolbad i 30 s, följt av att placera i 95% etanolbad i 30 s, ett 100% etanolbad i 30 s och slutligen en 100% etanol både i 30 s (i en andra behållare).
  2. Efter avslutad etanoluttorkningsserie, häll två färska 100% xylenbad. Placera sedan glasskivorna i det första xylenbadet i 1 min. Ta snabbt bort och placera rutschkanorna i det andra färska xylenbadet i 4 minuter.
  3. Ta glasskivor som innehåller färgade och uttorkade vävnadskryosektioner ur xylen och placera i en mörk men ventilerad behållare i 5 minuter för att lufttorka. Efter lufttorkning, placera glasskivor i en exsickator i 5 minuter för slutlig torkning.

6. Välj enstaka celler med laserfångningsmikrodissektion (LCM)

  1. Sätt in glasskiva som innehåller färgade, fasta och uttorkade vävnadskryosektioner i LCM-mikroskopprovhållaren. Använd anatomiska landmärken för att hitta det intressanta område från vilket cellinsamling kommer att äga rum (NTS i det här representativa exemplet).
  2. Slå på mikroskopfluorescens och hitta färgade celltyper av intresse. Se till att kärnan i den önskade cellen ligger i intresseområdet och isoleras från kärnorna i andra celler med ett avstånd >3 mm. Identifiera och markera en cell (om experimentet är sant encelligt) eller flera celler (om experimentet kräver poolade encellsprover [dvs. encellsskala] som demonstreras i detta representativa experiment) för att samla in med LCM-programvaran.
    OBS: Prover som omfattade 10-cellspooler användes i detta representativa experiment. Detta görs för att minska genuttrycksvariationen mellan prover och öka antalet analyserade enstaka celler, även om detta fortfarande är ett experiment med en cellskala. Sanna encellsexperiment kan slutföras med denna metod20,27. Dessutom kan större vävnadssektioner också väljas21.
  3. När de önskade cellerna har valts, använd LCM-robotarmen, placera LCM-locket på intresseområdet på den markerade vävnadskryosektionen.
  4. Kalibrera intensiteten och inriktningen på den infraröda (IR) lasern med hjälp av testbilder.
    OBS: Detta görs för varje prov. Kalibrering bör utföras på en del av locket som inte är direkt över vävnaden för att inte felaktigt välja icke-experimentell vävnad.
    1. För att kalibrera intensiteten, justera varaktigheten, styrkan och storleken på IR-laserskottet så att ett skott bara smälter locklimmet tillräckligt för att välja en enda cellulär kärna och är också tillräckligt stark för att smälta locket till kryosektionen på bilden. Dessa värden kommer att vara olika för varje tak.
    2. Kalibrera inriktningen genom att lokalisera laserhårkorset exakt där lasern smälte locket.
  5. Samla cellerna som identifieras genom att avfyra LCM-infraröd laser för att smälta locket på den kryosektionerade vävnaden över dessa celler. Se till att endast utvalda celler lyftes från vävnadsskivan genom att använda robotarmen för att lokalisera locket till kvalitetskontrollområdet (QC) i LCM-mikroskopet. För att ta bort överflödiga celler på locket, använd ultraviolett (UV) laser för att utplåna det genetiska materialet i de extra cellerna.
  6. Spela in anatomisk specificitet med LCM-programvarukameran. Ta en bild av den kryosektionsvävnad från vilken cellen /cellerna togs bort.
  7. Använd en anatomisk atlas (en atlas över råttans framhjärna i det här exemplet) för att bestämma avståndet för denna vävnadsskiva från bregma och registrera denna information som Z-avståndet28. Bestäm platsen i X- och/eller Y-planet från fotot för att helt lokalisera den markerade cellen.
  8. Ta bort LCM-locket från QC-området med handskar. Fäst sedan provextraktionsanordningen på LCM-locket. Använd en pipett för att applicera 5,5 μL lysbuffert på de valda cellerna. Detta kallas nu provet.
    OBS: Lysbuffertlösningen består av 5 μL resuspensionsbuffert tillsammans med 0,5 μL lysförstärkare.
  9. Montera ett 0,5 ml mikrocentrifugrör på provutsugningsanordningen som är fäst vid LCM-locket. Placera detta arrangemang på en 75 °C kokplatta med prov- och lysbufferten närmare plattan. Låt provet värmas i 15 min.
  10. Använd en låghastighetscentrifug vid 0,01-0,02 x g för att snurra provet och lysbufferten ner i botten av 0,5 ml mikrocentrifugröret. Förvara provet vid -80 °C tills det är mikrofluidiskt qPCR.

7. Kör qPCR-chip på en mikrofluidisk RT-qPCR på plattformen

  1. För att mäta genuttryck för encellsprover, utför mRNA-förförstärkning enligt beskrivningen nedan.
    OBS: Protokollet involverar inte mRNA-extraktion eftersom proverna är enstaka celler som innehåller en mycket låg mängd RNA (10 pg), som kommer att gå förlorade under mRNA-isoleringssteget. De enskilda cellerna lyseras och fortsätter direkt för omvänd transkription för att minimera provförlusten.
    1. Skapa en primerpool genom att lägga till mRNA qPCR-genprimrar (framåt och bakåt) för varje gen som analyseras i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Se till att den slutliga koncentrationen av varje primer är 500 nM. Primers i detta exempelexperiment listas i tilläggstabell 116.
    2. Pipettera 1 μL 5x cDNA-reaktionsblandning i varje brunn på en 96-brunns PCR-platta.
    3. Låt encellsprover tina en kort stund (2-3 min) genom att ta bort dem från frysen på -80 °C och låta dem sitta i rumstemperatur. Använd en låghastighetscentrifug vid 0,01-0,02 x g för att snurra ner proverna i 20-30 s. Pipettera 5,5 μL av varje encellsprov till en annan brunn i PCR-plattan med 96 brunnar.
      OBS: Provnumret och typen som ska sättas i varje brunn bestäms innan detta steg påbörjas.
    4. PCR-plattan med 96 brunnar har nu cDNA-reaktionsblandningen och ett encellsprov tillsatt till varje brunn. Placera denna platta i en termocykler i 1,5 minuter vid 65 °C för att aktivera cDNA-reaktionsblandningen. Snurra ner innehållet med höghastighetscentrifugering vid 1 300 x g i 1 min vid 4 °C och lägg PCR-plattan på våt is.
    5. I varje brunn i PCR-plattan, pipettera 0,12 μL T4-gen 32-protein, 0,73 μL DNA-suspensionsbuffert och 0,15 μL 10x cDNA-syntesmasterblandning. Kör PCR-plattan genom följande protokoll i termocykeln: 25 °C i 5 min, 50 °C i 30 min, 55 °C i 25 min, 60 °C i 5 min, 70 °C i 10 min och ett slutligt grepp vid 4 °C.
      OBS: T4 Gen 32-protein (ett enkelsträngat DNA (ssDNA) bindande protein) krävs för bakteriofag T4-replikation och reparation. T4 Gene 32-proteinet användes i protokollets omvända transkriptionssteg för att förbättra utbytet och effektiviteten av omvänd transkription och för att öka PCR-produktutbytet.
    6. I varje brunn i PCR-plattan, pipettera 7,5 μL Taq-polymerashuvudblandning. Därefter skapas i varje brunn 1,5 μL av primerpoolen i steg 7.1.1. Kör PCR-plattan genom följande linjära förförstärkningssteg i termocyklern: 95 °C i 10 minuter; 22 cykler av: 96 °C i 5 s och 60 °C i 4 minuter.
    7. I varje brunn i PCR-plattan, pipettera 1,2 μL exonukleas I, 4,2 μL DNA-suspensionsbuffert och 0,6 μL 10x exonukleas I reaktionsbuffert. Kör PCR-plattan genom följande protokoll i termocykeln: 37 °C i 30 min, 80 °C i 15 min.
      OBS: Exonukleas katalyserar avlägsnandet av nukleotider från linjärt enkelsträngat DNA i riktningen 3'till 5'. Vi använder exonukleas för provrensning för avlägsnande av icke-inkorporerade primers och eventuellt enkelsträngat cDNA som kan finnas efter förförstärkning.
    8. I varje brunn i PCR-plattan, pipettera 54 μL TE-buffert. Använd en höghastighetscentrifug vid 1 300 x g i 5 minuter vid 4 °C för att snurra ner innehållet i PCR-plattan.
    9. Om du planerar att fortsätta med nästa fas i protokollet, kyl PCR-plattan vid 4 °C. Om det finns mer än 12 timmar mellan slutförandet av förförstärkningsfasen och påbörjandet av mikrofluidisk qPCR, täck över qPCR-plattan och placera den i en frys på -20 °C.
  2. Gör provplattan (ny 96-brunns PCR-platta) för qPCR-chip enligt beskrivningen nedan.
    1. Om PCR-plattan från steg 7.1 placerades i en frys för -20 °C, ta bort och låt tina i rumstemperatur i 10 minuter.
    2. Till en ny 96-brunns PCR-platta, pipettera i varje brunn 4,55 μL PCR-supermix lågt rox och 0,45 μL 20x DNA-bindande färgämne. Pipettera sedan 3 μl förförstärkt prov från PCR-plattan i steg 7.1. Använd höghastighetscentrifugering vid 1 300 x g i 5 minuter vid 4 °C för att snurra ner PCR-plattan och placera PCR-provplattan på is.
  3. Gör en analysplatta (en ny 96-brunns PCR-platta) för qPCR-chip enligt beskrivningen nedan.
    1. Till en ny 96-brunns PCR-platta, pipettera in i varje brunn 1,25 μL DNA-suspensionsbuffert och 3,75 μL 2x analysladdningsreagens. Pipettera sedan motsvarande qPCR-primer vid 2,5 μL 10 μM primer. Använd höghastighetscentrifug vid 1 300 x g i 5 minuter vid 4 °C för att snurra ner PCR-plattan och placera PCR-analysplattan på is.
  4. Förbered qPCR-chipet för laddning i den mikrofluidiska RT-qPCR-plattformen enligt beskrivningen nedan.
    OBS: qPCR-chipet är en qPCR-plattform i realtid som fungerar på mikrofluidiska principer. qPCR-chipet är i huvudsak en matris med 96 provkanaler och 96 RNA qPCR-primerkanaler (dvs. analyser) som skär varandra i 9 216 (96 x 96) kamrar. Ett prov och en specifik analys kombineras i varje kammare i matrisen där en qPCR-reaktion i realtid inträffar. Avläsningen genereras som tröskelvärdesvärden (Ct) och förstärkningsdiagram för de primers som används.
    1. Injicera kontrollledningsvätska i qPCR-chipet för grundning. Sätt i qPCR-chipet i mikrofluidikblandningsanordningen. Välj prime (136x) skript och kör det här programmet.
    2. När programmet är klart efter ~ 45 min, ta bort det grundade qPCR-chipet. In i det grundade qPCR-chipet, pipettera 6 μL av reaktionen från PCR-provplattan till motsvarande provbrunn i qPCR-chipet.
    3. In i det grundade qPCR-chipet, pipettera 6 μL av reaktionen från PCR-analysplattan till motsvarande analysbrunn i qPCR-chipet.
      OBS: Luftbubblor kan bildas längst ner i provet och analysbrunnar i qPCR-chipet, vilket kan förhindra att lösningarna kommer in i de mikrofluidiska ledningarna. En vass nål kan användas för att poppa eller ta bort dessa luftbubblor innan qPCR-chipet sätts in i mikrofluidikblandningsanordningen.
    4. Sätt i qPCR-chipet i mikrofluidikblandningsanordningen. Välj skriptet för lastmix (136x) och kör det här programmet.
  5. Ladda qPCR-chip i den mikrofluidiska RT-qPCR-plattformen.
    1. Slå på den mikrofluidiska RT-qPCR-plattformen och värm upp glödlampan (~ 20 min). Ta bort qPCR-chipet från mikrofluidikblandningsanordningen. Skala skyddsdekalen från botten av qPCR-chipet.
    2. Öppna den mikrofluidiska RT-qPCR-plattformen och ladda qPCR-chipet i den mikrofluidiska RT-qPCR-plattformen. Kör det snabba 96 x 96 PCR-protokollet (30 cykler) på den mikrofluidiska RT-qPCR-plattformen.
    3. Starta datainsamlingsprogramvaran - klicka på Starta en ny körning.
    4. Kontrollera chipstreckkoden och chiptyp-klicka på Nästa. Klicka på Chip Run-filen och bläddra i filplatsen för datainsamlingslagringen.
    5. Klicka på Programtyp och välj Genuttryck; välj ROX för passiv referens, välj Enkel avsökning och välj EvaGreen för avsökningstyp.
    6. Klicka för att välja det termiska cykelprogrammet och välj Biomark HD: GE Fast 96x96 PCR + Melt v2.pcl-fil.

8. Dataanalys

  1. Ladda upp data från qPCR-chipkörningen till analysprogramvaran för QC enligt beskrivningen nedan.
    1. Ladda ner programvaran för dataanalys. Detta finns på följande webbplats: https://www.fluidigm.com/products-services/software#. Starta programvaran för att analysera det mikrofluidiska RT-qPCR-experimentet.
    2. Öppna Chip Run i programvaran. Öppna sedan filen ChipRun.bml som skapades av experimentet. Ett fönster visas med experimentella detaljer, inklusive passiv referens, sond och PCR-termiskt program.
      OBS: Kvalitetskontroll (QC) och dataanalys kan göras på den dator som är ansluten till den mikrofluidiska RT-qPCR-plattformen eller genom att överföra .bml-filen till en annan dator via en flash-enhet eller på annat sätt.
  2. Definiera exempelinställningen enligt beskrivningen nedan.
    OBS: Detta steg skapar en märkt mall med prover och analyser (qPCR-primers) för kvalitetskontroll (QC) och dataanalysprocedurer.
    1. Välj Chip Explorer > Sample Plate Setup och skapa en ny provplatta. Välj lämplig behållartyp och behållarformat (SBS96 för en 96-brunnsplatta som används i detta representativa experiment).
    2. Klistra in exempeletiketterna i programvarukalkylarket enligt den experimentella designen och välj Karta från uppgiftsmenyn. Välj SBS96-Left.dsp. Exempelkonfigurationen har nu mappats. Välj Detaljvy > Analysera för att uppdatera ändringarna i filen.
      OBS: Alla ändringar som görs i denna programvara sparas inte förrän du klickar på knappen Analysera .
  3. Definiera kontrollexemplen i programvaran. Markera cellerna för kontrollproverna genom att vänsterklicka och hålla ned medan du drar genom cellerna för markering. Enskilda celler kan väljas genom att trycka och hålla ned Ctrl-tangenten och klicka på enskilda celler. För RNA-standardproverna (utspädningsserien) anger du provnamnet och den använda RNA-koncentrationen. Klicka på Analysera för att spara.
  4. Definiera detektoruppsättningen liknande steg 8.2 ovan men med RT-qPCR-analysnamn, dvs namnen på de gener som analyseras. Välj Detector Plate Setup och skapa en ny analysplatta. Välj lämplig behållartyp och format (SBS96 för en 96-brunnsplatta). Klistra in analysnamnen enligt den experimentella designen och klicka på Analysera för att spara.
  5. Börja processen för användarkvalitetskontroll (QC) enligt beskrivningen nedan.
    OBS: Detta representativa experiment använde en tröskelmetod för cykeltid (Ct). Det vill säga prover som inte nådde en tröskelsignal som definierats av programvaran (Auto Global) eller manuellt (User Global) kommer att betraktas som misslyckade reaktioner och inte inkluderas i datauppsättningen.
    1. Välj Analysvy > Aktivitetsram. I fönstret för analysinställningar ändrar du inställningarna till Auto Global (beräknar automatiskt ett tröskelvärde som tillämpas på hela chipet) eller User Global. Ställ in baslinjekorrigeringen på linjär derivata. Om User Global används måste feltröskeln fastställas manuellt som i det representativa experimentet.
    2. I det här representativa experimentet användes en QC-regel enligt följande: om en enskild analys eller ett enskilt prov hade en felfrekvens på 70 % eller mer misslyckades hela raden eller kolumnen i datauppsättningen.
    3. Granska varje reaktion manuellt i 96 x 96-chipet. Visualisera förstärkningskurvorna och smältkurvorna för att bedöma om varje reaktion följde det förväntade qPCR-mönstret. Om förstärknings- eller smältkurvan inte stämmer överens med vad som förväntas, misslyckas den reaktionen.
  6. Efter QC exporterar du data genom att välja Arkiv > Exportera och spara datauppsättningen som en .csv fil.
  7. Beskär datauppsättningen eftersom den exporterade .csv-filen har både en matris med godkänt fel och en matris med råa Ct-värden. Använd matrisen Pass – fail för att ersätta alla misslyckade celler i datauppsättningen med NA.
  8. Ladda ner den mest uppdaterade versionen av R-programvaran med öppen källkod och ladda sedan ner R-Studio-applikationen. Ladda upp den normaliserade datauppsättningen till R. Analysera data som passar för studien.
  9. Normalisera datauppsättningen med metoden -ΔΔCt enligt beskrivningen nedan.
    OBS: Mediancentrering eller hushållningsgennormalisering kan användas över en provrad för att generera ett -ΔCt-värde . I det representativa experimentet användes mediancentrering och validerades genom normalisering av hushållningsgenen. Detta kan göras i .csv format eller genom att ladda upp till en dataanalysprogramvara.
    1. För mediancentrering beräknar du medianvärdet för Ct beräknat utifrån alla Ct-värden för ett enskilt prov (10-cellspool). Subtrahera sedan alla enskilda Ct-värden från detta medianvärde. Detta ger ett -ΔCt-värde .
    2. För normalisering av hushållsgenen, beräkna det genomsnittliga uttrycket för hushållningsgenerna (Actb, Gapdh och Ldha i det representativa experimentet) för varje prov och använd detta värde som det för att subtrahera de enskilda Ct-värdena.
    3. Om du vill generera ett -ΔΔC t-värde tar du medianvärdet för varje analyskolumn, som nu innehåller värdet -ΔCt. Subtrahera analysmedianen från varje -ΔC t-värde för att producera ett -ΔΔCt-värde.
  10. Beräkna z-poäng för varje -ΔΔCt-värde med hjälp av skalfunktionen i R. Använd R-värmekartfunktionen eller en separat programvara för att generera en värmekarta.
  11. Använd Pearson-korrelationsfunktionen för att beräkna Pearson-korrelationer mellan varje gen. Använd smältfunktionen i R för att organisera datauppsättningen för andra funktioner. Exportera dessa data och ladda upp dem till en programvara för genkorrelationsnätverk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Validering av encellsinsamling utförs visuellt under LCM-procedurer. Cellkärnor bedöms vid QC-stationen. Celltypen kan bestämmas genom utsläpp av taggad fluorofor för den celltypen och dess allmänna morfologi. Om icke-önskade celler har valts på locket kan deras genetiska material förstöras med en UV-laser vid QC-stationen. Ytterligare validering genom molekylär analys är också nödvändig. I detta representativa exempel16 valdes två typer av neuroner-tyrosinhydroxylas (Th) positiva (+) och Th-negativa (-), förutom mikroglia. Figur 1D visar att prover avsedda att vara neuroner visade statistiskt signifikant förhöjt uttryck av neuronmarkören NeuN. Samtidigt hade mikroglialprover signifikant höjning av mikroglialmarkörerna, CD34 och Cx3xr1, vilket tyder på att provvalet utfördes med hög trohet. Dessutom visade Th + neuronala prover signifikant förhöjt uttryck av Th jämfört med Th- neuronala prover och mikrogliaprover medan Th-neuroner visade signifikant förhöjt uttryck av GCG (en preproglukagonkodande gen) vilket tyder på att dessa Th-neuronala prover är berikade med neuroner som använder GLP-1 som neurotransmittor (Figur 1D ). Ett mer globalt beräkningsmått som kallas linjär diskrimineringsanalys visade att dessa tre celltyper hade olika genuttrycksprofiler över alla 65 gener uppmätta med neuroner och mikroglia som separerade längs x-axeln och Th + och Th- neuronala prover som delade sig längs y-axeln (Figur 1E).

Kvaliteten på uppgifterna validerades också med tekniska replikat inom och mellan olika tillverkningssatser (figur 2 och figur 3). Intrabatchreplikerar kontroll för kvaliteten på data från den specifika satsen. Om replikat inom batch inte justeras kan ett annat qPCR-chipexperiment utföras från samma prov- och analysplattor som gjordes för att köra den första batchen. Replikat mellan batchar säkerställer att data från olika batchar kan jämföras. Detta är avgörande för experiment där ett stort antal prover analyseras som kräver flera satser som detta representativa exempel. Det fanns en outlier i detta experiment som prov 40 i sats 4 (figur 3). Prov 40 i batch 1, 2 och 3 korrekt justerade, och de andra replikaten från batch 4 i linje med batch 1, 2 och 3 tyder på att detta var en isolerad dålig reaktion, som inträffade i den här replikaten. Att jämföra mellan batchar kräver också rätt datanormaliseringstekniker. Detta experiment använde mediancentrering, även om hushållningsgener (Actb, Gapdh, Ldha), också analyserades i detta experiment och fungerade som en kontroll för mediancentreringsmetoden. Det vill säga, båda metoderna gav mycket analoga datamängder, vilket ytterligare tyder på hög datakvalitet.

Figur 4 visar en värmekarta över GLP-1-berikade neuronala prover som är organiserade efter cellulär subfenotyp. Denna siffra visar inte bara vikten av cellulära subfenotyper i neurobiologi, utan visar också hur förhållanden mellan subfenotyper förändras genom alkoholabstinens. Värmekartan visar att subfenotyp A, som starkt uttrycker det inflammatoriska genklustret 1, ökar i förhållande vid 8 h Wd-tiden och når maximalt vid 32 h Wd. Vid 176 h Wd normaliserar denna inflammatoriska subfenotyp sin prevalens tillbaka till kontroll. Subfenotyp B, som starkt uttrycker GABAR-genkluster 2, visar en övergripande undertryckning i uttrycket av detta genkluster genom 176 h Wd-tillståndet. Dessa fynd visar hur denna GLP-1 neuronala celltyp blir hyperexcitabel genom att öka dess inflammatoriska subfenoype och samtidigt minska uttrycksnivån för GABAR i dess GABA-subfenotyp under alkoholabstinens. Figur 5 kombinerar genuttrycket av enskilda prover i medelvärden så att uttrycket av kluster av gener och placeringen av proteinet i det gentranskriptet kan visualiseras under hela tidsserien.

Figure 1
Figur 1: Experimentell design och encellsval. (A) Råtta-trillingar lottades till ett av de fem behandlingstillstånden. (B) Generering av encelliga transkriptomdata. (C) Tecknad representation av gener som analyserats och deras funktion. Gener i grönt analyserades inte. Officiell gensymbol används. (D) Genuttryck av celltypsmarkörer. Felstaplar visar standardfel. Neuroner jämfört med microglia, p-värden = 0,0273, 3,94 x 10-10, 7,73 x 10-12, respektive. Th+ neuroner visade förhöjt Th-uttryck jämfört med Th-neuroner (p = 4,56 x 10-11) och microglia (p = 2,95678 x 10-15). Th-neuroner visade förhöjt uttryck av GCG jämfört med Th + neuroner (p = 0,0106) och mikroglia (p = 0,0435) vilket indikerar att de är GLP-1+ neuroner. *p < 0,05, ***p < 4 x 10-10. (E) Linjär urskillningsanalys av alla prover visar skillnaden mellan alla gener som mäts mellan de tre celltyperna som samlats in i ett tvådimensionellt utrymme. Centroidavstånd mellan NE-neuroner och GLP-1-neuroner = 3,30, NE-neuroner och mikroglia = 1,57, GLP-1-neuroner och mikroglia = 2,92. Denna siffra har modifierats från O'Sullivan et al. 202116. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Tekniska replikatdiagram över råaC-t-värden inom en sats. Varje diagram visar råa Ct-värden för intrachip tekniska replikat plottade mot varandra som visar teknisk experimentell integritet. Denna siffra har modifierats från O'Sullivan et al. 202116. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Tekniska replikatdiagram över råa Ct-värden mellan satser. Varje diagram visar råa Ct-värden för interchip tekniska replikat plottade mot varandra som visar att alla satser är jämförbara med varandra. Denna siffra har modifierats från O'Sullivan et al. 202116. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Värmekarta över GLP-1-berikade neuronala prover. Värmekarta visar cellulära subfenotyper av GLP-1-berikade neuronprover genom en tidsserie för alkoholabstinens. Raderna representerar 10-cells poolade prover med cellulära subfenotypkluster märkta med stora bokstäver. Kolumner representerar z-poängen för -ΔΔC t-genuttrycksvärden på en -1 till +1 färgskala för den genen i det provet. Genkluster är märkta med nummer. Denna siffra har modifierats från O'Sullivan et al. 202116. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Sufenotypgenuttryck i GLP-1-berikade neuronala prover. Mobildiagram visar rutor som representerar relativt genuttryck (genomsnittlig z-poäng för -ΔΔCt-värden ) av subfenotyper som visas i värmekartan i figur 4. Diagrammen konstruerades med Cytoscape version 3.8.0 och z-poäng beräknades med hjälp av skalfunktionen i R version 3.5.2. -ΔΔCt-etiketter till höger visar vilka rutor som motsvarar vilken gen och färgen representerar uttryck (blått är lågt uttryck och gult är högt uttryck). Lådans placering representerar lokaliseringen eller funktionen hos proteinprodukten från det gentranskriptet. Gröna siffror anger undergrupper inom subfenotyper. Denna siffra har modifierats från O'Sullivan et al. 202116. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Interoceptiv vagal krets, visceral-emotionell neuraxi och schematisk för motståndare-processmodell för missbruk. (A) Interoceptiva vagala afferenter vidarebefordrar tarmens tillstånd, som är starkt påverkat av tarmmikrofloran och andra perifera organ till kärnan tractus solitarius (NTS). Denna information vidarebefordras därefter till amygdala och påverkar känslomässiga tillstånd. (B) En förenklad tecknad representation som visar de integrerande rollerna hos kärnan tractus solitarius (NTS) och den centrala kärnan i amygdala (CeA) i känslor, stress och autonom reglering. Två neuronala subtyper, GLP-1 och NE-neuroner markeras. Många anatomiska och funktionella anslutningar utelämnas för tydlighetens skull. Förkortningar: NE = noradrenalin; GLP-1 = glukagonliknande peptid 1; GABA = γ-aminosmörsyra; HPA-axel = hypotalamus-hypofys-binjure-axel; CRF = kortikotropinfrisättande hormon. (C) Alkohol- och/eller opioidexponering har två åtgärder: stimulera belöning, via den mesolimbiska dopaminvägen, och hämma antireward. Dessa åtgärder motiverar substansanvändning via positiv förstärkning. (D) Alkohol- och / eller opioidabstinens har två åtgärder: hämma belöningen genom att hämma den mesolimbiska dopaminvägen (visas inte) och stimulera antireward. Denna studie föreslår att visceral-emotionell neuroinflammation är en slutpunkt vid antireward-stimulering, även om denna hypotes motiverar ytterligare testning. Dessa åtgärder, oavsett mekanism, motiverar substansberoende via negativ förstärkning. Denna siffra har modifierats från O'Sullivan et al. 202116. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tilläggstabell 1: Primers för mikrofluidisk RT-qPCR. Alla primerpar för mRNA-förstärkning listas tillsammans med ampliconlängden som bildas av varje primerpar. Denna tabell har modifierats från O'Sullivan et al. 202116. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Alkoholanvändningsstörning är fortfarande en utmanande sjukdom att behandla. Vår grupp har närmat sig denna sjukdom genom att undersöka antireward-processer med ett systemneurovetenskapligt perspektiv. Vi mätte genuttrycksförändringar i enstaka NTS-neuroner och mikroglia i en alkoholabstinenstidsserie16. NTS valdes för sin framträdande roll i den autonoma dysreglering som uppstår vid alkoholabstinenssyndrom. Vi kombinerar LCM med encellig mikrofluidisk RT-qPCR vilket möjliggör robust antal prover och gener som kan mätas till låg kostnad med anatomisk och molekylär känslighet och specificitet (figur 1B-C). Enstaka celler identifierades och valdes ut genom IHC-färgning, och dessa cellulära subfenotypgrupperingar validerades med molekylärt uttryck (figur 1D-E). Vissa GLP-1-berikade neuronala prover (TH-neuroner) uttryckte emellertid måttligt Th (Figur 4). Upprättandet av cellfenotyp gjordes vid cellval baserat på fluorescerande visualisering, och detta kriterium användes för studien eftersom molekylär gruppering baserad på uttrycket av en enda gen, Th, misslyckades med att definiera uttrycksmönster som tyder på en cellulär fenotyp16. Således karakteriserar resultaten stora NTS-mikrogliala och neuronala subfenotyper och deras dynamik i alkoholabstinens.

Detta manuskript beskriver en metod för encells transkriptomik, och det är absolut nödvändigt att alla steg i protokollet följs enligt beskrivningen. Vissa ändringar kan krävas när man arbetar med olika organvävnader eller celltyper. En av utmaningarna med detta protokoll är att upprätthålla RNA-kvalitet och integritet under LCM. Vi har upprättat protokoll för IHC-färgning, LCM och mikrofluidisk RT-qPCR för att hantera utmaningarna som beskrivs ovan. Kortfattat inkluderar dessa processer tillsats av RNas-hämmare till alla färgningslösningar för att förhindra RNA-nedbrytning, ett snabbfärgningsprotokoll för att förhindra eventuell RNA-nedbrytning, bearbetning av glidbanor för LCM omedelbart efter IHC-färgning och uttorkning och upprätthållande av korrekta kalla förhållanden när det är möjligt under provbearbetning eller överföring.

Transkriptomikanalysen utförs på lyserade enskilda celler utan RNA-isolering, följt av omvänd transkription, förförstärkning och qPCR. Förförstärkningssteget är att förstärka cDNA-molekyler till detekterbara nivåer för qPCR selektivt. Det finns flera begränsningar för förförstärkningssteget. Dessa inkluderar gentranskript som inte förstärks, vilket inte kommer att resultera i någon detektion i mikrofluidisk RT-qPCR. Det finns också möjlighet till primer dimerbildning eftersom PCR-reaktionen innehåller alla primers för den experimentella analysen. Det vill säga bildandet av dimerer med en framåt- och bakåtsekvens av ett enda primerpar och med alla framåt- och bakåtsekvenser i experimentet är möjligt. Därför rekommenderas primertestning med positiv experimentell kontroll som RNA-standarder.

RT-qPCR-chipdesignen är en annan viktig aspekt av detta protokoll för kvalitetskontroll och batcheffekter. Positiva kontroller består av standard-RNA från djuret och organet som analyseras (råtthjärna i detta representativa exempel). En RNA-utspädningsserie kan sedan laddas i varje chip och bör visa lämplig kvantitativ signal för varje genanalys. Vatten kan användas som en negativ kontroll. Dessa kontroller är avgörande för korrekt normalisering som styr för batcheffekter som kan uppstå när data från olika chips kombineras. Detta diskuteras i detalj i steg 8.

I det representativa experimentet som visas här tillämpades dessa metoder för hypotesgenerering och ger insikt i möjlig mekanism. Studien utfördes i samband med ett annat arbete och ger viktig information för den avlyssnande antirewardhypotesen13. I korthet antar denna modell att antireward stimuleras i substansabstinens genom interoceptiv signalering från vagus via NTS till amygdala och att det initiala substratet för denna antireward är neuroinflammation (Figur 6). Detta arbete stöder denna hypotes genom att fastställa de inflammatoriska förändringarna i genuttryck i nervceller och mikroglia vid alkoholabstinens.

En stor svaghet i denna studie är dess brist på mekanistiska påståenden. Dessa metoder kan dock användas för att bestämma en mekanism efter att ett baslinjeexperiment som det här har utförts. Till exempel kan en djurmodellintervention eller störningar, såsom en submembranmatisk vagotomi eller gen knockout, visa anatomiska eller genetiska mekanismer hos inflammatoriska regulatorer. Framtida studier som tar detta tillvägagångssätt kan bidra till utvecklingen av den interoceptiva antirewardhypotesen, som syftar till att implementera dessa insikter i klinisk praxis för missbruksbehandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Arbetet som presenteras här finansierades genom NIH HLB U01 HL133360 som tilldelades JS och RV, NIDA R21 DA036372 tilldelades JS och EVB, T32 AA-007463 tilldelades Jan Hoek till stöd för SJO'S och National Institute of Alcoholism and Alcohol Abuse: R01 AA018873.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20X DNA Binding Dye Fluidigm 100-7609 NA
2x GE Assay Loading Reagent Fluidigm 85000802-R NA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text) Fluidigm BMK-M-96.96 NA
Anti-Cd11β Antibody Genway Biotech CCEC48 Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60 EMD Millipore MAB377 Neuronal Stain
Anti-tyrosine hydroxylase antibody abcam ab112 Stain for TH+ neurons
ArcturusXT Laser Capture Microdissection System Arcturus NA NA
Biomark HD Fluidigm NA RT-qPCR platform
Bovine Serum Antigen Sigma-Aldrich B4287
CapSure Macro LCM Caps ThermoFisher Scientific  LCM0211 NA
CellDirect One-Step qRT-PCR Kit ThermoFisher Scientific 11753500 Lysis buffer solution components
CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer Kit ThermoFisher Scientific 11739010 Invitrogen
DAPI ThermoFisher Scientific 62248 Nucleus Stain
DNA Suspension Buffer TEKnova T0221
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific R37118 Seconadry Antibody
Exonuclease I New Englnad BioLabs, Inc. M0293S NA
ExtracSure Sample Extraction Device ThermoFisher Scientific LCM0208 NA
FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope Slides ThermoFisher Scientific 22-037-246 Plain glass slides
GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube ThermoFisher Scientific N8010611
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 ThermoFisher Scientific A28180 Seconadry Antibody
IFC Controller Fluidigm NA NA
RNaseOut ThermoFisher Scientific 10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox Bio-Rad PN 172-5211 NA
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit ThermoFisher Scientific 11754250 Contains VILO and SuperScript
T4 Gene 32 Protein New Englnad BioLabs, Inc. M0300S NA
TaqMan PreAmp Master Mix ThermoFisher Scientific 4391128 NA
TE Buffer TEKnova T0225 NA
TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mL USA Scientific 1402-9700 NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Substance Use and Mental Health Indicators in the United States: Results from the 2019 National Survey on Drug Use and Health. , Available from: https://www.samhsa.gov/data/ (2020).
  2. Prevalence of Serious Mental Illness (SMI). NIH. 49, Available from: https://www.nimh.nih.gov/health/statistics/mental-illness.shtml (2020).
  3. Mattick, R. P., Kimber, J., Breen, C., Davoli, M. Buprenorphine maintenance versus placebo or methadone maintenance for opioid dependence. Cochrane Database of Systematic Reviews. Mattick, R. P. , John Wiley & Sons, Ltd. (2008).
  4. Mattick, R. P., Breen, C., Kimber, J., Davoli, M. Methadone maintenance therapy versus no opioid replacement therapy for opioid dependence. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 2009 (3), (2009).
  5. Miller, P. M., Book, S. W., Stewart, S. H. Medical treatment of alcohol dependence: A systematic review. International Journal of Psychiatry in Medicine. 42 (3), 227-266 (2012).
  6. Holmes, E. A., et al. The Lancet Psychiatry Commission on psychological treatments research in tomorrow's science. The Lancet. Psychiatry. 5 (3), 237-286 (2018).
  7. Ford, C. L., Young, L. J. Translational opportunities for circuit-based social neuroscience: advancing 21st century psychiatry. Current Opinion in Neurobiology. 68, 1-8 (2021).
  8. Holmes, E. A., Craske, M. G., Graybiel, A. M. Psychological treatments: A call for mental-health science. Nature. 511 (7509), 287-289 (2014).
  9. Miranda, A., Taca, A. Neuromodulation with percutaneous electrical nerve field stimulation is associated with reduction in signs and symptoms of opioid withdrawal: a multisite, retrospective assessment. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 44 (1), 56-63 (2018).
  10. Metz, V. E., et al. Effects of ibudilast on the subjective, reinforcing, and analgesic effects of oxycodone in recently detoxified adults with opioid dependence. Neuropsychopharmacology. 42 (9), 1825-1832 (2017).
  11. Heinzerling, K. G., et al. placebo-controlled trial of targeting neuroinflammation with ibudilast to treat methamphetamine use disorder. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (2), 238-248 (2020).
  12. Bogenschutz, M. P., et al. Psilocybin-assisted treatment for alcohol dependence: A proof-of-concept study. Journal of Psychopharmacology. 29 (3), 289-299 (2015).
  13. O'Sullivan, S. J., Schwaber, J. S. Similarities in alcohol and opioid withdrawal syndromes suggest common negative reinforcement mechanisms involving the interoceptive antireward pathway. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 125, 355-364 (2021).
  14. O'Sullivan, S. J. Single-cell systems neuroscience: A growing frontier in mental illness. Biocell. 46 (1), 7-11 (2022).
  15. O'Sullivan, S. J., et al. Single-cell glia and neuron gene expression in the central amygdala in opioid withdrawal suggests inflammation with correlated gut dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
  16. O'Sullivan, S. J., McIntosh-Clarke, D., Park, J., Vadigepalli, R., Schwaber, J. S. Single cell scale neuronal and glial gene expression and putative cell phenotypes and networks in the nucleus tractus solitarius in an alcohol withdrawal time series. Frontiers in Systems Neuroscience. 15, 739790 (2021).
  17. O'Sullivan, S. J., Reyes, B. A. S., Vadigepalli, R., Van Bockstaele, E. J., Schwaber, J. S. Combining laser capture microdissection and microfluidic qpcr to analyze transcriptional profiles of single cells: A systems biology approach to opioid dependence. Journal of Visualized Experiments. (157), e60612 (2020).
  18. Achanta, S., Vadigepalli, R. Single cell high-throughput qRT-PCR protocol. Protocols.io. , (2020).
  19. O'Sullivan, S. J. The interoceptive antireward pathway and gut dysbiosis in addiction. Journal of Psychiatry, Depression & Anxiety. 7 (40), 1-5 (2021).
  20. Park, J., et al. Single-cell transcriptional analysis reveals novel neuronal phenotypes and interaction networks involved in the central circadian clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
  21. Staehle, M. M., et al. Diurnal patterns of gene expression in the dorsal vagal complex and the central nucleus of the amygdala - Non-rhythm-generating brain regions. Frontiers in Neuroscience. 14, 375 (2020).
  22. Réus, G. Z., et al. The role of inflammation and microglial activation in the pathophysiology of psychiatric disorders. Neuroscience. 300, 141-154 (2015).
  23. Zhang, X., et al. Role of astrocytes in major neuropsychiatric disorders. Neurochemical Research. 46 (10), 2715-2730 (2021).
  24. Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (1), 87-98 (2015).
  25. Lieber, C. S., DeCarli, L. M. An experimental model of alcohol feeding and liver injury in the baboon. Journal of Medical Primatology. 3 (3), 153-163 (1974).
  26. Lieber, C. S., Decarli, L. M. Animal models of chronic ethanol toxicity. Methods in Enzymology. 233, 585-594 (1994).
  27. Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24 (6), 930-941 (2014).
  28. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , Academic Press. Elsevier Inc. (1982).

Tags

Neurovetenskap utgåva 186 encelligt genuttryck laserfångande mikrodissektion mikrofluidisk qPCR beroende visceral-emotionell neuraxi neuroinflammation antireward
Undersöka drivkrafter för antireward i beroendebeteende med anatomiskt specifika encelliga genuttrycksmetoder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

O'Sullivan, S. J., Srivastava, A.,… More

O'Sullivan, S. J., Srivastava, A., Vadigepalli, R., Schwaber, J. S. Investigating Drivers of Antireward in Addiction Behavior with Anatomically Specific Single-Cell Gene Expression Methods. J. Vis. Exp. (186), e64014, doi:10.3791/64014 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter