Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Undersøgelse af drivere til antireward i afhængighedsadfærd med anatomisk specifikke enkeltcellegenekspressionsmetoder

Published: August 4, 2022 doi: 10.3791/64014
Automatic Translation
*1,2,3, *1, 1, 1
1Daniel Baugh Institute for Functional Genomics and Computational Biology, Department of Pathology, Anatomy, and Cell Biology, Thomas Jefferson University, 2Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 3Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Kombinationen af laserfangstmikrodissektion og mikrofluidisk RT-qPCR giver anatomisk og bioteknisk specificitet ved måling af transkriptomet i enkeltneuroner og glia. Anvendelse af kreative metoder med et systems biologiske tilgang til psykiatrisk sygdom kan føre til gennembrud i forståelse og behandling såsom neuroinflammation antireward hypotesen i afhængighed.

Abstract

Stigende afhængighedsadfærd har motiveret både forskere og klinikere inden for mental sundhed til at forstå antireward og genopretning. Dette skift væk fra belønning og begyndelse nødvendiggør nye perspektiver, paradigmer og hypoteser sammen med en udvidelse af de metoder, der anvendes til at undersøge afhængighed. Her giver vi et eksempel: En systembiologisk tilgang til at undersøge antireward, der kombinerer laserfangstmikrodissektion (LCM) og mikrofluidisk regultion kvantitative polymerasekædereaktioner (RT-qPCR) med høj kapacitet. Genekspressionsnetværksdynamik blev målt, og en vigtig drivkraft for neurovisceral dysregulering i alkohol- og opioidabstinenser, neuroinflammation, blev identificeret. Denne kombination af teknologier giver anatomisk og fænotypisk specificitet ved enkeltcelleopløsning med høj kapacitetsfølsomhed og specifikke genekspressionsmål, der giver både hypotesegenererende datasæt og mekaniske muligheder, der skaber muligheder for ny indsigt og behandlinger.

Introduction

Afhængighed er fortsat en voksende udfordring i den udviklede verden 1,2. På trods af store videnskabelige og kliniske fremskridt fortsætter afhængighedsraterne med at stige, mens effektiviteten af etablerede behandlinger forbliver stabil i bedste fald 3,4,5. Imidlertid har fremskridt inden for bioteknologi og videnskabelige tilgange ført til nye metoder og hypoteser til yderligere at undersøge patofysiologien af stofafhængighed 6,7,8. Faktisk tyder den seneste udvikling på, at nye begreber og behandlingsparadigmer kan føre til gennembrud med sociale, økonomiske og politiske konsekvenser 9,10,11,12.

Vi undersøgte antireward i tilbagetrækning af alkohol- og opioidafhængighed13,14,15,16. Metoder er centrale for dette paradigme17,18. Laserfangstmikrodissektion (LCM) kan vælge enkeltceller med høj anatomisk specificitet. Denne funktionalitet er integreret i neuroinflammation antireward-hypotesen, da både glia og neuroner kan indsamles og analyseres fra den samme neuronale subnucleus i det samme dyr 13,14,15,16,19. En relevant del af transkriptomet af udvalgte celler kan derefter måles med mikrofluidiske kontratranskriptionsresponser med høj kapacitet kvantitative polymerasekædereaktioner (RT-qPCR), der giver højdimensionelle datasæt til beregningsanalyse, hvilket giver indsigt i funktionelle netværk20,21.

Måling af en delmængde af transkriptomet i neuroner og glia i en bestemt hjernekerne genererer et datasæt, der er robust i både prøveantal og gener målt og er følsomt og specifikt. Disse værktøjer er optimale for et systems neurovidenskabelige tilgang til psykiatrisk sygdom, fordi glia, hovedsageligt astrocytter og microglia, har vist en central rolle i neurologisk og psykiatrisk sygdom i løbet af det sidste årti22,23. Vores tilgang kan måle det ekspressive respons af glia og neuroner samtidigt på tværs af adskillige receptorer og ligander involveret i lokal parakrin signalering. Faktisk kan signalering udledes af disse datasæt ved hjælp af forskellige kvantitative metoder såsom fuzzy logik24. Endvidere kan identifikationen af cellulære subphenotyper i neuroner eller glia og deres funktion give indsigt i, hvordan hjerneceller i specifikke kerner organiserer, reagerer på og dysregulerer på enkeltcelleniveau. Dynamikken i dette funktionelle system kan også modelleres med tidsserieeksperimenter16. Endelig kan dyremodeller forstyrres anatomisk eller farmakologisk for at give en mekanistisk tilstand til dette systems tilgang.

Repræsentativt eksperiment:
Nedenfor giver vi et eksempel på anvendelsen af disse metoder. Denne undersøgelse undersøgte rotteneuronal og microglia-genekspression i den ensomme kerne (NTS) som reaktion på alkoholafhængighed og efterfølgende tilbagetrækning16. Rottekohorter bestod af 1) Kontrol, 2) Ethanolafhængig (EtOH), 3) 8 timers tilbagetrækning (Wd), 4) 32 h Wd og 5) 176 h Wd (figur 1A). Efter hurtig halshugning blev hjernestammer adskilt fra forhjernen og kryosektioneret, og skiver blev farvet for tyrosinhydroxylase-positive (TH +) neuroner og microglia (figur 1B). LCM blev brugt til at indsamle både TH+ og TH-neuroner og microglia. Alle cellerne var fra NTS og analyseret som prøver af 10-cellede puljer. Fire 96 x 96 mikrofluidiske RT-qPCR dynamiske arrays blev kørt på RT-qPCR-platformen, der målte 65 gener (figur 1B-C). Data blev normaliseret ved hjælp af en -ΔΔCt-metode og analyseret ved hjælp af R, og enkeltcellevalg blev valideret med molekylære markører (figur 1D-E). Teknisk validering blev yderligere verificeret af tekniske replikater analyseret inden for en enkelt batch og på tværs af batcher (figur 2 og figur 3). TH + og TH- neuroner organiseret i forskellige subfænotyper med lignende inflammatoriske genklynger, men forskellige γ-aminosmørsyre (GABA) receptor (R) klynger (figur 4 og figur 5). Subfænotyper, der havde forhøjet ekspression af inflammatoriske genklynger, var overrepræsenteret ved 32 h Wd, mens GABA-receptor (GABAR) ekspression forblev lav i langvarig alkoholudtagning (176 h Wd). Dette arbejde bidrager til antireward-hypotesen om alkohol- og opioidafhængighed, som formoder, at interceptiv feedback fra indvoldene ved tilbagetrækning bidrager til dysreguleringen af visceral-følelsesmæssige neuronale kerner (dvs. NTS og amygdala), hvilket resulterer i mere alvorlige autonome og følelsesmæssige følgevirkninger, som bidrager til stofafhængighed (figur 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne fra Animal Care and Use Committee (IACUC) fra Thomas Jefferson University. Protokollen blev godkendt af Thomas Jefferson University IACUC.

1. Dyremodel

  1. Hushan Sprague Dawley (>120 g, Harlan, Indianapolis, IN, USA) rottetupliletter individuelt med fri adgang til ethanol-chow (2 rotter) eller kontrol-chow-blanding (1 rotte).
    BEMÆRK: Dette repræsentative eksperiment anvendte Lieber-DeCarli-protokollen til at studere neurobiologien ved alkoholabstinenser25,26. Rottetrillinger består af en tre-rottekohorte, der skal fodres med det samme antal kalorier, men ender i forskellige arme af undersøgelsen ved ofring. De tre arme til denne undersøgelse er: 1) Kontrol, 2) Ethanolafhængig (EtOH) og 3) Tilbagetrækning (Wd) (figur 1A). Der er fem samlede betingelser i denne undersøgelse, da der er tre alkoholaftagningstidspunkter (figur 1A).
    1. Hver anden dag måles ethanol-chow-blandingen, der forbruges af Wd-rotten, og den forbrugte mængde erstattes med den samme mængde ethanolblanding til EtOH-rotteføderen. Tilsæt den ækvivalente kaloriemængde kontrolblanding til kontrolrottens føder.
      BEMÆRK: Det gennemsnitlige daglige ethanolforbrug er omkring 12-16 g / kg efter 3 uger26.
    2. Efter stabilt langtidsforbrug og afhængighed af ethanol (>5 uger) fremkaldes akut alkoholabstinenser hos Wd-rotter ved at tømme hans eller hendes madbeholder og fylde den med kontrolblanding. Udfør dette på en sådan måde, at alle tre rotter ofres på samme døgnrytmepunkt21.
    3. På det forudvalgte tidspunkt skal du ofre alle tre rotter i trillingen på samme tidspunkt (Control, EtOH og Wd).

2. Prøvehøst

  1. Høsthjerne på samme døgnrytmepunkt for hver rotte trilling på korrekt Wd-tidspunkt (8 timer, 32 timer, 176 timer).
    1. Forbered et methanol- og tørisbad til hurtig afkøling af frisk væv for at bevare RNA-integriteten. Sæt til siden.
    2. Sæt rotten i isoflurantank (5% i ilt) i ~ 30 s eller indtil bevidsthedstab opstår, som det fremgår af den reducerede respirationsfrekvens og fravær af motorisk aktivitet. Sæt rottehovedet i en korrekt skærpet guillotine for hurtigt at halshugge.
    3. Åbn dyrets kranium for at dissekere hjernen ved hjælp af tang. Fjern lillehjernen fra den friske hjerne med en håndholdt barbermaskine ved grov udskæring og kassér den. Ved tværgående snit skæres hjernestammen fra forhjernen.
      BEMÆRK: En håndholdt barbermaskine kan bruges yderligere til at hemi-sektere forhjernen eller hjernestammen i venstre og højre halvkugle i henhold til det eksperimentelle design. For eksempel for at validere fund fra en halvkugle med forskellige metoder, undersøge venstre-højre divergens eller øge prøvenummeret.
    4. Tilsæt optimal skæretemperatur (O.C.T.) medium til ca. 3-4 cm dybde i vævsindlejringsformen, så vævsprøven kan nedsænkes helt. Placer vævet, forhjernen og / eller hjernestammen i vævsindlejringsformen og tilsæt mere O.C.T. for fuldt ud at dække vævsprøven.
    5. Tilsæt plastvævets indlejringsform indeholdende vævsprøven (rotteforhjernen) i kølebadet af tøris og methanol for straks at fryse vævsprøven. Lad vævsprøven i indlejringsformen forblive i kølebadet, indtil vævsopsamlingen er afsluttet, men ikke længere end 15 minutter.
      BEMÆRK: Vær forsigtig med at forhindre methanol i at spilde i vævsbeholderen.
    6. Vævsprøver opbevares hurtigt ved -80 °C.
      BEMÆRK: Mikrofluidisk RT-qPCR måler genekspression ved at forstærke og måle mRNA-transkripter. Disse transkripter er relativt ustabile, så der tages mange skridt i denne proces for at holde prøven så kold som muligt for at forhindre mRNA-nedbrydning.

3. Kryosektionering

BEMÆRK: En rotte neuronale kerner er ca. 10 μm. Således er 10 μm den optimale skivetykkelse for denne dyremodel. Skivetykkelsen justeres i henhold til dyremodellen for undersøgelsen.

  1. Fra -80 °C fryseren tages vævsindlejringsformen ud, der indeholder frossen hjernestamme, og prøven optøes ved -20 °C i kryostat i 5-10 min. Udfør kun denne frysning-optøning til -20 °C én gang for mRNA-konservering.
  2. Med en håndholdt barbermaskine skal du lodret skære hjørnerne af plastindlejringsformen. Fjern hjernestammen indlejret i O.C.T. fra plastvævets indlejringsform. På kryostatens borepatron indstillet til -20 °C skal du bruge rumtemperaturvæsken O.C.T. som lim til at montere hjernestammen i rostral til kaudal retning til koronal kryosektion.
  3. Skær 10 μm koronale kryosektioner i rostral til kaudal retning fra rottehjernestammen, indtil sektioner, der indeholder interesseområdet (NTS), er nået. Højden og bredden af disse kryosektioner er ~ 200 mm baseret på dimensionerne af plastindlejringsformen.
  4. Saml de 10 μm kryosektioner af hjernestammevæv, der inkluderer NTS eller et andet interesseområde baseret på undersøgelsen, ved optøning på stuetemperatur almindelige glasrutschebaner. Placer hurtigt disse dias med sektioner i en kølende metalpande, der er placeret oven på tøris. Anbring så hurtigt som muligt glasglas indeholdende kryosektioner i -80 °C fryser til opbevaring.
    BEMÆRK: Et enkelt glasglas kan passe til flere 10 μm kryosektioner, da bredden og højden er ~ 200 mm. Således kan det samme dias indeholde kryosektioner, der er farvet til forskellige celletyper.
    1. Når der er flere sektioner på diaset, skal du sikre dig, at de er adskilt af 100 mm tom plads. For at skabe en kant mellem kryosektionerne skal du bruge en hydrofob pen. Dette giver mulighed for forskellige antistofopløsninger til pletter til forskellige celletyper på det samme glasglas. Oprethold 20 mm plads til kryosektionen fra kanten af glasrutsjebanen.

4. Immunofluorescensfarvning af enkeltceller

  1. Brug hurtig farvning immunfluorescensprotokol på hjernekryosektioner til at mærke ønskede hjernecelletyper (neuroner, microglia, astrocyt osv.) til indsamling ved hjælp af LCM.
    BEMÆRK: Den immunohistokemiske farvningsprotokol, der blev brugt til disse eksperimenter, var designet til at være hurtig for at forhindre overskydende mRNA-nedbrydning under denne proces.
    1. Fra -80 °C fryseren tages glasglas med 10 μm kryosektioner af rottehjernestamme indeholdende NTS ud. Dip glider i 30 s i 75% ethanolbad for at fiksere kryosektioneret væv. Fjern overskydende væske.
    2. På det faste kryosektionerede hjernestammevæv påføres 2% Bovin Serum Albumin (BSA) i fosfatbuffersaltvand (PBS) i 30 s til blokering af ikke-målrettet binding af antistoffer. Vask derefter med PBS.
    3. Påfør tilstrækkelig mængde primær antistofopløsning til at dække det kryosektionerede væv (nu fastgjort og blokeret). Inkuber vævssektionen i primær antistofopløsning i 2 min. Vask vævet med 2% BSA-opløsning én gang. Den primære antistofopløsning indeholder 96% af BSA-PBS-opløsningen til blokering, 3% primært antistof og 1% RNase-hæmmer. Primært antistof blev fortyndet i forholdet 1:25.
      BEMÆRK: I dette repræsentative eksperiment består primære antistoffer af anti-NeuN-antistof og anti-Cd11β-antistof. Neuroner blev yderligere opdelt i TH + og TH-undergrupper, så primære antistofopløsninger til neuronal farvning indeholdt 93% af BSA PBS-opløsningen, 3% anti-NeuN-antistof, 3% anti-tyrosinhydroxylase-antistof og 1% RNase Out.
    4. Påfør tilstrækkelig mængde sekundær antistof (1:200) opløsning til at dække hjernestammevævet. Lad den sekundære antistofopløsning bade vævet. Efter 3 minutter vaskes vævet med 2% BSA-opløsning en gang.
      BEMÆRK: Opløsningen indeholdende det sekundære antistof var sammensat af 196,5 μL 2% BSA, 1 μL ged anti-mus 555 nm fluorescerende mærke til celletype, 1 μL æsel anti-kanin Alexa 488 nm til TH-farvning, 2,5 μL RNasehæmmer og 1,3 μL DAPI (1:10000).

5. Standard ethanol og xylenvævsdehydreringsserier

  1. Placer glasglas, hvorpå det farvede kryosektionsvæv hviler i et 75% ethanolbad i 30 s, efterfulgt af placering i 95% ethanolbad i 30 s, et 100% ethanolbad i 30 s og endelig en 100% ethanol begge i 30 s (i en anden beholder).
  2. Efter afslutningen af ethanoldehydreringsserien hældes to friske 100% xylenbade. Placer derefter glasrutsjebanerne i det første xylenbad i 1 min. Fjern hurtigt og læg diasene i det andet friske xylenbad i 4 min.
  3. Tag glasdias indeholdende farvede og dehydrerede vævskryosektioner ud af xylen og læg dem i en mørk, men ventileret beholder i 5 minutter for at lufttørre. Efter lufttørring placeres glasrutschebaner i en tørremiddel i 5 minutter til endelig tørring.

6. Vælg enkeltceller ved hjælp af laserfangstmikrodissektion (LCM)

  1. Indsæt glasglas indeholdende farvede, faste og dehydrerede vævskryosektioner i LCM-mikroskopprøveholderen. Brug anatomiske landemærker til at lokalisere det område af interesse, hvorfra celleindsamling vil finde sted (NTS i dette repræsentative eksempel).
  2. Tænd for mikroskopfluorescens og find farvede celletyper af interesse. Sørg for, at kernen i den ønskede celle er i interesseområdet og er isoleret fra kernerne i andre celler med en afstand >3 mm. Identificer og markér en celle (hvis eksperimentet er ægte enkeltcelle) eller flere celler (hvis eksperimentet kræver samlede enkeltcelleprøver [dvs. enkeltcelleskala] som demonstreret i dette repræsentative eksperiment) for at indsamle ved hjælp af LCM-softwaren.
    BEMÆRK: Prøver bestående af 10-celle puljer blev brugt i dette repræsentative eksperiment. Dette gøres for at mindske genekspressionsvariationen mellem prøver og øge antallet af analyserede enkeltceller, selvom dette stadig er et enkeltcelleskalaeksperiment. Ægte enkeltcelleeksperimenter kan afsluttes med denne metode20,27. Derudover kan større vævssektioner også vælges21.
  3. Når de ønskede celler er valgt, skal du bruge LCM-robotarmen, placere LCM-hætten på interesseområdet på den markerede vævskyosektion.
  4. Kalibrer intensiteten og målretningen af den infrarøde (IR) laser ved hjælp af testskud.
    BEMÆRK: Dette gøres for hver prøve. Kalibrering skal udføres på en del af hætten, der ikke er direkte over vævet for ikke fejlagtigt at vælge ikke-eksperimentelt væv.
    1. For at kalibrere intensiteten skal du justere varigheden, styrken og størrelsen af IR-laserskuddet, så et skud kun smelter hætteklæbemidlet nok til at vælge en enkelt cellulær kerne og også er stærk nok til at smelte hætten til kryosektionen på diaset. Disse værdier vil være forskellige for hvert loft.
    2. Kalibrer målretningen ved at lokalisere lasertrådkorset præcis der, hvor laseren smeltede hætten.
  5. Saml de celler, der er identificeret ved at affyre LCM-infrarød laser for at smelte hætten på det kryosektionerede væv over disse celler. Sørg for, at kun udvalgte celler blev løftet fra vævsskiven ved at bruge robotarmen til at lokalisere hætten til kvalitetskontrolområdet (QC) af LCM-mikroskopet. For at fjerne overskydende celler på hætten skal du bruge ultraviolet (UV) laser til at udslette det genetiske materiale i de ekstra celler.
  6. Optag anatomisk specificitet med LCM-softwarekameraet. Tag et billede af det kryosektionelle væv, hvorfra cellen /cellerne blev fjernet.
  7. Brug et anatomisk atlas (et atlas over rottens forhjerne i dette eksempel) til at bestemme afstanden til denne vævsskive fra bregma og registrere disse oplysninger som Z-afstanden28. Bestem placeringen i X- og/eller Y-planet fra billedet for at lokalisere den valgte celle fuldt ud.
  8. Fjern LCM-hætten fra QC-området med behandskede hænder. Fastgør derefter prøveudsugningsenheden til LCM-hætten. Brug en pipette til at påføre 5,5 μL lysisbuffer på den eller de valgte celler. Dette kaldes nu prøven.
    BEMÆRK: Lysisbufferopløsning består af 5 μL resuspensionbuffer sammen med 0,5 μL lysisforstærker.
  9. Sæt et 0,5 ml mikrocentrifugerør på prøveudsugningsanordningen, der er fastgjort til LCM-hætten. Dette arrangement anbringes på en 75 °C kogeplade med prøven og lysisbufferen tættere på pladen. Lad prøven varme i 15 min.
  10. Brug en lavhastighedscentrifuge ved 0,01-0,02 x g til at dreje prøven og lysisbufferen ned i bunden af 0,5 ml mikrocentrifugerøret. Prøven opbevares ved -80 °C indtil mikrofluidisk qPCR.

7. Kør qPCR-chip på en mikrofluidisk RT-qPCR på platformen

  1. For at måle genekspression for enkeltcelleprøver skal du udføre mRNA-foramplifikation som beskrevet nedenfor.
    BEMÆRK: Protokollen involverer ikke mRNA-ekstraktion, da prøverne er enkeltceller, der indeholder en meget lav mængde RNA (10 pg), som vil gå tabt under mRNA-isoleringstrinnet. De enkelte celler lyseres og fortsættes direkte til omvendt transkription for at minimere prøvetabet.
    1. Opret en primerpulje ved at tilføje mRNA qPCR-genprimere (fremad og omvendt) for hvert gen, der analyseres i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Sørg for, at den endelige koncentration af hver primer er 500 nM. Primere i dette eksempeleksperiment er anført i supplerende tabel 116.
    2. Pipette 1 μL 5x cDNA-reaktion blandes i hver brønd i en 96-brønds PCR-plade.
    3. Lad enkeltcelleprøver tø kortvarigt op (2-3 min) ved at fjerne dem fra -80 °C fryseren og lade dem sidde ved stuetemperatur. Brug en lavhastighedscentrifuge ved 0,01-0,02 x g til at dreje prøverne ned i 20-30 s. Pipette 5,5 μL af hver enkeltcelleprøve til en anden brønd i 96-brøndens PCR-plade.
      BEMÆRK: Prøvenummeret og typen, der skal lægges i hver brønd, bestemmes, inden dette trin påbegyndes.
    4. PCR-pladen med 96 brønde har nu cDNA-reaktionsblandingen og en enkeltcelleprøve tilsat til hver brønd. Denne plade anbringes i en termocyklist i 1,5 minutter ved 65 °C for at aktivere cDNA-reaktionsblandingen. Drej indholdet ned ved hjælp af højhastighedscentrifugering ved 1.300 x g i 1 minut ved 4 °C, og sæt PCR-pladen på våd is.
    5. I hver brønd i PCR-pladen pipetteres 0,12 μL T4-gen 32-protein, 0,73 μL DNA-suspensionsbuffer og 0,15 μL 10x cDNA-syntesemasterblanding. PCR-pladen køres gennem følgende protokol i termocyklisten: 25 °C i 5 min., 50 °C i 30 min., 55 °C i 25 min., 60 °C i 5 min., 70 °C i 10 min. og et endeligt lastrum ved 4 °C.
      BEMÆRK: T4 Gene 32-protein (et enkeltstrenget DNA (ssDNA) bindende protein) er påkrævet til bakteriofag T4-replikation og reparation. T4 Gene 32-proteinet blev brugt i protokollens omvendte transkriptionstrin for at forbedre udbyttet og effektiviteten af omvendt transkription og for at øge PCR-produktudbyttet.
    6. I hver brønd i PCR-pladen pipetteres 7,5 μL Taq-polymerasemasterblanding. Herefter pipetteres i hver brønd 1,5 μL af primerpuljen oprettet i trin 7.1.1. Kør PCR-pladen gennem følgende lineære forforstærkertrin i termocyklisten: 95 °C i 10 min; 22 cyklusser på: 96 °C i 5 s og 60 °C i 4 min.
    7. I hver brønd i PCR-pladen pipetteres 1,2 μL exonuklease I, 4,2 μL DNA-suspensionsbuffer og 0,6 μL 10x exonuklease I-reaktionsbuffer. Kør PCR-pladen gennem følgende protokol i termocyklisten: 37 °C i 30 min., 80 °C i 15 min.
      BEMÆRK: Exonuklease katalyserer fjernelsen af nukleotider fra lineært enkeltstrenget DNA i 3'til 5'-retningen. Vi bruger exonuklease til prøveoprydning til fjernelse af ikke-inkorporerede primere og ethvert enkeltstrenget cDNA, der kan være til stede efter foramplifikation.
    8. I hver brønd i PCR-pladen pipetteres 54 μL TE-buffer. Brug en højhastighedscentrifuge ved 1.300 x g i 5 minutter ved 4 °C til at dreje indholdet af PCR-pladen ned.
    9. Hvis du planlægger at fortsætte med den næste fase af protokollen, skal PCR-pladen nedkøles ved 4 °C. Hvis der er mere end 12 timer mellem afslutningen af foramplifikationsfasen og påbegyndelsen af mikrofluidisk qPCR, skal du dække qPCR-pladen og anbringe den i en -20 °C fryser.
  2. Lav prøvepladen (ny 96-brønds PCR-plade) til qPCR-chip som beskrevet nedenfor.
    1. Hvis PCR-pladen for forforstærkning fra trin 7.1 blev anbragt i en -20 °C fryser, fjernes og optøes ved stuetemperatur i 10 min.
    2. I en ny 96-brønds PCR-plade, pipette i hver brønd 4,55 μL PCR supermix low rox og 0,45 μL 20x DNA-bindende farvestof. Derefter pipetteres 3 μL forforstærket prøve fra PCR-pladen fremstillet i trin 7.1. Brug højhastighedscentrifugering ved 1.300 x g i 5 minutter ved 4 °C til at dreje PCR-pladen ned og placere PCR-prøvepladen på is.
  3. Lav en analyseplade (en ny 96-brønds PCR-plade) til qPCR-chip som beskrevet nedenfor.
    1. I en ny 96-brønds PCR-plade pipetteres i hver brønd 1,25 μL DNA-suspensionsbuffer og 3,75 μL 2x assaybelastningsreagens. Derefter pipetteres den tilsvarende qPCR-primer ved 2,5 μL 10 μM primer. Brug højhastighedscentrifuge ved 1.300 x g i 5 minutter ved 4 °C til at dreje PCR-pladen ned og placere PCR-analysepladen på is.
  4. Forbered qPCR-chippen til indlæsning i den mikrofluidiske RT-qPCR-platform som beskrevet nedenfor.
    BEMÆRK: qPCR-chippen er en qPCR-platform i realtid, der fungerer på mikrofluidiske principper. qPCR-chippen er i det væsentlige en matrix af 96 prøvekanaler og 96 RNA qPCR-primerkanaler (dvs. assays), der skærer i 9,216 (96 x 96) kamre. En prøve og et specifikt assay kombineres i hvert kammer i arrayet, hvor en qPCR-reaktion i realtid forekommer. Aflæsningen genereres som tærskelcyklusværdier (Ct) og forstærkningsdiagrammer for de anvendte primere.
    1. Injicer kontrollinjevæske i qPCR-chippen til grunding. Indsæt qPCR-chippen i den mikrofluidiske blandingsanordning. Vælg prime (136x) scriptet og kør dette program.
    2. Når programmet er færdigt efter ~ 45 minutter, skal du fjerne den primede qPCR-chip. I den grundede qPCR-chip pipetteres 6 μL af reaktionen fra PCR-prøvepladen ind i det tilsvarende prøvebrønd i qPCR-chippen.
    3. I den grundede qPCR-chip pipetteres 6 μL af reaktionen fra PCR-analysepladen ind i den tilsvarende analysebrønd i qPCR-chippen.
      BEMÆRK: Der kan dannes luftbobler i bunden af prøven og analysebrøndene i qPCR-chippen, hvilket kan forhindre opløsningerne i at komme ind i de mikrofluidiske ledninger. En skarp nål kan bruges til at poppe eller fjerne disse luftbobler, før qPCR-chippen indsættes i den mikrofluidiske blandingsanordning.
    4. Indsæt qPCR-chippen i den mikrofluidiske blandingsanordning. Vælg load mix (136x) scriptet, og kør dette program.
  5. Indlæs qPCR-chip i den mikrofluidiske RT-qPCR-platform.
    1. Tænd for den mikrofluidiske RT-qPCR-platform, og varm pæren op (~ 20 min). Fjern qPCR-chippen fra den mikrofluidiske blandingsanordning. Skræl det beskyttende klistermærke fra bunden af qPCR-chippen.
    2. Åbn den mikrofluidiske RT-qPCR-platform, og indlæs qPCR-chippen i den mikrofluidiske RT-qPCR-platform. Kør den hurtige 96 x 96 PCR-protokol (30 cyklusser) på den mikrofluidiske RT-qPCR-platform.
    3. Start dataindsamlingssoftwaren - klik på Start en ny kørsel.
    4. Bekræft chipstregkoden og chiptypen-klik på Næste. Klik på Chip Run-filen , og gennemse filplaceringen for dataindsamlingslageret.
    5. Klik på Applikationstype og vælg Genekspression; vælg ROX til passiv reference, vælg Single Probe og vælg EvaGreen for sondetype.
    6. Klik for at vælge det termiske cykelprogram, og vælg Biomark HD: GE Fast 96x96 PCR+Melt v2.pcl-fil.

8. Dataanalyse

  1. Upload data fra qPCR-chippen til analysesoftwaren til QC som beskrevet nedenfor.
    1. Download dataanalysesoftwaren. Dette kan findes på følgende hjemmeside: https://www.fluidigm.com/products-services/software#. Start softwaren for at analysere det mikrofluidiske RT-qPCR-eksperiment.
    2. Åbn Chip Run i softwaren. Åbn derefter filen ChipRun.bml, der blev oprettet af eksperimentet. Et vindue vises med de eksperimentelle detaljer, herunder den passive reference, sonde og PCR-termisk program.
      BEMÆRK: Kvalitetskontrol (QC) og dataanalyse kan udføres på den computer, der er tilsluttet den mikrofluidiske RT-qPCR-platform, eller ved at overføre .bml-filen til en anden computer via et flashdrev eller på anden måde.
  2. Definer eksempelopsætningen som beskrevet nedenfor.
    BEMÆRK: Dette trin opretter en mærket skabelon med prøver og assays (qPCR-primere) til kvalitetskontrol (QC) og dataanalyseprocedurer.
    1. Vælg Chip Explorer > Sample Plate Setup , og opret en ny prøveplade. Vælg den relevante containertype og containerformat (SBS96 for en 96-brøndplade, der bruges i dette repræsentative eksperiment).
    2. Indsæt eksempeletiketterne i softwareregnearket i henhold til det eksperimentelle design, og vælg Kort i menuen Opgave. Vælg SBS96-Left.dsp. Eksempelopsætningen er nu kortlagt. Vælg Detaljevisning > analysere for at opdatere disse ændringer i filen.
      BEMÆRK: Eventuelle ændringer i denne software gemmes ikke, før der klikkes på knappen Analysér .
  3. Definer kontroleksemplerne i softwaren. Markér cellerne for kontrolelementeksemplerne ved at venstreklikke og holde nede, mens du trækker gennem cellerne for at få markeret dem. Individuelle celler kan vælges ved at trykke og holde Ctrl-tasten nede og klikke på individuelle celler. For RNA-standardprøverne (fortyndingsserier) skal du indtaste prøvenavnet og den anvendte RNA-koncentration. Klik på Analyser for at gemme.
  4. Definer detektoropsætningen svarende til trin 8.2 ovenfor, men med RT-qPCR-analysenavne, dvs. navnene på de gener, der analyseres. Vælg Opsætning af detektorplade, og opret en ny analyseplade. Vælg den relevante beholdertype og -format (SBS96 for en 96-brøndsplade). Indsæt analysenavnene i henhold til det eksperimentelle design, og klik på Analysér for at gemme.
  5. Start brugerkvalitetskontrolprocessen (QC) som beskrevet nedenfor.
    BEMÆRK: Dette repræsentative eksperiment brugte en cyklustidstærskelmetode (Ct). Det vil sige, at prøver, der ikke nåede et tærskelsignal defineret af softwaren (Auto Global) eller manuelt (User Global), betragtes som mislykkede reaktioner og ikke inkluderet i datasættet.
    1. Vælg Analysevisning > opgaveramme. I ruden analyseindstillinger skal du ændre indstillingerne til Auto Global (beregner automatisk en tærskel, der anvendes på hele chippen) eller User Global. Indstil den oprindelige korrektion til lineær derivat. Hvis User Global bruges, skal fejlgrænsen bestemmes manuelt som i det repræsentative eksperiment.
    2. Dette repræsentative eksperiment brugte en QC-regel som følger: Hvis et individuelt assay eller en prøve havde en fejlrate på 70% eller derover, mislykkedes hele rækken eller kolonnen i datasættet.
    3. Gennemgå hver reaktion manuelt i 96 x 96 chip. Visualiser forstærkningskurverne og smeltekurverne for at vurdere, om hver reaktion fulgte det forventede qPCR-mønster. Hvis forstærknings- eller smeltekurven ikke stemmer overens med det forventede, mislykkes denne reaktion.
  6. Efter QC skal du eksportere dataene ved at vælge Filer > eksportere og gemme datasættet som en .csv fil.
  7. Beskær datasættet, da den eksporterede .csv-fil har både en Pass-Fail-matrix og en matrix med rå Ct-værdier. Brug matrixen Pass-Fail til at erstatte eventuelle mislykkede celler i datasættet med NA.
  8. Download den mest opdaterede version af open source R-software, og download derefter R-Studio-applikationen. Upload det normaliserede datasæt til R. Analyser data, som de passer til undersøgelsen.
  9. Normaliser datasættet ved hjælp af -ΔΔCt-metoden som beskrevet nedenfor.
    BEMÆRK: Median centrering eller husholdning gennormalisering kan bruges på tværs af en prøverække til at generere en -ΔCt-værdi . I det repræsentative eksperiment blev median centrering brugt og valideret ved husholdning gen normalisering. Dette kan gøres i .csv format eller ved at uploade til en dataanalysesoftware.
    1. For median centrering skal du beregne median Ct-værdien beregnet ud fra alle Ct-værdierne for en individuel prøve (10-cellet pool). Træk derefter alle individuelle Ct-værdier fra denne medianværdi. Dette giver en -ΔCt-værdi .
    2. For husholdning gennormalisering beregnes den gennemsnitlige ekspression af husholdningsgenerne (Actb, Gapdh og Ldha i det repræsentative eksperiment) for hver prøve og brug denne værdi som den, hvorfra de enkelte Ct-værdier skal trækkes fra.
    3. For at generere en -ΔΔC t-værdi skal du tage medianen for hver analysekolonne, som nu indeholder -ΔCt-værdien. Træk analysemedianen fra hver -ΔC t-værdi for at producere en -ΔΔCt-værdi.
  10. Beregn z-scores for hver -ΔΔCt-værdi ved hjælp af skalafunktionen i R. Brug R-varmekortfunktionen eller en separat software til at generere et varmekort.
  11. Brug Pearson-korrelationsfunktionen til at beregne Pearson-korrelationer mellem hvert gen. Brug smeltefunktionen i R til at organisere datasættet til anden funktionalitet. Eksporter disse data, og upload dem til en genkorrelationsnetværkssoftware.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Validering af enkeltcelleopsamling udføres visuelt under LCM-procedurer. Cellekerner vurderes på QC-stationen. Celletypen kan bestemmes ved emission af mærket fluorophore for den celletype og dens generelle morfologi. Hvis ikke-ønskede celler er blevet valgt på hætten, kan deres genetiske materiale ødelægges med en UV-laser på QC-stationen. Yderligere validering ved molekylær analyse er også nødvendig. I dette repræsentative eksempel16 blev to typer neuroner udvalgt-tyrosinhydroxylase (Th) positiv (+) og Th negativ (-) ud over microglia. Figur 1D viser, at prøver, der skulle være neuroner, viste statistisk signifikant forhøjet ekspression af neuronmarkøren, NeuN. Samtidig havde mikroglialprøver signifikant forhøjelse af mikroglialmarkørerne, CD34 og Cx3xr1, hvilket tyder på, at prøveudvælgelsen blev udført med høj nøjagtighed. Derudover viste Th + neuronale prøver signifikant forhøjet ekspression af Th sammenlignet med Th- neuronale prøver og microglia-prøver, mens Th- neuroner viste signifikant forhøjet ekspression af GCG (et preproglucagon-kodende gen), hvilket tyder på, at disse Th-neuronale prøver er beriget med neuroner, der bruger GLP-1 som neurotransmitter (figur 1D ). Et mere globalt beregningsmål kendt som lineær diskriminatanalyse viste, at disse tre celletyper havde forskellige genekspressionsprofiler på tværs af alle 65 gener målt med neuroner og microglia, der adskiller sig langs x-aksen og Th + og Th- neuronale prøver, der deler sig langs y-aksen (figur 1E).

Dataenes kvalitet blev også valideret med tekniske replikater inden for og mellem batcher (figur 2 og figur 3). Intrabatch replikerer kontrol af kvaliteten af data fra den specifikke batch. Hvis intrabatchreplikater ikke justeres, kan et andet qPCR-chipeksperiment udføres fra de samme prøve- og analyseplader, der blev lavet til at køre den første batch. Replikater mellem batcher sikrer, at data fra tværs af batches kan sammenlignes. Dette er afgørende for eksperimenter, hvor et stort antal prøver analyseres, hvilket kræver flere partier som dette repræsentative eksempel. Der var en outlier i dette forsøg som prøve 40 i batch 4 (figur 3). Imidlertid justeres prøve 40 i batch 1, 2 og 3 korrekt, og de andre replikater fra batch 4 er justeret med batch 1, 2 og 3, hvilket tyder på, at dette var en isoleret dårlig reaktion, som opstod i denne ene replikat. Sammenligning på tværs af batches kræver også korrekte datanormaliseringsteknikker. Dette eksperiment brugte median centrering, selvom husholdningsgener (Actb, Gapdh, Ldha) også blev analyseret i dette eksperiment og fungerede som en kontrol for mediancentreringsmetoden. Det vil sige, at begge metoder gav meget analoge datasæt, hvilket yderligere tyder på høj datakvalitet.

Figur 4 viser et varmekort over GLP-1 berigede neuronale prøver, der er organiseret efter cellulær subphenotype. Denne figur viser ikke kun betydningen af cellulære subphenotyper i neurobiologi, men viser også, hvordan forholdet mellem subphenotyper ændres gennem alkoholabstinenser. Varmekortet viser, at subphenotype A, som i høj grad udtrykker den inflammatoriske genklynge 1, stiger i forhold ved 8 h Wd-tidspunktet og når et maksimum ved 32 h Wd. Ved 176 timer Wd normaliserer denne inflammatoriske subphenotype sin udbredelse tilbage til kontrol. Subphenotype B, som stærkt udtrykker GABAR-genklynge 2, viser en samlet undertrykkelse i ekspressionen af denne genklynge ved 176 h Wd-tilstanden. Disse resultater viser, hvordan denne GLP-1 neuronale celletype bliver hyperexcitabel ved at øge sin inflammatoriske subphenoype og samtidig reducere ekspressionsniveauet for GABAR'er i sin GABA-subphenotype under alkoholudtagning. Figur 5 kombinerer genekspressionen af individuelle prøver i gennemsnit, således at ekspressionen af klynger af gener og placeringen af proteinet i dette gentranskript kan visualiseres gennem hele tidsserien.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentelt design og enkeltcelleudvælgelse. (A) Rottetrillinger blev tilfældigt tildelt en af de fem behandlingsbetingelser. (B) Generering af enkeltcellede transkriptomdata. (C) Tegneserierepræsentation af gener analyseret og deres funktion. Gener i grønt blev ikke analyseret. Officielt gensymbol bruges. (D) Genekspression af celletypemarkører. Fejllinjer viser standardfejl. Neuroner sammenlignet med microglia, p-værdier = henholdsvis 0,0273, 3,94 x 10-10, 7,73 x 10-12. Th+ neuroner viste forhøjet Th-ekspression sammenlignet med Th-neuroner (p = 4,56 x 10-11) og microglia (p = 2,95678 x 10-15). Th-neuroner viste forhøjet ekspression af GCG sammenlignet med Th + neuroner (p = 0,0106) og microglia (p = 0,0435), hvilket indikerer, at de er GLP-1 + neuroner. *p < 0,05, ***p < 4 x 10-10. (E) Lineær diskriminatanalyse af alle prøver viser forskellen på tværs af alle gener målt mellem de tre celletyper indsamlet i et todimensionelt rum. Centroid afstand mellem NE neuroner og GLP-1 neuroner = 3,30, NE neuroner og microglia = 1,57, GLP-1 neuroner og microglia = 2,92. Dette tal er ændret fra O'Sullivan et al. 202116. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Tekniske replikater plots af rå Ct-værdier inden for en batch. Hver graf viser rå Ct-værdier for intrachip tekniske replikater plottet mod hinanden, hvilket viser teknisk eksperimentel integritet. Dette tal er ændret fra O'Sullivan et al. 202116. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Tekniske replikater plots af rå Ct-værdier mellem batcher. Hver graf viser rå Ct-værdier for interchip tekniske replikater plottet mod hinanden, hvilket viser, at alle batches er sammenlignelige med hinanden. Dette tal er ændret fra O'Sullivan et al. 202116. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Varmekort over GLP-1 berigede neuronale prøver. Varmekort viser cellulære subphenotyper af GLP-1-berigede neuronprøver gennem en alkoholabstinenstidsserie. Rækker repræsenterer 10-cellede poolede prøver med cellulære subphenotypeklynger mærket med store bogstaver. Kolonner repræsenterer z-scoren for -ΔΔC t-genekspressionsværdier på en -1 til +1 farveskala for det pågældende gen i den pågældende prøve. Genklynger er mærket efter nummer. Dette tal er ændret fra O'Sullivan et al. 202116. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Suphenotype genekspression i GLP-1 berigede neuronale prøver. Cellediagrammer viser bokse, der repræsenterer relativ genekspression (gennemsnitlig z-score af -ΔΔCt-værdier ) af subphenotyper vist i varmekortet i figur 4. Diagrammerne blev konstrueret ved hjælp af Cytoscape version 3.8.0, og z-scores blev beregnet ved hjælp af skalafunktionen i R version 3.5.2. -ΔΔCt etiketter til højre viser, hvilke bokse der svarer til hvilket gen og farven repræsenterer udtryk (blå er lavt udtryk og gul er højt udtryk). Placeringen af kassen repræsenterer lokaliseringen eller funktionen af proteinproduktet fra det gentranskription. Grønne tal angiver undergrupper inden for subphenotyper. Dette tal er ændret fra O'Sullivan et al. 202116. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Interoceptiv vagal kredsløb, visceral-følelsesmæssig neuraxis og skematisk af modstander-proces model af afhængighed. (A) Interoceptive vagale afferenter videresender tarmens tilstand, som er stærkt påvirket af tarmmikroflora, og andre perifere organer til kernen, tractus solitarius (NTS). Disse oplysninger videresendes efterfølgende til amygdala og påvirker følelsesmæssige tilstande. (B) En forenklet tegneserierepræsentation, der viser de integrerende roller for kernen tractus solitarius (NTS) og den centrale kerne i amygdala (CeA) i følelse, stress og autonom regulering. To neuronale undertyper, GLP-1 og NE neuroner fremhæves. Mange anatomiske og funktionelle forbindelser udelades for klarhedens skyld. Forkortelser: NE = noradrenalin; GLP-1 = glukagonlignende peptid 1; GABA = γ-aminosmørsyre; HPA-akse = hypothalamus-hypofyse-binyreakse; CRF = korticotropinfrigivende hormon. (C) Eksponering for alkohol og/eller opioider har to virkninger: stimulere belønning via den mesolimbiske dopaminvej og hæmme antireward. Disse foranstaltninger motiverer stofbrug via positiv forstærkning. (D) Alkohol- og/eller opioidabstinenser har to virkninger: hæmmer belønningen ved at hæmme den mesolimbiske dopaminvej (ikke vist) og stimulerer antireward. Denne undersøgelse foreslår, at visceral-følelsesmæssig neuroinflammation er et endepunkt i antireward-stimulering, selvom denne hypotese berettiger yderligere test. Disse handlinger, uanset mekanismen, motiverer stofafhængighed via negativ forstærkning. Dette tal er ændret fra O'Sullivan et al. 202116. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende tabel 1: Primere til mikrofluidisk RT-qPCR. Alle primerpar til mRNA-amplifikation er angivet sammen med ampliconlængden dannet af hvert primerpar. Denne tabel er blevet ændret fra O'Sullivan et al. 202116. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Alkoholforstyrrelse er fortsat en udfordrende sygdom at behandle. Vores gruppe har nærmet sig denne lidelse ved at undersøge antireward-processer med et systemneurovidenskabeligt perspektiv. Vi målte genekspressionsændringer i enkelte NTS-neuroner og microglia i en alkoholabstinenstidsserie16. NTS blev valgt for sin fremtrædende rolle i den autonome dysregulering, der forekommer i alkoholabstinenssyndrom. Vi kombinerer LCM med encellet mikrofluidisk RT-qPCR, hvilket gør det muligt at måle et robust antal prøver og gener til lave omkostninger med anatomisk og molekylær følsomhed og specificitet (figur 1B-C). Enkeltceller blev identificeret og udvalgt ved IHC-farvning, og disse cellulære subphenotypegrupperinger blev valideret med molekylær ekspression (figur 1D-E). Imidlertid udtrykte nogle GLP-1-berigede neuronale prøver (TH-neuroner) moderat Th (figur 4). Etableringen af cellefænotype blev foretaget ved celleudvælgelse baseret på fluorescerende visualisering, og dette kriterium blev brugt til undersøgelsen som molekylær gruppering baseret på ekspression af et enkelt gen, Th, undlod at definere ekspressionsmønstre, der tyder på en cellulær fænotype16. Således karakteriserer resultaterne store NTS-mikrogliale og neuronale subphenotyper og deres dynamik i alkoholabstinenser.

Dette manuskript beskriver en metode til enkeltcelle transkriptomik, og det er bydende nødvendigt, at alle trin i protokollen følges som beskrevet. Nogle ændringer kan være nødvendige, når du arbejder med et andet organvæv eller celletyper. En af udfordringerne ved denne protokol er at opretholde RNA-kvalitet og integritet under LCM. Vi har etableret protokoller for IHC-farvning, LCM og mikrofluidisk RT-qPCR for at løse udfordringerne som beskrevet ovenfor. Kort fortalt inkluderer disse processer tilsætning af RNase-hæmmer til alle farvningsopløsninger for at forhindre RNA-nedbrydning, en hurtigfarvningsprotokol for at forhindre mulig RNA-nedbrydning, behandling af dias til LCM umiddelbart efter IHC-farvning og dehydrering og opretholdelse af passende kolde forhold, når det er muligt under prøvebehandling eller overførsel.

Transkriptomics-analysen udføres på lyserede enkeltceller uden RNA-isolering efterfulgt af omvendt transkription, foramplifikation og qPCR. Præamplifikationstrinnet er at amplificere cDNA-molekyler til detekterbare niveauer for qPCR selektivt. Der er flere begrænsninger for forforstærkningstrinnet. Disse omfatter gentransskriptioner, der ikke forstærkes, hvilket ikke vil resultere i nogen detektion i mikrofluidisk RT-qPCR. Der er også mulighed for dannelse af primerdimer, da PCR-reaktionen indeholder alle primere til det eksperimentelle assay. Det vil sige, at dannelsen af dimers med en fremadgående og omvendt sekvens af et enkelt primerpar og med alle fremadgående og omvendte sekvenser i eksperimentet er mulig. Derfor er primertest ved hjælp af positiv eksperimentel kontrol som RNA-standarder tilrådeligt.

RT-qPCR-chipdesignet er et andet afgørende aspekt af denne protokol til kvalitetskontrol og batcheffekter. Positive kontroller består af standard RNA fra dyret og organet, der analyseres (rottehjerne i dette repræsentative eksempel). En RNA-fortyndingsserie kan derefter indlæses i hver chip og skal demonstrere det passende kvantitative signal for hvert gen, der analyseres. Vand kan bruges som en negativ kontrol. Disse kontroller er kritiske for korrekt normalisering, der kontrollerer for batcheffekter, der kan opstå, når man kombinerer data fra forskellige chips. Dette diskuteres detaljeret i trin 8.

I det repræsentative eksperiment, der er vist her, blev disse metoder anvendt til hypotesegenerering og giver indsigt i mulig mekanisme. Undersøgelsen blev udført i forbindelse med et andet arbejde og giver vigtige oplysninger til den aflyttende antirewardhypotese13. Kort fortalt antager denne model, at antireward stimuleres i stofudtagning ved interoceptiv signalering fra vagus via NTS til amygdala, og at det oprindelige substrat for denne antireward er neuroinflammation (figur 6). Dette arbejde understøtter denne hypotese ved at etablere de inflammatoriske ændringer i genekspression i neuroner og microglia ved alkoholabstinenser.

En stor svaghed ved denne undersøgelse er dens mangel på mekaniske påstande. Disse metoder kan dog bruges til at bestemme en mekanisme, efter at et baseline-eksperiment som dette er udført. For eksempel kan en dyremodelintervention eller forstyrrelser, såsom en subdiafragmatisk vagotomi eller gen knockout, demonstrere anatomiske eller genetiske mekanismer af inflammatoriske regulatorer. Fremtidige undersøgelser, der tager denne tilgang, kan bidrage til udviklingen af den interoceptive antireward-hypotese, der sigter mod at implementere disse indsigter i klinisk praksis for afhængighedsbehandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Arbejdet, der præsenteres her, blev finansieret gennem NIH HLB U01 HL133360 tildelt JS og RV, NIDA R21 DA036372 tildelt JS og EVB, T32 AA-007463 tildelt Jan Hoek til støtte for SJO'S og National Institute of Alcoholism and Alcohol Abuse: R01 AA018873.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20X DNA Binding Dye Fluidigm 100-7609 NA
2x GE Assay Loading Reagent Fluidigm 85000802-R NA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text) Fluidigm BMK-M-96.96 NA
Anti-Cd11β Antibody Genway Biotech CCEC48 Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60 EMD Millipore MAB377 Neuronal Stain
Anti-tyrosine hydroxylase antibody abcam ab112 Stain for TH+ neurons
ArcturusXT Laser Capture Microdissection System Arcturus NA NA
Biomark HD Fluidigm NA RT-qPCR platform
Bovine Serum Antigen Sigma-Aldrich B4287
CapSure Macro LCM Caps ThermoFisher Scientific  LCM0211 NA
CellDirect One-Step qRT-PCR Kit ThermoFisher Scientific 11753500 Lysis buffer solution components
CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer Kit ThermoFisher Scientific 11739010 Invitrogen
DAPI ThermoFisher Scientific 62248 Nucleus Stain
DNA Suspension Buffer TEKnova T0221
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific R37118 Seconadry Antibody
Exonuclease I New Englnad BioLabs, Inc. M0293S NA
ExtracSure Sample Extraction Device ThermoFisher Scientific LCM0208 NA
FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope Slides ThermoFisher Scientific 22-037-246 Plain glass slides
GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube ThermoFisher Scientific N8010611
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 ThermoFisher Scientific A28180 Seconadry Antibody
IFC Controller Fluidigm NA NA
RNaseOut ThermoFisher Scientific 10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox Bio-Rad PN 172-5211 NA
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit ThermoFisher Scientific 11754250 Contains VILO and SuperScript
T4 Gene 32 Protein New Englnad BioLabs, Inc. M0300S NA
TaqMan PreAmp Master Mix ThermoFisher Scientific 4391128 NA
TE Buffer TEKnova T0225 NA
TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mL USA Scientific 1402-9700 NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Substance Use and Mental Health Indicators in the United States: Results from the 2019 National Survey on Drug Use and Health. , Available from: https://www.samhsa.gov/data/ (2020).
  2. Prevalence of Serious Mental Illness (SMI). NIH. 49, Available from: https://www.nimh.nih.gov/health/statistics/mental-illness.shtml (2020).
  3. Mattick, R. P., Kimber, J., Breen, C., Davoli, M. Buprenorphine maintenance versus placebo or methadone maintenance for opioid dependence. Cochrane Database of Systematic Reviews. Mattick, R. P. , John Wiley & Sons, Ltd. (2008).
  4. Mattick, R. P., Breen, C., Kimber, J., Davoli, M. Methadone maintenance therapy versus no opioid replacement therapy for opioid dependence. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 2009 (3), (2009).
  5. Miller, P. M., Book, S. W., Stewart, S. H. Medical treatment of alcohol dependence: A systematic review. International Journal of Psychiatry in Medicine. 42 (3), 227-266 (2012).
  6. Holmes, E. A., et al. The Lancet Psychiatry Commission on psychological treatments research in tomorrow's science. The Lancet. Psychiatry. 5 (3), 237-286 (2018).
  7. Ford, C. L., Young, L. J. Translational opportunities for circuit-based social neuroscience: advancing 21st century psychiatry. Current Opinion in Neurobiology. 68, 1-8 (2021).
  8. Holmes, E. A., Craske, M. G., Graybiel, A. M. Psychological treatments: A call for mental-health science. Nature. 511 (7509), 287-289 (2014).
  9. Miranda, A., Taca, A. Neuromodulation with percutaneous electrical nerve field stimulation is associated with reduction in signs and symptoms of opioid withdrawal: a multisite, retrospective assessment. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 44 (1), 56-63 (2018).
  10. Metz, V. E., et al. Effects of ibudilast on the subjective, reinforcing, and analgesic effects of oxycodone in recently detoxified adults with opioid dependence. Neuropsychopharmacology. 42 (9), 1825-1832 (2017).
  11. Heinzerling, K. G., et al. placebo-controlled trial of targeting neuroinflammation with ibudilast to treat methamphetamine use disorder. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (2), 238-248 (2020).
  12. Bogenschutz, M. P., et al. Psilocybin-assisted treatment for alcohol dependence: A proof-of-concept study. Journal of Psychopharmacology. 29 (3), 289-299 (2015).
  13. O'Sullivan, S. J., Schwaber, J. S. Similarities in alcohol and opioid withdrawal syndromes suggest common negative reinforcement mechanisms involving the interoceptive antireward pathway. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 125, 355-364 (2021).
  14. O'Sullivan, S. J. Single-cell systems neuroscience: A growing frontier in mental illness. Biocell. 46 (1), 7-11 (2022).
  15. O'Sullivan, S. J., et al. Single-cell glia and neuron gene expression in the central amygdala in opioid withdrawal suggests inflammation with correlated gut dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
  16. O'Sullivan, S. J., McIntosh-Clarke, D., Park, J., Vadigepalli, R., Schwaber, J. S. Single cell scale neuronal and glial gene expression and putative cell phenotypes and networks in the nucleus tractus solitarius in an alcohol withdrawal time series. Frontiers in Systems Neuroscience. 15, 739790 (2021).
  17. O'Sullivan, S. J., Reyes, B. A. S., Vadigepalli, R., Van Bockstaele, E. J., Schwaber, J. S. Combining laser capture microdissection and microfluidic qpcr to analyze transcriptional profiles of single cells: A systems biology approach to opioid dependence. Journal of Visualized Experiments. (157), e60612 (2020).
  18. Achanta, S., Vadigepalli, R. Single cell high-throughput qRT-PCR protocol. Protocols.io. , (2020).
  19. O'Sullivan, S. J. The interoceptive antireward pathway and gut dysbiosis in addiction. Journal of Psychiatry, Depression & Anxiety. 7 (40), 1-5 (2021).
  20. Park, J., et al. Single-cell transcriptional analysis reveals novel neuronal phenotypes and interaction networks involved in the central circadian clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
  21. Staehle, M. M., et al. Diurnal patterns of gene expression in the dorsal vagal complex and the central nucleus of the amygdala - Non-rhythm-generating brain regions. Frontiers in Neuroscience. 14, 375 (2020).
  22. Réus, G. Z., et al. The role of inflammation and microglial activation in the pathophysiology of psychiatric disorders. Neuroscience. 300, 141-154 (2015).
  23. Zhang, X., et al. Role of astrocytes in major neuropsychiatric disorders. Neurochemical Research. 46 (10), 2715-2730 (2021).
  24. Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (1), 87-98 (2015).
  25. Lieber, C. S., DeCarli, L. M. An experimental model of alcohol feeding and liver injury in the baboon. Journal of Medical Primatology. 3 (3), 153-163 (1974).
  26. Lieber, C. S., Decarli, L. M. Animal models of chronic ethanol toxicity. Methods in Enzymology. 233, 585-594 (1994).
  27. Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24 (6), 930-941 (2014).
  28. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , Academic Press. Elsevier Inc. (1982).

Tags

Neurovidenskab udgave 186 enkeltcelle genekspression laserfangstmikrodissektion mikrofluidisk qPCR afhængighed visceral-følelsesmæssig neuraxis neuroinflammation antireward
Undersøgelse af drivere til antireward i afhængighedsadfærd med anatomisk specifikke enkeltcellegenekspressionsmetoder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

O'Sullivan, S. J., Srivastava, A.,… More

O'Sullivan, S. J., Srivastava, A., Vadigepalli, R., Schwaber, J. S. Investigating Drivers of Antireward in Addiction Behavior with Anatomically Specific Single-Cell Gene Expression Methods. J. Vis. Exp. (186), e64014, doi:10.3791/64014 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter