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Bioengineering

टी कोशिकाओं के वायरल ट्रांसडक्शन के लिए ड्राई मैक्रोपोरस एल्गिनेट स्काफोल्ड्स का निर्माण और उपयोग

Published: September 9, 2022 doi: 10.3791/64036
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Joint Department of Biomedical Engineering, University of North Carolina at Chapel Hill and North Carolina State University, 2Comparative Medicine Institute, North Carolina State University, 3Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

यहां शुष्क मैक्रोपोरस एल्गिनेट मचानों को बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल है जो टी कोशिकाओं की आनुवंशिक इंजीनियरिंग में उपयोग के लिए कुशल वायरल जीन हस्तांतरण की मध्यस्थता करता है, जिसमें सीएआर-टी सेल थेरेपी के लिए टी कोशिकाएं शामिल हैं। मचानों को >85% पारगमन के साथ सक्रिय प्राथमिक टी कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने के लिए दिखाया गया था।

Abstract

सीएआर-टी सेल थेरेपी के लिए टी कोशिकाओं की आनुवंशिक इंजीनियरिंग पिछले कुछ वर्षों में कैंसर के उपचार में सबसे आगे आ गई है। सीएआर-टी कोशिकाएं टी कोशिकाओं में वायरल जीन हस्तांतरण द्वारा निर्मित होती हैं। वायरल जीन ट्रांसफर के वर्तमान स्वर्ण मानक में रेट्रोनेक्टिन-लेपित प्लेटों का स्पिनोक्यूलेशन शामिल है, जो महंगा और समय लेने वाला है। सीएआर-टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए कुशल और लागत प्रभावी तरीकों की महत्वपूर्ण आवश्यकता है। यहां वर्णित सस्ती, शुष्क मैक्रोपोरस एल्गिनेट मचानों को बनाने की एक विधि है, जिसे ड्राइडक्स मचानों के रूप में जाना जाता है, जो सक्रिय टी कोशिकाओं के वायरल पारगमन को कुशलतापूर्वक बढ़ावा देता है। मचानों को वायरस से भरे रेट्रोनेक्टिन-लेपित प्लेटों के सोने के मानक स्पिनोक्यूलेशन के स्थान पर उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है और कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने की प्रक्रिया को सरल बनाता है। एल्गिनेट को कैल्शियम-डी-ग्लूकोनेट के साथ क्रॉस-लिंक किया जाता है और मचानों को बनाने के लिए रात भर फ्रीज किया जाता है। जमे हुए मचानों को शुष्क मैक्रोपोरस मचानों के गठन को पूरा करने के लिए 72 घंटे के लिए लियोफिलाइज़र में फ्रीज-सुखाया जाता है। मचान वायरल जीन हस्तांतरण की मध्यस्थता करते हैं जब वायरस और सक्रिय टी कोशिकाओं को आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए मचान के शीर्ष पर एक साथ बीज दिया जाता है। मचान >85% प्राथमिक टी सेल ट्रांसडक्शन का उत्पादन करते हैं, जो रेट्रोनेक्टिन-लेपित प्लेटों पर स्पिनोक्यूलेशन की पारगमन दक्षता के बराबर है। इन परिणामों से पता चलता है कि शुष्क मैक्रोपोरस एल्गिनेट मचान पारंपरिक पारगमन विधि के लिए एक सस्ता और अधिक सुविधाजनक विकल्प के रूप में काम करते हैं।

Introduction

इम्यूनोथेरेपी विशेष रूप से ट्यूमर को लक्षित करने, ऑफ-टारगेट साइटोटॉक्सिसिटी को सीमित करने और रिलैप्स को रोकने की क्षमता के कारण एक क्रांतिकारी कैंसर उपचार प्रतिमान के रूप में उभरा है। विशेष रूप से, चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी (सीएआर-टी) सेल थेरेपी ने लिम्फोमा और ल्यूकेमिया के इलाज में अपनी सफलता के कारण लोकप्रियता हासिल की है। एफडीए ने 2017 में पहली सीएआर-टी सेल थेरेपी को मंजूरी दी, और तब से, चार और सीएआर-टी सेल थेरेपी 1,2,3,4,5 को मंजूरी दी है। सीएआर में एक एंटीजन पहचान डोमेन होता है जिसमें आमतौर पर एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का एकल श्रृंखला चर टुकड़ा होता है जो ट्यूमर से जुड़े एंटीजन 3,4 के लिए विशिष्ट होता है। जब एक सीएआर अपने ट्यूमर से जुड़े एंटीजन के साथ बातचीत करता है, तो सीएआर-टी कोशिकाएं सक्रिय हो जाती हैं, जिससे साइटोकिन रिलीज, साइटोलाइटिक डिग्रेनुलेशन, ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर अभिव्यक्ति और टी सेल प्रसार शामिल होता है। सीएआर-टी कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए, रोगी से उनकी टी कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए रक्त एकत्र किया जाता है। सीएआर को आनुवंशिक रूप से वायरस का उपयोग करके रोगी की टी कोशिकाओं में जोड़ा जाता है। सीएआर-टी कोशिकाओं को विट्रो में उगाया जाता है और रोगी मेंवापस 2,3,4,6 डाला जाता है। सीएआर-टी कोशिकाओं की सफल पीढ़ी पारगमन दक्षता द्वारा निर्धारित की जाती है, जो टी कोशिकाओं की संख्या का वर्णन करती है जो आनुवंशिक रूप से सीएआर-टी कोशिकाओं में संशोधित होती हैं।

वर्तमान में, सीएआर-टी सेल उत्पादन के लिए स्वर्ण मानक सक्रिय टी कोशिकाओं और रेट्रोनेक्टिन-लेपित प्लेटों 7,8 पर वायरस का स्पिनोक्यूलेशन है। पारगमन तब शुरू होता है जब वायरल कण टी कोशिकाओं की सतह के साथ संलग्न होते हैं। रेट्रोनेक्टिन वायरल कणों और कोशिकाओं के बीच बाध्यकारी दक्षता को बढ़ाकर वायरस और कोशिकाओं के कोलोकलाइजेशन को बढ़ावा देता है,पारगमन 7,8 को बढ़ाता है। रेट्रोनेक्टिन अपने आप में अच्छी तरह से काम नहीं करता है और इसके साथ स्पिनोक्यूलेशन की आवश्यकता होती है, जो वायरल कणों को केंद्रित करके जीन हस्तांतरण को बढ़ाता है और टी सेल की सतह पारगम्यता को बढ़ाता है, जिससे आसान वायरल संक्रमण की अनुमति मिलतीहै। रेट्रोनेक्टिन-लेपित प्लेटों पर स्पिनोक्यूलेशन की सफलता के बावजूद, यह एक जटिल प्रक्रिया है जिसके लिए कई स्पिन चक्रों और महंगे अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है। इसलिए, वायरल जीन हस्तांतरण के लिए वैकल्पिक तरीके जो तेज और सस्ते हैं, अत्यधिक वांछनीय हैं।

एल्गिनेट एक प्राकृतिक आयनिक पॉलीसेकेराइड है जिसका उपयोग बायोमेडिकल उद्योग में बड़े पैमाने पर किया जाता है क्योंकि इसकी कम लागत, अच्छी सुरक्षा प्रोफ़ाइल, और 9,10,11,12 के साथ मिश्रण करने पर हाइड्रोगेल बनाने की क्षमता होती है। एल्गिनेट एक जीएमपी-अनुरूप बहुलक है और आमतौर पर एफडीए13 द्वारा सुरक्षित (जीआरएएस) के रूप में मान्यता प्राप्त है। पिंजरों के साथ क्रॉस-लिंकिंग एल्गिनेट स्थिर हाइड्रोगेल बनाता है जिसका उपयोग अक्सर घाव भरने, छोटी रासायनिक दवाओं और प्रोटीन के वितरण और सेल परिवहन 9,10,11,12,14,15,16 में किया जाता है। अपने उत्कृष्ट गेलिंग गुणों के कारण, एल्गिनेट10,17 को फ्रीज-सुखाकर छिद्रपूर्ण मचान बनाने के लिए पसंदीदा सामग्री है। एल्गिनेट की ये विशेषताएं इसे एक मचान बनाने के लिए एक आकर्षक उम्मीदवार बनाती हैं जो सक्रिय कोशिकाओं के वायरल जीन हस्तांतरण को मध्यस्थ कर सकती है।

यहां वर्णित शुष्क मैक्रोपोरस एल्गिनेट मचानों को बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल है, जिसे ड्राइडक्स स्काफोल्ड्स के रूप में जाना जाता है, जो वायरल जीन ट्रांसफर17,18 द्वारा टी कोशिकाओं को स्थिर रूप से ट्रांसड्यूस करता है। इन मचानों को बनाने की प्रक्रिया चित्र 1 में दर्शाई गई है। ये मचान रेट्रोनेक्टिन-लेपित प्लेटों के पुन: ऑक्सीकरण की आवश्यकता को समाप्त करते हैं। मैक्रोपोरस एल्गिनेट मचान वायरल कणों और टी कोशिकाओं की बातचीत को प्रोत्साहित करते हैं ताकि इंजीनियर टी कोशिकाओं की कार्यक्षमता और व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना एक ही चरण में कुशल जीन हस्तांतरण को सक्षम कियाजा सके। जब सही तरीके से पालन किया जाता है, तो इन मैक्रोपोरस एल्गिनेट स्काफोल्ड्स में कम से कम 80% की पारगमन दक्षता होती है, जो वायरल ट्रांसडक्शन प्रक्रिया को सरल और छोटा करती है।

Figure 1
चित्र 1: प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध और समयरेखा। (A) शुष्क मैक्रोपोरस एल्गिनेट मचानों को बनाने के लिए समयरेखा। एल्गिनेट कैल्शियम-डी-ग्लूकोनेट के साथ क्रॉस-लिंक्ड है और रात भर जमे हुए हैं। ड्राइडक्स मचानों को बनाने के लिए जमे हुए मचानों को 72 घंटे के लिए लियोफिलाइज्ड किया जाता है। (बी) सक्रिय कोशिकाओं के वायरल पारगमन के लिए समयरेखा। सक्रिय कोशिकाओं और वायरस (एमओआई 2) को मचान के शीर्ष पर बीज दिया जाता है और आईएल -7 और आईएल -15 के साथ पूरक पूर्ण मीडिया में इनक्यूबेट किया जाता है। मचान मिश्रण को अवशोषित करते हैं और वायरल जीन हस्तांतरण को बढ़ावा देते हैं। ईडीटीए का उपयोग मचानों को भंग करने और ट्रांसड्यूस कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया जाता है। पीबीएस के साथ दो बार धोने के बाद, सेल पेलेट का उपयोग विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। संक्षेप: पीबीएस = फॉस्फेट-बफर्ड खारा; पीबीएमसी = परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

मानव प्रधानता कोशिकाओं और रेट्रोवायरल वैक्टर से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को उत्तरी कैरोलिना स्टेट यूनिवर्सिटी के जैविक सुरक्षा दिशानिर्देशों के अनुपालन में किया गया था और पर्यावरण स्वास्थ्य और सुरक्षा कार्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था। मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को वाणिज्यिक स्रोतों से बफी कोट के रूप में खरीदा गया था। प्राथमिक मानव कोशिकाओं को मानव बफी कोट अंशों से अलग किया जाना चाहिए और जैव सुरक्षा स्तर 2 की मंजूरी और विस्तृत मानक संचालन प्रक्रियाओं और उस संस्थान से अनुमोदन की आवश्यकता होती है जहां काम होना है। वायरल वैक्टर, जिसमें ट्रांसडक्शन के लिए उपयोग किए जाने वाले रेट्रोवायरल वेक्टर सुपरनैटेंट शामिल हैं, जैसा कि पहले वर्णित19 में वर्णित है, को एन्कोडेड प्रोटीन के आधार पर बायोसेफ्टी लेवल 1 या बायोसेफ्टी लेवल 2 के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है और संबंधित संस्थागत जैव सुरक्षा समिति से अनुमोदन की आवश्यकता होती है।

1. मैक्रोपोरस एल्गिनेट मचानों को बनाना

  1. एक बीकर में कैल्शियम डी ग्लूकोनेट में बाँझ-फ़िल्टर किए गए विआयनीकृत पानी को जोड़कर 0.4% (प्रति मात्रा वजन) कैल्शियम डी ग्लूकोनेट का स्टॉक समाधान तैयार करें। मध्यम गति पर हिलाएं जब तक कि कैल्शियम ग्लूकोनेट घुल न जाए (~ 1.5 घंटे), बाँझ-फ़िल्टर, और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
    नोट: समाधान के पीएच की जांच करना आवश्यक नहीं है।
  2. स्क्रू कैप शीशी या बीकर में 2% (वजन प्रति मात्रा) एल्गिनेट का घोल तैयार करें। सावधानी से बर्तन में अल्ट्राप्योर एल्जिनेट जोड़ें और एल्गिनेट में बाँझ-फ़िल्टर किए गए विआयनीकृत पानी जोड़ें। संभव सबसे बड़ी हलचल पट्टी चुनें जो मिश्रण में बाधा नहीं डालेगी और इसे बर्तन में जोड़ें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए उपयोग किए जाने वाले अल्ट्राप्योर एल्गिनेट के प्रकार पर जानकारी सामग्री की तालिका और नोवामैट्रिक्स वेबसाइट20 पर पाई जा सकती है। इन मचानों के लिए अलग-अलग एल्गिनेट्स का पता नहीं लगाया गया था, क्योंकि वेमचानों 9,10,11 की सरंध्रता और जैव-रासायनिकता में अवांछित परिवर्तन कर सकते हैं।
  3. एल्गिनेट के घुलने तक घोल को उच्च गति पर हिलाएं (~ 1 घंटे)। यदि पोत के किनारों पर बड़े झुरमुट हैं, तो उन्हें हटाने के लिए बर्तन को झुकाएं। किनारों पर एल्गिनेट की छोटी मात्रा हिलाते समय भंग हो जाएगी और चिंता का कारण नहीं है।
    नोट: समाधान के पीएच की जांच करना आवश्यक नहीं है।
  4. जब एल्गिनेट घुल जाता है, तो सरगर्मी की गति कम करें, धीरे-धीरे क्रॉसलिंकिंग क्लंप को बनने से रोकने के लिए एल्गिनेट समाधान में 0.4% कैल्शियम डी ग्लूकोनेट की समान मात्रा जोड़ें, और 15 मिनट के लिए जोर से हिलाएं।
  5. किसी भी झुरमुट को हटाने के लिए बीकर या शीशी को साइडवे झुकाएं।
    नोट: होमोजेनाइज़र का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। अंतिम समाधान ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट होना चाहिए।
  6. 48-वेल प्लेट या 24-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में समाधान की वांछित मात्रा को पाइपेट करें। 48-वेल प्लेट के लिए 300 μL/well और 24-वेल प्लेट के लिए 1 mL/well का उपयोग करें। धीरे-धीरे डालें और बार-बार युक्तियां बदलें, क्योंकि समाधान चिपचिपा होगा और टिप से चिपक जाएगा।
  7. प्लेटों को ढक्कन के साथ कवर करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर फ्रीज करें।
  8. ढक्कन को हटाकर और वाइप्स और रबर बैंड के साथ शीर्ष को सुरक्षित करके लियोफिलाइज़र के लिए प्लेट तैयार करें। प्लेटों को 750 एमएल से 2,000 एमएल लियोफिलाइज़र फ्लास्क में रखें, और 72 घंटे के लिए लियोफिलाइज़र पर रखें।
  9. 72 घंटे के बाद, लियोफिलाइज़र से प्लेट को हटा दें और ढक्कन को बदलें। प्लेट को सील करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से पहले प्लेट को वैक्यूम-सील करें। जरूरत पड़ने तक सूखा रखें।
    नोट: वॉल्यूम त्रुटि के कारण अतिरिक्त कैल्शियम-एल्गिनेट समाधान बनाएं (कुछ शीशी की दीवारों पर चिपक जाते हैं, पिपेट टिप्स)। उदाहरण के लिए, 24-वेल प्लेट में चार मचान बनाने के लिए, 4 एमएल संयुक्त घोल (2 एमएल एल्जिनेट + 2 एमएल कैल्शियम डी ग्लूकोनेट) की आवश्यकता होती है, लेकिन 2.5 एमएल 2% एल्गिनेट समाधान और 2.5 एमएल 0.4% कैल्शियम डी ग्लूकोनेट घोल तैयार करने की सिफारिश की जाती है।

2. पारगमन

  1. 100 केडीए फिल्टर का उपयोग करके वायरल सुपरनैटेंट की एकाग्रता
    1. केन्द्रापसारक फिल्टर को 1 एमएल 1x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ 2 मिनट के लिए हाइड्रेट करें। PBS को छोड़ दें।
    2. वायरल सस्पेंशन के 2 एमएल (1 × 106 टीयू / एमएल) को जोड़कर वायरल निलंबन को केंद्रित करें और इसे एक स्विंगिंग बकेट रोटर में 10 मिनट के लिए 1,500 × ग्राम पर केन्द्रापसारक फिल्टर के माध्यम से सेंट्रीफ्यूज करें।
      नोट: प्रति मचान एक से दो सौ माइक्रोलीटर केंद्रित वायरस की आवश्यकता होती है।
    3. यदि केंद्रित वायरस निलंबन मात्रा 200 μL से अधिक है, तो कुछ अतिरिक्त मिनटों के लिए स्पिन करें।
    4. प्रत्येक मचान के लिए चरण 2.1.1-2.1.3 दोहराएँ।
      नोट: वायरस के एक बड़े स्टॉक को केंद्रित करना और केंद्रित स्टॉक से 100-200 μL एलिकोट लेना भी स्वीकार्य है।
  2. बीज सक्रिय कोशिकाएं और वायरस एक साथ।
    1. प्रत्येक मचान के लिए, पूर्ण सेल कल्चर मीडिया के 50 μL में 1 × 106 सक्रिय परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMC) को निलंबित करके एक एलिकोट तैयार करें (250 एमएल क्लिक का मीडिया + 250 एमएल आरपीएमआई 1640 मीडिया + 50 एमएल भ्रूण गोजातीय सीरम + 5 एमएल ग्लूटामाइन विकल्प + 5 एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन)।
      नोट: PBMCs को सक्रिय करने के तरीके पर प्रोटोकॉल के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें।
    2. सेल निलंबन में केंद्रित वायरल सुपरनैटेंट (~ 2 × 106 टीयू, एमओआई 2) जोड़ें। सेल-वायरस निलंबन की कुल मात्रा 48-वेल पाड़ के लिए 200 μL या 24-वेल पाड़ के लिए 350 μL से अधिक नहीं होनी चाहिए।
    3. सेल-वायरस मिश्रण को सूखे मचान के शीर्ष पर ड्रॉपवाइज जोड़ें। नकारात्मक नियंत्रण प्रयोगों के लिए, केंद्रित वायरस के स्थान पर पूर्ण सेल संस्कृति मीडिया का उपयोग करें। शुष्क मचान के शीर्ष पर सेल निलंबन जोड़ें।
    4. प्रत्येक मचान के लिए चरण 2.2.1-2.2.3 दोहराएँ।
    5. 45-60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में मचानों को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेटर से मचानों को हटा दें; मचान इस समय के दौरान समाधान को पूरी तरह से अवशोषित करेंगे।
    6. प्रसार को प्रेरित करने के लिए, प्रत्येक कुएं में आईएल -15 (5 एनजी / एमएल) और आईएल -7 (10 एनजी / एमएल) के साथ पूरक पूर्ण सेल कल्चर मीडिया जोड़ें; आईएल -2 का भी उपयोग किया जा सकता है। प्रत्येक 48-कूप मचान में 500 μL जोड़ें या प्रत्येक 24-कुएं के मचान में 1 एमएल जोड़ें।
    7. 72 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मचानों को इनक्यूबेट करें। जैसे-जैसे कोशिकाओं का प्रसार होता है, मीडिया नारंगी हो जाएगा।
  3. विश्लेषण के लिए मचानों से कोशिकाओं को अलग करें।
    1. 1x PBS में 0.5 M EDTA को 0.25 M EDTA तक पतला करें।
    2. प्रत्येक कुएं से अतिरिक्त माध्यम निकालें और अलग-अलग 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में इकट्ठा करें।
    3. पाड़ से कोशिकाओं को अलग करने के लिए, प्रत्येक मचान में 0.25 एम ईडीटीए जोड़ें। 48-वेल स्काफोल्ड्स में 300 μL या 24-वेल स्काफोल्ड्स में 1 एमएल जोड़ें। प्लेट को बैठने दें या धीरे से 3-4 मिनट के लिए उत्तेजित करें।
    4. एक बार जब मचान ज्यादातर घुल जाता है, तो कुएं के अंदर धीरे-धीरे अंदर और बाहर करें। मचान को पूरी तरह से भंग करने के लिए कुछ इन-एंड-आउट पाइपिंग चरण आवश्यक हो सकते हैं। यदि यह 10 मिनट में भंग नहीं होता है, तो 0.25 एम ईडीटीए का एक और 200 μL जोड़ें।
    5. एक बार जब मचान पूरी तरह से घुल जाता है, तो घोल को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    6. प्रत्येक मचान के लिए चरण 2.3.4 और 2.3.5 दोहराएं।
    7. प्रत्येक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 12 एमएल पीबीएस जोड़कर और 5 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके कोशिकाओं को दो बार धोएं। प्रत्येक ट्यूब के निचले भाग में एक सेल गोली बनेगी। सुपरनैटेंट को एस्पायरेट करें और धोने को दोहराएं। हर धोने के साथ सतह पर तैरने वाले को पूरी तरह से एस्पिरेट करने के लिए सावधान रहें क्योंकि सभी ईडीटीए को हटाना महत्वपूर्ण है।
    8. पीबीएस के साथ दूसरे धोने के बाद, सेल पेलेट अब विश्लेषण के लिए तैयार है। विश्लेषण के लिए आवश्यक उपयुक्त प्रोटोकॉल का पालन करें।

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Representative Results

ये मैक्रोपोरस एल्गिनेट मचान बनाने में आसान हैं और लियोफिलाइज़र से छिद्रपूर्ण, फूला हुआ और सफेद डिस्क के रूप में आना चाहिए। यद्यपि इस प्रयोग में अध्ययन नहीं किया गया है, कैल्शियम-एल्जिनेट समाधान को उपयोगकर्ताकी जरूरतों के आधार पर अलग-अलग आकार के मचान बनाने के लिए विभिन्न मोल्डों में डाला जा सकता है। मचान इलेक्ट्रोस्टैटिक हैं और अच्छी तरह से प्लेट के ढक्कन या एक घिसी हुई उंगली से चिपके रह सकते हैं। चित्र 2 दर्शाता है कि पूरा होने पर मचानों को कैसा दिखना चाहिए। 24- और 48-वेल मचानों के अनुमानित आयाम भी चित्र में दिखाए गए हैं।

Figure 2
चित्र 2: सूखे मैक्रोपोरस एल्गिनेट मचानों की छवियां। (A) मचानों से भरी एक 48-वेल प्लेट। (बी) मचानों से भरी एक 24-वेल प्लेट। (c) 48-वेल पाड़ की तुलना 24-वेल पाड़ से करना। पाड़ आयाम भी दिखाए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सफल पारगमन के लिए मचानों की सरंध्रता अत्यधिक महत्वपूर्ण है, और हमने पहले मचानों की सरंध्रता के साथ प्रयोग किया है। मचानों की एसईएम छवियों सहित सरंध्रता के बारे में अधिक जानकारी के लिए, कृपया अग्रवाल एट के कागजात देखें। संदर्भ17,18 में।

प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके पारगमन दक्षता का विश्लेषण किया गया था और परिणाम चित्रा 3 में दिखाए गए हैं। एक ही दाता से जमे हुए पीबीएमसी सक्रिय थे और सभी प्रयोगात्मक समूहों के लिए उपयोग किए गए थे। पीबीएमसी को सक्रिय करने के लिए एक प्रोटोकॉल पूरक फ़ाइल 1 में पाया जा सकता है, और टी कोशिकाओं को सक्रिय करने और सक्रियण को मान्य करने के लिए किसी भी मानक विधि का उपयोग 21,22,23 किया जा सकता है। सक्रिय पीबीएमसी को या तो जीएफपी-एन्कोडिंग रेट्रोवायरस के साथ एक मचान या वायरस के बिना एक मचान पर बीज दिया गया था, जिसे "रिक्त" मचान कहा जाता है। सक्रिय पीबीएमसी को पारंपरिक विधि के लिए एल्गिनेट मचानों की पारगमन दक्षता की तुलना करने के लिए रेट्रोनेक्टिन और जीएफपी-एन्कोडिंग रेट्रोवायरस के साथ स्पिनोकेटेड प्लेटों पर भी बीज दिया गया था। गैर-ट्रांसड्यूस्ड (एनटी) कोशिकाओं-सक्रिय पीबीएमसी को 24-वेल प्लेट के अनकोटेड कुओं में बीज दिया गया था- को नकारात्मक नियंत्रण समूह के रूप में इस्तेमाल किया गया था। जैसा कि अपेक्षित था, रिक्त मचान से अलग गैर-ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं और कोशिकाओं ने कोई पारगमन नहीं दिखाया। सक्रिय पीबीएमसी और जीएफपी रेट्रोवायरस के साथ बीजित मचान से अलग कोशिकाओं ने रेट्रोनेक्टिन-लेपित प्लेटों के लिए तुलनीय पारगमन दक्षता दिखाई। पाड़ में 85% की औसत पारगमन दक्षता थी, जो रेट्रोनेक्टिन समूह के ठीक नीचे थी। इन परिणामों से पता चलता है कि ये एल्गिनेट मचान रेट्रोनेक्टिन के स्पिनोक्यूलेशन की आवश्यकता के बिना वायरल ट्रांसड्यूस टी कोशिकाओं के लिए एक आसान और सस्ता विकल्प के रूप में काम करते हैं।

Figure 3
चित्र 3: ट्रांसडक्शन दक्षता का एफएसीएस परिमाणीकरण। (ए) एफएसीएस प्लॉट जीएफपी अभिव्यक्ति दिखाते हैं। कोशिकाओं को व्यवहार्य कोशिकाओं, एफएससी सिंगल्स और जीएफपी पॉजिटिव कोशिकाओं पर गेट किया गया था। (बी) एफएसीएस द्वारा जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं का परिमाणीकरण। रेट्रोनेक्टिन-लेपित प्लेटों (बैंगनी उल्टे त्रिकोण) के पारंपरिक स्पिनोक्यूलेशन का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। वायरस (लाल वर्ग) के बिना एल्गिनेट मचानों पर बीजित गैर-ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं (ब्लू सर्कल) और सक्रिय कोशिकाओं को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था। सक्रिय कोशिकाओं और जीएफपी रेट्रोवायरस (हरे त्रिकोण) के साथ बीजित मचानों में 85% की पारगमन दक्षता थी, जो रेट्रोनेक्टिन के बराबर थी। डेटा को n = 4 के साथ औसत ± मानक विचलन के रूप में दर्शाया गया है। संक्षेप: जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; एफएसीएस = प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग; एसएससी-ए = साइड स्कैटर-पीक क्षेत्र; एफएससी = आगे बिखराव। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए प्रोटोकॉल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 1: -80 डिग्री सेल्सियस पर निर्मित शुष्क मैक्रोपोरस एल्गिनेट मचानों की छवियां। -80 डिग्री सेल्सियस पर ठंड मचानों से -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे होने की तुलना में कम सुसंगत पाड़ उपस्थिति और कार्य होता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

सीएआर-टी सेल थेरेपी अनुसंधान और वाणिज्यिक अनुप्रयोगों दोनों के लिए रुचि हासिल करना जारी रखती है। रक्त कैंसर के इलाज में सीएआर-टी सेल थेरेपी की सफलता के बावजूद, प्रक्रिया की उच्च लागत इसके उपयोग को सीमित करती है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल रेट्रोनेक्टिन-लेपित प्लेटों के स्पिनोक्यूलेशन की आवश्यकता के बिना टी कोशिकाओं के वायरल जीन हस्तांतरण के लिए एक नई विधि का परिचय देता है। पारगमन को मध्यस्थ करने के लिए शुष्क मैक्रोपोरस एल्गिनेट मचानों का उत्पादन अपेक्षाकृत सरल है और पारंपरिक विधि के लिए एक उपयुक्त कम लागत वाला प्रतिस्थापन है।

कभी-कभी, पाड़ की उपस्थिति चित्र 2 में दिखाए गए लोगों से भिन्न हो सकती है और इसके बजाय सफेद और फूली हुई के बजाय स्पष्ट और क्रिस्टलीय दिखाई दे सकती है। यह फ्रीजर दरवाजे के बार-बार खुलने के कारण -20 डिग्री सेल्सियस पर असंगत ठंड से हो सकता है या यदि जमे हुए होने वाली प्लेट फ्रीजर में भारी वस्तुओं के बगल में या उसके ऊपर होने से अछूता है। उपस्थिति में अंतर के बावजूद, हमारी प्रयोगशाला ने क्रिस्टलीय मचानों के साथ पारगमन दक्षता में कोई अंतर नहीं किया है। यद्यपि क्रायोगेलेशन पर पिछले काम ने कम ठंड तापमान24,25 का उपयोग किया है, हमने पाया कि कम तापमान पर ठंड से -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए होने की तुलना में कम सुसंगत पाड़ उपस्थिति और कार्य होता है। -80 डिग्री सेल्सियस पर ठंड से बने मचान की छवियां पूरक चित्रा एस 1 में पाई जा सकती हैं। इसलिए, यह अभी भी अनुशंसा की जाती है कि मचानों को न्यूनतम व्यवधान के साथ -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए होना चाहिए, और प्लेट को रैक-स्टाइल शेल्फ पर रखा जाना चाहिए जो प्लेट के नीचे हवा के प्रवाह की अनुमति देता है।

यद्यपि इन मचानों ने उत्कृष्ट पारगमन दक्षता दिखाई है, कुछ सीमाओं पर ध्यान दिया जाना चाहिए। सबसे पहले, ईडीटीए के साथ काम करते समय देखभाल की जानी चाहिए, जो सेल व्यवहार्यता को सीमित कर सकती है, यहां तक कि छोटी मात्रा में भी। इसलिए, ईडीटीए को पूरी तरह से हटा दिया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, मचान का आकार अवशोषित होने वाले तरल की मात्रा को सीमित करेगा और इस प्रकार, कोशिकाओं की संख्या जिन्हें ट्रांसड्यूस किया जा सकता है। अंत में, इस प्रोटोकॉल का उपयोग निष्क्रिय टी कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने के लिए नहीं किया जा सकता है। भविष्य के काम में कोशिकाओं के एक साथ मध्यस्थता सक्रियण और प्रसार में सक्षम मचानों के निर्माण की रिपोर्टिंग पर ध्यान केंद्रित किया जाएगा, पारगमन के लिए कोशिकाओं और वायरल कणों के सह-स्थानीयकरण को बढ़ावा दिया जाएगा, और विवो18 में पूरी तरह कार्यात्मक ट्रांसड्यूस कोशिकाओं को जारी किया जाएगा।

हमारी प्रयोगशाला द्वारा प्रकाशित अध्ययन इन मचानों का उपयोग करके उत्पन्न सीएआर-टी कोशिकाओं के फेनोटाइपिक विश्लेषण और कार्यक्षमता की रिपोर्ट करते हैं। इन मचानों द्वारा उत्पादित सीडी 19-विशिष्ट सीएआर-टी कोशिकाओं ने प्रभावकारक फेनोटाइप को बनाए रखा और 1: 5 प्रभावक-से-लक्ष्य अनुपात 17 पर सह-संवर्धित होने पर विट्रो में सीडी19 + डौडी कोशिकाओं को खत्म करने में सक्षम थे। डौडी कोशिकाओं के साथ सह-संवर्धित सीएआर-टी कोशिकाओं ने आईएल -2 और आईएफएन -γ भी जारी किया, जो प्रोइंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स हैं जो इंगित करते हैं कि टी कोशिकाएं सक्रिय हैं। इन परिणामों से पता चलता है कि ये मचान विट्रो में अत्यधिक कार्यात्मक सीएआर-टी कोशिकाओं का उत्पादन करते हैं। इन मचानों द्वारा उत्पन्न सीएआर-टी कोशिकाओं ने जुगनू लूसिफेरस के साथ लेबल किए गए सीडी 19 + डौडी कोशिकाओं के खिलाफ विवो एंटीट्यूमर फ़ंक्शन में उत्कृष्ट प्रदर्शन किया। सीएआर-टी कोशिकाओं ने ट्यूमर के विकास को प्रभावी ढंग से नियंत्रित किया, समग्र जीवित रहने की दर में सुधार किया, और विषाक्तता के कोई महत्वपूर्ण संकेत नहींदिखाए। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि इन मचानों का उपयोग कोशिकाओं की कार्यक्षमता और एंटीट्यूमर गतिविधि को प्रभावित किए बिना सीएआर-टी सेल थेरेपी के लिए कोशिकाओं को आनुवंशिक रूप से संशोधित करने के लिए किया जा सकता है। इन एल्गिनेट मचानों के साथ भविष्य के अध्ययनों में मैक्रोपोरसिटी के साथ-साथ एल्गिनेट और कैल्शियम सांद्रता को समायोजित करके पारगमन दक्षता को अनुकूलित करना शामिल है।

निष्कर्ष में, इन मैक्रोपोरस एल्गिनेट मचानों में रेट्रोनेक्टिन के लिए एक तुलनीय पारगमन दक्षता है, जो सीएआर-टी सेल थेरेपी के लिए कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने के लिए एक वैकल्पिक विधि प्रदान करती है। ये मचान विट्रो और विवो17 दोनों में एंटीट्यूमर गतिविधि के साथ पूरी तरह कार्यात्मक सीएआर-टी कोशिकाओं का उत्पादन करते हैं। ड्राइडक्स स्काफोल्ड्स एक वैकल्पिक विधि प्रदान करते हैं जो सीएआर-टी सेल थेरेपी में उपयोग के लिए टी कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने के लिए सरल और सस्ती है।

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Disclosures

पीए और वाईबी सीएआर-टी सेल चिकित्सीय के उत्पादन के लिए बायोमैटेरियल्स के उपयोग से संबंधित पेटेंट पर आविष्कारक हैं। वाईबी को सीएआर-टी सेल चिकित्सीय प्रौद्योगिकी (इस काम से असंबंधित) से संबंधित उद्योग-प्रायोजित अनुसंधान अनुदान प्राप्त होता है। अन्य सभी लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा अनुदान पुरस्कार संख्या R37-CA260223, R21CA246414 के माध्यम से समर्थित किया गया था। हम प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण पर प्रशिक्षण और मार्गदर्शन के लिए एनसीएसयू फ्लो साइटोमेट्री कोर को धन्यवाद देते हैं। Biorender.com के साथ योजनाबद्ध बनाए गए थे

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA Invitrogen 15575-038 UltraPure, pH 8.0
1x DPBS Gibco 14190-144 No calcium chloride or magnesium chloride
3% Acetic Acid with Methylene Blue Stemcell Technologies Inc 07060
Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells - - Fresh or frozen
Calcium-D-Gluconate Alfa Aesar A11649
CD28.2 Antibody BD 555725 1 mg/mL
CD3 Antibody Miltenyi 130-093-387 100 μg/mL
Click's Media FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS 9195
DI Water - -
Glutamax Gibco 35-050-061
HyClone FBS Cytvia SH3039603
HyClone RPMI 1640 Media Cytvia SH3009601
Penicillin-streptomycin (P/S) Gibco 15-140-122
Peripheral Blood Mononuclear Cells - - Fresh or frozen
PRONOVA UP MVG NovaMatrix 4200101 Sodium alginate
Recombinant Human IL-15 Peprotech 200-15 5 ng/mL
Recombinant Human IL-7 Peprotech 200-07 10 ng/mL
Retrovirus - - 1 x 106 TU/mL

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 187 बायोमटेरियल पाड़ एल्गिनेट मैक्रोपोरस वायरल ट्रांसडक्शन इम्यूनोथेरेपी सीएआर-टी कोशिकाएं
टी कोशिकाओं के वायरल ट्रांसडक्शन के लिए ड्राई मैक्रोपोरस एल्गिनेट स्काफोल्ड्स का निर्माण और उपयोग
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VanBlunk, M., Agarwalla, P., Pandit, … More

VanBlunk, M., Agarwalla, P., Pandit, S., Brudno, Y. Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells. J. Vis. Exp. (187), e64036, doi:10.3791/64036 (2022).

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