Summary
本明細書は、CAR-T細胞療法のためのT細胞を含むT細胞の遺伝子工学において使用するための効率的なウイルス遺伝子導入を媒介する乾燥マクロポーラスアルギン酸スキャフォールドを作成するためのプロトコルである。足場は、活性化された初代T細胞を>85%の形質導入で形質導入することが示された。
Abstract
CAR-T細胞治療のためのT細胞の遺伝子工学は、ここ数年で癌治療の最前線に来ています。CAR-T細胞は、T細胞へのウイルス遺伝子導入によって産生される。ウイルス遺伝子導入の現在のゴールドスタンダードは、レトロネクチンコーティングプレートのスピンオキュレーションを含み、これは高価で時間がかかります。CAR-T細胞を生成するための効率的で費用効果の高い方法に対する大きなニーズがあります。ここで説明するのは、活性化T細胞のウイルス形質導入を効率的に促進する、Dryduxスキャフォールドとして知られる安価で乾燥したマクロポーラスアルギン酸スキャフォールドを製造する方法です。足場は、ウイルスを播種したレトロネクチンコーティングプレートのゴールドスタンダードのスピンオキュレーションの代わりに使用するように設計されており、細胞を形質導入するプロセスを簡素化します。アルギン酸塩はカルシウム-D-グルコン酸塩と架橋され、一晩凍結して足場を作ります。凍結した足場を凍結乾燥機で72時間凍結乾燥して、乾燥したマクロポーラス足場の形成を完了します。足場は、ウイルスと活性化T細胞が足場の上に一緒に播種されて遺伝子組み換え細胞を生成するときに、ウイルス遺伝子導入を仲介します。足場は>85%の初代T細胞形質導入を生成し、これはレトロネクチンコーティングプレート上のスピンノキュレーションの形質導入効率に匹敵します。これらの結果は、乾燥マクロポーラスアルギン酸スキャフォールドが従来の形質導入法に代わる安価で便利な代替手段として機能することを示しています。
Introduction
免疫療法は、腫瘍を特異的に標的とし、オフターゲット細胞毒性を制限し、再発を防ぐ能力により、革新的な癌治療パラダイムとして浮上しています。特に、キメラ抗原受容体T(CAR-T)細胞療法は、リンパ腫や白血病の治療に成功したことで人気を博しています。FDAは2017年に最初のCAR-T細胞療法を承認し、それ以来、さらに4つのCAR-T細胞療法を承認しました1,2,3,4,5。CARは、通常、腫瘍関連抗原3,4に特異的であるモノクローナル抗体の一本鎖可変断片からなる抗原認識ドメインを有する。CARが腫瘍関連抗原と相互作用すると、CAR-T細胞が活性化され、サイトカイン放出、細胞溶解性脱顆粒、転写因子発現、およびT細胞増殖を含む抗腫瘍応答を引き起こします。CAR-T細胞を産生するために、患者から血液を採取してT細胞を得る。CARは、ウイルスを使用して患者のT細胞に遺伝的に追加されます。CAR-T細胞はインビトロで増殖し、患者に注入されます2、3、4、6。CAR-T細胞の生成の成功は、CAR-T細胞に遺伝子改変されたT細胞の数を記述する形質導入効率によって決定される。
現在、CAR-T細胞生成のゴールドスタンダードは、レトロネクチンコーティングプレート上での活性化T細胞およびウイルスのスピンオキュレーションである7,8。形質導入は、ウイルス粒子がT細胞の表面と係合するときに始まります。レトロネクチンは、ウイルス粒子と細胞との間の結合効率を高めることによってウイルスと細胞の共局在を促進し、形質導入を増強する7,8。レトロネクチンはそれ自体ではうまく機能せず、ウイルス粒子を濃縮し、T細胞の表面透過性を高めることによって遺伝子導入を促進する脊髄分泌を伴う必要があり、ウイルス感染を容易にします8。レトロネクチンコーティングプレートでのスピンオキュレーションの成功にもかかわらず、それは複数のスピンサイクルと高価な試薬を必要とする複雑なプロセスです。したがって、より迅速かつ安価なウイルス遺伝子導入のための代替方法が非常に望ましい。
アルギン酸塩は、その低コスト、優れた安全性プロファイル、および二価カチオンとの混合時にヒドロゲルを形成する能力のために、生物医学産業で広く使用されている天然アニオン性多糖類です9,10,11,12。アルギン酸塩はGMP準拠のポリマーであり、FDA13によって一般的に安全(GRAS)として認められています。アルギン酸塩を陽イオンと架橋すると、創傷治癒、少量の化学薬品やタンパク質の送達、および細胞輸送によく使用される安定したヒドロゲルが作成されます9、10、11、12、14、15、16。その優れたゲル化特性のために、アルギン酸塩は凍結乾燥によって多孔質足場を作成するための好ましい材料である10,17。アルギン酸塩のこれらの特性は、活性化細胞のウイルス遺伝子導入を媒介することができる足場を製造するための魅力的な候補となる。
ここで説明するのは、ウイルス遺伝子導入によってT細胞を静的に形質導入する、Drydux足場として知られる乾燥マクロポーラスアルギン酸足場を作製するためのプロトコルである17,18。これらの足場を作成するプロセスを図 1 に示します。これらの足場は、レトロネクチンコーティングプレートの脊髄分泌の必要性を排除します。マクロポーラスアルギン酸スキャフォールドは、ウイルス粒子とT細胞の相互作用を促進し、操作されたT細胞の機能および生存率に影響を与えることなく、単一ステップで効率的な遺伝子導入を可能にする17。正しく従えば、これらのマクロポーラスアルギン酸塩足場は、少なくとも80%の形質導入効率を有し、ウイルス形質導入プロセスを単純化および短縮する。
図1:プロトコルの概略図とタイムライン 。 (A)乾燥マクロポーラスアルギン酸塩足場を作製するためのタイムライン。アルギン酸塩はカルシウム-D-グルコン酸塩と架橋され、一晩凍結されます。凍結した足場を72時間凍結乾燥して、Drydux足場を作ります。(B)活性化細胞のウイルス形質導入のタイムライン。活性化細胞およびウイルス(MOI 2)を足場の上に播種し、IL-7およびIL-15を添加した完全培地中でインキュベートする。足場は混合物を吸収し、ウイルス遺伝子導入を促進します。EDTAは、足場を溶解し、形質導入された細胞を単離するために使用されます。PBSで2回洗浄した後、細胞ペレットを分析に使用できます。略語:PBS =リン酸緩衝生理食塩水;PBMC =末梢血単核細胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Protocol
ヒト優位性細胞とレトロウイルスベクターを含むすべての手順は、ノースカロライナ州立大学の生物学的安全性ガイドラインに準拠して実行され、環境衛生安全局によって承認されました。ヒト末梢血単核細胞は、商業的供給源からバフィーコートとして購入された。初代ヒト細胞は、ヒトバフィーコート画分から単離する必要があり、バイオセーフティレベル2のクリアランスと詳細な標準操作手順、および作業が行われる機関からの承認が必要です。前述のように調製された形質導入に使用されるレトロウイルスベクター上清を含むウイルスベクター19は、コードされたタンパク質に応じてバイオセーフティレベル1またはバイオセーフティレベル2のいずれかに分類することができ、関連する機関のバイオセーフティ委員会からの承認を必要とする。
1. マクロポーラスアルギン酸塩足場の作製
- ビーカー内のDグルコン酸カルシウムに滅菌ろ過された脱イオン水を加えて、0.4%(体積あたりの重量)のカルシウムDグルコン酸塩のストック溶液を調製します。グルコン酸カルシウムが溶解するまで中速で攪拌し(~1.5時間)、滅菌フィルターで、室温で保存します。
注:溶液のpHを確認する必要はありません。 - スクリューキャップバイアルまたはビーカーに2%(体積当たりの重量)アルギン酸塩の溶液を調製する。超高純度アルギン酸塩を容器に注意深く加え、滅菌ろ過された脱イオン水をアルギン酸塩に加えます。混合を妨げない可能な限り最大の攪拌子を選択し、それを容器に追加します。
注:このプロトコルに使用される超高純度アルギン酸塩の種類に関する情報は、材料表およびNovamatrixのウェブサイト20に記載されています。これらの足場については、足場の多孔性および生体適合性に望ましくない変化をもたらす可能性があるため、異なるアルギン酸塩は調査されなかった9,10,11。 - アルギン酸塩が溶解するまで(~1時間)高速で溶液を攪拌します。容器の側面に大きな塊がある場合は、容器を傾けてそれらを取り除きます。側面の少量のアルギン酸塩は攪拌中に溶解し、心配する必要はありません。
注:溶液のpHを確認する必要はありません。 - アルギン酸塩が溶解したら、攪拌速度を下げ、架橋塊の形成を防ぐためにアルギン酸塩溶液に等量の0.4%グルコン酸カルシウムDをゆっくりと加え、15分間激しく攪拌します。
- ビーカーまたはバイアルを横に傾けて、形成された可能性のある塊を取り除きます。
注意: ホモジナイザーを使用することをお勧めします。最終的な解決策は光学的に明確でなければなりません。 - 希望量の溶液を48ウェルプレートまたは24ウェルプレートの各ウェルにピペットで入れます。48ウェルプレートには300 μL/ウェル、24ウェルプレートには1 mL/ウェルを使用します。溶液は粘性があり、先端にくっつくため、ゆっくりとキャストし、チップを頻繁に交換します。
- プレートを蓋で覆い、-20°Cで一晩凍結する。
- 蓋を外し、ワイプと輪ゴムで上部を固定して、凍結乾燥機用のプレートを準備します。プレートを750 mL〜2,000 mLの凍結乾燥フラスコに入れ、凍結乾燥機に72時間置きます。
- 72時間後、凍結乾燥機からプレートを取り外し、蓋を元に戻します。プレートを密封し、4°Cで保存します。長期保存の場合は、プレートを真空シールしてから4°Cで保存してください。必要になるまで乾いた状態に保ちます。
注:容量誤差のために余分なカルシウム-アルギン酸塩溶液を作ります(バイアルの壁、ピペットチップに付着するものもあります)。例えば、24ウェルプレートに4つの足場を作るには、4mLの複合溶液(2mLアルギン酸塩+2mLカルシウムDグルコン酸塩)が必要であるが、2.5mLの2%アルギン酸塩溶液および2.5mLの0.4%カルシウムDグルコン酸塩溶液を調製することが推奨される。
2. 形質導入
- 100 kDaフィルターを用いたウイルス上清の濃度
- 遠心フィルターを1 mLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2分間水和します。PBS を破棄します。
- 2 mLのウイルス懸濁液(1 ×10 6 TU / mL)を加え、遠心フィルターを通して1,500 × g でスイングバケットローターで10分間遠心分離することにより、ウイルス懸濁液を濃縮します。
注:足場ごとに1〜200マイクロリットルの濃縮ウイルスが必要です。 - 濃縮ウイルス懸濁液量が200 μLを超える場合は、さらに数分間スピンします。
- スキャフォールディングごとに手順 2.1.1-2.1.3 を繰り返します。
注:大量のウイルスを濃縮し、濃縮ストックから100〜200μLのアリコートを採取することもできます。
- 活性化された細胞とウイルスを一緒に播種します。
- 各足場について、1×106 活性化末梢血単核球(PBMC)を50 μLの完全細胞培養培地(250 mLクリック培地 + 250 mL RPMI 1640培地 + 50 mLウシ胎児血清 + 5 mLグルタミン代替物+ 5 mLペニシリン/ストレプトマイシン)に懸濁してアリコートを調製します。
メモ: PBMC のアクティブ化方法に関するプロトコルについては、 補足ファイル 1 を参照してください。 - 濃縮されたウイルス上清(~2 × 106 TU、MOI 2)を細胞懸濁液に加えます。細胞ウイルス懸濁液の総容量は、48ウェル足場の場合は200μL、24ウェル足場の場合は350μLを超えてはなりません。
- 細胞とウイルスの混合物を乾いた足場の上部に滴下します。ネガティブコントロール実験では、濃縮ウイルスの代わりに完全な細胞培養培地を使用します。セル懸濁液を乾いた足場の上部に追加します。
- スキャフォールディングごとに手順 2.2.1 から 2.2.3 を繰り返します。
- スキャフォールドを細胞培養インキュベーター内で37°Cで45〜60分間インキュベートします。インキュベーターから足場を取り外します。足場はこの間に溶液を完全に吸収します。
- 増殖を誘導するには、IL-15(5 ng/mL)およびIL-7(10 ng/mL)を添加した完全な細胞培養培地を各ウェルに追加します。IL-2も使用することができる。各48ウェル足場に500 μL、または各24ウェル足場に1 mLを追加します。
- 足場を37°Cで72時間インキュベートします。細胞が増殖すると、培地はオレンジ色に変わります。
- 各足場について、1×106 活性化末梢血単核球(PBMC)を50 μLの完全細胞培養培地(250 mLクリック培地 + 250 mL RPMI 1640培地 + 50 mLウシ胎児血清 + 5 mLグルタミン代替物+ 5 mLペニシリン/ストレプトマイシン)に懸濁してアリコートを調製します。
- 分析のために足場から細胞を分離します。
- 1x PBSで0.5 M EDTAを0.25 M EDTAに希釈します。
- 各ウェルから余分な培地を取り除き、別々の15 mL遠沈管に集めます。
- スキャフォールドから細胞を単離するには、各スキャフォールドに0.25 M EDTAを追加します。300 μLを48ウェルスキャフォールドに追加するか、1 mLを24ウェルスキャフォールドに追加します。プレートを3〜4分間座らせるか、穏やかに攪拌します。
- 足場がほとんど溶解したら、ウェル内でピペットでゆっくりと出し入れします。足場を完全に溶解するには、いくつかのピペッティングのインとアウトのステップが必要になる場合があります。10分以内に溶解しない場合は、さらに200μLの0.25 M EDTAを追加します。
- 足場が完全に溶解したら、溶液を15 mLの遠沈管に移します。
- スキャフォールドごとに手順 2.3.4 と 2.3.5 を繰り返します。
- 各遠沈管に12 mL PBSを加え、400 × g で5分間遠心分離することにより、細胞を2回洗浄します。セルペレットが各チューブの底に形成されます。上清を吸引し、洗浄を繰り返す。すべてのEDTAを除去することが重要であるため、洗浄するたびに上清を完全に吸引するように注意してください。
- PBSによる2回目の洗浄後、細胞ペレットは分析の準備が整いました。分析に必要な適切なプロトコルに従います。
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Representative Results
これらのマクロポーラスアルギン酸塩足場は簡単に作成でき、凍結乾燥機から多孔質でふわふわした白いディスクとして出てくるはずです。この実験では検討されていないが、カルシウム−アルギン酸塩溶液を異なる型に鋳造して、ユーザのニーズに応じて様々な形状の足場を作り出すことができる9、10。足場は静電であり、ウェルプレートの蓋または手袋をはめた指に付着する可能性があります。 図 2 は、完了時のスキャフォールドの外観を示しています。24ウェル足場と48ウェル足場のおおよその寸法も図に示されています。
図2:乾燥したマクロポーラスアルギン酸塩足場の画像 。 (A)足場でいっぱいの48ウェルプレート。(B)足場でいっぱいの24ウェルプレート。(C)48ウェル足場と24ウェル足場の比較。足場の寸法も表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
足場の気孔率は形質導入を成功させるために非常に重要であり、我々は以前に足場の気孔率を実験したことがある。足場のSEM画像を含む多孔性の詳細については、Agarwallaらの論文を参照してください。参考文献17,18。
形質導入効率をフローサイトメトリーを用いて分析し、その結果を図3に示す。同じドナーからの凍結PBMCを活性化し、すべての実験群に使用しました。PBMCを活性化するためのプロトコルは補足ファイル1にあり、T細胞を活性化し、活性化を検証するための任意の標準的な方法を使用することができます21、22、23。活性化されたPBMCは、GFPをコードするレトロウイルスを含む足場または「ブランク」足場と呼ばれるウイルスを含まない足場のいずれかに播種されました。活性化PBMCをレトロネクチンおよびGFPコードレトロウイルスで有糸球されたプレートに播種し、アルギン酸スキャフォールドの形質導入効率を従来の方法と比較しました。24ウェルプレートのコーティングされていないウェルに播種した非形質導入(NT)細胞活性化PBMCを陰性対照群として使用しました。予想されたように、非形質導入細胞およびブランク足場から単離された細胞は、いかなる形質導入も示さなかった。活性化PBMCおよびGFPレトロウイルスを播種した足場から単離された細胞は、レトロネクチンコーティングプレートと同等の形質導入効率を示した。足場の平均形質導入効率は85%で、レトロネクチン群のすぐ下でした。これらの結果は、これらのアルギン酸スキャフォールドが、レトロネクチンの脊髄分泌を必要とせずにT細胞をウイルス的に形質導入するためのより簡単で安価な代替物として機能することを示しています。
図3:形質導入効率のFACS定量 。 (A)GFP発現を示すFACSプロット。細胞は、生細胞、FSCシングレット、およびGFP陽性細胞上でゲーティングした。(B)FACSによるGFP陽性細胞の定量。レトロネクチン被覆プレートの従来のスピンオキュレーション(紫色の逆三角形)をポジティブコントロールとして使用した。非形質導入細胞(青い円)およびウイルスを含まないアルギン酸足場に播種された活性化細胞(赤四角)をネガティブコントロールとして使用した。活性化細胞とGFPレトロウイルス(緑色の三角形)を播種した足場は、レトロネクチンに匹敵する85%の形質導入効率を有していた。データは、n = 4の平均値±標準偏差として表されます。略語:GFP =緑色蛍光タンパク質;FACS = 蛍光活性化細胞選別;SSC-A = 側方散乱ピーク面積;FSC = 前方散乱。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:細胞を活性化するためのプロトコル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S1:-80°Cで作製した乾燥マクロポーラスアルギン酸足場の画像。 足場を-80°Cで凍結すると、-20°Cで凍結した場合よりも足場の外観と機能の一貫性が低下します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
CAR-T細胞療法は、研究と商業的応用の両方で関心を集め続けています。CAR-T細胞療法が血液がんの治療に成功しているにもかかわらず、この手順の高コストはその使用を制限しています。ここで紹介するプロトコルは、レトロネクチンコーティングプレートの脊髄分泌を必要とせずにT細胞のウイルス遺伝子導入のための新しい方法を紹介します。形質導入を媒介する乾燥マクロポーラスアルギン酸塩足場の製造は比較的簡単であり、従来の方法に代わる適切な低コストである。
時折、足場の外観は図2に示されているものと異なり、代わりに白くてふわふわではなく、透明で結晶的に見えることがあります。これは、冷凍庫のドアを繰り返し開くことによる-20°Cでの一貫性のない凍結、または冷凍するプレートが冷凍庫内のかさばるアイテムの隣または上にあることによって断熱されている場合に発生する可能性があります。外観の違いにもかかわらず、私たちの研究室では結晶足場で形質導入効率に違いはありません。凍結ゲル化に関する以前の研究では、より低い凍結温度を使用していましたが24,25、低温での凍結は、-20°Cで凍結した場合よりも足場の外観と機能の一貫性が低下することがわかりました。-80°Cで凍結して作成した足場の画像は、補足図S1に記載されています。したがって、足場は最小限の混乱で-20°Cで凍結し、プレートの下の空気の流れを可能にするラックスタイルの棚にプレートを配置することをお勧めします。
これらの足場は優れた形質導入効率を示していますが、いくつかの制限に注意する必要があります。まず、EDTAを扱う際には、少量でも細胞の生存率を制限する可能性があることに注意する必要があります。したがって、EDTAは完全に削除する必要があります。さらに、足場のサイズは、吸収できる液体の量を制限し、したがって、形質導入できる細胞の数を制限します。最後に、このプロトコルを使用して、不活性化されたT細胞を形質導入することはできません。今後の研究では、細胞の活性化と増殖を同時に媒介し、形質導入のための細胞とウイルス粒子の共局在を促進し、完全に機能する形質導入細胞をin vivoで放出することができる足場の作製の報告に焦点を当てます18。
私たちの研究室による発表された研究は、これらの足場を使用して生成されたCAR-T細胞の表現型分析と機能性を報告しています。これらの足場によって産生されたCD19特異的CAR-T細胞はエフェクター表現型を保持し、1:5のエフェクター対標的比で共培養した場合、in vitroでCD19+ Daudi細胞を排除することができました17。ダウディ細胞と共培養されたCAR-T細胞は、T細胞が活性化されていることを示す炎症誘発性サイトカインであるIL-2およびIFN-γも放出した。これらの結果は、これらの足場がin vitroで高機能CAR-T細胞を産生することを示しています。これらの足場材により作製されたCAR-T細胞は、ホタルルシフェラーゼで標識されたCD19+ Daudi細胞に対して優れたin vivo抗腫瘍機能を示した。CAR-T細胞は腫瘍増殖を効果的に制御し、全生存率を改善し、毒性の有意な兆候を示さなかった17。これらの結果は、これらの足場が、細胞の機能および抗腫瘍活性に影響を与えることなく、CAR-T細胞治療のために細胞を遺伝子改変するために使用できることを示している。これらのアルギン酸スキャフォールドを用いた将来の研究では、マクロ多孔性、アルギン酸塩およびカルシウム濃度を調整することにより、形質導入効率を最適化する必要があります。
結論として、これらのマクロポーラスアルギン酸足場は、レトロネクチンと同等の形質導入効率を有し、CAR-T細胞療法のために細胞を形質導入するための代替方法を提供する。これらの足場はまた、インビトロおよびインビボの両方で抗腫瘍活性を有する完全に機能するCAR-T細胞を産生する17。Drydux足場は、CAR-T細胞療法で使用するためにT細胞を形質導入するための簡単で安価な代替方法を提供します。
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Disclosures
P.A.およびY.B.は、CAR-T細胞治療薬の生成のための生体材料の使用に関連する特許の発明者である。Y.B.は、CAR-T細胞治療技術に関連する業界支援の研究助成金を受け取ります(この研究とは無関係)。他のすべての著者は、競合する利益がないことを宣言します。
Acknowledgments
この研究は、助成金番号R37-CA260223、R21CA246414を通じて国立衛生研究所によってサポートされました。フローサイトメトリー分析に関するトレーニングとガイダンスを提供してくれたNCSUフローサイトメトリーコアに感謝します。回路図は Biorender.com で作成されました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | 15575-038 | UltraPure, pH 8.0 |
| 1x DPBS | Gibco | 14190-144 | No calcium chloride or magnesium chloride |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies Inc | 07060 | |
| Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells | - | - | Fresh or frozen |
| Calcium-D-Gluconate | Alfa Aesar | A11649 | |
| CD28.2 Antibody | BD | 555725 | 1 mg/mL |
| CD3 Antibody | Miltenyi | 130-093-387 | 100 μg/mL |
| Click's Media | FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS | 9195 | |
| DI Water | - | - | |
| Glutamax | Gibco | 35-050-061 | |
| HyClone FBS | Cytvia | SH3039603 | |
| HyClone RPMI 1640 Media | Cytvia | SH3009601 | |
| Penicillin-streptomycin (P/S) | Gibco | 15-140-122 | |
| Peripheral Blood Mononuclear Cells | - | - | Fresh or frozen |
| PRONOVA UP MVG | NovaMatrix | 4200101 | Sodium alginate |
| Recombinant Human IL-15 | Peprotech | 200-15 | 5 ng/mL |
| Recombinant Human IL-7 | Peprotech | 200-07 | 10 ng/mL |
| Retrovirus | - | - | 1 x 106 TU/mL |
References
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