Summary
Heri er en protokol til oprettelse af tørre makroporøse alginatstilladser, der formidler effektiv viral genoverførsel til brug i genteknologi af T-celler, herunder T-celler til CAR-T-celleterapi. Stilladserne viste sig at transducere aktiverede primære T-celler med >85% transduktion.
Abstract
Genteknologi af T-celler til CAR-T-celleterapi er kommet i spidsen for kræftbehandling i løbet af de sidste par år. CAR-T-celler produceres ved viral genoverførsel til T-celler. Den nuværende guldstandard for viral genoverførsel involverer spinokulation af retronectinbelagte plader, hvilket er dyrt og tidskrævende. Der er et betydeligt behov for effektive og omkostningseffektive metoder til at generere CAR-T-celler. Beskrevet her er en metode til fremstilling af billige, tørre makroporøse alginatstilladser, kendt som Drydux-stilladser, der effektivt fremmer viral transduktion af aktiverede T-celler. Stilladserne er designet til at blive brugt i stedet for guldstandard spinokulation af retronectinbelagte plader podet med virus og forenkle processen til transducering af celler. Alginat er tværbundet med calcium-D-gluconat og frosset natten over for at skabe stilladserne. De frosne stilladser frysetørres i en frysetørrer i 72 timer for at fuldføre dannelsen af de tørre makroporøse stilladser. Stilladserne formidler viral genoverførsel, når virus og aktiverede T-celler podes sammen oven på stilladset for at producere genetisk modificerede celler. Stilladserne producerer >85% primær T-celletransduktion, hvilket kan sammenlignes med transduktionseffektiviteten af spinokulation på retronectinbelagte plader. Disse resultater viser, at tørre makroporøse alginatstilladser tjener som et billigere og mere bekvemt alternativ til den konventionelle transduktionsmetode.
Introduction
Immunterapi er opstået som et revolutionerende kræftbehandlingsparadigme på grund af dets evne til specifikt at målrette tumorer, begrænse off-target cytotoksicitet og forhindre tilbagefald. Især har kimær antigenreceptor T (CAR-T) celleterapi vundet popularitet på grund af dens succes med behandling af lymfomer og leukæmier. FDA godkendte den første CAR-T-celleterapi i 2017 og har siden da godkendt yderligere fire CAR-T-celleterapier 1,2,3,4,5. CAR'er har et antigengenkendelsesdomæne, der normalt består af et enkelt kædevariabelt fragment af et monoklonalt antistof, der er specifikt for et tumorassocieret antigen 3,4. Når en CAR interagerer med sit tumorassocierede antigen, aktiveres CAR-T-cellerne, hvilket fører til et antitumorrespons, der involverer cytokinfrigivelse, cytolytisk degranulering, transkriptionsfaktorekspression og T-celleproliferation. For at producere CAR-T-celler opsamles blod fra patienten for at få deres T-celler. CAR'er tilsættes genetisk til patientens T-celler ved hjælp af en virus. CAR-T-cellerne dyrkes in vitro og infunderes tilbage i patienten 2,3,4,6. Vellykket generering af CAR-T-celler bestemmes af transduktionseffektiviteten, som beskriver antallet af T-celler, der er genetisk modificeret til CAR-T-celler.
I øjeblikket er guldstandarden for CAR-T-cellegenerering spinokulation af aktiverede T-celler og virus på retronectinbelagte plader 7,8. Transduktion begynder, når virale partikler går i indgreb med overfladen af T-cellerne. Retronectin fremmer colokalisering af virus og celler ved at øge bindingseffektiviteten mellem de virale partikler og cellerne, hvilket forbedrer transduktion 7,8. Retronectin fungerer ikke godt alene og skal ledsages af spinokulation, som forbedrer genoverførslen ved at koncentrere de virale partikler og øge T-cellens overfladepermeabilitet, hvilket giver mulighed for lettere virusinfektion8. På trods af succesen med spinokulation på retronectinbelagte plader er det en kompleks proces, der kræver flere spincyklusser og dyre reagenser. Derfor er alternative metoder til viral genoverførsel, der er hurtigere og billigere, meget ønskelige.
Alginat er et naturligt anionisk polysaccharid, der i vid udstrækning anvendes i den biomedicinske industri på grund af dets lave omkostninger, gode sikkerhedsprofil og evne til at danne hydrogeler ved blanding med divalente kationer 9,10,11,12. Alginat er en GMP-kompatibel polymer og er generelt anerkendt som sikker (GRAS) af FDA13. Tværbinding af alginat med kationer skaber stabile hydrogeler, der ofte bruges til sårheling, levering af små kemiske lægemidler og proteiner og celletransport 9,10,11,12,14,15,16. På grund af dets fremragende geleringsegenskaber er alginat det foretrukne materiale til at skabe porøse stilladser ved frysetørring10,17. Disse egenskaber ved alginat gør det til en attraktiv kandidat til fremstilling af et stillads, der kan formidle viral genoverførsel af aktiverede celler.
Beskrevet her er en protokol til fremstilling af tørre makroporøse alginatstilladser, kendt som Drydux-stilladser, der statisk transducerer T-celler ved viral genoverførsel17,18. Processen til fremstilling af disse stilladser er vist i figur 1. Disse stilladser eliminerer behovet for spinokulation af retronectinbelagte plader. De makroporøse alginatstilladser tilskynder til interaktion mellem virale partikler og T-celler for at muliggøre effektiv genoverførsel i et enkelt trin uden at påvirke funktionaliteten og levedygtigheden af de konstruerede T-celler17. Når de følges korrekt, har disse makroporøse alginatstilladser en transduktionseffektivitet på mindst 80%, hvilket forenkler og forkorter den virale transduktionsproces.
Figur 1: Skematisk og tidslinje for protokollen . (A) Tidslinje for fremstilling af de tørre makroporøse alginatstilladser. Alginat er tværbundet med calcium-D-gluconat og frosset natten over. De frosne stilladser fryses i 72 timer for at skabe Drydux-stilladserne. (B) Tidslinje for viral transduktion af aktiverede celler. Aktiverede celler og virus (MOI 2) podes oven på stilladset og inkuberes i komplette medier suppleret med IL-7 og IL-15. Stilladserne absorberer blandingen og fremmer viral genoverførsel. EDTA bruges til at opløse stilladserne og isolere de transducerede celler. Efter vask to gange med PBS kan cellepelleten bruges til analyse. Forkortelser: PBS = fosfatbufferet saltvand; PBMC'er = mononukleære celler i perifert blod. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverede humane forrangceller og retrovirale vektorer, blev udført i overensstemmelse med North Carolina State University's retningslinjer for biologisk sikkerhed og godkendt af Environmental Health and Safety Office. Humane perifere blodmononukleære celler blev købt som buffy frakker fra kommercielle kilder. Primære humane celler skal isoleres fra fraktioner af human buffy coat og kræve godkendelse på biosikkerhedsniveau 2 og detaljerede standardprocedurer og godkendelse fra den institution, hvor arbejdet skal finde sted. Virale vektorer, herunder de retrovirale vektorsupernatanter, der anvendes til transduktionen fremstillet som tidligere beskrevet19, kan klassificeres enten som biosikkerhedsniveau 1 eller biosikkerhedsniveau 2 afhængigt af det kodede protein og kræver godkendelse fra det relevante institutionelle biosikkerhedsudvalg.
1. Fremstilling af de makroporøse alginatstilladser
- Der fremstilles en stamopløsning af 0,4 vægtprocent (vægt pr. volumen) calcium D-gluconat ved tilsætning af sterilfiltreret deioniseret vand til calcium D-gluconat i et bægerglas. Rør på medium hastighed, indtil calciumgluconatet er opløst (~ 1,5 timer), sterilt filter og opbevares ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at kontrollere opløsningens pH. - Der fremstilles en opløsning af 2% (vægt pr. volumen) alginat i et hætteglas med skruelåg eller bægerglas. Tilsæt forsigtigt ultrarent alginat til beholderen og tilsæt sterilt filtreret deioniseret vand til alginatet. Vælg den størst mulige rørestang, der ikke forhindrer blanding, og tilsæt den til beholderen.
BEMÆRK: Oplysninger om den type ultrarent alginat, der anvendes til denne protokol, findes i materialetabellen og på Novamatrix-webstedet20. Forskellige alginater blev ikke undersøgt for disse stilladser, da de kan føre til uønskede ændringer i porøsitet og biokompatibilitet af stilladserne 9,10,11. - Opløsningen omrøres ved høj hastighed, indtil alginatet opløses (~1 time). Hvis der er store klumper på siderne af fartøjet, skal du vippe fartøjet for at løsne dem. Små mængder alginat på siderne opløses under omrøring og giver ikke anledning til bekymring.
BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at kontrollere opløsningens pH. - Når alginatet opløses, reduceres omrøringshastigheden, tilsæt langsomt et lige stort volumen 0,4% calcium D-gluconat til alginatopløsningen for at forhindre tværbindingsklumper i at danne sig, og rør kraftigt i 15 minutter.
- Vip bægerglasset eller hætteglasset sidelæns for at fjerne eventuelle klumper, der måtte være dannet.
BEMÆRK: Det anbefales at bruge en homogenisator. Den endelige løsning bør være optisk klar. - Pipetter det ønskede volumen af opløsningen i hver brønd i en 48-brøndplade eller 24-brøndsplade. Brug 300 μL/brønd til en 48-brønds plade og 1 ml/brønd til en 24-brønds plade. Kast langsomt og skift spidser ofte, da opløsningen vil være tyktflydende og klæbe til spidsen.
- Pladerne dækkes med låg, og der fryses natten over ved -20 °C.
- Forbered pladen til frysestoffet ved at fjerne låget og fastgøre toppen med klude og gummibånd. Placer pladerne i 750 ml til 2.000 ml lyofilisatorkolber, og læg dem på fryseapparatet i 72 timer.
- Efter 72 timer skal du fjerne pladen fra fryseapparatet og udskifte låget. Pladen forsegles og opbevares ved 4 °C. Ved langtidsopbevaring vakuumforsegles pladen, inden den opbevares ved 4 °C. Holdes tør, indtil det er nødvendigt.
BEMÆRK: Lav ekstra calciumalginatopløsning på grund af volumenfejl (nogle klæber til hætteglassets vægge, pipettespidser). For eksempel for at fremstille fire stilladser i en 24-brøndsplade kræves 4 ml kombineret opløsning (2 ml alginat + 2 ml calcium D-gluconat), men det anbefales at fremstille 2,5 ml 2% alginatopløsning og 2,5 ml 0,4% calcium D-gluconatopløsning.
2. Transduktion
- Koncentration af viral supernatant ved anvendelse af 100 kDa filtre
- Centrifugalfilteret hydreres i 2 minutter med 1 ml 1x fosfatbufferet saltvand (PBS). Kassér PBS.
- Viral suspension koncentreres ved at tilsætte 2 ml viral suspension (1 × 106 TU / ml) og centrifugere den gennem centrifugalfilteret ved 1.500 × g i 10 minutter i en svingende spandrotor.
BEMÆRK: Der kræves en til to hundrede mikroliter koncentreret virus pr. Stillads. - Spin i et par ekstra minutter, hvis det koncentrerede virussuspensionsvolumen er større end 200 μL.
- Trin 2.1.1-2.1.3 gentages for hvert stillads.
BEMÆRK: Det er også acceptabelt at koncentrere en stor bestand af virus og tage 100-200 μL aliquots fra den koncentrerede bestand.
- Frø aktiverede celler og virus sammen.
- For hvert stillads fremstilles en aliquot ved at suspendere 1 × 106 aktiverede mononukleære celler i perifert blod (PBMC'er) i 50 μL komplette cellekulturmedier (250 ml Clicks medie + 250 ml RPMI 1640 medier + 50 ml føtalt bovint serum + 5 ml glutaminerstatning + 5 ml penicillin / streptomycin).
BEMÆRK: Se Supplerende fil 1 for en protokol om, hvordan du aktiverer PBMC'er. - Tilsæt den koncentrerede virale supernatant (~ 2 × 106 TU, MOI 2) til cellesuspensionen. Det samlede volumen af cellevirussuspensionen må ikke overstige 200 μL for et stillads med 48 brønde eller 350 μL for et stillads med 24 brønde.
- Tilsæt celle-virusblandingen dråbevis til toppen af det tørre stillads. Til negative kontroleksperimenter skal du bruge komplette cellekulturmedier i stedet for den koncentrerede virus. Tilsæt cellesuspensionen til toppen af det tørre stillads.
- Trin 2.2.1-2.2.3 gentages for hvert stillads.
- Stilladserne inkuberes i en cellekulturinkubator ved 37 °C i 45-60 min. Fjern stilladserne fra inkubatoren; Stilladserne absorberer opløsningen fuldt ud i løbet af denne tid.
- For at inducere proliferation tilsættes komplette cellekulturmedier suppleret med IL-15 (5 ng / ml) og IL-7 (10 ng / ml) til hver brønd; IL-2 kan også bruges. Tilsæt 500 μL til hvert stillads med 48 brønde eller 1 ml til hvert stillads med 24 brønde.
- Stilladserne udruges ved 37 °C i 72 timer. Efterhånden som cellerne spredes, bliver medierne orange.
- For hvert stillads fremstilles en aliquot ved at suspendere 1 × 106 aktiverede mononukleære celler i perifert blod (PBMC'er) i 50 μL komplette cellekulturmedier (250 ml Clicks medie + 250 ml RPMI 1640 medier + 50 ml føtalt bovint serum + 5 ml glutaminerstatning + 5 ml penicillin / streptomycin).
- Isoler celler fra stilladserne til analyse.
- Der fortyndes 0,5 m EDTA til 0,25 m EDTA i 1x PBS.
- Fjern overskydende medium fra hver brønd og opsaml i separate 15 ml centrifugerør.
- For at isolere celler fra stilladset tilsættes 0,25 M EDTA til hvert stillads. Tilsæt 300 μL til 48-brønds stilladser eller 1 ml til 24-brønd stilladser. Lad pladen sidde eller forsigtigt omrøre i 3-4 min.
- Når stilladset for det meste er opløst, pipetteres forsigtigt ind og ud inde i brønden. Et par ind-og-ud-pipetteringstrin kan være nødvendige for at opløse stilladset helt. Hvis det ikke opløses på 10 min, tilsættes yderligere 200 μL 0,25 M EDTA.
- Når stilladset er opløst helt, overføres opløsningen til et 15 ml centrifugerør.
- Gentag trin 2.3.4 og 2.3.5 for hvert stillads.
- Cellerne vaskes to gange ved at tilsætte 12 ml PBS til hvert centrifugerør og centrifugeres ved 400 × g i 5 minutter. Der dannes en cellepellet i bunden af hvert rør. Aspirer supernatanten og gentag vasken. Vær forsigtig med at aspirere supernatanten fuldt ud ved hver vask, da det er afgørende at fjerne al EDTA.
- Efter den anden vask med PBS er cellepelleten nu klar til analyse. Følg den relevante protokol, der kræves til analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Disse makroporøse alginatstilladser er nemme at fremstille og bør komme ud af fryseapparatet som porøse, fluffy og hvide skiver. Selvom det ikke er undersøgt i dette eksperiment, kan calciumalginatopløsning støbes i forskellige forme for at skabe stilladser i forskellige former afhængigt af brugerens behov 9,10. Stilladserne er elektrostatiske og kan klæbe til låget på brøndpladen eller til en behandsket finger. Figur 2 viser, hvordan stilladserne skal se ud, når de er færdige. Omtrentlige dimensioner af 24- og 48-brønds stilladser er også vist i figuren.
Figur 2: Billeder af tørre makroporøse alginatstilladser . (A) En 48-brønds plade fuld af stilladser. (B) En 24-brønds plade fuld af stilladser. (C) Sammenligning af et stillads med 48 brønde med et stillads med 24 brønde. Stillads dimensioner er også vist. Klik her for at se en større version af denne figur.
Stilladsernes porøsitet er meget vigtig for en vellykket transduktion, og vi har tidligere eksperimenteret med stilladsernes porøsitet. For mere information om porøsiteten, herunder SEM-billeder af stilladserne, henvises til papirer af Agarwalla et. al. i referencerne17,18.
Transduktionseffektivitet blev analyseret ved hjælp af flowcytometri, og resultaterne er vist i figur 3. Frosne PBMC'er fra samme donor blev aktiveret og brugt til alle eksperimentelle grupper. En protokol til aktivering af PBMC'er findes i supplerende fil 1, og enhver standardmetode til at aktivere T-celler og validere aktivering kan bruges21,22,23. De aktiverede PBMC'er blev podet på enten et stillads med GFP-kodende retrovirus eller et stillads uden virus, kaldet et "tomt" stillads. Aktiverede PBMC'er blev også podet på plader spinokuleret med retronectin og GFP-kodende retrovirus for at sammenligne transduktionseffektiviteten af alginatstilladserne med den konventionelle metode. Ikke-transducerede (NT) celler - aktiverede PBMC'er podet i ubelagte brønde i en 24-brøndsplade - blev brugt som den negative kontrolgruppe. Som forventet viste de ikke-transducerede celler og celler isoleret fra det tomme stillads ingen transduktion. Celler isoleret fra stilladset podet med aktiverede PBMC'er og GFP-retrovirus viste sammenlignelig transduktionseffektivitet med de retronectinbelagte plader. Stilladset havde en gennemsnitlig transduktionseffektivitet på 85%, lige under retronectingruppen. Disse resultater viser, at disse alginatstilladser tjener som et lettere og billigere alternativ til viralt transducerer T-celler uden behov for spinokulation af retronectin.
Figur 3: FACS-kvantificering af transduktionseffektivitet . (A) FACS-plots, der viser GFP-udtryk. Celler blev gated på levedygtige celler, FSC singlets og GFP positive celler. (B) Kvantificering af GFP-positive celler af FACS. Konventionel spinokulation af retronectinbelagte plader (lilla omvendt trekant) blev brugt som en positiv kontrol. Ikke-transducerede celler (blå cirkel) og aktiverede celler podet på alginatstilladserne uden virus (rød firkant) blev brugt som negative kontroller. Stilladser podet med aktiverede celler og GFP retrovirus (grøn trekant) havde en transduktionseffektivitet på 85%, sammenlignelig med retronectin. Data repræsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse med n = 4. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; FACS = fluorescensaktiveret cellesortering; SSC-A = side scatter-peak område; FSC = fremad spredning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Protokol til aktivering af celler. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S1: Billeder af tørre makroporøse alginatstilladser fremstillet ved -80 °C. Frysestilladser ved -80 °C fører til mindre ensartet stilladsudseende og -funktion, end når de fryses ved -20 °C. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CAR-T-celleterapi fortsætter med at få interesse for både forskning og kommercielle anvendelser. På trods af den succes, CAR-T-celleterapi har haft med at behandle blodkræft, begrænser de høje omkostninger ved proceduren dens anvendelse. Protokollen, der præsenteres her, introducerer en ny metode til viral genoverførsel af T-celler uden behov for spinokulation af retronectinbelagte plader. Fremstilling af tørre makroporøse alginatstilladser til mediering af transduktion er relativt enkel og er en passende billig erstatning for den konventionelle metode.
Lejlighedsvis kan stilladsudseende afvige fra dem, der er vist i figur 2, og kan i stedet virke klart og krystallinsk snarere end hvidt og luftigt. Dette kan forekomme ved inkonsekvent frysning ved -20 °C på grund af gentagen åbning af frysedøren, eller hvis pladen, der skal fryses, er isoleret ved at være ved siden af eller oven på omfangsrige genstande i fryseren. På trods af forskellen i udseende har vores laboratorium ikke oplevet nogen forskel i transduktionseffektivitet med de krystallinske stilladser. Selvom tidligere arbejde med kryogelation har brugt lavere frysetemperaturer24,25, fandt vi, at frysning ved lavere temperaturer fører til mindre ensartet stilladsudseende og funktion end ved frossen ved -20 ° C. Billeder af et stillads skabt ved frysning ved -80 °C findes i supplerende figur S1. Derfor anbefales det stadig, at stilladser fryses ved -20 °C med minimal forstyrrelse, og pladen placeres på en hylde, der tillader luftstrøm under pladen.
Selvom disse stilladser har vist fremragende transduktionseffektivitet, skal der bemærkes et par begrænsninger. For det første skal man være forsigtig, når man arbejder med EDTA, hvilket kan begrænse cellens levedygtighed, selv i små mængder. Derfor bør EDTA fjernes helt. Derudover vil stilladsstørrelsen begrænse mængden af væske, der kan absorberes, og dermed antallet af celler, der kan transduceres. Endelig kan denne protokol ikke bruges til at transducere ikke-aktiverede T-celler. Fremtidigt arbejde vil fokusere på rapportering af fremstilling af stilladser, der er i stand til samtidig medieret aktivering og spredning af celler, fremme kolokalisering af celler og virale partikler til transduktion og frigivelse af fuldt funktionelle transducerede celler in vivo18.
Offentliggjorte undersøgelser fra vores laboratorium rapporterer den fænotypiske analyse og funktionalitet af CAR-T-celler genereret ved hjælp af disse stilladser. De CD19-specifikke CAR-T-celler produceret af disse stilladser bevarede effektorfænotype og var i stand til at eliminere CD19+ Daudi-celler in vitro , når de blev samdyrket ved et 1: 5 effektor-til-mål-forhold17. CAR-T-cellerne, der dyrkes sammen med Daudi-celler, frigav også IL-2 og IFN-γ, som er proinflammatoriske cytokiner, der indikerer, at T-cellerne aktiveres. Disse resultater viser, at disse stilladser producerer yderst funktionelle CAR-T-celler in vitro. CAR-T-celler genereret af disse stilladser viste fremragende in vivo-antitumorfunktion mod CD19+ Daudi-celler mærket med firefly luciferase. CAR-T-cellerne kontrollerede effektivt tumorvæksten, forbedrede den samlede overlevelsesrate og viste ingen signifikante tegn på toksicitet17. Disse resultater indikerer, at disse stilladser kan bruges til genetisk modificering af celler til CAR-T-celleterapi uden at påvirke cellernes funktionalitet og antitumoraktivitet. Fremtidige undersøgelser med disse alginatstilladser involverer optimering af transduktionseffektivitet ved at justere makroporøsiteten samt alginat- og calciumkoncentrationer.
Afslutningsvis har disse makroporøse alginatstilladser en sammenlignelig transduktionseffektivitet med retronectin, hvilket giver en alternativ metode til transducering af celler til CAR-T-celleterapi. Disse stilladser producerer også fuldt funktionelle CAR-T-celler med antitumoraktivitet både in vitro og in vivo17. Drydux stilladser tilbyder en alternativ metode, der er enkel og billig til transducering af T-celler til brug i CAR-T-celleterapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
P.A. og Y.B. er opfindere på patenter relateret til brugen af biomaterialer til generering af CAR-T-celleterapi. Y.B. modtager en industrisponsoreret forskningsbevilling relateret til CAR-T-celleterapeutisk teknologi (ikke relateret til dette arbejde). Alle andre forfattere erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health gennem Grant Award Numbers R37-CA260223, R21CA246414. Vi takker NCSU-flowcytometrikernen for træning og vejledning i flowcytometrianalyse. Skemaer blev oprettet med Biorender.com
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | 15575-038 | UltraPure, pH 8.0 |
| 1x DPBS | Gibco | 14190-144 | No calcium chloride or magnesium chloride |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies Inc | 07060 | |
| Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells | - | - | Fresh or frozen |
| Calcium-D-Gluconate | Alfa Aesar | A11649 | |
| CD28.2 Antibody | BD | 555725 | 1 mg/mL |
| CD3 Antibody | Miltenyi | 130-093-387 | 100 μg/mL |
| Click's Media | FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS | 9195 | |
| DI Water | - | - | |
| Glutamax | Gibco | 35-050-061 | |
| HyClone FBS | Cytvia | SH3039603 | |
| HyClone RPMI 1640 Media | Cytvia | SH3009601 | |
| Penicillin-streptomycin (P/S) | Gibco | 15-140-122 | |
| Peripheral Blood Mononuclear Cells | - | - | Fresh or frozen |
| PRONOVA UP MVG | NovaMatrix | 4200101 | Sodium alginate |
| Recombinant Human IL-15 | Peprotech | 200-15 | 5 ng/mL |
| Recombinant Human IL-7 | Peprotech | 200-07 | 10 ng/mL |
| Retrovirus | - | - | 1 x 106 TU/mL |
References
- Prinzing, B. L., Gottschalk, S. M., Krenciute, G. C. A. R. T-cell therapy for glioblastoma: ready for the next round of clinical testing. Expert Review of Anticancer Therapy. 18 (5), 451-461 (2018).
- Bagley, S. J., Desai, A. S., Linette, G. P., June, C. H., O'Rourke, D. M. CAR T-cell therapy for glioblastoma: recent clinical advances and future challenges. Neuro-oncology. 20 (11), 1429-1438 (2018).
- Nair, R., Westin, J.
- Jackson, H. J., Rafiq, S., Brentjens, R. J.
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer Journal. 11 (4), 69 (2021).
- Miliotou, A. N., Papadopoulou, L. C. CAR T-cell therapy: A new era in cancer immunotherapy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 19 (1), 5-18 (2018).
- Lee, H. -J., et al. Retronectin enhances lentivirus-mediated gene delivery into hematopoietic progenitor cells. Biologicals: Journal of the International Association of Biological Standardization. 37 (4), 203-209 (2009).
- Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).
- Sun, J., Tan, H. Alginate-based biomaterials for regenerative medicine applications. Materials. 6 (4), 1285-1309 (2013).
- Nayak, A. K., Mohanta, B. C., Hasnain, M. S., Hoda, M. N., Tripathi, G. Chapter 14 - Alginate-based scaffolds for drug delivery in tissue engineering. Alginates in Drug Delivery. , 359-386 (2020).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Alginate: properties and biomedical applications. Progress in Polymer Science. 37 (1), 106-126 (2012).
- Kuo, C. K., Ma, P. X. Ionically crosslinked alginate hydrogels as scaffolds for tissue engineering: part 1. Structure, gelation rate and mechanical properties. Biomaterials. 22 (6), 511-521 (2001).
- Soccol, C., et al.
- Moody, C. T., et al. Restoring carboxylates on highly modified alginates improves gelation, tissue retention and systemic capture. Acta Biomaterialia. 138, 208-217 (2022).
- Brudno, Y., et al. Replenishable drug depot to combat post-resection cancer recurrence. Biomaterials. 178, 373-382 (2018).
- Moody, C. T., Palvai, S., Brudno, Y. Click cross-linking improves retention and targeting of refillable alginate depots. Acta Biomaterialia. 112, 112-121 (2020).
- Agarwalla, P., et al. Scaffold-mediated static transduction of T Cells for CAR-T Cell therapy. Advanced Healthcare Materials. 9 (14), 2000275 (2020).
- Agarwalla, P., et al. Bioinstructive implantable scaffolds for rapid in vivo manufacture and release of CAR-T cells. Nature Biotechnology. 40 (8), 1250-1258 (2022).
- Vera, J., et al. T lymphocytes redirected against the kappa light chain of human immunoglobulin efficiently kill mature B lymphocyte-derived malignant cells. Blood. 108 (12), 3890-3897 (2006).
- PRONOVA UP MVG. IFF Nutrition Norge AS. , Available from: https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/ (2022).
- Zappasodi, R., Budhu, S., Abu-Akeel, M., Merghoub, T. In vitro assays for effector T cell functions and activity of immunomodulatory antibodies. Methods in Enzymology. 631, 43-59 (2020).
- Kong, B. S., Lee, C., Cho, Y. M. Protocol for the assessment of human T cell activation by real-time metabolic flux analysis. STAR Protocols. 3 (1), 101084 (2022).
- Bio-Rad cell activation protocols. Bio-Rad. , Available from: https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24. ecommerce2&evCntryLang=US-en&cntry= US&thirdPartyCookieEnabled=true (2022).
- Lin, H. -R., Yeh, Y. -J. Porous alginate/hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering: Preparation, characterization, andin vitro studies. Journal of Biomedical Materials Research. 71 (1), 52-65 (2004).
- Wu, J., Zhao, Q., Sun, J., Zhou, Q. Preparation of poly(ethylene glycol) aligned porous cryogels using a unidirectional freezing technique. Soft Matter. 8 (13), 3620 (2012).
