Summary
Aqui está um protocolo para a criação de andaimes de alginato macroporoso secos que medeiam a transferência eficiente de genes virais para uso em engenharia genética de células T, incluindo células T para terapia com células CAR-T. Os andaimes demonstraram transduzir células T primárias ativadas com transdução de >85%.
Abstract
A engenharia genética de células T para terapia com células CAR-T chegou à vanguarda do tratamento do câncer nos últimos anos. As células CAR-T são produzidas pela transferência de genes virais para as células T. O atual padrão-ouro de transferência de genes virais envolve a espinoculação de placas revestidas de retronectina, o que é caro e demorado. Há uma necessidade significativa de métodos eficientes e econômicos para gerar células CAR-T. Descrito aqui é um método para a fabricação de andaimes de alginato macroporosos secos e baratos, conhecidos como andaimes Drydux, que promovem eficientemente a transdução viral de células T ativadas. Os andaimes são projetados para serem usados no lugar da espinoculação padrão-ouro de placas revestidas de retronectina semeadas com vírus e simplificam o processo de transdução de células. O alginato é reticulado com cálcio-D-gluconato e congelado durante a noite para criar os andaimes. Os andaimes congelados são liofilizados em um liofilizador por 72 h para completar a formação dos andaimes macroporosos secos. Os andaimes mediam a transferência de genes virais quando o vírus e as células T ativadas são semeados juntos no topo do andaime para produzir células geneticamente modificadas. Os andaimes produzem >85% de transdução primária de células T, o que é comparável à eficiência de transdução da espinoculação em placas revestidas de retronectina. Estes resultados demonstram que os andaimes de alginato macroporoso secos servem como uma alternativa mais barata e conveniente ao método de transdução convencional.
Introduction
A imunoterapia emergiu como um paradigma revolucionário de tratamento do câncer devido à sua capacidade de atingir especificamente tumores, limitar a citotoxicidade fora do alvo e prevenir a recaída. Particularmente, a terapia celular com receptor de antígeno quimérico T (CAR-T) ganhou popularidade devido ao seu sucesso no tratamento de linfomas e leucemias. A FDA aprovou a primeira terapia com células CAR-T em 2017 e, desde então, aprovou mais quatro terapias com células CAR-T 1,2,3,4,5. Os CARs têm um domínio de reconhecimento de antígeno geralmente consistindo de um fragmento variável de cadeia única de um anticorpo monoclonal que é específico para um antígeno associado ao tumor 3,4. Quando um CAR interage com seu antígeno associado ao tumor, as células CAR-T são ativadas, levando a uma resposta antitumoral envolvendo liberação de citocinas, degranulação citolítica, expressão do fator de transcrição e proliferação de células T. Para produzir células CAR-T, o sangue é coletado do paciente para obter suas células T. Os CARs são geneticamente adicionados às células T do paciente usando um vírus. As células CAR-T são cultivadas in vitro e infundidas de volta no paciente 2,3,4,6. A geração bem-sucedida de células CAR-T é determinada pela eficiência de transdução, que descreve o número de células T que são geneticamente modificadas em células CAR-T.
Atualmente, o padrão-ouro para a geração de células CAR-T é a espinoculação de células T ativadas e vírus em placas revestidas de retronectina 7,8. A transdução começa quando as partículas virais se envolvem com a superfície das células T. A retronectina promove a colocalização de vírus e células, aumentando a eficiência de ligação entre as partículas virais e as células, aumentando a transdução 7,8. A retronectina não funciona bem por si só e precisa ser acompanhada de espinoculação, o que aumenta a transferência gênica, concentrando as partículas virais e aumentando a permeabilidade superficial da célula T, permitindo uma infecção viral mais fácil8. Apesar do sucesso da espinoculação em placas revestidas de retronectina, é um processo complexo que requer múltiplos ciclos de rotação e reagentes caros. Portanto, métodos alternativos para a transferência de genes virais que são mais rápidos e mais baratos são altamente desejáveis.
O alginato é um polissacarídeo aniônico natural amplamente utilizado na indústria biomédica devido ao seu baixo custo, bom perfil de segurança e capacidade de formar hidrogéis após a mistura com cátions divalentes 9,10,11,12. O alginato é um polímero compatível com GMP e é geralmente reconhecido como seguro (GRAS) pela FDA13. A reticulação do alginato com cátions cria hidrogéis estáveis frequentemente utilizados na cicatrização de feridas, na entrega de pequenas drogas químicas e proteínas e no transporte celular 9,10,11,12,14,15,16. Devido às suas excelentes propriedades gelificantes, o alginato é o material preferido para criar andaimes porosos por liofilização10,17. Essas características do alginato o tornam um candidato atraente para a produção de um andaime que pode mediar a transferência de genes virais de células ativadas.
Descreve-se aqui um protocolo para a confecção de andaimes de alginato macroporoso secos, conhecidos como andaimes de Drydux, que transduziram estaticamente células T por transferência de genes virais17,18. O processo de fabricação desses andaimes é mostrado na Figura 1. Esses andaimes eliminam a necessidade de espinoculação de placas revestidas de retronectina. Os andaimes de alginato macroporoso estimulam a interação de partículas virais e células T para permitir a transferência eficiente de genes em uma única etapa, sem afetar a funcionalidade e a viabilidade das células T modificadas17. Quando seguidos corretamente, esses andaimes de alginato macroporoso têm uma eficiência de transdução de pelo menos 80%, simplificando e encurtando o processo de transdução viral.
Figura 1: Esquema e linha do tempo do protocolo. (A) Linha do tempo para fazer os andaimes secos de alginato macroporoso. O alginato é reticulado com cálcio-D-gluconato e congelado durante a noite. Os andaimes congelados são liofilizados por 72 h para criar os andaimes Drydux. (B) Cronograma para transdução viral de células ativadas. As células ativadas e o vírus (MOI 2) são semeados no topo do andaime e incubados em meio completo suplementado com IL-7 e IL-15. Os andaimes absorvem a mistura e promovem a transferência de genes virais. O EDTA é usado para dissolver os andaimes e isolar as células transduzidas. Após a lavagem duas vezes com PBS, o pellet celular pode ser usado para análise. Abreviaturas: PBS = solução salina tamponada com fosfato; PBMCs = células mononucleares do sangue periférico. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
Todos os procedimentos envolvendo células de primazia humana e vetores retrovirais foram realizados em conformidade com as diretrizes de Segurança Biológica da Universidade Estadual da Carolina do Norte e aprovados pelo Escritório de Saúde e Segurança Ambiental. As células mononucleares do sangue periférico humano foram compradas como casacos de buffy de fontes comerciais. As células humanas primárias devem ser isoladas de frações de pelagem humana e requerem autorização de nível 2 de biossegurança e procedimentos operacionais padrão detalhados e aprovação da instituição onde o trabalho deve ocorrer. Os vetores virais, incluindo os sobrenadantes vetoriais retrovirais utilizados para a transdução preparada conforme descrito anteriormente19, podem ser classificados como Nível de Biossegurança 1 ou Nível de Biossegurança 2, dependendo da proteína codificada e requerem aprovação do comitê de biossegurança institucional relevante.
1. Fazendo os andaimes de alginato macroporoso
- Preparar uma solução-mãe de gluconato D de cálcio a 0,4% (peso por volume) adicionando água desionizada filtrada estéril ao gluconato de cálcio D num copo. Mexa em velocidade média até que o gluconato de cálcio tenha se dissolvido (~1,5 h), filtro estéril e armazenar à temperatura ambiente.
NOTA: Não é necessário verificar o pH da solução. - Prepare uma solução de alginato a 2% (peso por volume) num frasco para injetáveis ou copo de tampa de rosca. Adicione cuidadosamente o alginato ultrapuro ao recipiente e adicione água deionizada filtrada estéril ao alginato. Escolha a maior barra de agitação possível que não impeça a mistura e adicione-a ao recipiente.
NOTA: Informações sobre o tipo de alginato ultrapuro utilizado para este protocolo podem ser encontradas na Tabela de Materiais e no site da Novamatrix20. Diferentes alginatos não foram explorados para esses andaimes, pois podem levar a mudanças indesejadas na porosidade e biocompatibilidade dos andaimes 9,10,11. - Mexa a solução a alta velocidade até que o alginato se dissolva (~1 h). Se houver grandes aglomerados nas laterais do vaso, incline o vaso para desalojá-los. Pequenas quantidades de alginato nos lados se dissolverão durante a agitação e não são motivo de preocupação.
NOTA: Não é necessário verificar o pH da solução. - Quando o alginato se dissolver, reduza a velocidade de agitação, adicione lentamente um volume igual de gluconato D de cálcio a 0,4% à solução de alginato para evitar a formação de aglomerados de reticulação e mexa vigorosamente por 15 min.
- Incline o copo ou o frasco para injetáveis para os lados para remover quaisquer aglomerados que possam ter se formado.
NOTA: Recomenda-se usar um homogeneizador. A solução final deve ser opticamente clara. - Pipetar o volume desejado da solução para cada poço de uma placa de 48 poços ou de 24 poços. Use 300 μL/poço para uma placa de 48 poços e 1 mL/poço para uma placa de 24 poços. Lance devagar e mude as pontas com frequência, pois a solução será viscosa e grudará na ponta.
- Cobrir as placas com tampas e congelar durante a noite a -20 °C.
- Prepare a placa para o liofilizador, removendo a tampa e prendendo o topo com lenços umedecidos e elásticos. Colocar as placas em frascos de liofilizador de 750 mL a 2.000 mL e colocar no liofilizador por 72 h.
- Após 72 h, retire a placa do liofilizador e substitua a tampa. Selar a placa e conservar a 4 °C. Para armazenamento a longo prazo, sele a vácuo a placa antes de armazenar a 4 °C. Mantenha seco até que seja necessário.
NOTA: Faça uma solução extra de cálcio-alginato devido a erro de volume (alguns aderem às paredes do frasco para injetáveis, pontas de pipeta). Por exemplo, para fazer quatro andaimes em uma placa de 24 poços, são necessários 4 mL de solução combinada (2 mL de alginato + 2 mL de gluconato de cálcio D), mas recomenda-se preparar 2,5 mL de solução de alginato a 2% e 2,5 mL de solução de gluconato D de cálcio a 0,4%.
2. Transdução
- Concentração de sobrenadante viral utilizando filtros de 100 kDa
- Hidrate o filtro centrífugo por 2 min com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x. Descartar o PBS.
- Concentrar a suspensão viral adicionando 2 mL de suspensão viral (1 × 106 TU/mL) e centrifugando-a através do filtro centrífugo a 1.500 × g por 10 min em um rotor de caçamba oscilante.
NOTA: Um a duzentos microlitros de vírus concentrado é necessário por andaime. - Gire por alguns minutos adicionais se o volume concentrado de suspensão do vírus for maior que 200 μL.
- Repita as etapas 2.1.1-2.1.3 para cada andaime.
NOTA: É igualmente aceitável concentrar uma grande unidade populacional de vírus e retirar alíquotas de 100-200 μL da unidade populacional concentrada.
- Células ativadas por sementes e vírus juntos.
- Para cada andaime, preparar uma alíquota suspendendo 1 × 106 células mononucleares ativadas do sangue periférico (PBMCs) em 50 μL de meio de cultura celular completo (250 mL de meio de clique + 250 mL de RPMI 1640 meios + 50 mL de soro fetal bovino + 5 mL de substituto de glutamina + 5 mL de penicilina/estreptomicina).
Observação : consulte Arquivo suplementar 1 para obter um protocolo sobre como ativar PBMCs. - Adicione o sobrenadante viral concentrado (~2 × 106 TU, MOI 2) à suspensão celular. O volume total da suspensão do vírus celular não deve exceder 200 μL para um andaime de 48 poços ou 350 μL para um andaime de 24 poços.
- Adicione a mistura célula-vírus gota a gota na parte superior do andaime seco. Para experimentos de controle negativo, use meios de cultura celular completos no lugar do vírus concentrado. Adicione a suspensão da célula à parte superior do andaime seco.
- Repita as etapas 2.2.1-2.2.3 para cada andaime.
- Incubar os andaimes numa incubadora de cultura celular a 37 °C durante 45-60 min. Remova os andaimes da incubadora; os andaimes absorverão totalmente a solução durante este tempo.
- Para induzir a proliferação, adicionar meios de cultura celular completos suplementados com IL-15 (5 ng/mL) e IL-7 (10 ng/mL) a cada poço; IL-2 também pode ser usado. Adicione 500 μL a cada andaime de 48 poços ou 1 mL a cada andaime de 24 poços.
- Incubar os andaimes a 37 °C durante 72 h. À medida que as células proliferam, a mídia se tornará laranja.
- Para cada andaime, preparar uma alíquota suspendendo 1 × 106 células mononucleares ativadas do sangue periférico (PBMCs) em 50 μL de meio de cultura celular completo (250 mL de meio de clique + 250 mL de RPMI 1640 meios + 50 mL de soro fetal bovino + 5 mL de substituto de glutamina + 5 mL de penicilina/estreptomicina).
- Isole as células dos andaimes para análise.
- Diluir 0,5 M EDTA a 0,25 M EDTA em 1x PBS.
- Remova o excesso de meio de cada poço e colete em tubos de centrífuga separados de 15 mL.
- Para isolar as células do andaime, adicione 0,25 M EDTA a cada andaime. Adicione 300 μL a andaimes de 48 poços ou 1 mL a andaimes de 24 poços. Deixe a placa descansar ou agitar suavemente por 3-4 min.
- Uma vez que o andaime esteja praticamente dissolvido, pipete para dentro e para fora suavemente dentro do poço. Algumas etapas de pipetagem de entrada e saída podem ser necessárias para dissolver completamente o andaime. Se não se dissolver em 10 min, adicione mais 200 μL de 0,25 M EDTA.
- Uma vez que o andaime se dissolva completamente, transfira a solução para um tubo de centrífuga de 15 mL.
- Repita as etapas 2.3.4 e 2.3.5 para cada andaime.
- Lavar as células duas vezes adicionando 12 mL de PBS a cada tubo de centrífuga e centrifugando a 400 × g por 5 min. Um pellet de célula se formará na parte inferior de cada tubo. Aspirar o sobrenadante e repetir a lavagem. Tenha o cuidado de aspirar totalmente o sobrenadante a cada lavagem, pois é crucial remover todo o EDTA.
- Após a segunda lavagem com PBS, o pellet celular está agora pronto para análise. Siga o protocolo apropriado necessário para a análise.
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Representative Results
Esses andaimes de alginato macroporoso são fáceis de fazer e devem sair do liofilizador como discos porosos, macios e brancos. Embora não estudada neste experimento, a solução de alginato de cálcio pode ser fundida em diferentes moldes para criar andaimes de formas variadas, dependendo das necessidades do usuário 9,10. Os andaimes são eletrostáticos e podem aderir à tampa da placa do poço ou a um dedo enluvado. A Figura 2 demonstra como os andaimes devem ficar após a conclusão. As dimensões aproximadas dos andaimes de 24 e 48 poços também são mostradas na figura.
Figura 2: Imagens de andaimes secos de alginato macroporoso. (A) Uma placa de 48 poços cheia de andaimes. (B) Uma placa de 24 poços cheia de andaimes. (C) Comparando um andaime de 48 poços com um andaime de 24 poços. As dimensões do andaime também são mostradas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A porosidade dos andaimes é altamente importante para o sucesso da transdução, e já experimentamos anteriormente a porosidade dos andaimes. Para obter mais informações sobre a porosidade, incluindo imagens SEM dos andaimes, consulte os artigos de Agarwalla et. al. nas referências17,18.
A eficiência da transdução foi analisada por citometria de fluxo e os resultados são apresentados na Figura 3. PBMCs congelados do mesmo doador foram ativados e utilizados para todos os grupos experimentais. Um protocolo para ativar PBMCs pode ser encontrado no Arquivo Suplementar 1, e qualquer método padrão para ativar células T e validar a ativação pode ser usado21,22,23. Os PBMCs ativados foram semeados em um andaime com retrovírus codificador de GFP ou em um andaime sem vírus, denominado andaime "em branco". Os PBMCs ativados também foram semeados em placas espinoculadas com retrovírus codificador de retronectina e GFP para comparar a eficiência de transdução dos andaimes de alginato com o método convencional. Células não transduzidas (NT) - PBMCs ativadas semeadas em poços não revestidos de uma placa de 24 poços - foram usadas como grupo controle negativo. Como esperado, as células não transduzidas e as células isoladas do andaime em branco não apresentaram transdução. Células isoladas do andaime semeado com PBMCs ativados e retrovírus GFP apresentaram eficiência de transdução comparável às placas revestidas de retronectina. O andaime apresentou eficiência média de transdução de 85%, logo abaixo do grupo retronectina. Esses resultados demonstram que esses andaimes de alginato servem como uma alternativa mais fácil e barata para transduzir células T por via viral sem a necessidade de espinoculação de retronectina.
Figura 3: Quantificação da eficiência de transdução do FACS . (A) Gráficos FACS mostrando a expressão da GFP. As células foram fechadas em células viáveis, singletos FSC e células GFP positivas. (B) Quantificação de células GFP-positivas pelo FACS. A espinoculação convencional de placas revestidas de retronectina (triângulo invertido roxo) foi utilizada como controle positivo. Células não transduzidas (círculo azul) e células ativadas semeadas nos andaimes de alginato sem vírus (quadrado vermelho) foram utilizadas como controles negativos. Andaimes semeados com células ativadas e retrovírus GFP (triângulo verde) tiveram uma eficiência de transdução de 85%, comparável à retronectina. Dados representados como média ± desvio padrão com n = 4. Abreviaturas: GFP = proteína verde fluorescente; FACS = classificação celular ativada por fluorescência; SSC-A = área de dispersão lateral e pico; FSC = dispersão para a frente. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo suplementar 1: Protocolo para ativação de células. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar S1: Imagens de andaimes secos de alginato macroporoso fabricados a -80 °C. O congelamento de andaimes a -80 °C conduz a uma aparência e função de andaimes menos consistentes do que quando congelados a -20 °C. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
A terapia celular CAR-T continua a ganhar interesse tanto para pesquisas quanto para aplicações comerciais. Apesar do sucesso que a terapia com células CAR-T teve no tratamento de cânceres no sangue, o alto custo do procedimento limita seu uso. O protocolo aqui apresentado introduz um novo método para a transferência de genes virais de células T sem a necessidade de espinoculação de placas revestidas de retronectina. A produção de andaimes de alginato macroporoso secos para mediar a transdução é relativamente simples e é um substituto adequado de baixo custo para o método convencional.
Ocasionalmente, a aparência do andaime pode diferir daquelas mostradas na Figura 2 e, em vez disso, pode parecer clara e cristalina, em vez de branca e fofa. Isso pode ocorrer a partir de congelamento inconsistente a -20 °C devido à abertura repetida da porta do freezer ou se a placa a ser congelada estiver isolada por estar ao lado ou em cima de itens volumosos no freezer. Apesar da diferença na aparência, nosso laboratório não experimentou nenhuma diferença na eficiência de transdução com os andaimes cristalinos. Embora trabalhos anteriores sobre criogelação tenham utilizado temperaturas de congelamento mais baixas24,25, descobrimos que o congelamento a temperaturas mais baixas leva a uma aparência e função de andaimes menos consistentes do que quando congelado a -20 °C. Imagens de um andaime criado por congelamento a -80 °C podem ser encontradas na Figura Suplementar S1. Portanto, ainda é recomendável que os andaimes sejam congelados a -20 °C com o mínimo de interrupção, e a placa deve ser colocada em uma prateleira estilo rack que permita o fluxo de ar sob a placa.
Embora esses andaimes tenham mostrado excelente eficiência de transdução, algumas limitações devem ser observadas. Primeiro, deve-se ter cuidado ao trabalhar com EDTA, que pode limitar a viabilidade celular, mesmo em pequenas quantidades. Portanto, o EDTA deve ser completamente removido. Além disso, o tamanho do andaime limitará a quantidade de líquido que pode ser absorvido e, portanto, o número de células que podem ser transduzidas. Finalmente, este protocolo não pode ser usado para transduzir células T não ativadas. Trabalhos futuros se concentrarão em relatar a fabricação de andaimes capazes de ativação e proliferação de células mediadas simultaneamente, promovendo a colocalização de células e partículas virais para transdução e liberando células transduzidas totalmente funcionais in vivo18.
Estudos publicados por nosso laboratório relatam a análise fenotípica e a funcionalidade das células CAR-T geradas usando esses andaimes. As células CAR-T CD19-específicas produzidas por esses andaimes mantiveram o fenótipo efetor e foram capazes de eliminar células Daudi CD19+ in vitro quando co-cultivadas em uma relação efetor / alvo de 1:517. As células CAR-T co-cultivadas com células Daudi também liberaram IL-2 e IFN-γ, que são citocinas pró-inflamatórias que indicam que as células T estão ativadas. Estes resultados demonstram que estes andaimes produzem células CAR-T altamente funcionais in vitro. As células CAR-T geradas por esses andaimes mostraram excelente função antitumoral in vivo contra células CD19+ Daudi marcadas com luciferase de vagalume. As células CAR-T controlaram efetivamente o crescimento tumoral, melhoraram a sobrevida global e não mostraram sinais significativos de toxicidade17. Esses resultados indicam que esses andaimes podem ser usados para modificar geneticamente células para terapia com células CAR-T sem afetar a funcionalidade e a atividade antitumoral das células. Estudos futuros com esses andaimes de alginato envolvem a otimização da eficiência da transdução ajustando a macroporosidade, bem como as concentrações de alginato e cálcio.
Em conclusão, esses andaimes de alginato macroporoso têm uma eficiência de transdução comparável à retronectina, fornecendo um método alternativo para a transdução de células para a terapia com células CAR-T. Esses andaimes também produzem células CAR-T totalmente funcionais com atividade antitumoral in vitro e in vivo17. Os andaimes Drydux oferecem um método alternativo que é simples e barato para transduzir células T para uso em terapias com células CAR-T.
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Disclosures
P.A. e Y.B. são inventores de patentes relacionadas ao uso de biomateriais para geração de terapias com células CAR-T. Y.B. recebe uma bolsa de pesquisa patrocinada pela indústria relacionada à tecnologia terapêutica de células CAR-T (não relacionada a este trabalho). Todos os outros autores declaram que não têm interesses concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde através dos Números de Concessão R37-CA260223, R21CA246414. Agradecemos ao núcleo de citometria de fluxo da NCSU pelo treinamento e orientação na análise da citometria de fluxo. Os esquemas foram criados com Biorender.com
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | 15575-038 | UltraPure, pH 8.0 |
| 1x DPBS | Gibco | 14190-144 | No calcium chloride or magnesium chloride |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies Inc | 07060 | |
| Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells | - | - | Fresh or frozen |
| Calcium-D-Gluconate | Alfa Aesar | A11649 | |
| CD28.2 Antibody | BD | 555725 | 1 mg/mL |
| CD3 Antibody | Miltenyi | 130-093-387 | 100 μg/mL |
| Click's Media | FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS | 9195 | |
| DI Water | - | - | |
| Glutamax | Gibco | 35-050-061 | |
| HyClone FBS | Cytvia | SH3039603 | |
| HyClone RPMI 1640 Media | Cytvia | SH3009601 | |
| Penicillin-streptomycin (P/S) | Gibco | 15-140-122 | |
| Peripheral Blood Mononuclear Cells | - | - | Fresh or frozen |
| PRONOVA UP MVG | NovaMatrix | 4200101 | Sodium alginate |
| Recombinant Human IL-15 | Peprotech | 200-15 | 5 ng/mL |
| Recombinant Human IL-7 | Peprotech | 200-07 | 10 ng/mL |
| Retrovirus | - | - | 1 x 106 TU/mL |
References
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