Summary
Hierin is een protocol voor het maken van droge macroporeuze alginaatsteigers die efficiënte virale genoverdracht bemiddelen voor gebruik bij genetische manipulatie van T-cellen, inclusief T-cellen voor CAR-T-celtherapie. De scaffolds bleken geactiveerde primaire T-cellen te transduceren met >85% transductie.
Abstract
Genetische manipulatie van T-cellen voor CAR-T-celtherapie is de afgelopen jaren op de voorgrond van de behandeling van kanker gekomen. CAR-T-cellen worden geproduceerd door virale genoverdracht naar T-cellen. De huidige gouden standaard van virale genoverdracht omvat spinoculatie van retronectine-gecoate platen, wat duur en tijdrovend is. Er is een aanzienlijke behoefte aan efficiënte en kosteneffectieve methoden om CAR-T-cellen te genereren. Hier beschreven is een methode voor het fabriceren van goedkope, droge macroporeuze alginaatsteigers, bekend als Drydux-steigers, die efficiënt virale transductie van geactiveerde T-cellen bevorderen. De steigers zijn ontworpen om te worden gebruikt in plaats van gouden standaard spinoculatie van retronectine-gecoate platen bezaaid met virus en vereenvoudigen het proces voor het transduceren van cellen. Alginaat wordt verknoopt met calcium-D-gluconaat en 's nachts ingevroren om de steigers te creëren. De bevroren steigers worden gedurende 72 uur gevriesdroogd in een lyofilisator om de vorming van de droge macroporeuze steigers te voltooien. De scaffolds bemiddelen virale genoverdracht wanneer virus- en geactiveerde T-cellen samen bovenop de steiger worden gezaaid om genetisch gemodificeerde cellen te produceren. De steigers produceren >85% primaire T-celtransductie, wat vergelijkbaar is met de transductie-efficiëntie van spinoculatie op retronectine-gecoate platen. Deze resultaten tonen aan dat droge macroporeuze alginaatsteigers dienen als een goedkoper en handiger alternatief voor de conventionele transductiemethode.
Introduction
Immunotherapie is naar voren gekomen als een revolutionair paradigma voor de behandeling van kanker vanwege het vermogen om zich specifiek op tumoren te richten, off-target cytotoxiciteit te beperken en terugval te voorkomen. Met name chimere antigeenreceptor T (CAR-T) celtherapie heeft aan populariteit gewonnen vanwege het succes bij de behandeling van lymfomen en leukemieën. De FDA keurde de eerste CAR-T-celtherapie in 2017 goed en heeft sindsdien nog vier CAR-T-celtherapieëngoedgekeurd 1,2,3,4,5. CARs hebben een antigeenherkenningsdomein dat meestal bestaat uit een enkelketenvariabel fragment van een monoklonaal antilichaam dat specifiek is voor een tumorgeengeassocieerd antigeen 3,4. Wanneer een CAR interageert met zijn tumor-geassocieerde antigeen, worden de CAR-T-cellen geactiveerd, wat leidt tot een antitumorrespons met cytokine-afgifte, cytolytische degranulatie, transcriptiefactorexpressie en T-celproliferatie. Om CAR-T-cellen te produceren, wordt bloed verzameld van de patiënt om hun T-cellen te verkrijgen. CARs worden genetisch toegevoegd aan de T-cellen van de patiënt met behulp van een virus. De CAR-T-cellen worden in vitro gekweekt en terug toegediend aan patiënt 2,3,4,6. Succesvolle generatie van CAR-T-cellen wordt bepaald door de transductie-efficiëntie, die het aantal T-cellen beschrijft dat genetisch is gemodificeerd tot CAR-T-cellen.
Momenteel is de gouden standaard voor CAR-T-celgeneratie spinoculatie van geactiveerde T-cellen en virus op retronectine-gecoate platen 7,8. Transductie begint wanneer virale deeltjes zich bezighouden met het oppervlak van de T-cellen. Retronectine bevordert de colocalisatie van virus en cellen door de bindingsefficiëntie tussen de virale deeltjes en de cellen te verhogen, waardoor de transductie wordt verbeterd 7,8. Retronectine werkt op zichzelf niet goed en moet gepaard gaan met spinoculatie, wat de genoverdracht verbetert door de virale deeltjes te concentreren en de oppervlaktedoorlaatbaarheid van de T-cel te vergroten, waardoor virale infectie gemakkelijkerwordt 8. Ondanks het succes van spinoculatie op retronectine-gecoate platen, is het een complex proces dat meerdere spincycli en dure reagentia vereist. Daarom zijn alternatieve methoden voor virale genoverdracht die sneller en goedkoper zijn, zeer wenselijk.
Alginaat is een natuurlijke anionische polysaccharide die op grote schaal wordt gebruikt in de biomedische industrie vanwege de lage kosten, het goede veiligheidsprofiel en het vermogen om hydrogels te vormen bij het mengen met tweewaardige kationen 9,10,11,12. Alginaat is een GMP-conform polymeer en wordt algemeen erkend als veilig (GRAS) door de FDA13. Cross-linking alginaat met kationen creëert stabiele hydrogels die vaak worden gebruikt bij wondgenezing, levering van kleine chemische geneesmiddelen en eiwitten en celtransport 9,10,11,12,14,15,16. Vanwege de uitstekende geleereigenschappen is alginaat het voorkeursmateriaal om poreuze steigers te creëren door10,17 te vriesdrogen. Deze kenmerken van alginaat maken het een aantrekkelijke kandidaat voor het produceren van een steiger die virale genoverdracht van geactiveerde cellen kan bemiddelen.
Hier beschreven is een protocol voor het maken van droge macroporeuze alginaatsteigers, bekend als Drydux-steigers, die T-cellen statisch transduceren door virale genoverdracht17,18. Het proces voor het maken van deze steigers is weergegeven in figuur 1. Deze steigers elimineren de noodzaak van spinoculatie van retronectine-gecoate platen. De macroporeuze alginaatsteigers moedigen de interactie van virale deeltjes en T-cellen aan om efficiënte genoverdracht in één stap mogelijk te maken zonder de functionaliteit en levensvatbaarheid van de gemanipuleerde T-cellen te beïnvloeden17. Indien correct gevolgd, hebben deze macroporeuze alginaatsteigers een transductie-efficiëntie van ten minste 80%, waardoor het virale transductieproces wordt vereenvoudigd en verkort.
Figuur 1: Schema en tijdlijn van het protocol. (A) Tijdlijn voor het maken van de droge macroporeuze alginaatsteigers. Alginaat is verknoopt met calcium-D-gluconaat en wordt 's nachts ingevroren. De bevroren steigers worden gedurende 72 uur gelyofiliseerd om de Drydux-steigers te creëren. (B) Tijdlijn voor virale transductie van geactiveerde cellen. Geactiveerde cellen en virussen (MOI 2) worden bovenop de steiger gezaaid en geïncubeerd in volledige media aangevuld met IL-7 en IL-15. De steigers absorberen het mengsel en bevorderen de virale genoverdracht. EDTA wordt gebruikt om de steigers op te lossen en de getransduceerde cellen te isoleren. Na twee keer wassen met PBS kan de celpellet worden gebruikt voor analyse. Afkortingen: PBS = fosfaat-gebufferde zoutoplossing; PBMC's = perifere mononucleaire bloedcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures met menselijke primaatcellen en retrovirale vectoren werden uitgevoerd in overeenstemming met de biologische veiligheidsrichtlijnen van de North Carolina State University en goedgekeurd door het Environmental Health and Safety Office. Menselijke perifere bloed mononucleaire cellen werden gekocht als buffy jassen van commerciële bronnen. Primaire menselijke cellen moeten worden geïsoleerd uit menselijke buffy vachtfracties en vereisen bioveiligheidsniveau 2-goedkeuring en gedetailleerde standaardwerkprocedures en goedkeuring van de instelling waar het werk zal plaatsvinden. Virale vectoren, met inbegrip van de retrovirale vectorsupernatanten die worden gebruikt voor de transductie die zijn bereid zoals eerder beschreven19, kunnen worden geclassificeerd als bioveiligheidsniveau 1 of bioveiligheidsniveau 2, afhankelijk van het gecodeerde eiwit en vereisen goedkeuring van het relevante institutionele bioveiligheidscomité.
1. Het maken van de macroporeuze alginaatsteigers
- Bereid een stamoplossing van 0,4% (gewicht per volume) calcium D-gluconaat door steriel gefilterd gedeïoniseerd water toe te voegen aan calcium D-gluconaat in een bekerglas. Roer op gemiddelde snelheid totdat het calciumgluconaat is opgelost (~ 1,5 uur), steriel filter en bewaar bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Het is niet nodig om de pH van de oplossing te controleren. - Bereid een oplossing van 2% (gewicht per volume) alginaat in een injectieflacon met schroefdop of bekerglas. Voeg voorzichtig het ultrazuivere alginaat toe aan het vat en voeg steriel gefilterd gedeïoniseerd water toe aan het alginaat. Kies de grootst mogelijke roerstaaf die het mengen niet belemmert en voeg deze toe aan het vat.
OPMERKING: Informatie over het type ultrapuur alginaat dat voor dit protocol wordt gebruikt, is te vinden in de Tabel van Materialen en op de Novamatrix-website20. Verschillende alginaten werden niet onderzocht voor deze steigers, omdat ze kunnen leiden tot ongewenste veranderingen in porositeit en biocompatibiliteit van de steigers 9,10,11. - Roer de oplossing op hoge snelheid totdat het alginaat oplost (~1 uur). Als er grote klonten aan de zijkanten van het vat zijn, kantel het vat dan om ze los te maken. Kleine hoeveelheden alginaat aan de zijkanten zullen oplossen tijdens het roeren en zijn geen reden tot bezorgdheid.
OPMERKING: Het is niet nodig om de pH van de oplossing te controleren. - Wanneer het alginaat oplost, verlaagt u de roersnelheid, voegt u langzaam een gelijk volume van 0,4% calcium D-gluconaat toe aan de alginaatoplossing om te voorkomen dat zich kruislingse klonten vormen en roer krachtig gedurende 15 minuten.
- Kantel het bekerglas of de injectieflacon zijwaarts om eventuele klonten te verwijderen.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een homogenisator te gebruiken. De uiteindelijke oplossing moet optisch duidelijk zijn. - Pipetteer het gewenste volume van de oplossing in elke put van een 48-well plaat of 24-well plaat. Gebruik 300 μL/put voor een 48-well plaat en 1 mL/well voor een 24-well plaat. Werp langzaam en verander regelmatig van tip, omdat de oplossing stroperig zal zijn en aan de punt zal blijven plakken.
- Dek de borden af met deksels en vries ze een nacht in bij -20 °C.
- Bereid de plaat voor op de lyofilisator door het deksel te verwijderen en de bovenkant vast te zetten met doekjes en elastiekjes. Plaats de platen in 750 ml tot 2.000 ml lyofilisatorkolven en plaats deze gedurende 72 uur op de lyofilisator.
- Verwijder na 72 uur de plaat van de lyofilisator en vervang het deksel. Sluit de plaat af en bewaar bij 4 °C. Voor langdurige opslag, vacuümdicht de plaat voordat u deze bij 4 °C bewaart. Droog bewaren tot het nodig is.
OPMERKING: Maak extra calcium-alginaatoplossing vanwege een volumefout (sommige kleven aan de wanden van de injectieflacon, pipetpunten). Om bijvoorbeeld vier steigers in een 24-wellsplaat te maken, is 4 ml gecombineerde oplossing (2 ml alginaat + 2 ml calcium D-gluconaat) vereist, maar het wordt aanbevolen om 2,5 ml 2% alginaatoplossing en 2,5 ml 0,4% calcium D-gluconaatoplossing te bereiden.
2. Transductie
- Concentratie van viraal supernatant met behulp van 100 kDa filters
- Hydrateer het centrifugaalfilter gedurende 2 minuten met 1 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Gooi de PBS weg.
- Concentreer de virale suspensie door 2 ml virale suspensie toe te voegen (1 × 106 TU / ml) en deze gedurende 10 minuten door het centrifugaalfilter te centrifugaalfilter bij 1.500 × g in een zwenkbakrotor.
LET OP: Per steiger is één tot tweehonderd microliter geconcentreerd virus nodig. - Draai nog een paar minuten als het geconcentreerde virussuspensievolume groter is dan 200 μL.
- Herhaal stap 2.1.1-2.1.3 voor elk schavot.
OPMERKING: Het is ook acceptabel om een grote voorraad virus te concentreren en 100-200 μL aliquots uit de geconcentreerde voorraad te nemen.
- Zaad geactiveerde cellen en virus samen.
- Bereid voor elke scaffold een aliquot door 1 × 106 geactiveerde perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) te suspenseren in 50 μL volledige celkweekmedia (250 ml Click's media + 250 ml RPMI 1640 media + 50 ml foetaal runderserum + 5 ml glutaminevervanger + 5 ml penicilline / streptomycine).
OPMERKING: Zie Aanvullend bestand 1 voor een protocol over het activeren van PBMC's. - Voeg het geconcentreerde virale supernatant (~2 × 106 TU, MOI 2) toe aan de celsuspensie. Het totale volume van de celvirussuspensie mag niet hoger zijn dan 200 μL voor een scaffold van 48 putten of 350 μL voor een scaffold met 24 putten.
- Voeg het cel-virusmengsel druppelsgewijs toe aan de bovenkant van de droge steiger. Gebruik voor negatieve controle-experimenten complete celkweekmedia in plaats van het geconcentreerde virus. Voeg de celsuspensie toe aan de bovenkant van de droge steiger.
- Herhaal stap 2.2.1-2.2.3 voor elk schavot.
- Incubeer de steigers in een celkweekincubator bij 37 °C gedurende 45-60 min. Verwijder de steigers uit de incubator; de steigers zullen de oplossing gedurende deze tijd volledig absorberen.
- Om proliferatie te induceren, voegt u volledige celkweekmedia aangevuld met IL-15 (5 ng / ml) en IL-7 (10 ng / ml) toe aan elke put; IL-2 kan ook worden gebruikt. Voeg 500 μL toe aan elke 48-well scaffold of 1 mL aan elke 24-well scaffold.
- Incubeer de steigers bij 37 °C gedurende 72 uur. Naarmate de cellen zich vermenigvuldigen, zullen de media oranje worden.
- Bereid voor elke scaffold een aliquot door 1 × 106 geactiveerde perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) te suspenseren in 50 μL volledige celkweekmedia (250 ml Click's media + 250 ml RPMI 1640 media + 50 ml foetaal runderserum + 5 ml glutaminevervanger + 5 ml penicilline / streptomycine).
- Isoleer cellen van de steigers voor analyse.
- Verdun 0,5 M EDTA tot 0,25 M EDTA in 1x PBS.
- Verwijder overtollig medium uit elke put en verzamel in afzonderlijke centrifugebuizen van 15 ml.
- Om cellen van de steiger te isoleren, voegt u 0,25 M EDTA toe aan elke steiger. Voeg 300 μL toe aan 48-well steigers of 1 ml aan 24-well steigers. Laat het bord 3-4 min zitten of voorzichtig roeren.
- Zodra de steiger grotendeels is opgelost, pipet u voorzichtig in en uit in de put. Een paar in-en-uit pipetteerstappen kunnen nodig zijn om de steiger volledig op te lossen. Als het niet binnen 10 minuten oplost, voeg dan nog eens 200 μL van 0,25 M EDTA toe.
- Zodra de steiger volledig is opgelost, brengt u de oplossing over naar een centrifugebuis van 15 ml.
- Herhaal stap 2.3.4 en 2.3.5 voor elk schavot.
- Was de cellen tweemaal door 12 ml PBS aan elke centrifugebuis toe te voegen en gedurende 5 minuten te centrifugeren met 400 × g . Aan de onderkant van elke buis vormt zich een celpellet. Aspirateer het supernatant en herhaal de was. Zorg ervoor dat u het supernatant bij elke wasbeurt volledig aspirateert, omdat het cruciaal is om alle EDTA te verwijderen.
- Na de tweede wasbeurt met PBS is de celpellet nu klaar voor analyse. Volg het juiste protocol dat vereist is voor de analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze macroporeuze alginaatsteigers zijn gemakkelijk te maken en moeten uit de lyofilisator komen als poreuze, donzige en witte schijven. Hoewel niet bestudeerd in dit experiment, kan calcium-alginaatoplossing in verschillende mallen worden gegoten om steigers van verschillende vormen te creëren, afhankelijk van de behoeften van de gebruiker 9,10. De steigers zijn elektrostatisch en kunnen aan het deksel van de putplaat of aan een gehandschoende vinger kleven. Figuur 2 laat zien hoe de steigers er na voltooiing uit moeten zien. Geschatte afmetingen van 24- en 48-well steigers zijn ook weergegeven in de figuur.
Figuur 2: Afbeeldingen van droge macroporeuze alginaatsteigers. (A) Een plaat met 48 putten vol steigers. (B) Een plaat met 24 putten vol steigers. (C) Het vergelijken van een 48-well scaffold met een 24-well scaffold. Steigerafmetingen worden ook getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De porositeit van de steigers is van groot belang voor een succesvolle transductie en we hebben eerder geëxperimenteerd met de porositeit van de steigers. Voor meer informatie over de porositeit, inclusief SEM-afbeeldingen van de steigers, verwijzen wij u naar artikelen van Agarwalla et. al. in de referenties 17,18.
Transductie-efficiëntie werd geanalyseerd met behulp van flowcytometrie en de resultaten zijn weergegeven in figuur 3. Bevroren PBMC's van dezelfde donor werden geactiveerd en gebruikt voor alle experimentele groepen. Een protocol voor het activeren van PBMC's is te vinden in Supplemental File 1, en elke standaardmethode om T-cellen te activeren en activering te valideren kan worden gebruikt 21,22,23. De geactiveerde PBMC's werden gezaaid op een steiger met GFP-coderend retrovirus of een steiger zonder virus, een "lege" steiger genoemd. Geactiveerde PBMC's werden ook gezaaid op platen die waren gespinoculeerd met retronectine en GFP-coderend retrovirus om de transductie-efficiëntie van de alginaatsteigers te vergelijken met de conventionele methode. Niet-getransduceerde (NT) cellen - geactiveerde PBMC's gezaaid in ongecoate putten van een 24-well plaat - werden gebruikt als de negatieve controlegroep. Zoals verwacht vertoonden de niet-getransduceerde cellen en cellen geïsoleerd uit de lege scaffold geen transductie. Cellen geïsoleerd uit de scaffold bezaaid met geactiveerde PBMC's en GFP retrovirus vertoonden een vergelijkbare transductie-efficiëntie als de retronectine-gecoate platen. De steiger had een gemiddeld transductierendement van 85%, net onder de retronectinegroep. Deze resultaten tonen aan dat deze alginaatsteigers dienen als een gemakkelijker en goedkoper alternatief voor virale transduce T-cellen zonder de noodzaak van spinoculatie van retronectine.
Figuur 3: FACS-kwantificering van transductie-efficiëntie. (A) FACS-plots met GFP-expressie. Cellen werden afgesloten op levensvatbare cellen, FSC-singlets en GFP-positieve cellen. (B) Kwantificering van GFP-positieve cellen door FACS. Conventionele spinoculatie van retronectine-gecoate platen (paarse omgekeerde driehoek) werd gebruikt als een positieve controle. Niet-getransduceerde cellen (blauwe cirkel) en geactiveerde cellen gezaaid op de alginaatsteigers zonder virus (rood vierkant) werden gebruikt als negatieve controles. Scaffolds bezaaid met geactiveerde cellen en GFP retrovirus (groene driehoek) hadden een transductie-efficiëntie van 85%, vergelijkbaar met retronectine. Gegevens weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie met n = 4. Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering; SSC-A = zijwaarts strooipuntgebied; FSC = voorwaartse verstrooiing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: Protocol voor het activeren van cellen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S1: Afbeeldingen van droge macroporeuze alginaatsteigers vervaardigd bij -80 °C. Het invriezen van steigers bij -80 °C leidt tot een minder consistent uiterlijk en functie van de steiger dan bij -20 °C. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CAR-T-celtherapie blijft interesse wekken voor zowel onderzoek als commerciële toepassingen. Ondanks het succes dat CAR-T-celtherapie heeft gehad bij de behandeling van bloedkankers, beperken de hoge kosten van de procedure het gebruik ervan. Het hier gepresenteerde protocol introduceert een nieuwe methode voor virale genoverdracht van T-cellen zonder de noodzaak van spinoculatie van retronectine-gecoate platen. Het produceren van droge macroporeuze alginaatsteigers om transductie te bemiddelen is relatief eenvoudig en is een geschikte goedkope vervanging voor de conventionele methode.
Af en toe kan het uiterlijk van de steiger afwijken van die in figuur 2 en kan het in plaats daarvan helder en kristallijn lijken in plaats van wit en pluizig. Dit kan gebeuren door inconsistente bevriezing bij -20 °C als gevolg van het herhaaldelijk openen van de vriesdeur of als de te bevriezen plaat geïsoleerd is door naast of bovenop omvangrijke items in de vriezer te liggen. Ondanks het verschil in uiterlijk heeft ons lab geen verschil in transductie-efficiëntie ervaren met de kristallijne steigers. Hoewel eerder werk aan cryogelatie lagere vriestemperaturen24,25 heeft gebruikt, ontdekten we dat bevriezen bij lagere temperaturen leidt tot een minder consistent uiterlijk en functie van de steiger dan wanneer bevroren bij -20 °C. Afbeeldingen van een steiger die is ontstaan door bevriezing bij -80 °C zijn te vinden in aanvullende figuur S1. Daarom wordt nog steeds aanbevolen dat steigers worden ingevroren bij -20 °C met minimale verstoring, en de plaat moet op een rekachtige plank worden geplaatst die luchtstroom onder de plaat mogelijk maakt.
Hoewel deze steigers een uitstekende transductie-efficiëntie hebben laten zien, moeten enkele beperkingen worden opgemerkt. Ten eerste moet voorzichtig worden omgegaan bij het werken met EDTA, wat de levensvatbaarheid van cellen kan beperken, zelfs in kleine hoeveelheden. Daarom moet EDTA volledig worden verwijderd. Bovendien zal de grootte van de steiger de hoeveelheid vloeistof beperken die kan worden geabsorbeerd en dus het aantal cellen dat kan worden overgeschakeld. Ten slotte kan dit protocol niet worden gebruikt om niet-geactiveerde T-cellen te transduceren. Toekomstig werk zal zich richten op het rapporteren van fabricage van steigers die in staat zijn tot gelijktijdig gemedieerde activering en proliferatie van cellen, het bevorderen van colocalisatie van cellen en virale deeltjes voor transductie en het vrijgeven van volledig functionele getransduceerde cellen in vivo18.
Gepubliceerde studies door ons laboratorium rapporteren de fenotypische analyse en functionaliteit van CAR-T-cellen gegenereerd met behulp van deze steigers. De CD19-specifieke CAR-T-cellen geproduceerd door deze scaffolds behielden effectorfenotype en waren in staat om CD19+ Daudi-cellen in vitro te elimineren wanneer ze werden gecokweekt in een 1:5 effector-to-target ratio17. De CAR-T-cellen die samen met Daudi-cellen werden gekweekt, gaven ook IL-2 en IFN-γ vrij, wat pro-inflammatoire cytokines zijn die aangeven dat de T-cellen worden geactiveerd. Deze resultaten tonen aan dat deze steigers in vitro zeer functionele CAR-T-cellen produceren. CAR-T-cellen gegenereerd door deze steigers vertoonden een uitstekende in vivo antitumorfunctie tegen CD19+ Daudi-cellen gelabeld met vuurvlieg luciferase. De CAR-T-cellen controleerden effectief de tumorgroei, verbeterden de algehele overlevingskans en vertoonden geen significante tekenen van toxiciteit17. Deze resultaten geven aan dat deze scaffolds kunnen worden gebruikt om cellen genetisch te modificeren voor CAR-T-celtherapie zonder de functionaliteit en antitumoractiviteit van de cellen te beïnvloeden. Toekomstige studies met deze alginaatsteigers omvatten het optimaliseren van de transductie-efficiëntie door de macroporositeit en alginaat- en calciumconcentraties aan te passen.
Concluderend kunnen deze macroporeuze alginaatsteigers een vergelijkbare transductie-efficiëntie hebben als retronectine, wat een alternatieve methode biedt voor het transduceren van cellen voor CAR-T-celtherapie. Deze scaffolds produceren ook volledig functionele CAR-T-cellen met antitumoractiviteit, zowel in vitro als in vivo17. Drydux-steigers bieden een alternatieve methode die eenvoudig en goedkoop is voor het transduceren van T-cellen voor gebruik in CAR-T-celtherapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
P.A. en Y.B. zijn uitvinders van patenten met betrekking tot het gebruik van biomaterialen voor het genereren van CAR-T-celtherapieën. Y.B. ontvangt een door de industrie gesponsorde onderzoekssubsidie met betrekking tot CAR-T-celtherapeutische technologie (niet gerelateerd aan dit werk). Alle andere auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health via Grant Award Numbers R37-CA260223, R21CA246414. We danken de NCSU flowcytometriekern voor training en begeleiding bij flowcytometrie-analyse. Schema's zijn gemaakt met Biorender.com
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | 15575-038 | UltraPure, pH 8.0 |
| 1x DPBS | Gibco | 14190-144 | No calcium chloride or magnesium chloride |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies Inc | 07060 | |
| Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells | - | - | Fresh or frozen |
| Calcium-D-Gluconate | Alfa Aesar | A11649 | |
| CD28.2 Antibody | BD | 555725 | 1 mg/mL |
| CD3 Antibody | Miltenyi | 130-093-387 | 100 μg/mL |
| Click's Media | FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS | 9195 | |
| DI Water | - | - | |
| Glutamax | Gibco | 35-050-061 | |
| HyClone FBS | Cytvia | SH3039603 | |
| HyClone RPMI 1640 Media | Cytvia | SH3009601 | |
| Penicillin-streptomycin (P/S) | Gibco | 15-140-122 | |
| Peripheral Blood Mononuclear Cells | - | - | Fresh or frozen |
| PRONOVA UP MVG | NovaMatrix | 4200101 | Sodium alginate |
| Recombinant Human IL-15 | Peprotech | 200-15 | 5 ng/mL |
| Recombinant Human IL-7 | Peprotech | 200-07 | 10 ng/mL |
| Retrovirus | - | - | 1 x 106 TU/mL |
References
- Prinzing, B. L., Gottschalk, S. M., Krenciute, G. C. A. R. T-cell therapy for glioblastoma: ready for the next round of clinical testing. Expert Review of Anticancer Therapy. 18 (5), 451-461 (2018).
- Bagley, S. J., Desai, A. S., Linette, G. P., June, C. H., O'Rourke, D. M. CAR T-cell therapy for glioblastoma: recent clinical advances and future challenges. Neuro-oncology. 20 (11), 1429-1438 (2018).
- Nair, R., Westin, J.
- Jackson, H. J., Rafiq, S., Brentjens, R. J.
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer Journal. 11 (4), 69 (2021).
- Miliotou, A. N., Papadopoulou, L. C. CAR T-cell therapy: A new era in cancer immunotherapy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 19 (1), 5-18 (2018).
- Lee, H. -J., et al. Retronectin enhances lentivirus-mediated gene delivery into hematopoietic progenitor cells. Biologicals: Journal of the International Association of Biological Standardization. 37 (4), 203-209 (2009).
- Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).
- Sun, J., Tan, H. Alginate-based biomaterials for regenerative medicine applications. Materials. 6 (4), 1285-1309 (2013).
- Nayak, A. K., Mohanta, B. C., Hasnain, M. S., Hoda, M. N., Tripathi, G. Chapter 14 - Alginate-based scaffolds for drug delivery in tissue engineering. Alginates in Drug Delivery. , 359-386 (2020).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Alginate: properties and biomedical applications. Progress in Polymer Science. 37 (1), 106-126 (2012).
- Kuo, C. K., Ma, P. X. Ionically crosslinked alginate hydrogels as scaffolds for tissue engineering: part 1. Structure, gelation rate and mechanical properties. Biomaterials. 22 (6), 511-521 (2001).
- Soccol, C., et al.
- Moody, C. T., et al. Restoring carboxylates on highly modified alginates improves gelation, tissue retention and systemic capture. Acta Biomaterialia. 138, 208-217 (2022).
- Brudno, Y., et al. Replenishable drug depot to combat post-resection cancer recurrence. Biomaterials. 178, 373-382 (2018).
- Moody, C. T., Palvai, S., Brudno, Y. Click cross-linking improves retention and targeting of refillable alginate depots. Acta Biomaterialia. 112, 112-121 (2020).
- Agarwalla, P., et al. Scaffold-mediated static transduction of T Cells for CAR-T Cell therapy. Advanced Healthcare Materials. 9 (14), 2000275 (2020).
- Agarwalla, P., et al. Bioinstructive implantable scaffolds for rapid in vivo manufacture and release of CAR-T cells. Nature Biotechnology. 40 (8), 1250-1258 (2022).
- Vera, J., et al. T lymphocytes redirected against the kappa light chain of human immunoglobulin efficiently kill mature B lymphocyte-derived malignant cells. Blood. 108 (12), 3890-3897 (2006).
- PRONOVA UP MVG. IFF Nutrition Norge AS. , Available from: https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/ (2022).
- Zappasodi, R., Budhu, S., Abu-Akeel, M., Merghoub, T. In vitro assays for effector T cell functions and activity of immunomodulatory antibodies. Methods in Enzymology. 631, 43-59 (2020).
- Kong, B. S., Lee, C., Cho, Y. M. Protocol for the assessment of human T cell activation by real-time metabolic flux analysis. STAR Protocols. 3 (1), 101084 (2022).
- Bio-Rad cell activation protocols. Bio-Rad. , Available from: https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24. ecommerce2&evCntryLang=US-en&cntry= US&thirdPartyCookieEnabled=true (2022).
- Lin, H. -R., Yeh, Y. -J. Porous alginate/hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering: Preparation, characterization, andin vitro studies. Journal of Biomedical Materials Research. 71 (1), 52-65 (2004).
- Wu, J., Zhao, Q., Sun, J., Zhou, Q. Preparation of poly(ethylene glycol) aligned porous cryogels using a unidirectional freezing technique. Soft Matter. 8 (13), 3620 (2012).
