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Bioengineering

Fabbricazione e utilizzo di scaffold di alginato macroporoso secco per la trasduzione virale delle cellule T

Published: September 9, 2022 doi: 10.3791/64036
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Joint Department of Biomedical Engineering, University of North Carolina at Chapel Hill and North Carolina State University, 2Comparative Medicine Institute, North Carolina State University, 3Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

Qui è un protocollo per la creazione di scaffold di alginato macroporoso secco che mediano un efficiente trasferimento genico virale per l'uso nell'ingegneria genetica delle cellule T, comprese le cellule T per la terapia cellulare CAR-T. Gli scaffold hanno dimostrato di trasdurre le cellule T primarie attivate con una trasduzione del >85%.

Abstract

L'ingegneria genetica delle cellule T per la terapia cellulare CAR-T è arrivata alla ribalta nel trattamento del cancro negli ultimi anni. Le cellule CAR-T sono prodotte dal trasferimento genico virale nelle cellule T. L'attuale gold standard del trasferimento genico virale comporta la spinoculazione di piastre rivestite di retronectina, che è costosa e richiede tempo. Vi è una significativa necessità di metodi efficienti ed economici per generare celle CAR-T. Qui è descritto un metodo per fabbricare scaffold di alginato macroporoso poco costoso e secco, noti come scaffold Drydux, che promuovono efficacemente la trasduzione virale delle cellule T attivate. Gli scaffold sono progettati per essere utilizzati al posto della spinoculazione gold standard di piastre rivestite di retronectina seminate con virus e semplificano il processo di trasduzione delle cellule. L'alginato è reticolato con calcio-D-gluconato e congelato durante la notte per creare gli scaffold . Gli scaffold congelati vengono liofilizzati in un liofilizzatore per 72 ore per completare la formazione degli scaffold macroporosi asciutti. Gli scaffold mediano il trasferimento genico virale quando il virus e le cellule T attivate vengono seminati insieme sulla parte superiore dell'impalcatura per produrre cellule geneticamente modificate. Gli scaffold producono >85% di trasduzione primaria delle cellule T, che è paragonabile all'efficienza di trasduzione della spinoculazione su piastre rivestite di retronectina. Questi risultati dimostrano che gli scaffold di alginato macroporoso secco servono come alternativa più economica e più conveniente al metodo di trasduzione convenzionale.

Introduction

L'immunoterapia è emersa come un paradigma rivoluzionario per il trattamento del cancro grazie alla sua capacità di colpire specificamente i tumori, limitare la citotossicità fuori bersaglio e prevenire le ricadute. In particolare, la terapia cellulare del recettore dell'antigene chimerico T (CAR-T) ha guadagnato popolarità grazie al suo successo nel trattamento di linfomi e leucemie. La FDA ha approvato la prima terapia cellulare CAR-T nel 2017 e, da allora, ha approvato altre quattro terapie cellulari CAR-T 1,2,3,4,5. Le CAR hanno un dominio di riconoscimento dell'antigene solitamente costituito da un frammento variabile a catena singola di un anticorpo monoclonale specifico per un antigene associato al tumore 3,4. Quando una CAR interagisce con il suo antigene associato al tumore, le cellule CAR-T si attivano, portando a una risposta antitumorale che coinvolge il rilascio di citochine, la degranulazione citolitica, l'espressione del fattore di trascrizione e la proliferazione delle cellule T. Per produrre cellule CAR-T, il sangue viene raccolto dal paziente per ottenere le loro cellule T. Le CAR vengono aggiunte geneticamente alle cellule T del paziente utilizzando un virus. Le cellule CAR-T vengono coltivate in vitro e reinfuse nel paziente 2,3,4,6. La generazione di successo delle cellule CAR-T è determinata dall'efficienza di trasduzione, che descrive il numero di cellule T geneticamente modificate in cellule CAR-T.

Attualmente, il gold standard per la generazione di cellule CAR-T è la spinoculazione di cellule T attivate e virus su piastre rivestite di retronectina 7,8. La trasduzione inizia quando le particelle virali interagiscono con la superficie delle cellule T. La retronectina promuove la colocalizzazione di virus e cellule aumentando l'efficienza di legame tra le particelle virali e le cellule, migliorando la trasduzione 7,8. La retronectina non funziona bene da sola e deve essere accompagnata da spinoculazione, che migliora il trasferimento genico concentrando le particelle virali e aumentando la permeabilità superficiale delle cellule T, consentendo una più facile infezione virale8. Nonostante il successo della spinoculazione su piastre rivestite di retronectina, si tratta di un processo complesso che richiede più cicli di centrifuga e costosi reagenti. Pertanto, metodi alternativi per il trasferimento genico virale che sono più rapidi ed economici sono altamente desiderabili.

L'alginato è un polisaccaride anionico naturale ampiamente utilizzato nell'industria biomedica grazie al suo basso costo, al buon profilo di sicurezza e alla capacità di formare idrogel dopo la miscelazione con cationi bivalenti 9,10,11,12. L'alginato è un polimero conforme alle GMP ed è generalmente riconosciuto come sicuro (GRAS) dalla FDA13. L'alginato reticolante con i cationi crea idrogel stabili spesso utilizzati nella guarigione delle ferite, nella consegna di piccoli farmaci chimici e proteine e nel trasporto cellulare 9,10,11,12,14,15,16. Grazie alle sue eccellenti proprietà gelificanti, l'alginato è il materiale preferito per creare scaffold porosi mediante liofilizzazione10,17. Queste caratteristiche dell'alginato lo rendono un candidato attraente per la produzione di un'impalcatura in grado di mediare il trasferimento genico virale delle cellule attivate.

Qui è descritto un protocollo per la realizzazione di scaffold di alginato macroporoso secco, noti come scaffold di Drydux, che trasducono staticamente le cellule T mediante trasferimento genico virale17,18. Il processo per la realizzazione di questi scaffold è illustrato nella Figura 1. Questi scaffold eliminano la necessità di spinoculazione delle piastre rivestite di retronectina. Gli scaffold macroporosi di alginato incoraggiano l'interazione di particelle virali e cellule T per consentire un efficiente trasferimento genico in un unico passaggio senza compromettere la funzionalità e la vitalità delle cellule T ingegnerizzate17. Se seguiti correttamente, questi scaffold di alginato macroporoso hanno un'efficienza di trasduzione di almeno l'80%, semplificando e abbreviando il processo di trasduzione virale.

Figure 1
Figura 1: Schema e calendario del protocollo . (A) Calendario per la realizzazione degli scaffold di alginato macroporoso secco. L'alginato è reticolato con calcio-D-gluconato e congelato durante la notte. Gli scaffold congelati vengono liofilizzati per 72 ore per creare gli scaffold Drydux. (B) Cronologia per la trasduzione virale delle cellule attivate. Le cellule attivate e il virus (MOI 2) vengono seminati sopra l'impalcatura e incubati in terreni completi integrati con IL-7 e IL-15. Gli scaffold assorbono la miscela e promuovono il trasferimento genico virale. L'EDTA viene utilizzato per dissolvere gli scaffold e isolare le cellule trasdotte. Dopo aver lavato due volte con PBS, il pellet cellulare può essere utilizzato per l'analisi. Abbreviazioni: PBS = soluzione salina tamponata con fosfato; PBMCs = cellule mononucleate del sangue periferico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono cellule primate umane e vettori retrovirali sono state eseguite in conformità con le linee guida sulla sicurezza biologica della North Carolina State University e approvate dall'Ufficio per la salute e la sicurezza ambientale. Le cellule mononucleate del sangue periferico umano sono state acquistate come buffy coat da fonti commerciali. Le cellule umane primarie devono essere isolate dalle frazioni del rivestimento di buffy umano e richiedono l'autorizzazione di livello 2 di biosicurezza e procedure operative standard dettagliate e l'approvazione da parte dell'istituzione in cui si svolgerà il lavoro. I vettori virali, compresi i supernatanti vettori retrovirali utilizzati per la trasduzione preparati come descritto in precedenza19, possono essere classificati come livello di biosicurezza 1 o livello di biosicurezza 2 a seconda della proteina codificata e richiedono l'approvazione del comitato istituzionale competente per la biosicurezza.

1. Realizzazione degli scaffold di alginato macroporoso

  1. Preparare una soluzione madre di gluconato di calcio D allo 0,4% (peso per volume) aggiungendo acqua deionizzata filtrata sterile al gluconato di calcio D in un becher. Mescolare a velocità media fino a quando il gluconato di calcio si è sciolto (~ 1,5 h), filtrare sterile e conservare a temperatura ambiente.
    NOTA: Non è necessario controllare il pH della soluzione.
  2. Preparare una soluzione di alginato al 2% (peso per volume) in un flaconcino o becher con tappo a vite. Aggiungere con attenzione l'alginato ultrapuro alla nave e aggiungere acqua deionizzata filtrata sterile all'alginato. Scegli il più grande agitatore possibile che non impedisca la miscelazione e aggiungilo al recipiente.
    NOTA: Informazioni sul tipo di alginato ultrapuro utilizzato per questo protocollo sono disponibili nella tabella dei materiali e sul sito web Novamatrix20. Diversi alginati non sono stati esplorati per questi scafffold, in quanto possono portare a cambiamenti indesiderati nella porosità e nella biocompatibilità degli scaffold 9,10,11.
  3. Mescolare la soluzione ad alta velocità fino a quando l'alginato si scioglie (~1 h). Se ci sono grandi ciuffi sui lati della nave, inclinare la nave per spostarli. Piccole quantità di alginato sui lati si dissolveranno durante l'agitazione e non sono motivo di preoccupazione.
    NOTA: Non è necessario controllare il pH della soluzione.
  4. Quando l'alginato si dissolve, ridurre la velocità di agitazione, aggiungere lentamente un volume uguale di gluconato di calcio D allo 0,4% alla soluzione di alginato per evitare la formazione di grumi di reticolazione e mescolare vigorosamente per 15 minuti.
  5. Inclinare lateralmente il becher o il flaconcino per rimuovere eventuali grumi che potrebbero essersi formati.
    NOTA: Si consiglia di utilizzare un omogeneizzatore. La soluzione finale dovrebbe essere otticamente chiara.
  6. Pipettare il volume desiderato della soluzione in ciascun pozzetto di una piastra a 48 pozzetti o di una piastra a 24 pozzetti. Utilizzare 300 μL/pozzetto per una piastra da 48 pozzetti e 1 ml/pozzetto per una piastra da 24 pozzetti. Lanciare lentamente e cambiare le punte frequentemente, poiché la soluzione sarà viscosa e si attaccherà alla punta.
  7. Coprire le piastre con coperchi e congelare per una notte a -20 °C.
  8. Preparare la piastra per il liofilizzante rimuovendo il coperchio e fissando la parte superiore con salviette e elastici. Posizionare le piastre in boccette da 750 ml a 2.000 ml di liofilizzatore e posizionare sul liofilizzatore per 72 ore.
  9. Dopo 72 h, rimuovere la piastra dal liofilizzatore e sostituire il coperchio. Sigillare la piastra e conservare a 4 °C. Per una conservazione a lungo termine, sigillare sottovuoto la piastra prima di conservarla a 4 °C. Conservare asciutto fino al momento del bisogno.
    NOTA: Preparare una soluzione extra di alginato di calcio a causa di un errore di volume (alcuni si attaccano alle pareti del flaconcino, punte delle pipette). Ad esempio, per realizzare quattro scaffold in una piastra da 24 pozzetti, sono necessari 4 ml di soluzione combinata (2 ml di alginato + 2 ml di calcio D gluconato), ma si consiglia di preparare 2,5 ml di soluzione di alginato al 2% e 2,5 ml di soluzione di gluconato di calcio D allo 0,4%.

2. Trasduzione

  1. Concentrazione di surnatante virale con filtri da 100 kDa
    1. Idratare il filtro centrifugo per 2 minuti con 1 mL di 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS). Scartare il PBS.
    2. Concentrare la sospensione virale aggiungendo 2 ml di sospensione virale (1 × 106 TU/ml) e centrifugandola attraverso il filtro centrifugo a 1.500 × g per 10 minuti in un rotore a benna oscillante.
      NOTA: sono necessari da uno a duecento microlitri di virus concentrato per impalcatura.
    3. Ruotare per qualche minuto supplementare se il volume concentrato della sospensione virale è superiore a 200 μL.
    4. Ripetere i passaggi 2.1.1-2.1.3 per ogni impalcatura.
      NOTA: È anche accettabile concentrare una grande scorta di virus e prelevare 100-200 μL di aliquote dallo stock concentrato.
  2. Cellule attivate dal seme e virus insieme.
    1. Per ogni impalcatura, preparare un'aliquota sospendendo 1 × 106 cellule mononucleate del sangue periferico attivate (PBMC) in 50 μL di terreno di coltura cellulare completo (250 mL di supporti Click's + 250 mL di RPMI 1640 di media + 50 mL di siero fetale bovino + 5 mL di sostituto della glutammina + 5 mL di penicillina/streptomicina).
      NOTA: vedere il file supplementare 1 per un protocollo su come attivare i PBMC.
    2. Aggiungere il surnatante virale concentrato (~2 × 106 TU, MOI 2) alla sospensione cellulare. Il volume totale della sospensione di virus cellulare non deve superare 200 μL per un'impalcatura a 48 pozzetti o 350 μL per un'impalcatura a 24 pozzetti.
    3. Aggiungere la miscela di virus cellulare a goccia nella parte superiore dell'impalcatura asciutta. Per gli esperimenti di controllo negativo, utilizzare terreni di coltura cellulare completi al posto del virus concentrato. Aggiungere la sospensione cellulare nella parte superiore dell'impalcatura asciutta.
    4. Ripetere i passaggi 2.2.1-2.2.3 per ogni impalcatura.
    5. Incubare gli scaffold in un incubatore di colture cellulari a 37 °C per 45-60 minuti. Rimuovere le impalcature dall'incubatore; Gli scaffold assorbiranno completamente la soluzione durante questo periodo.
    6. Per indurre la proliferazione, aggiungere terreni di coltura cellulare completi integrati con IL-15 (5 ng / mL) e IL-7 (10 ng / mL) a ciascun pozzetto; IL-2 può anche essere usato. Aggiungere 500 μL a ciascuna impalcatura a 48 pozzetti o 1 mL a ciascuna impalcatura a 24 pozzetti.
    7. Incubare gli scaffold a 37 °C per 72 h. Man mano che le cellule proliferano, i media diventeranno arancioni.
  3. Isolare le cellule dagli scaffold per l'analisi.
    1. Diluire 0,5 M EDTA a 0,25 M EDTA in 1x PBS.
    2. Rimuovere il mezzo in eccesso da ciascun pozzetto e raccogliere in provette da centrifuga separate da 15 ml.
    3. Per isolare le cellule dallo scaffold, aggiungere 0,25 M EDTA a ciascuna impalcatura. Aggiungere 300 μL a scaffold a 48 pozzetti o da 1 mL a scaffold a 24 pozzetti. Lasciare riposare il piatto o agitare delicatamente per 3-4 minuti.
    4. Una volta che l'impalcatura è per lo più sciolta, pipettare dentro e fuori delicatamente all'interno del pozzetto. Potrebbero essere necessari alcuni passaggi di pipettaggio in entrata e in uscita per dissolvere completamente lo scaffold. Se non si dissolve in 10 minuti, aggiungere altri 200 μL di 0,25 M EDTA.
    5. Una volta che lo scaffold si scioglie completamente, trasferire la soluzione in una provetta da centrifuga da 15 ml.
    6. Ripetere i passaggi 2.3.4 e 2.3.5 per ogni impalcatura.
    7. Lavare le celle due volte aggiungendo 12 mL di PBS a ciascuna provetta da centrifuga e centrifugando a 400 × g per 5 minuti. Un pellet cellulare si formerà sul fondo di ogni tubo. Aspirare il surnatante e ripetere il lavaggio. Fare attenzione ad aspirare completamente il surnatante ad ogni lavaggio in quanto è fondamentale rimuovere tutto l'EDTA.
    8. Dopo il secondo lavaggio con PBS, il pellet cellulare è ora pronto per l'analisi. Seguire il protocollo appropriato richiesto per l'analisi.

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Representative Results

Questi scaffold di alginato macroporoso sono facili da realizzare e dovrebbero uscire dal liofilizzatore come dischi porosi, soffici e bianchi. Sebbene non studiata in questo esperimento, la soluzione di calcio-alginato può essere colata in diversi stampi per creare scaffold di forme variabili, a seconda delle esigenze dell'utente 9,10. Gli scaffold sono elettrostatici e possono attaccarsi al coperchio della piastra del pozzetto o a un dito guantato. Nella Figura 2 viene illustrato l'aspetto delle impalcature al termine. Nella figura sono mostrate anche le dimensioni approssimative degli scaffold a 24 e 48 pozzetti.

Figure 2
Figura 2: Immagini di scaffold di alginato macroporoso secco . (A) Una piastra da 48 pozzetti piena di impalcature. (B) Una piastra da 24 pozzetti piena di impalcature. (C) Confronto tra un'impalcatura a 48 pozzetti e un'impalcatura a 24 pozzetti. Vengono mostrate anche le dimensioni dell'impalcatura. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

La porosità degli scaffold è molto importante per una trasduzione di successo, e abbiamo precedentemente sperimentato la porosità degli scaffold. Per ulteriori informazioni sulla porosità, comprese le immagini SEM degli impalcature, si prega di fare riferimento ai documenti di Agarwalla et. al. nei riferimenti17,18.

L'efficienza di trasduzione è stata analizzata utilizzando la citometria a flusso e i risultati sono mostrati in Figura 3. Le PBMC congelate dello stesso donatore sono state attivate e utilizzate per tutti i gruppi sperimentali. Un protocollo per l'attivazione delle PBMC può essere trovato nel file supplementare 1 e qualsiasi metodo standard per attivare le cellule T e convalidare l'attivazione può essere utilizzato21,22,23. Le PBMC attivate sono state seminate su un'impalcatura con retrovirus codificante GFP o su un'impalcatura senza virus, definita impalcatura "vuota". Le PBMC attivate sono state anche seminate su piastre spinoculate con retronectina e retrovirus codificanti GFP per confrontare l'efficienza di trasduzione degli scaffold di alginato con il metodo convenzionale. Le PBMC attivate da cellule non trasdotte (NT) seminate in pozzetti non rivestiti di una piastra a 24 pozzetti sono state utilizzate come gruppo di controllo negativo. Come previsto, le cellule non trasdotte e le cellule isolate dallo scaffold bianco non hanno mostrato alcuna trasduzione. Le cellule isolate dallo scaffold seminato con PBMC attivate e retrovirus GFP hanno mostrato un'efficienza di trasduzione comparabile alle piastre rivestite di retronectina. Lo scaffold aveva un'efficienza media di trasduzione dell'85%, appena al di sotto del gruppo retronectina. Questi risultati dimostrano che questi scaffold di alginato servono come alternativa più facile ed economica alle cellule T di trasduzione virale senza la necessità di spinoculazione della retronectina.

Figure 3
Figura 3: Quantificazione FACS dell'efficienza di trasduzione . (A) Grafici FACS che mostrano l'espressione di GFP. Le cellule sono state bloccate su cellule vitali, singoletti FSC e cellule GFP positive. (B) Quantificazione delle cellule GFP-positive mediante FACS. La spinoculazione convenzionale di piastre rivestite di retronectina (triangolo invertito viola) è stata utilizzata come controllo positivo. Le cellule non trasdotte (cerchio blu) e le cellule attivate seminate sugli scaffold di alginato senza virus (quadrato rosso) sono state utilizzate come controlli negativi. Gli scaffold seminati con cellule attivate e retrovirus GFP (triangolo verde) avevano un'efficienza di trasduzione dell'85%, paragonabile alla retronectina. Dati rappresentati come media ± deviazione standard con n = 4. Abbreviazioni: GFP = proteina fluorescente verde; FACS = selezione cellulare attivata dalla fluorescenza; SSC-A = area laterale del picco di dispersione; FSC = dispersione in avanti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

File supplementare 1: Protocollo per l'attivazione delle cellule. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S1: Immagini di scaffold di alginato macroporoso secco fabbricati a -80 °C. Il congelamento degli scaffold a -80 °C porta a un aspetto e a una funzione meno uniformi rispetto a quando sono congelati a -20 °C. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

La terapia cellulare CAR-T continua a guadagnare interesse sia per la ricerca che per le applicazioni commerciali. Nonostante il successo della terapia cellulare CAR-T nel trattamento dei tumori del sangue, l'alto costo della procedura ne limita l'uso. Il protocollo qui presentato introduce un nuovo metodo per il trasferimento genico virale delle cellule T senza la necessità di spinoculazione di piastre rivestite di retronectina. La produzione di scaffold di alginato macroporoso secco per mediare la trasduzione è relativamente semplice ed è un sostituto adatto a basso costo per il metodo convenzionale.

Occasionalmente, l'aspetto dell'impalcatura può differire da quelli mostrati nella Figura 2 e può invece apparire chiaro e cristallino piuttosto che bianco e soffice. Ciò può verificarsi a causa di congelamento incoerente a -20 °C a causa di ripetute aperture dello sportello del congelatore o se la piastra da congelare è isolata trovandosi accanto o sopra oggetti ingombranti nel congelatore. Nonostante la differenza di aspetto, il nostro laboratorio non ha sperimentato alcuna differenza nell'efficienza di trasduzione con gli scaffold cristallini. Sebbene il lavoro precedente sulla criogelazione abbia utilizzato temperature di congelamento più basse24,25, abbiamo scoperto che il congelamento a temperature più basse porta a un aspetto e a una funzione dell'impalcatura meno coerenti rispetto a quando congelati a -20 ° C. Le immagini di un'impalcatura creata dal congelamento a -80 °C sono riportate nella figura supplementare S1. Pertanto, si raccomanda comunque di congelare gli scaffold a -20 °C con interruzioni minime e di posizionare la piastra su un ripiano a cremagliera che consenta il flusso d'aria sotto la piastra.

Sebbene questi scaffold abbiano mostrato un'eccellente efficienza di trasduzione, è opportuno notare alcune limitazioni. In primo luogo, è necessario prestare attenzione quando si lavora con EDTA, che può limitare la vitalità cellulare, anche in piccole quantità. Quindi, l'EDTA dovrebbe essere completamente rimosso. Inoltre, la dimensione dell'impalcatura limiterà la quantità di liquido che può essere assorbito e, quindi, il numero di cellule che possono essere trasdotte. Infine, questo protocollo non può essere utilizzato per trasdurre le cellule T non attivate. Il lavoro futuro si concentrerà sulla segnalazione della fabbricazione di scaffold in grado di attivare e proliferare simultaneamente mediate di cellule, promuovere la colocalizzazione di cellule e particelle virali per la trasduzione e rilasciare cellule trasdotte pienamente funzionali in vivo18.

Gli studi pubblicati dal nostro laboratorio riportano l'analisi fenotipica e la funzionalità delle cellule CAR-T generate utilizzando questi scaffold. Le cellule CAR-T CD19-specifiche prodotte da questi scaffold hanno mantenuto il fenotipo effettore e sono state in grado di eliminare le cellule Daudi CD19+ in vitro quando co-coltivate con un rapporto effettore-bersaglio 1: 517. Le cellule CAR-T co-coltivate con cellule Daudi hanno anche rilasciato IL-2 e IFN-γ, che sono citochine proinfiammatorie che indicano che le cellule T sono attivate. Questi risultati dimostrano che questi scaffold producono cellule CAR-T altamente funzionali in vitro. Le cellule CAR-T generate da questi scaffold hanno mostrato un'eccellente funzione antitumorale in vivo contro le cellule Daudi CD19+ marcate con luciferasi. Le cellule CAR-T controllavano efficacemente la crescita tumorale, miglioravano il tasso di sopravvivenza globale e non mostravano alcun segno significativo di tossicità17. Questi risultati indicano che questi scaffold possono essere utilizzati per modificare geneticamente le cellule per la terapia cellulare CAR-T senza influenzare la funzionalità e l'attività antitumorale delle cellule. Studi futuri con questi scaffold di alginato comportano l'ottimizzazione dell'efficienza di trasduzione regolando la macroporosità e le concentrazioni di alginato e calcio.

In conclusione, questi scaffold di alginato macroporoso hanno un'efficienza di trasduzione paragonabile alla retronectina, fornendo un metodo alternativo per trasdurre le cellule per la terapia cellulare CAR-T. Questi scaffold producono anche cellule CAR-T completamente funzionali con attività antitumorale sia in vitro che in vivo17. Gli scaffold Drydux offrono un metodo alternativo semplice e poco costoso per la trasduzione delle cellule T da utilizzare nelle terapie cellulari CAR-T.

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Disclosures

P.A. e Y.B. sono inventori di brevetti relativi all'uso di biomateriali per la generazione di terapie cellulari CAR-T. Y.B. riceve una borsa di ricerca sponsorizzata dall'industria relativa alla tecnologia terapeutica delle cellule CAR-T (non correlata a questo lavoro). Tutti gli altri autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health attraverso i numeri di sovvenzione R37-CA260223, R21CA246414. Ringraziamo il nucleo di citometria a flusso NCSU per la formazione e la guida sull'analisi della citometria a flusso. Gli schemi sono stati creati con Biorender.com

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA Invitrogen 15575-038 UltraPure, pH 8.0
1x DPBS Gibco 14190-144 No calcium chloride or magnesium chloride
3% Acetic Acid with Methylene Blue Stemcell Technologies Inc 07060
Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells - - Fresh or frozen
Calcium-D-Gluconate Alfa Aesar A11649
CD28.2 Antibody BD 555725 1 mg/mL
CD3 Antibody Miltenyi 130-093-387 100 μg/mL
Click's Media FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS 9195
DI Water - -
Glutamax Gibco 35-050-061
HyClone FBS Cytvia SH3039603
HyClone RPMI 1640 Media Cytvia SH3009601
Penicillin-streptomycin (P/S) Gibco 15-140-122
Peripheral Blood Mononuclear Cells - - Fresh or frozen
PRONOVA UP MVG NovaMatrix 4200101 Sodium alginate
Recombinant Human IL-15 Peprotech 200-15 5 ng/mL
Recombinant Human IL-7 Peprotech 200-07 10 ng/mL
Retrovirus - - 1 x 106 TU/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Bioingegneria Numero 187 scaffold di biomateriali alginato macroporoso trasduzione virale immunoterapia cellule CAR-T
Fabbricazione e utilizzo di scaffold di alginato macroporoso secco per la trasduzione virale delle cellule T
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VanBlunk, M., Agarwalla, P., Pandit, … More

VanBlunk, M., Agarwalla, P., Pandit, S., Brudno, Y. Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells. J. Vis. Exp. (187), e64036, doi:10.3791/64036 (2022).

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