Summary
小鼠心脏移植模型是研究移植免疫学的宝贵研究工具。本方案详细介绍了小鼠异位宫颈心脏移植，涉及在受体的颈总动脉和供体的肺动脉干上放置袖带以允许层流血流。
Abstract
心脏移植的小鼠模型经常用于研究缺血再灌注损伤、移植后的先天性和适应性免疫应答，以及免疫调节疗法对移植排斥反应的影响。小鼠异位宫颈心脏移植于1991年首次使用缝合吻合术进行描述，随后进行了修改以包括袖带技术。这种修改可以提高成功率，从那时起，已经有多份报告提出了进一步的技术改进。然而，由于与移植物吻合术相关的技术困难，转化为更广泛的应用仍然有限，这需要精确地达到足够的袖带长度和口径，以避免血管吻合口扭曲或过度紧张，这可能导致移植物受损。本协议描述了一种用于在小鼠中进行异位宫颈心脏移植的改进技术，该技术涉及将袖带放置在受者的颈总动脉和供体的肺动脉上，与血流方向对齐。
Introduction
Abbott等人于 1964年发表了1首关于大鼠异位腹心移植的描述。这些手术技术由小野等人在1969年改进和简化2。Corry等于1973年首次描述了一种在小鼠中进行异位腹心移植的方法;与先前报道的大鼠模型类似，这涉及通过供体肺动脉的端对侧吻合和升主动脉分别将血运重建到受者的下腔静脉和腹主动脉，从而植入宿主的腹部3。Heron于1971年使用由16G（外径1.6mm）静脉导管制成的特氟龙袖带描述了大鼠异位宫颈心脏移植4。Chen5 和Matsuura等人6后来 在1991年报道了小鼠的异位宫颈心脏移植，其技术主要在再吻合方法上有所不同。Chen的方法包括将供体的升主动脉缝合到受体的颈动脉，将供体的肺动脉缝合到受体的颈外静脉5。由于这些显微外科缝合吻合术需要先进的技术技能，因此需要大量的时间和经验才能实现高成功率。Matsuura等人描述了一种利用非缝合袖带技术的方法，类似于Heron使用的方法，该方法涉及使用袖带的腔外放置进行端到端吻合。他用 22 G（外径 0.8 毫米）和 24 克（外径 0.67 毫米）静脉导管制作了特氟龙袖带，并分别将它们放置在接受者的颈外静脉和颈总动脉上6.然后将这些袖带放置在供体的肺动脉和主动脉内，并通过在连接处周围绑上缝合线来固定。这种方法转化为更高的成功率。最重要的是，它缩短了完成两个颈部吻合所需的时间，从而将移植物的温暖缺血时间减少到使用腹部缝合方法的三分之一以下。此外，由于袖带放置在血管外表面周围，因此没有异物暴露在血管腔内，这大大降低了手术后血栓形成的可能性7。同时，使用袖带技术在吻合部位的血管周围提供支撑，而无需任何缝合，从而降低了血运重建后出血的风险6。
已经提出了对这种技术的多次修订。为了适应小鼠颈总动脉的短长度（约5毫米），Tomita等人8开发了这种技术的改进，使用较小的动脉袖带（外径0.6毫米），同时省略了保持缝合线并用细镊子直接将动脉拉过袖带。Wang等人进一步简化了这种方法，分别在供体的右肺动脉和受者的右颈总动脉上放置22 G和24 G袖带9。各种报告描述了对这些方法的修改，包括使用专用袖带、显微外科夹具、血管扩张器和心脏停搏10，11，12。值得注意的是，所有这些方法都涉及血液通过心脏的逆行循环，血液从受体颈总动脉流向供体主动脉，冠状动脉，冠状窦，然后排空到右心房并从肺动脉退出进入受体颈外静脉。
与腹部植入相比，宫颈心脏移植具有多种优势。如前所述，宫颈暴露可以更快地进行血运重建和更短的温暖缺血时间6。宫颈法的侵入性也较小，并且由于避免了剖腹手术6，因此术后恢复时间较短。重要的是，可以进行带袖带的端到端吻合术，而不是端对侧吻合术，从而降低吻合口出血等并发症的风险。腹部入路也增加了在腹主动脉或下腔静脉发生血栓并发症的风险，导致脊髓缺血和后肢麻痹。移植的宫颈浅表位置便于通过触诊、心电图和有创或非侵入性成像进行移植物活力评估。虽然宫颈移植物在再灌注后恢复自发的心脏活动，但它们不会显着影响受者的收缩和舒张期参数。该模型为研究移植后的细胞反应提供了有价值的见解，例如缺血再灌注损伤和移植排斥反应。此外，该模型提供了一种理想的方法，允许移植后成像，例如活体双光子显微镜或正电子发射断层扫描（PET）成像。为此，我们的实验室之前已经报道了对小鼠中移动组织和器官进行成像的方法，包括异位宫颈移植后的跳动鼠心脏和主动脉弓移植物，以可视化缺血再灌注损伤期间和动脉粥样硬化斑块内的白细胞运输，分别13，14，15.此外，由于其表面位置和易于暴露，该模型适用于心脏再移植16。
本报告描述了一种允许层流血流的技术，该技术通过将血管袖带外部放置在血流起源的血管上来实现。这允许血流从一血管平稳过渡到另一血管，避免远端血管边缘暴露在血管腔中。此外，该技术使用更大的20 G袖带，而不是以前使用的22 G袖带，用于供体肺动脉，以确保充足的血流返回受体。
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Protocol
所有动物处理程序均按照NIH实验动物护理和使用指南进行，并得到华盛顿大学医学院动物研究委员会的批准。将来自C57BL / 6（B6）和BALB / c小鼠（重量20-25g）的心脏移植到性别匹配的B6受体（6-8周龄）中。小鼠是从商业来源获得的（见 材料表）。进行同源移植以评估与缺血再灌注损伤相关的细胞反应，并进行同种异体移植以研究与移植物耐受性和排斥反应有关的免疫机制。B6溶菌酶M-绿色荧光蛋白（LysM-GFP）报告小鼠17最初从加利福尼亚州拉霍亚过敏和免疫学研究所的Klaus Ley获得，随后在我们的设施中繁殖，被用作选定实验的接受者，以可视化中性粒细胞浸润到心脏移植物中。使用无菌程序进行生存手术。
1. 捐赠程序
- 通过将氯胺酮（80-100mg / kg）和甲苯噻嗪（8-10mg / kg）（参见 材料表）腹膜内注射到供体小鼠中来麻醉小鼠。用脚趾和尾部捏住确认麻醉的手术平面。
- 通过使用电动剃须刀从胸部和腹部剃除头发来准备手术区域。
- 静脉注射100单位肝素（见 材料表）到静脉（男性）或颈外静脉（男性或女性）。
- 将小鼠置于仰卧位，前肢在头顶。用手术胶带固定前肢和后肢，并用3种0.75%碘和70%乙醇交替擦洗皮肤。
- 从脐部到胸骨角（3-4 cm）进行切口，正中剖腹胸切开术，然后沿每个肋缘（双侧 2 cm）进行双侧开胸术。将前胸壁折叠在颈部，以充分暴露纵隔。
- 切除胸腺并露出胸内下腔静脉。
- 横断横跨腹主动脉宽度以进行放血。
- 对于逆行灌注，将1.5mL的4°C盐水注入胸内下腔静脉，针头朝向移植物，如前所述13。
- 使用8-0连接上腔静脉丝缝合并远端分叉。
- 通过下腔静脉注射另外1.5mL的4°C盐水来重复逆行灌注。
- 使用8-0结扎下腔静脉丝缝合并远端分叉。
- 解剖主动脉弓和肺动脉干以进行移植物采集，并在远端横断。使用6-0丝线结扎心脏后表面的肺静脉，并在远端分开。
- 通过从胸腔中取出供体心脏来进行移植准备。将切除的心脏放入装有4°C肝素化盐水的塑料容器中1-2分钟。将移植物转移到装满冰块的无菌塑料烧瓶上以进行袖带放置（图1A）。
注意：心脏移植物需要在烧瓶上停留约5分钟，以放置供体肺动脉袖带。 - 将1mm长的20G血管导管（ 材料 表）袖带放在供体袖带的肺动脉上。使用细镊子，将动脉边缘轻轻折叠回袖带上。使用10-0尼龙领带将折叠的容器固定在袖口上，如前所述18 （图1B，C）。
- 将供体心脏储存在肝素化盐水或其他保存溶液中，温度为4°C。
注意：虽然有些人可能更喜欢特定的保存解决方案（例如，威斯康星大学的解决方案）来延长缺血性保存，但它可能很昂贵19。生理盐水可能是短时间缺血（<1小时）20的合适替代品。最终，保存溶液的选择取决于实验设计21。
2. 收件人程序
- 腹腔内将氯胺酮（80-100mg / kg）和甲苯噻嗪（8-10mg / kg）注射到受体小鼠中进行麻醉。皮下注射缓释丁丙诺啡（0.5-1.0mg/kg）用于镇痛。用脚趾和尾部捏住确认麻醉的手术平面。
- 通过使用电动剃须刀从颈部区域剃毛来准备手术区域。将无菌、非药物眼药膏涂抹在眼睛上，以防止角膜干燥。
- 将动物置于仰卧位，前肢与身体相邻，头部略微向左转动。用手术胶带固定前肢和后肢。用 0.75% 碘和 70% 乙醇的三种交替磨砂膏对皮肤进行消毒。
- 从下颌骨到胸骨做一个中线颈椎切口。
- 横断右侧胸锁乳突肌。切除下颌下腺的右叶，为移植物植入创造空间。
- 使用6-0丝线在近端颈外静脉上打一个滑结。使用 8-0 结扎远端颈外静脉和相邻分支丝绸缝合线。在颈外静脉前壁上做一个横向切口。
- 在袖带插入期间，将10-0尼龙缝合线穿过近端颈外静脉和下层组织的边缘，以固定静脉（图1D）。
- 使用 8-0 结扎右颈总动脉远端丝线仅不如颈动脉分叉。使用6-0丝线在颈总动脉近端打一个滑结。在缝合线之间远端横断动脉。
- 与供体袖带类似，将 0.6 mm 长的 24 G 血管导管袖带放在受者的右颈总动脉上。使用细镊子，将动脉边缘轻轻折叠回袖带上。使用10-0尼龙领带将折叠的容器固定在袖口上。
- 将供体心脏置于右颈椎区域上方。
- 在植入过程中每隔几分钟将冷盐水滴到心脏移植物上。
- 将10-0尼龙缝合线穿过供体主动脉的边缘，并通过下层组织的浅表咬合将移植物固定到位（图1E）。
- 用 0.5 mL 的 0.9% 肝素化盐水冲洗供体主动脉。
- 将受者的颈总动脉袖带插入供体主动脉。用 8-0 固定吻合口真丝领带（图1F）。移除主动脉锚缝线。
- 用 0.5 mL 的 0.9% 肝素化盐水冲洗受者的颈外静脉，使颈外静脉脱气。
- 通过将供体肺动脉袖带插入受者的颈外静脉并进行肺动脉吻合术，并用 8-0 固定真丝领带（图1G）。移除颈外静脉锚缝线并横断颈外静脉的剩余后壁，以将移植物从下层组织中释放出来。确保移植物方向正确，没有吻合口扭结或扭曲。
- 释放受体颈外静脉上的滑结，然后释放颈总动脉以启动心脏移植再灌注（图1H）。
- 使用中断的6-0尼龙缝合线关闭宫颈皮肤切口。
3. 术后护理
- 手术后立即将受体置于温暖的恢复室中，并密切监测直到从麻醉中完全恢复（约1小时）。
- 手术后继续密切监测动物（每6-8小时）至少72小时，以发现异常行为的迹象，如嗜睡，颤抖，呼吸急促或厌食。
- 为了控制疼痛，每8-12小时皮下注射卡洛芬（5mg / kg）用于镇痛，此外，每8-12小时皮下注射丁丙诺啡（0.05mg / kg），从手术结束时开始24-48小时。
4. 心脏移植物中白细胞运输的活体双光子成像
- 在移植物再灌注后17 小时腹膜内将氯胺酮（80-100mg / kg）和甲苯噻嗪（8-10mg / kg）注射到B6 LysM-GFP受体小鼠中进行麻醉。
- 如前所述，使用 20 G 血管导管进行口腔气管插管，如前所述18。
- 将血管导管连接到小鼠机械呼吸机的管道上，并以 120 次呼吸/分钟的速度和 0.5 mL 的潮气量用室内空气通气18.
- 如前所述，注入 12 μL 655 nm 非靶向量子点（参见 材料表），悬浮在 50 μL PBS 中，如前所述 13。
- 重新打开颈部切口以暴露心脏移植物。将鼠标放在稳定室中。
- 使用薄薄的组织粘合剂（见 材料表）固定左心室游离壁的一部分，应用于连接到上腔室板的玻璃盖玻片上。
- 将腔室置于双光子显微镜物镜下以获取图像和视频，如前所述13。
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Representative Results
该小鼠宫颈异位心脏移植模型已用于我们实验室的1，000多例移植，存活率约为97%。成功率略高于先前在小鼠中使用其他宫颈异位心脏移植技术的报告10，11，20。这可能归因于放置在供体肺动脉上的更大的20 G袖带，以确保血流充分返回受体（图1B，C）。此外，在目前技术中，血流与袖带放置的对齐可最大限度地降低血栓形成和吻合口湍流的风险（图1，2）。虽然磁共振成像（MRI）或超声可以评估移植物灌注的湍流22，23，但我们尚未在实验中使用这些技术。对于经验丰富的显微外科医生来说，使用这种技术的术中死亡很少见。术后死亡通常是由于出血并发症。平均受者手术时间为36.5±3.5 min，平均冷缺血时间为20 min。对于生存研究，每天通过直接可视化和心跳数字触诊来评估心脏移植物。通常在术后7-14天左右处死小鼠进行移植物评估。活体双光子成像是一种终末程序，通常在移植后早期进行，以评估白细胞运输（图3）。
大多数同系移植在处死前保持强烈的心跳，移植后长达6个月。在粗略检查中，大多数同系移植物看起来正常，组织学检查显示没有排斥反应的证据。所有非免疫抑制的同种异体移植（BALB/c转换为B6）在植入后1-2周内出现心跳减弱。从这些小鼠切除的同种异体移植物严重扩张，组织学检查显示淋巴细胞弥漫性浸润和心肌坏死区域。
图1：用于移植的心脏移植物的准备 。 （A）从供体小鼠中切除心脏。（乙，丙）将肺动脉干暴露并通过 20 G 袖带拉动，向后折叠，并用 10-0 尼龙缝合线固定。（D）将10-0尼龙缝合线穿过受体颈外静脉的边缘并固定在下面的组织上。（E）将10-0尼龙缝合线穿过供体主动脉的边缘并固定在与受体颈动脉相邻的下层组织上。（F）将受者的颈总动脉袖带插入供体主动脉并用8-0固定丝绸缝合线。（G）将供体肺动脉袖带插入受者的颈外静脉并用8-0固定丝绸缝合线。（H）受者颈外静脉近端滑结松解，颈总动脉滑结松解。 请点击此处查看此图的大图。
图2：心脏移植物的术中视图。 将 1 mm 20 G 袖带拉过供体的肺动脉，并用 10-0 尼龙领带固定。将 0.6 mm 24 G 袖带拉过接受者的右颈总动脉，并用 10-0 尼龙领带固定。锚缝线（10-0尼龙）放置在供体主动脉壁和受者右侧颈外静脉中，并固定在下面的组织上，以防止袖带插入期间移动。（AO = 主动脉，PA = 肺动脉，CCA = 颈总动脉，EJV = 颈外静脉）。 请点击此处查看此图的大图。
图3：心脏移植物中白细胞动力学的活体双光子成像。 从B6小鼠移植到B6 LysM-GFP受体的跳动心脏的活体双光子成像显示受体中性粒细胞在术后2-3小时之间转运到心脏移植组织中。（绿色=中性粒细胞，红色=用量子点标记的血管）。比例尺 = 20 μm。 请点击此处查看此图的大图。
| 并发症 | 可能的原因 | 解决 方案 |
| 收件人死亡 | 低温 | 加热垫 |
| 脱水 | 0.9%盐水 术后腹腔注射 | |
| 移植物灌注不良 | 颈动脉扭转 | 再吻合术，或 |
| 血栓或空气栓塞 | 开放动脉吻合术并用肝素化盐水冲洗 | |
| 静脉阻塞 | 血栓或空气栓塞 | 再吻合术，或 |
| 开放静脉吻合并用肝素化盐水冲洗 | ||
| 术后出血 | 颈静脉分支出血 | 结扎颈静脉分支 |
| 棉签压缩 | ||
| 宽松袖口 | 收紧袖口 | |
| 心跳微弱 | 冷心脏移植物 | 将温盐水滴在心脏表面 |
| 嫁接扭曲 | 移植位置不当 | 确保在皮肤闭合前移植物的方向正确 |
| 不稳定的活动（例如绕圈跑步） | 脑缺血 | 结扎颈总动脉低于颈动脉分叉 |
表 1：并发症的故障排除。 解决方案通常遇到的并发症。
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Discussion
利用这种技术，经验丰富的显微外科医生可以在不到40分钟的时间内进行小鼠异位宫颈心脏移植，入门级显微外科医生可以在大约60分钟内进行小鼠异位宫颈心脏移植。虽然宫颈心脏移植已经在许多动物模型中进行了研究，但由于多种明确定义的遗传菌株、遗传改变能力以及包括单克隆抗体在内的多种试剂的可用性，小鼠模型仍然是黄金标准24。这里描述的技术为移植后监测提供了独特的机会，例如心电图或活体成像，包括双光子显微镜（图3）或连续非侵入性PET成像13，14，15，25。该方法为心脏移植物提供了一个表面位置，更容易稳定以进行活体成像，从而避免了由于移植物和周围腹部器官的位置更深而导致的腹部移植方法固有的复杂性。此外，该技术在再移植的情况下特别有用。再移植模型是识别移植心脏移植物中介导同种免疫反应的常驻细胞的有力工具。虽然我们之前在小鼠心脏再移植模型中使用过这种技术来评估短期结果，但这种方法可以在未来的实验中扩展以探索长期结果16。为此，到目前为止，目前的研究已经使用了短时间的冷缺血（约20分钟）。未来的研究可以调查长时间冷缺血或热缺血对短期和长期结局的影响，以更接近临床移植。
需要考虑该技术的几个关键步骤。以前的方法涉及将较小的颈外静脉上的袖带插入供体肺动脉的大腔6，8。将较大的袖带放置在供体肺动脉上以建立正确的血流方向，使得将袖带插入较小的颈外静脉略微困难。将静脉边缘固定在下层组织上，仅部分切开静脉的前壁，便于袖带插入。此外，由于血管口径小，袖带放置在受体的颈总动脉上可能非常具有挑战性。因此，先前的技术已经报道了使用较小的袖带（例如，26 G）进行这种吻合12。然而，目前的方法使用更大的24 G袖带来确保足够的移植物灌注，我们认为这可能会提供一些生存益处。选择较大的受体小鼠可能有助于新手显微外科医生。再灌注后移除锚合线，并且移植物没有像其他人描述的那样固定在正确的方向上3。因此，在宫颈皮肤闭合之前检查移植物的位置和方向是否正确，以防止扭曲或扭转非常重要（表 1）。切除右下颌下腺，为心脏移植物提供足够的空间，从而避免皮肤闭合后移植物压迫。
此处描述的模型具有几个优点。通过将袖带放在供体肺动脉干和受者的颈总动脉上，袖带方向与血流方向对齐。这降低了湍流和血栓形成的可能性。其次，使用更大的 20 G 肺动脉袖带来确保血流充分返回受体。第三，在颈总动脉上放置一个更大的24 G袖带，以确保移植物充分灌注。最后，使用10-0尼龙锚缝线将移植物固定到下面的组织并促进袖带插入。这些修改有助于克服手术的技术挑战，防止吻合口湍流，并减少术后并发症，如血栓形成。
所有小鼠心脏移植模型的一个重要限制是生理血流无法通过心脏腔室恢复。相反，这些模型依赖于通过冠状动脉血管的循环。这种逆行流动模式对移植物细胞损伤和免疫反应的影响尚未明确描述;然而，这种非生理循环产生的机械剪切力可能会影响免疫反应。恢复生理血流的小鼠心脏移植手术模型尚未开发，需要大量的技术进步。据观察，一小部分小鼠（<3%）在手术后经历了短暂的不稳定行为（例如，绕圈奔跑）。这种行为在消退前持续约1-2小时。鉴于使用相同麻醉方案的其他手术后未观察到这种行为，它可能与宫颈心脏移植后血流改变引起的短暂性脑缺血有关。所有小鼠都发生了完全恢复，没有观察到任何慢性缺陷。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
DK得到了美国国立卫生研究院拨款1P01AI116501，R01HL094601，R01HL151078，退伍军人管理局功绩审查拨款1I01BX002730和巴恩斯犹太医院基金会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 braided silk ties | Henry Schein Inc | 7718729 | |
| 0.75% Providone iosine scrub | Priority Care Inc | NDC 57319-327-0 | |
| 10-0 nylon suture | Surgical Specialties Corporation | AK-0106 | |
| 655-nm nontargeted Q-dots | Invitrogen | Q21021MP | |
| 70% Ethanol | Pharmco Products Inc | 111000140 | |
| 8-0 braided silk ties | Henry Schein Inc | 1005597 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools Inc | 91127-12 | |
| BALB/c and C57BL/6 mice (6-8 weeks) | Jackson Laboratories | ||
| Bipolar coagulator | Valleylab Inc | SurgII-20, E6008/E6008B | |
| Carprofen (Rimadyl) injection | Transpharm | 35844 | |
| Carprofen (Rimadyl) oral chewable tablet | Transpharm | 38995/37919 | |
| Custom-built 2P microscope running ImageWarp acquisition software | A&B Software | ||
| Dumont no. 5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11251-20 | |
| Fine vannas style spring scissors | Fine Science Tools Inc | 15000-03 | |
| GraphPad Prism 5.0 | Sun Microsystems Inc. | ||
| Halsey needle holder | Fine Science Tools Inc | 91201-13 | |
| Halsted-Mosquito clamp curved tip | Fine Science Tools Inc | 91309-12 | |
| Harvard Apparatus mouse ventilator model 687 | Harvard Apparatus | MA1 55-0001 | |
| Heparin solution (100 U/mL) | Abraxis Pharmaceutical Products | 504031 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine (50 mg/kg) | Wyeth | 206205-01 | |
| Microscope—Leica Wild M651 × 6–40 magnification | Leica Microsystems | ||
| Moria extra fine spring scissors | Fine Science Tools Inc | 15396-00 | |
| Ohio isoflurane vaporizer | Parkland Scientific | V3000i | |
| Qdots | ThermoFisher | 1604036 | |
| S&T SuperGrip Forceps angled tip | Fine Science Tools Inc | 00649-11 | |
| S&T SuperGrip Forceps straight tip | Fine Science Tools Inc | 00632-11 | |
| Sterile normal saline (0.9% (wt/vol) sodium chloride | Hospira Inc | NDC 0409-4888-20 | |
| Sterile Q-tips (tapered mini cotton tipped 3-inch applicators) | Puritan Medical Company LLC | 823-WC | |
| Surflow 20 gauge 1/4-inch Teflon angiocatheter | Terumo Medical Corporation | SR-OX2032CA | |
| Surflow 24 gauge 3/4-inch Teflon angiocatheter | Terumo Medical Corporation | R-OX2419CA | |
| ThermoCare Small Animal ICU System (recovery settings 3 L/min O2, 80 °C, 40% humidity) | Thermocare Inc | ||
| VetBond | Santa Cruz Biotechnology SC361931 | NC0846393 | |
| Xylazine (10 mg/kg) | Lloyd Laboratories | 139-236 |
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