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Immunology and Infection

माउस हेटेरोटोपिक सर्वाइकल कार्डियक प्रत्यारोपण संवहनी कफ का उपयोग कर

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/64089
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3, 4, 1,3
1Department of Surgery, Washington University School of Medicine, 2Department of Surgery, The University of Maryland, 3Department of Pathology & Immunology, Washington University School of Medicine, 4Department of Medicine, Washington University School of Medicine

Summary

माउस कार्डियक प्रत्यारोपण मॉडल प्रत्यारोपण इम्यूनोलॉजी का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान अनुसंधान उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल माउस हेटेरोटोपिक ग्रीवा कार्डियक प्रत्यारोपण का विवरण देता है जिसमें प्राप्तकर्ता की सामान्य कैरोटिड धमनी और दाता के फुफ्फुसीय धमनी ट्रंक पर कफ का प्लेसमेंट शामिल है ताकि लैमिनर रक्त प्रवाह की अनुमति मिल सके।

Abstract

कार्डियक प्रत्यारोपण के मुराइन मॉडल का उपयोग अक्सर इस्केमिया-रीपरफ्यूजन चोट, प्रत्यारोपण के बाद जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और ग्राफ्ट अस्वीकृति पर इम्यूनोमॉड्यूलेटरी थेरेपी के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। चूहों में हेटेरोटोपिक सर्वाइकल हार्ट ट्रांसप्लांटेशन को पहली बार 1991 में सीवन्ड एनास्टोमोस का उपयोग करके वर्णित किया गया था और बाद में कफ तकनीकों को शामिल करने के लिए संशोधित किया गया था। इस संशोधन ने बेहतर सफलता दर की अनुमति दी, और तब से, कई रिपोर्टें हैं जिन्होंने आगे तकनीकी सुधारों का प्रस्ताव दिया है। हालांकि, ग्राफ्ट एनास्टोमोस से जुड़ी तकनीकी कठिनाई के कारण अधिक व्यापक उपयोग में अनुवाद सीमित रहता है, जिसके लिए संवहनी एनास्टोमोटिक ट्विस्टिंग या अत्यधिक तनाव से बचने के लिए कफ की पर्याप्त लंबाई और कैलिबर प्राप्त करने के लिए सटीकता की आवश्यकता होती है, जिसके परिणामस्वरूप ग्राफ्ट को नुकसान हो सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल चूहों में हेटरोटोपिक ग्रीवा कार्डियक प्रत्यारोपण करने के लिए एक संशोधित तकनीक का वर्णन करता है जिसमें रक्त प्रवाह की दिशा के साथ संरेखण में प्राप्तकर्ता की सामान्य कैरोटिड धमनी और दाता की फुफ्फुसीय धमनी पर कफ प्लेसमेंट शामिल है।

Introduction

एबॉट एट अल ने1964 में चूहों में हेटरोटोपिक पेट हृदय प्रत्यारोपण का पहला विवरण प्रकाशित किया। इन शल्य चिकित्सा तकनीकों को 1969 में ओनो एट अल द्वारा परिष्कृत और सरलीकृत कियागया था। कोरी एट अल ने पहली बार 1973 में चूहों में हेटरोटोपिक पेट हृदय प्रत्यारोपण के लिए एक विधि का वर्णन किया; पहले रिपोर्ट किए गए चूहे के मॉडल के समान, इसमें दाता की फुफ्फुसीय धमनी के एंड-टू-साइड एनास्टोमोस द्वारा रिवैस्कुलराइजेशन के साथ मेजबान के पेट में एनग्राफ्टमेंट शामिल थाऔर क्रमशः प्राप्तकर्ता के अवर वेना कावा और पेट की महाधमनी में चढ़ना शामिल था। चूहों में हेटेरोटोपिक सर्वाइकल हार्ट प्रत्यारोपण का वर्णन हेरॉन द्वारा 1971 में 16 जी (1.6 मिमी बाहरी व्यास) अंतःशिरा कैथेटर4 से बने टेफ्लॉन कफ का उपयोग करके किया गया था। चेन5 और मात्सुउरा एट अल.6 ने बाद में 1991 में चूहों में हेटरोटोपिक ग्रीवा हृदय प्रत्यारोपण की सूचना दी, जिनकी तकनीक मुख्य रूप से पुन: एनास्टोमोसिस की उनकी विधि में भिन्न थी। चेन के दृष्टिकोण में दाता की आरोही महाधमनी को प्राप्तकर्ता की कैरोटिड धमनी और दाता की फुफ्फुसीय धमनी को प्राप्तकर्ता की बाहरी जुगुलर नस में जोड़ागया। इन माइक्रोसर्जिकल सीवन एनास्टोमोस के लिए आवश्यक उन्नत तकनीकी कौशल के कारण, उच्च सफलता दर प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण समय और अनुभव आवश्यक था। मात्सुउरा एट अल ने हेरॉन द्वारा उपयोग की जाने वाली एक गैर-सीवन कफ तकनीक का उपयोग करने वाली एक विधि का वर्णन किया, जिसमें कफ के अतिरिक्त-ल्यूमिनल प्लेसमेंट का उपयोग करके एंड-टू-एंड एनास्टोमोस शामिल थे। उन्होंने 22 जी (0.8 मिमी बाहरी व्यास) और 24 जी (0.67 मिमी बाहरी व्यास) अंतःशिरा कैथेटर से टेफ्लॉन कफ तैयारकिए और उन्हें क्रमशः प्राप्तकर्ता की बाहरी जुगुलर नस और सामान्य कैरोटिड धमनी पर रखा। इन कफ को तब दाता की फुफ्फुसीय धमनी और महाधमनी के अंदर रखा गया था और कनेक्शन के चारों ओर एक सीवन लिगेचर बांधकर सुरक्षित किया गया था। इस दृष्टिकोण ने एक बेहतर सफलता दर में अनुवाद किया। सबसे महत्वपूर्ण बात, इसके परिणामस्वरूप गर्भाशय ग्रीवा एनास्टोमोस दोनों को पूरा करने के लिए आवश्यक समय कम हो गया, इस प्रकार ग्राफ्ट के गर्म इस्केमिक समय को पेट की ट्यूरिंग विधि का उपयोग करके एक तिहाई से भी कम कर दिया गया। इसके अलावा, चूंकि कफ को पोत की बाहरी सतह के चारों ओर रखा जाता है, इसलिए पोत लुमेन के संपर्क में कोई विदेशी शरीर नहीं होता है, जो सर्जरी के बाद घनास्त्रता की संभावना को काफी हद तक कम करदेता है। इस बीच, कफ तकनीक का उपयोग किसी भी ट्यूरिंग की आवश्यकता के बिना एनास्टोमोसिस की साइट पर वाहिकाओं के आसपास समर्थन प्रदान करता है, जो रिवैस्कुलराइजेशन 6 के बाद रक्तस्राव के जोखिम को कम करताहै।

इस तकनीक के कई संशोधन प्रस्तावित किए गए हैं। माउस कॉमन कैरोटिड धमनी (लगभग 5 मिमी) की छोटी लंबाई को समायोजित करने के लिए, टोमिता एट अल.8 ने इस तकनीक का एक संशोधन एक छोटे धमनी कफ (0.6 मिमी बाहरी व्यास) के साथ विकसित किया, जबकि सीवन को पकड़ने और इसके बजाय ठीक बल के साथ सीधे कफ के माध्यम से धमनी को खींचने का काम किया। वांग एट अलने दाता की दाईं फुफ्फुसीय धमनी और प्राप्तकर्ता की दाईं सामान्य कैरोटिड धमनी पर क्रमशः 22 जी और 24 जी कफ रखकर इस दृष्टिकोण को और सरल बनाया। विभिन्न रिपोर्टों ने इन दृष्टिकोणों में संशोधनों का वर्णन किया है, जिसमें विशेष कफ, माइक्रोसर्जिकल क्लैंप, पोत डायलेटर और कार्डियोप्लेजिया10,11,12 का उपयोग शामिल है। विशेष रूप से, इन सभी तरीकों में हृदय के माध्यम से रक्त का प्रतिगामी परिसंचरण शामिल होता है, जिसमें रक्त प्राप्तकर्ता सामान्य कैरोटिड धमनी से दाता महाधमनी, कोरोनरी धमनियों, कोरोनरी साइनस में बहता है, फिर दाहिने आलिंद में खाली होता है और फुफ्फुसीय धमनी से प्राप्तकर्ता बाहरी जुगुलर नस में बाहर निकलता है।

पेट में सूजन की तुलना में, ग्रीवा हृदय प्रत्यारोपण कई फायदे प्रदान करता है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, गर्भाशय ग्रीवा एक्सपोजर तेजी से रिवैस्कुलराइजेशन और कम गर्म इस्केमिक समय6 की अनुमति देता है। ग्रीवा विधि भी कम आक्रामक है और कम पोस्टऑपरेटिव रिकवरी समय से जुड़ी है क्योंकि यह लैप्रोटॉमी6 से बचती है। महत्वपूर्ण रूप से, कफ के साथ एंड-टू-एंड एनास्टोमोस को एंड-टू-साइड एनास्टोमोस के बजाय किया जा सकता है, जो एनास्टोमोटिक रक्तस्राव जैसी जटिलताओं के जोखिम को कम करता है। पेट के दृष्टिकोण से पेट की महाधमनी या अवर वेना कावा में थ्रोम्बोटिक जटिलताओं के विकास का खतरा भी बढ़ जाता है, जिससे रीढ़ की हड्डी इस्किमिया और हिंदलिम्ब पक्षाघात होता है। प्रत्यारोपण का सतही ग्रीवा स्थान धड़कन, इलेक्ट्रोकार्डियोग्राफी और इनवेसिव या गैर-इनवेसिव इमेजिंग द्वारा ग्राफ्ट व्यवहार्यता मूल्यांकन तक आसान पहुंच की अनुमति देता है। यद्यपि सर्वाइकल ग्राफ्ट रीपरफ्यूजन के बाद सहज हृदय गतिविधि को फिर से शुरू करते हैं, लेकिन वे प्राप्तकर्ता के सिस्टोलिक और डायस्टोलिक मापदंडों को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं करते हैं। यह मॉडल प्रत्यारोपण के बाद सेलुलर प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, जैसे कि इस्किमिया-रीपरफ्यूजन चोट और ग्राफ्ट अस्वीकृति। इसके अलावा, यह मॉडल पोस्ट-ट्रांसप्लांट इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिए एक आदर्श दृष्टिकोण प्रदान करता है, जैसे कि इंट्रावाइटल टू-फोटॉन माइक्रोस्कोपी या पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) इमेजिंग। इसके लिए, हमारी प्रयोगशाला ने पहले माउस में गतिशील ऊतकों और अंगों की छवि बनाने के तरीकों की सूचना दी है, जिसमें हेटेरोटोपिक ग्रीवा प्रत्यारोपण के बाद मुराइन दिल और महाधमनी आर्क ग्राफ्ट को मारना शामिल है, ताकि इस्किमिया-रीपरफ्यूजन चोट के दौरान और एथेरोस्क्लेरोटिक प्लेकके भीतर ल्यूकोसाइट तस्करी की कल्पना की जा सके। . इसके अतिरिक्त, इसके सतही स्थान और जोखिम में आसानी के कारण, यह मॉडल कार्डियक री-ट्रांसप्लांटेशन16 के लिए उपयुक्त है।

यह रिपोर्ट एक ऐसी तकनीक का वर्णन करती है जो उन वाहिकाओं पर संवहनी कफ के बाहरी प्लेसमेंट के साथ लैमिनर रक्त प्रवाह की अनुमति देती है जिनसे रक्त प्रवाह उत्पन्न होता है। यह एक वाहिका से दूसरे में रक्त प्रवाह के सुचारू संक्रमण की अनुमति देता है, जिससे संवहनी लुमेन में डिस्टल वाहिका किनारे के संपर्क से बचा जा सकता है। इसके अतिरिक्त, यह तकनीक दाता फुफ्फुसीय धमनी के लिए पहले इस्तेमाल किए गए 22 जी कफ के बजाय एक बड़े 20 जी कफ का उपयोग करती है, ताकि प्राप्तकर्ता को रक्त प्रवाह की पर्याप्त वापसी सुनिश्चित हो सके।

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Protocol

सभी पशु हैंडलिंग प्रक्रियाओं को एनआईएच देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग दिशानिर्देशों के अनुपालन में आयोजित किया गया था और वाशिंगटन यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन में पशु अध्ययन समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। C57BL/6 (B6) और BALB/c चूहों (वजन 20-25 ग्राम) के दिलों को लिंग-मिलान वाले B6 प्राप्तकर्ताओं (6-8 सप्ताह की आयु) में प्रत्यारोपित किया गया था। चूहों को वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। इस्केमिया-रीपरफ्यूजन चोट से संबंधित सेलुलर प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए सिंजेनिक प्रत्यारोपण किए गए थे, और ग्राफ्ट सहिष्णुता और अस्वीकृति में शामिल प्रतिरक्षा तंत्र की जांच के लिए एलोजेनिक प्रत्यारोपण किए गए थे। बी 6 लाइसोजाइम एम-ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (लिसएम-जीएफपी) रिपोर्टर चूहों17, मूल रूप से ला जोला इंस्टीट्यूट फॉर एलर्जी एंड इम्यूनोलॉजी, ला जोला, सीए के क्लॉस ली से प्राप्त किया गया था, और बाद में हमारी सुविधा में पैदा हुआ, कार्डियक ग्राफ्ट में न्यूट्रोफिल घुसपैठ की कल्पना करने के लिए चयनित प्रयोगों के लिए प्राप्तकर्ताओं के रूप में उपयोग किया गया था। एसेप्टिक प्रक्रियाओं का उपयोग करके उत्तरजीविता सर्जरी की गई थी।

1. दाता प्रक्रिया

  1. दाता माउस में इंट्रापेरिटोनियल रूप से केटामाइन (80-100 मिलीग्राम / किग्रा) और ज़ाइलाज़िन (8-10 मिलीग्राम / किग्रा) इंजेक्ट करके चूहों को एनेस्थेटाइज करें। पैर की अंगुली और पूंछ की चुटकी के साथ संज्ञाहरण के सर्जिकल प्लेन की पुष्टि करें।
  2. इलेक्ट्रिक रेजर का उपयोग करके छाती और पेट से बालों को शेव करके सर्जिकल क्षेत्र तैयार करें।
  3. हेपरिन की 100 इकाइयों ( सामग्री की तालिका देखें) को पेनाइल नस (पुरुषों) या बाहरी जुगुलर नस (पुरुषों या महिलाओं) में अंतःशिरा रूप से प्रशासित करें।
  4. चूहों को ऊपर के अग्रभाग के साथ लापरवाह स्थिति में रखें। सर्जिकल टेप के साथ अग्रभाग और हिंदलिम्ब को सुरक्षित करें और 0.75% आयोडीन और 70% इथेनॉल के तीन वैकल्पिक स्क्रब के साथ त्वचा को कीटाणुरहित करें।
  5. उम्बिलिकस से उरोस्थि कोण (3-4 सेमी) तक एक चीरा, औसत लैप्रोस्टेरोटॉमी करें, इसके बाद प्रत्येक कॉस्टल मार्जिन (द्विपक्षीय रूप से 2 सेमी) के साथ एक द्विपक्षीय थोराकोटॉमी करें। मीडियास्टिनम के पूर्ण जोखिम के लिए गर्दन पर पूर्ववर्ती छाती की दीवार को मोड़ें।
  6. थाइमस का उत्पादन करें और इंट्राथोरेसिक अवर वेना कावा को उजागर करें।
  7. एक्ससेंगुइनेशन के लिए पेट की महाधमनी की चौड़ाई को सही करें।
  8. प्रतिगामी छिड़काव के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस के 1.5 एमएल खारा को इंट्राथोरेसिक अवर वेना कावा में इंजेक्ट करें, जिसमें सुई ग्राफ्ट की ओर बेहतर रूप से उन्मुख हो, जैसा कि पहलेवर्णित 13 में वर्णित है।
  9. 8-0 का उपयोग करके बेहतर वेना कावा को परिभाषित करें रेशम सीवन और दूर से विभाजित करें।
  10. अवर वेना कावा के माध्यम से 4 डिग्री सेल्सियस खारा के एक और 1.5 एमएल इंजेक्ट करके प्रतिगामी छिड़काव को दोहराएं।
  11. 8-0 का उपयोग करके अवर वेना कावा को हटा दें रेशम सीवन और दूर से विभाजित करें।
  12. ग्राफ्ट कटाई के लिए महाधमनी आर्क और फुफ्फुसीय धमनी ट्रंक को विच्छेदित करें और दोनों को बाहर से सही करें। 6-0 रेशम सीवन का उपयोग करके हृदय की पीछे की सतह पर फुफ्फुसीय नसों को लपेटें और बाहर से विभाजित करें।
  13. छाती गुहा से दाता हृदय को हटाकर ग्राफ्ट तैयारी करें। एक्साइज्ड हार्ट को 1-2 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस हेपरिनाइज्ड खारा से भरे प्लास्टिक कंटेनर में रखें। कफ प्लेसमेंट के लिए बर्फ से भरे बाँझ प्लास्टिक फ्लास्क पर ग्राफ्ट को स्थानांतरित करें (चित्रा 1 ए)।
    नोट: हृदय ग्राफ्ट को दाता फुफ्फुसीय धमनी कफ रखने के लिए लगभग 5 मिनट के लिए फ्लास्क पर रहने की आवश्यकता होती है।
  14. दाता कफ के लिए फुफ्फुसीय धमनी पर 1 मिमी लंबा 20 जी एंजियोकैथेटर ( सामग्री की तालिका देखें) कफ रखें। ठीक बल का उपयोग करके, धीरे से कफ के ऊपर धमनी के किनारों को मोड़ें। मुड़े हुए पोत को 10-0 नायलॉन टाई का उपयोग करके कफ में सुरक्षित करें, जैसा कि पहले18 (चित्रा 1 बी, सी) वर्णित है।
  15. दाता के दिल को हेपरिनाइज्ड खारा या किसी अन्य संरक्षण समाधान में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: जबकि कुछ लंबे समय तक इस्केमिक संरक्षण के लिए विशिष्ट संरक्षण समाधान (जैसे, विस्कॉन्सिन समाधान विश्वविद्यालय) पसंद कर सकते हैं,यह महंगा हो सकता है। इस्किमिया (<1 घंटे) 20 की छोटी अवधि के लिए खारा एक उपयुक्त विकल्प हो सकता है। अंततः, संरक्षण समाधान की पसंद प्रयोगात्मक डिजाइन21 पर निर्भर करती है।

2. प्राप्तकर्ता प्रक्रिया

  1. एनेस्थीसिया के लिए प्राप्तकर्ता माउस में केटामाइन (80−100 मिलीग्राम / किग्रा) और ज़ाइलज़िन (8-10 मिलीग्राम / किग्रा) इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्ट करें। एनाल्जेसिया के लिए निरंतर-रिलीज ब्यूप्रेनोर्फिन (0.5-1.0 मिलीग्राम / किग्रा) को चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें। पैर की अंगुली और पूंछ की चुटकी के साथ संज्ञाहरण के सर्जिकल प्लेन की पुष्टि करें।
  2. इलेक्ट्रिक रेजर का उपयोग करके ग्रीवा क्षेत्र से बालों को शेव करके सर्जिकल क्षेत्र तैयार करें। कॉर्नियल सुखाने से रोकने के लिए आंखों पर बाँझ, गैर-औषधीय नेत्र मलहम लागू करें।
  3. जानवर को शरीर से सटे अग्रभागों के साथ लापरवाह स्थिति में रखें और सिर बाईं ओर थोड़ा मुड़ा हुआ हो। सर्जिकल टेप के साथ अग्रभाग और पिछले अंगों को सुरक्षित करें। 0.75% आयोडीन और 70% इथेनॉल के तीन वैकल्पिक स्क्रब के साथ त्वचा को कीटाणुरहित करें।
  4. निचले जबड़े से उरोस्थि तक मध्य रेखा ग्रीवा चीरा लगाएं।
  5. दाहिने स्टर्नोक्लेडोमास्टोइड मांसपेशी को सही करें। ग्राफ्ट आरोपण के लिए जगह बनाने के लिए सबमैंडिबुलर ग्रंथि के दाहिने लोब का उत्पादन।
  6. 6-0 रेशम सीवन का उपयोग करके समीपस्थ बाहरी जुगुलर नस पर एक स्लिपनॉट बांधें। 8-0 का उपयोग करके डिस्टल बाहरी जुगुलर नस और आसन्न शाखाओं को लाइगेट करें रेशम सीवन। बाहरी जुगुलर नस की पूर्ववर्ती दीवार पर एक अनुप्रस्थ चीरा लगाएं।
  7. कफ सम्मिलन के दौरान नस को सुरक्षित करने के लिए समीपस्थ बाहरी जुगुलर नस और अंतर्निहित ऊतक के किनारे के माध्यम से 10-0 नायलॉन सीवन रखें (चित्रा 1 डी)।
  8. 8-0 का उपयोग करके डिस्टल राइट कॉमन कैरोटिड धमनी को लिपिगेट करें रेशम सीवन कैरोटिड विभाजन से कमतर है। 6-0 रेशम सीवन का उपयोग करके समीपस्थ सामान्य कैरोटिड धमनी पर एक स्लिपनॉट बांधें। सीवन के बीच की धमनी को बाहर की ओर सही करें।
  9. दाता कफ के समान, प्राप्तकर्ता की दाईं सामान्य कैरोटिड धमनी के ऊपर 0.6 मिमी लंबा 24 जी एंजियोकैथेटर कफ रखें। ठीक बल का उपयोग करके, धीरे से कफ के ऊपर धमनी के किनारों को मोड़ें। 10-0 नायलॉन टाई का उपयोग करके मुड़े हुए बर्तन को कफ में सुरक्षित करें।
  10. दाता के दिल को दाहिने ग्रीवा क्षेत्र से बेहतर रखें।
  11. प्रत्यारोपण के दौरान हर कुछ मिनट में हार्ट ग्राफ्ट पर ठंडा खारा टपकाएं।
  12. दाता महाधमनी के किनारे के माध्यम से और अंतर्निहित ऊतक के सतही काटने के माध्यम से ग्राफ्ट को सुरक्षित करने के लिए 10-0 नायलॉन सीवन रखें (चित्रा 1 ई)।
  13. दाता महाधमनी को 0.9% हेपरिनाइज्ड खारा के 0.5 एमएल के साथ फ्लश करें।
  14. प्राप्तकर्ता के सामान्य कैरोटिड धमनी कफ को दाता महाधमनी में डालें। एनास्टोमोसिस को 8-0 से सुरक्षित करें रेशम टाई (चित्र 1 एफ)। महाधमनी लंगर सीवन को हटा दें।
  15. प्राप्तकर्ता की बाहरी जुगुलर नस को 0.5 एमएल 0.9% हेपरिनाइज्ड सेलाइन के साथ फ्लश करके बाहरी जुगुलर नस को डी-एयर करें।
  16. प्राप्तकर्ता की बाहरी जुगुलर नस में दाता फुफ्फुसीय धमनी कफ डालकर फुफ्फुसीय धमनी एनास्टोमोसिस करें और 8-0 के साथ सुरक्षित करें रेशम टाई (चित्रा 1 जी)। बाहरी जुगुलर नस लंगर सीवन को हटा दें और अंतर्निहित ऊतक से ग्राफ्ट को मुक्त करने के लिए बाहरी जुगुलर नस की शेष पीछे की दीवार को सही करें। सुनिश्चित करें कि ग्राफ्ट एनास्टोमोस के गांठ या घुमाव के बिना ठीक से उन्मुख है।
  17. प्राप्तकर्ता की बाहरी जुगुलर नस पर स्लिपनॉट्स को छोड़ दें, जिसके बाद सामान्य कैरोटिड धमनी को हार्ट ग्राफ्ट रीपरफ्यूजन (चित्रा 1 एच) शुरू करने के लिए छोड़ दिया जाता है।
  18. एक बाधित 6-0 नायलॉन सीवन का उपयोग करके ग्रीवा त्वचा चीरा को बंद करें।

3. पोस्टऑपरेटिव देखभाल

  1. सर्जरी के तुरंत बाद प्राप्तकर्ता को गर्म रिकवरी कक्ष में रखें और संज्ञाहरण (लगभग 1 घंटे) से पूरी तरह से ठीक होने तक बारीकी से निगरानी करें।
  2. असामान्य व्यवहार के संकेतों के लिए सर्जरी के बाद कम से कम 72 घंटे तक जानवर (हर 6-8 घंटे) की बारीकी से निगरानी करना जारी रखें, जैसे कि सुस्ती, झटकों, तेजी से सांस लेना, या एनोरेक्सिया।
  3. दर्द नियंत्रण के लिए, सर्जरी के अंत में शुरू होने वाले 24-48 घंटे के लिए हर 8-12 घंटे में चमड़े के नीचे ब्यूप्रेनोर्फिन (0.05 मिलीग्राम / किग्रा) के अलावा एनाल्जेसिया के लिए हर 8-12 घंटे में कारप्रोफेन (5 मिलीग्राम / किग्रा) इंजेक्ट करें।

4. हृदय ग्राफ्ट में ल्यूकोसाइट तस्करी की इंट्रावाइटल टू-फोटॉन इमेजिंग

  1. एनेस्थीसिया के लिए ग्राफ्ट रीपरफ्यूजन के 17 2 घंटे बाद केटामाइन (80-100 मिलीग्राम / किग्रा) और ज़ाइलज़िन (8-10 मिलीग्राम / किग्रा) को इंट्रापेरिटोनियल रूप से बी 6 लिस्म-जीएफपी प्राप्तकर्ता माउस में इंजेक्ट करें।
  2. 20 जी एंजियोकैथेटर का उपयोग करके ओरोट्राचेल इंटुबैशन करें, जैसा कि पहले18 वर्णित किया गया था।
  3. एंजियोकैथेटर को माउस मैकेनिकल वेंटिलेटर से ट्यूबिंग से कनेक्ट करें और 120 सांस / मिनट की दर से कमरे की हवा के साथ हवादार करें और 0.5 एमएल18 की ज्वारीय मात्रा।
  4. 655 एनएम गैर-लक्षित क्वांटम डॉट्स के 12 μL इंजेक्ट करें ( सामग्री की तालिका देखें), पीबीएस के 50 μL में अंतःशिरा रूप से निलंबित, जैसा कि पहले13 वर्णित है।
  5. दिल के ग्राफ्ट को उजागर करने के लिए गर्दन के चीरे को फिर से खोलें। माउस को स्थिरीकरण कक्ष में रखें।
  6. ऊतक चिपकने वाले की एक पतली अंगूठी का उपयोग करके बाएं वेंट्रिकल की मुक्त दीवार के एक हिस्से को सुरक्षित करें ( सामग्री की तालिका देखें), ऊपरी कक्ष प्लेट से जुड़े ग्लास कवरस्लिप पर लागू होता है।
  7. छवियों और वीडियो प्राप्त करने के लिए दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप उद्देश्य के तहत कक्ष रखें, जैसा कि पहलेवर्णित है।

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Representative Results

इस माउस ग्रीवा हेटरोटोपिक कार्डियक प्रत्यारोपण मॉडल का उपयोग हमारी प्रयोगशाला में 1,000 से अधिक प्रत्यारोपण करने के लिए किया गया है, जिसमें लगभग 97% की जीवित रहने की दर है। चूहों10,11,20 में अन्य ग्रीवा हेटरोटोपिक हृदय प्रत्यारोपण तकनीकों का उपयोग करने वाली पिछली रिपोर्टों की तुलना में सफलता दर थोड़ी अधिक है। यह संभावित रूप से दाता फुफ्फुसीय धमनी पर रखे गए बड़े 20 जी कफ के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है ताकि प्राप्तकर्ता को रक्त प्रवाह की पर्याप्त वापसी सुनिश्चित हो सके (चित्रा 1 बी, सी)। इसके अतिरिक्त, वर्तमान तकनीक में कफ प्लेसमेंट के साथ रक्त प्रवाह का संरेखण घनास्त्रता और एनास्टोमोटिक अशांति के जोखिम को कम करता है (चित्रा 1,2)। जबकि चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) या अल्ट्रासाउंड ग्राफ्ट छिड़काव22,23 की अशांति का आकलन कर सकता है, हमने अभी तक प्रयोगों में इन तकनीकों का उपयोग नहीं किया है। अनुभवी माइक्रोसर्जनों के लिए इस तकनीक का उपयोग करके इंट्राऑपरेटिव मृत्यु दुर्लभ है। पोस्टऑपरेटिव मृत्यु दर अक्सर रक्तस्राव जटिलताओं के कारण होती है। औसत प्राप्तकर्ता ऑपरेशन समय 36.5 ± 3.5 मिनट था, जिसमें औसत ठंडा इस्केमिया समय 20 मिनट था। उत्तरजीविता अध्ययन के लिए, कार्डियक ग्राफ्ट का मूल्यांकन दिल की धड़कन के प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन और डिजिटल पैल्पेशन द्वारा दैनिक रूप से किया गया था। चूहों को आमतौर पर 7-14 दिनों के बाद ग्राफ्ट मूल्यांकन के लिए बलिदान किया जाता है। इंट्रावाइटल टू-फोटॉन इमेजिंग एक टर्मिनल प्रक्रिया है जो आमतौर पर ल्यूकोसाइट तस्करी का मूल्यांकन करने के लिए प्रत्यारोपण के बाद जल्दी की जाती है (चित्रा 3)।

अधिकांश सिंजेनिक प्रत्यारोपण ने प्रत्यारोपण के 6 महीने बाद तक बलिदान तक मजबूत दिल की धड़कन बनाए रखी। सकल निरीक्षण पर, अधिकांश सिंजेनिक ग्राफ्ट सामान्य दिखाई दिए और हिस्टोलॉजिकल परीक्षण में अस्वीकृति का कोई सबूत नहीं मिला। सभी गैर-इम्यूनोसप्रेस्ड एलोजेनिक प्रत्यारोपण (बीएएलबी / सी में बी 6) ने एनग्राफ्टमेंट के बाद 1-2 सप्ताह के भीतर दिल की धड़कन को कम कर दिया। ऐसे चूहों से उत्पादित एलोजेनिक ग्राफ्ट को काफी पतला किया गया था, और हिस्टोलॉजिकल परीक्षण ने लिम्फोसाइटों और मायोकार्डियल नेक्रोसिस के क्षेत्रों की फैलाव घुसपैठ को दिखाया।

Figure 1
चित्र 1: प्रत्यारोपण के लिए हृदय ग्राफ्ट की तैयारी। (A) हृदय को दाता माउस से निकाला जाता है। (बी, सी) फुफ्फुसीय धमनी ट्रंक को उजागर किया जाता है और 20 ग्राम कफ के माध्यम से खींचा जाता है, वापस मोड़ा जाता है, और 10-0 नायलॉन सीवन के साथ सुरक्षित किया जाता है। (डी) एक 10-0 नायलॉन सीवन प्राप्तकर्ता की बाहरी जुगुलर नस के किनारे के माध्यम से रखा जाता है और अंतर्निहित ऊतक पर तय किया जाता है। (ई) एक 10-0 नायलॉन सीवन को दाता महाधमनी के किनारे के माध्यम से रखा जाता है और प्राप्तकर्ता कैरोटिड धमनी से सटे अंतर्निहित ऊतक से सुरक्षित किया जाता है। (एफ) प्राप्तकर्ता के सामान्य कैरोटिड धमनी कफ को दाता महाधमनी में डाला जाता है और 8-0 के साथ सुरक्षित किया जाता है रेशम सीवन। (जी) दाता फुफ्फुसीय धमनी कफ को प्राप्तकर्ता की बाहरी जुगुलर नस में डाला जाता है और 8-0 के साथ सुरक्षित किया जाता है रेशम सीवन। (एच) प्राप्तकर्ता की बाहरी जुगुलर नस पर समीपस्थ स्लिपनॉट जारी किया जाता है, इसके बाद सामान्य कैरोटिड धमनी स्लिपनॉट की रिहाई होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: कार्डियक ग्राफ्ट का इंट्रा-ऑपरेटिव दृश्य। एक 1 मिमी 20 ग्राम कफ को दाता की फुफ्फुसीय धमनी पर खींचा जाता है और 10-0 नायलॉन टाई के साथ सुरक्षित किया जाता है। एक 0.6 मिमी 24 जी कफ को प्राप्तकर्ता की दाईं सामान्य कैरोटिड धमनी पर खींचा जाता है और 10-0 नायलॉन टाई के साथ सुरक्षित किया जाता है। लंगर सीवन (10-0 नायलॉन) को दाता महाधमनी और प्राप्तकर्ता की दाईं बाहरी जुगुलर नस की दीवार में रखा जाता है और कफ सम्मिलन के दौरान आंदोलन को रोकने के लिए अंतर्निहित ऊतक में सुरक्षित किया जाता है। (एओ = महाधमनी, पीए = फुफ्फुसीय धमनी, सीसीए = सामान्य कैरोटिड धमनी, ईजेवी = बाहरी जुगुलर नस)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: हृदय ग्राफ्ट में ल्यूकोसाइट गतिशीलता की इंट्रावाइटल दो-फोटॉन इमेजिंग। बी 6 माउस से बी 6 लिसएम-जीएफपी प्राप्तकर्ता में प्रत्यारोपित धड़कते हुए दिल की इंट्रावाइटल टू-फोटॉन इमेजिंग 2-3 घंटे के बीच कार्डियक ग्राफ्ट ऊतकों में प्राप्तकर्ता न्यूट्रोफिल की तस्करी को दर्शाती है। (हरा = न्यूट्रोफिल, लाल = क्वांटम डॉट्स के साथ लेबल किए गए वाहिकाएं)। स्केल बार = 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

फंस संभावित कारण समाधान
प्राप्तकर्ता की मृत्यु हाइपोथर्मिया हीटिंग पैड
निर्जलीकरण 0.9% खारा यानी पोस्टऑपरेटिव रूप से
खराब ग्राफ्ट छिड़काव कैरोटिड धमनी मरोड़ पुन: एनास्टोमोसिस, या
थ्रोम्बस या एयर एम्बोली खुले धमनी एनास्टोमोसिस और हेपरिनाइज्ड खारा के साथ फ्लश करें
शिरापरक बाधा थ्रोम्बस या एयर एम्बोली पुन: एनास्टोमोसिस, या
शिरापरक एनास्टोमोसिस खोलें और हेपरिनाइज्ड खारा के साथ फ्लश करें
पोस्टऑपरेटिव रक्तस्राव जुगुलर नस शाखाओं से खून बह रहा है लिगेट जुगुलर नस शाखाएं
कपास के फाहे का संपीड़न
ढीले कफ कफ कसें
कमजोर दिल की धड़कन कोल्ड कार्डियक ग्राफ्ट दिल की सतह पर गर्म खारा टपकाएं
ग्राफ्ट ट्विस्टिंग अनुचित भ्रष्टाचार की स्थिति सुनिश्चित करें कि त्वचा बंद होने से पहले ग्राफ्ट ठीक से उन्मुख है
अनियमित गतिविधि (जैसे मंडलियों में चलना) सेरेब्रल इस्किमिया कैरोटिड विभाजन से कम उम्र की आम कैरोटिड धमनी

तालिका 1: जटिलताओं के लिए समस्या निवारण। आमतौर पर समाधान के साथ जटिलताओं का सामना करना पड़ता है।

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Discussion

इस तकनीक का उपयोग करते हुए, माउस हेटेरोटोपिक ग्रीवा कार्डियक प्रत्यारोपण एक अनुभवी माइक्रोसर्जन द्वारा 40 मिनट से भी कम समय में और प्रवेश-स्तरीय माइक्रोसर्जन द्वारा लगभग 60 मिनट में किया जा सकता है। जबकि गर्भाशय ग्रीवा हृदय प्रत्यारोपण का अध्ययन कई पशु मॉडलों में किया गया है, एक माउस मॉडल कई अच्छी तरह से परिभाषित आनुवंशिक उपभेदों, आनुवंशिक परिवर्तन क्षमताओं और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी24 सहित कई अभिकर्मकों की उपलब्धता के कारण स्वर्ण मानक बना हुआ है। यहां वर्णित तकनीक पोस्ट-ट्रांसप्लांट मॉनिटरिंग के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करती है, जैसे इलेक्ट्रोकार्डियोग्राफी या इंट्रावाइटल इमेजिंग, जिसमें दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3) या सीरियल नॉन-इनवेसिव पीईटी इमेजिंग 13,14,15,25 शामिल हैं। यह विधि हृदय ग्राफ्ट के लिए एक सतही स्थान प्रदान करती है जो इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए स्थिर करना आसान है, इस प्रकार ग्राफ्ट और आसपास के पेट के अंगों के गहरे स्थान के कारण पेट प्रत्यारोपण विधि में निहित जटिलता से बचता है। इसके अलावा, यह तकनीक विशेष रूप से पुन: प्रत्यारोपण के संदर्भ में उपयोगी है। पुन: प्रत्यारोपण मॉडल प्रत्यारोपित कार्डियक ग्राफ्ट में निवासी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए शक्तिशाली उपकरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं जो एलोइम्यून प्रतिक्रियाओं को मध्यस्थ करते हैं। जबकि हमने पहले अल्पकालिक परिणामों का आकलन करने के लिए माउस हार्ट री-ट्रांसप्लांटेशन मॉडल में इस तकनीक का उपयोग किया है, इस दृष्टिकोण को दीर्घकालिक परिणामों का पता लगाने के लिए भविष्य केप्रयोगों में विस्तारित किया जा सकता है। इसके लिए, वर्तमान जांच ने अब तक कोल्ड इस्किमिया (लगभग 20 मिनट) की एक छोटी अवधि का उपयोग किया है। भविष्य के अध्ययन नैदानिक प्रत्यारोपण की अधिक बारीकी से नकल करने के लिए अल्पकालिक और दीर्घकालिक परिणामों पर लंबे समय तक ठंड या गर्म इस्किमिया के प्रभाव की जांच कर सकते हैं।

इस तकनीक के कई महत्वपूर्ण चरणों पर विचार करने की आवश्यकता है। पिछले तरीकों में दाता फुफ्फुसीय धमनी 6,8 के बड़े लुमेन में छोटी बाहरी जुगुलर नस पर कफ सम्मिलन शामिल है। रक्त प्रवाह के साथ उचित अभिविन्यास स्थापित करने के लिए दाता फुफ्फुसीय धमनी पर बड़े कफ की नियुक्ति से कफ को छोटी बाहरी जुगुलर नस में डालना थोड़ा अधिक कठिन हो जाता है। नस के किनारे को अंतर्निहित ऊतक में ठीक करना और केवल आंशिक रूप से नस की पूर्ववर्ती दीवार को संक्रमित करना कफ सम्मिलन की सुविधा प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, पोत के छोटे कैलिबर के कारण प्राप्तकर्ता की सामान्य कैरोटिड धमनी पर कफ प्लेसमेंट काफी चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इस प्रकार, पूर्व तकनीकों ने इस एनास्टोमोसिस12 के लिए छोटे कफ (जैसे, 26 जी) के उपयोग की सूचना दी है। हालांकि, वर्तमान दृष्टिकोण पर्याप्त ग्राफ्ट छिड़काव सुनिश्चित करने के लिए एक बड़े 24 जी कफ का उपयोग करता है, जो हमें विश्वास है कि कुछ जीवित लाभ प्रदान कर सकता है। बड़े प्राप्तकर्ता चूहों का चयन नौसिखिए माइक्रोसर्जनों की मदद कर सकता है। एंकर सीवन को रीपरफ्यूजन के बाद हटा दिया जाता है, और ग्राफ्ट को उचित अभिविन्यास में तय नहीं किया जाता है जैसा कि दूसरों नेवर्णित किया है। इस प्रकार, यह जांचना महत्वपूर्ण है कि ग्राफ्ट को मरोड़ या मरोड़ को रोकने के लिए ग्रीवा त्वचा बंद होने से पहले ठीक से तैनात और उन्मुख किया गया है (तालिका 1)। हृदय ग्राफ्ट के लिए पर्याप्त स्थान प्रदान करने के लिए दाईं सबमैंडिबुलर ग्रंथि का छांटना किया जाता है, इस प्रकार त्वचा बंद होने के बाद ग्राफ्ट संपीड़न से बचा जाता है।

यहां वर्णित मॉडल कई फायदे प्रदान करता है। कफ को दाता फुफ्फुसीय धमनी ट्रंक और प्राप्तकर्ता की सामान्य कैरोटिड धमनी पर रखकर, कफ अभिविन्यास रक्त प्रवाह की दिशा के साथ संरेखित होता है। यह अशांत प्रवाह और थ्रोम्बस गठन की संभावना को कम करता है। दूसरा, प्राप्तकर्ता को रक्त प्रवाह की पर्याप्त वापसी सुनिश्चित करने के लिए एक बड़े 20 जी फुफ्फुसीय धमनी कफ का उपयोग किया जाता है। तीसरा, ग्राफ्ट के पर्याप्त छिड़काव को सुनिश्चित करने के लिए आम कैरोटिड धमनी पर एक बड़ा 24 जी कफ रखा जाता है। अंत में, 10-0 नायलॉन एंकर सीवन का उपयोग अंतर्निहित ऊतकों में ग्राफ्ट को ठीक करने और कफ सम्मिलन की सुविधा के लिए किया जाता है। ये संशोधन प्रक्रिया की तकनीकी चुनौतियों पर काबू पाने में मदद करते हैं, एनास्टोमोटिक अशांति को रोकते हैं, और थ्रोम्बस गठन जैसी पोस्टऑपरेटिव जटिलताओं को कम करते हैं।

सभी माउस हृदय प्रत्यारोपण मॉडल की एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि हृदय के कक्षों के माध्यम से शारीरिक रक्त प्रवाह बहाल नहीं होता है। इसके बजाय, ये मॉडल कोरोनरी वाहिकाओं के माध्यम से परिसंचरण पर भरोसा करते हैं। ग्राफ्ट की सेलुलर चोट और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं पर इस प्रतिगामी प्रवाह पैटर्न के परिणामों को स्पष्ट रूप से चित्रित नहीं किया गया है; हालांकि, यह संभव है कि इस गैर-शारीरिक परिसंचरण से उत्पन्न यांत्रिक कतरनी बल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करते हैं। चूहों में हृदय प्रत्यारोपण का एक सर्जिकल मॉडल जो शारीरिक रक्त प्रवाह को बहाल करता है, अभी तक विकसित नहीं किया गया है और इसके लिए पर्याप्त तकनीकी प्रगति की आवश्यकता होगी। यह देखा गया है कि प्रक्रिया के बाद चूहों का एक छोटा सा अनुपात (<3%) क्षणिक अनियमित व्यवहार (जैसे, मंडलियों में दौड़ना) का अनुभव करता है। यह व्यवहार समाधान से पहले लगभग 1-2 घंटे तक रहता है। यह देखते हुए कि एक ही एनेस्थेटिक आहार का उपयोग करके अन्य प्रक्रियाओं के बाद यह व्यवहार नहीं देखा जाता है, यह ग्रीवा हृदय प्रत्यारोपण के बाद रक्त प्रवाह में परिवर्तन के कारण क्षणिक सेरेब्रल इस्किमिया से संबंधित हो सकता है। किसी भी पुरानी कमी के बिना सभी चूहों में पूर्ण वसूली हुई है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

डीके को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट्स 1पी01एआई116501, आर01एचएल094601, आर01एचएल151078, वेटरन्स एडमिनिस्ट्रेशन मेरिट रिव्यू ग्रांट 1आई01बीएक्स002730 और द फाउंडेशन फॉर बार्न्स-यहूदी अस्पताल द्वारा समर्थित किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-0 braided silk ties Henry Schein Inc 7718729
0.75% Providone iosine scrub Priority Care Inc NDC 57319-327-0
10-0 nylon suture Surgical Specialties Corporation AK-0106
655-nm nontargeted Q-dots Invitrogen Q21021MP
70% Ethanol Pharmco Products Inc 111000140
8-0 braided silk ties Henry Schein Inc 1005597
Adson forceps Fine Science Tools Inc 91127-12
BALB/c and C57BL/6 mice (6-8 weeks) Jackson Laboratories
Bipolar coagulator Valleylab Inc SurgII-20, E6008/E6008B
Carprofen (Rimadyl) injection Transpharm 35844
Carprofen (Rimadyl) oral chewable tablet Transpharm 38995/37919
Custom-built 2P microscope running ImageWarp acquisition software A&B Software
Dumont no. 5 forceps Fine Science Tools Inc 11251-20
Fine vannas style spring scissors Fine Science Tools Inc 15000-03
GraphPad Prism 5.0 Sun Microsystems Inc.
Halsey needle holder Fine Science Tools Inc 91201-13
Halsted-Mosquito clamp curved tip Fine Science Tools Inc 91309-12
Harvard Apparatus mouse ventilator model 687 Harvard Apparatus MA1 55-0001
Heparin solution (100 U/mL) Abraxis Pharmaceutical Products 504031
Imaris Bitplane
Ketamine (50 mg/kg) Wyeth 206205-01
Microscope—Leica Wild M651 × 6–40 magnification Leica Microsystems
Moria extra fine spring scissors Fine Science Tools Inc 15396-00
Ohio isoflurane vaporizer Parkland Scientific V3000i
Qdots ThermoFisher 1604036
S&T SuperGrip Forceps angled tip Fine Science Tools Inc 00649-11
S&T SuperGrip Forceps straight tip Fine Science Tools Inc 00632-11
Sterile normal saline (0.9% (wt/vol) sodium chloride Hospira Inc NDC 0409-4888-20
Sterile Q-tips (tapered mini cotton tipped 3-inch applicators) Puritan Medical Company LLC 823-WC
Surflow 20 gauge 1/4-inch Teflon angiocatheter Terumo Medical Corporation SR-OX2032CA
Surflow 24 gauge 3/4-inch Teflon angiocatheter Terumo Medical Corporation R-OX2419CA
ThermoCare Small Animal ICU System (recovery settings 3 L/min O2, 80 °C, 40% humidity) Thermocare Inc
VetBond Santa Cruz Biotechnology SC361931 NC0846393
Xylazine (10 mg/kg) Lloyd Laboratories 139-236

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 184
माउस हेटेरोटोपिक सर्वाइकल कार्डियक प्रत्यारोपण संवहनी कफ का उपयोग कर
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Li, W., Shepherd, H. M., Krupnick, A. S., Gelman, A. E., Lavine, K. J., Kreisel, D. Mouse Heterotopic Cervical Cardiac Transplantation Utilizing Vascular Cuffs. J. Vis. Exp. (184), e64089, doi:10.3791/64089 (2022).

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