Summary
Мышиные модели трансплантации сердца представляют собой ценные исследовательские инструменты для изучения трансплантационной иммунологии. Настоящий протокол детализирует гетеротопную трансплантацию шейного отдела сердца мыши, которая включает в себя размещение манжет на общей сонной артерии реципиента и стволе легочной артерии донора, чтобы обеспечить ламинарный кровоток.
Abstract
Мышиные модели трансплантации сердца часто используются для изучения травмы ишемии-реперфузии, врожденных и адаптивных иммунных реакций после трансплантации и влияния иммуномодулирующей терапии на отторжение трансплантата. Гетеротопическая трансплантация шейного сердца у мышей была впервые описана в 1991 году с использованием ушных анастомозов и впоследствии модифицирована, чтобы включить методы манжеты. Это изменение позволило улучшить показатели успеха, и с тех пор было опубликовано несколько докладов, в которых предлагалось дальнейшее техническое усовершенствование. Тем не менее, перевод в более широкое использование остается ограниченным из-за технических трудностей, связанных с анастомозами трансплантата, которые требуют точности для достижения адекватной длины и калибра манжет, чтобы избежать сосудистого анастомотического скручивания или чрезмерного напряжения, что может привести к повреждению трансплантата. Настоящий протокол описывает модифицированный метод выполнения гетеротопной трансплантации шейного сердца у мышей, который включает размещение манжеты на общей сонной артерии реципиента и легочной артерии донора в соответствии с направлением кровотока.
Introduction
Abbott et al. опубликовали1 первое описание гетеротопной трансплантации брюшного сердца у крыс в 1964 году. Эти хирургические методы были усовершенствованы и упрощены Оно и др. в 1969 году2. Corry et al. впервые описали метод гетеротопной абдоминальной трансплантации сердца у мышей в 1973 году; подобно ранее сообщенным моделям крыс, это включало приживление в брюшную полость хозяина с реваскуляризацией путем сквозных анастомозов легочной артерии донора и восходящей аорты к нижней полой вене реципиента и брюшной аорте, соответственно3. Гетеротопическая трансплантация шейного сердца у крыс была описана Хероном в 1971 году с использованием тефлоновых манжет, изготовленных из 16 г (наружный диаметр 1,6 мм) внутривенных катетеров4. Chen5 и Matsuura et al.6 позже сообщили о гетеротопической трансплантации шейного сердца у мышей в 1991 году, чьи методы отличались главным образом методом повторного анастомоза. Подход Чэня включал ушённые анастомозы восходящей аорты донора к сонной артерии реципиента и легочной артерии донора к наружной яремной вене реципиента5. Благодаря передовым техническим навыкам, необходимым для этих микрохирургических ушибленных анастомозов, для достижения высокого уровня успеха потребовалось значительное количество времени и опыта. Matsuura et al. описали метод, использующий технику без шовной манжеты, аналогичную той, которая использовалась Heron, которая включала сквозные анастомозы с использованием внесветного размещения манжет. Он изготовил тефлоновые манжеты из 22 G (наружный диаметр 0,8 мм) и 24 G (наружный диаметр 0,67 мм) внутривенных катетеров и поместил их над наружной яремной веной реципиента и общей сонной артерией, соответственно6. Затем эти манжеты были помещены внутрь легочной артерии и аорты донора и закреплены путем связывания шовной лигатуры вокруг соединения. Такой подход привел к повышению показателей успеха. Самое главное, это привело к сокращению времени, необходимого для завершения обоих шейных анастомозов, тем самым сократив теплое ишемическое время трансплантата до менее чем одной трети от того, что используется метод брюшного шва. Кроме того, поскольку манжеты размещены вокруг наружной поверхности сосуда, нет инородного тела, подвергающегося воздействию просвета сосуда, что в значительной степени снижает возможность тромбоза после операции7. Между тем, использование манжеты обеспечивает поддержку вокруг сосудов в месте анастомоза, не требуя каких-либо швов, что снижает риск кровотечения после реваскуляризации6.
Были предложены многочисленные пересмотры этого метода. Чтобы приспособиться к короткой длине общей сонной артерии мыши (приблизительно 5 мм), Tomita et al.8 разработали модификацию этой техники с меньшей артериальной манжетой (наружный диаметр 0,6 мм), при этом не удерживая швы и протягивая артерию непосредственно через манжету тонкими щипцами. Wang et al. еще больше упростили этот подход, поместив манжеты 22 G и 24 G на правую легочную артерию донора и правую общую сонную артерию реципиента, соответственно9. В различных докладах описываются модификации этих подходов, включая использование специализированных манжет, микрохирургических зажимов, расширителей сосудов и кардиоплегии 10,11,12. Примечательно, что все эти методы включают ретроградную циркуляцию крови через сердце, при этом кровь течет от общей сонной артерии реципиента к донорской аорте, коронарным артериям, коронарной пазухе, затем опорожняется в правое предсердие и выходит из легочной артерии в наружную яремную вену реципиента.
По сравнению с приживлением в брюшной полости, трансплантация шейного сердца предлагает множество преимуществ. Как упоминалось ранее, цервикальное воздействие позволяет быстрее реваскуляризации и сократить теплые ишемические времена6. Шейный метод также менее инвазивный и связан с более коротким послеоперационным временем восстановления, поскольку он позволяет избежать лапаротомии6. Важно отметить, что сквозные анастомозы с манжетами могут быть выполнены вместо сквозных анастомозов, что снижает риск осложнений, таких как анастомотическое кровотечение. Абдоминальный подход также представляет повышенный риск развития тромботических осложнений в брюшной аорте или нижней полой вене, что приводит к ишемии спинного мозга и параличу задних конечностей. Поверхностное расположение цервикального отдела трансплантата обеспечивает легкий доступ к оценке жизнеспособности трансплантата с помощью пальпации, электрокардиографии и инвазивной или неинвазивной визуализации. Хотя шейные трансплантаты возобновляют спонтанную сердечную деятельность после реперфузии, они существенно не влияют на систолические и диастолические параметры реципиента. Эта модель дает ценную информацию для изучения клеточных реакций после трансплантации, таких как ишемия-реперфузионное повреждение и отторжение трансплантата. Кроме того, эта модель предлагает идеальный подход, позволяющий проводить посттрансплантационную визуализацию, такую как прижизненная двухфотонная микроскопия или позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ). С этой целью наша лаборатория ранее сообщала о методах визуализации движущихся тканей и органов у мышей, включая бьющиеся мышиные сердца и трансплантаты дуги аорты после гетеротопической трансплантации шейки матки для визуализации трафика лейкоцитов во время ишемическо-реперфузионного повреждения и в атеросклеротических бляшках, соответственно 13,14,15 . Кроме того, благодаря своему поверхностному расположению и простоте воздействия, эта модель подходит для повторной трансплантации сердца16.
В этом отчете описывается методика, позволяющая осуществлять ламинарный кровоток с наружным размещением сосудистых манжет на сосудах, из которых происходит кровоток. Это позволяет плавно переходить кровотока из одного сосуда в другой, избегая воздействия края дистального сосуда на сосудистый просвет. Кроме того, метод использует большую манжету 20 Г вместо ранее использовавшихся манжет 22 Г для легочной артерии донора, чтобы обеспечить достаточный возврат кровотока к реципиенту.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры обращения с животными были проведены в соответствии с руководящими принципами NIH по уходу и использованию лабораторных животных и одобрены Комитетом по изучению животных в Медицинской школе Вашингтонского университета. Сердца мышей C57BL/6 (B6) и BALB/c (весом 20-25 г) пересаживали реципиентам B6 соответствующего пола (в возрасте 6-8 недель). Мыши были получены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов). Сингенные трансплантации были выполнены для оценки клеточных реакций, связанных с травмой ишемии-реперфузии, и аллогенные трансплантации были выполнены для исследования иммунных механизмов, участвующих в толерантности и отторжении трансплантата. B6 лизоцим M-зеленый флуоресцентный белок (LysM-GFP) репортер мышей17, первоначально полученный от Клауса Лея из Института аллергии и иммунологии Ла-Хойя, Ла-Хойя, Калифорния, и впоследствии выведенный в нашем учреждении, использовался в качестве реципиентов для отдельных экспериментов по визуализации инфильтрации нейтрофилов в сердечные трансплантаты. Операция по выживанию проводилась с использованием асептических процедур.
1. Донорская процедура
- Анестезируют мышей путем введения кетамина (80−100 мг/кг) и ксилазина (8−10 мг/кг) (см. Таблицу материалов) внутрибрюшинно в донорскую мышь. Подтвердите хирургическую плоскость анестезии с защемлением пальца ноги и хвоста.
- Подготовьте хирургическую область, сбрив волосы с груди и живота с помощью электрической бритвы.
- Вводят 100 единиц гепарина (см. Таблицу материалов) внутривенно в вену полового члена (мужчины) или наружную яремную вену (мужчины или женщины).
- Поместите мышей в лежачее положение с передними конечностями над головой. Закрепите передние и задние конечности хирургическим скотчем и продезинфицируйте кожу тремя чередующимися скрабами с 0,75% йода и 70% этанола.
- Выполняют разрез, срединную лапаростернотомию, от пупка до грудинного угла (3-4 см) с последующим проведением двусторонней торакотомии вдоль каждого реберного края (2 см двусторонне). Сложите переднюю грудную стенку над шеей для полного обнажения средостения.
- Иссечение тимуса и обнажение внутригрудной нижней полой вены.
- Трансекция по ширине брюшной аорты для экссангинации.
- Для ретроградной перфузии вводят 1,5 мл физиологического раствора 4 °C во внутригрудную нижнюю полую вену с помощью иглы, ориентированной преимущественно на трансплантат, как описано ранее13.
- Лигайте верхнюю полую вену со счетом 8-0 шелк накладывают шов и делят дистально.
- Повторите ретроградную перфузию, введя еще 1,5 мл физиологического раствора 4 °C через нижнюю полую вену.
- Лигат нижней полой вены с помощью 8-0 шелк накладывают шов и делят дистально.
- Рассекать дугу аорты и ствол легочной артерии для сбора трансплантата и транссектировать обе дистально. Разложите легочные вены на задней поверхности сердца с помощью шелкового шва 6-0 и разделите дистально.
- Выполните подготовку трансплантата, удалив донорское сердце из грудной полости. Поместите иссеченное сердце в пластиковый контейнер, наполненный гепаринизированным физиологическим раствором 4 °C, на 1-2 мин. Переложите трансплантат на стерильную пластиковую колбу, наполненную льдом, для размещения манжеты (рисунок 1А).
ПРИМЕЧАНИЕ: Сердечный трансплантат должен оставаться на колбе в течение примерно 5 минут, чтобы поместить манжету легочной артерии донора. - Поместите манжету ангиокатетера длиной 1 мм 20 Г (см. Таблицу материалов) над легочной артерией для манжеты донора. Используя тонкие щипцы, аккуратно сложите края артерии обратно над манжетой. Прикрепите сложенный сосуд к манжете с помощью нейлоновой стяжки 10-0, как описано ранее18 (рисунок 1B,C).
- Храните донорское сердце в гепаринизированном физиологическом растворе или другом консервационном растворе при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя некоторые могут предпочесть конкретные решения для сохранения (например, раствор Университета Висконсина) для длительного ишемического сохранения, это может быть дорогостоящим19. Физиологический раствор может быть подходящей альтернативой для коротких периодов ишемии (<1 ч)20. В конечном счете, выбор консервационного решения зависит от экспериментальной конструкции21.
2. Процедура получения
- Вводят кетамин (80−100 мг/кг) и ксилазин (8−10 мг/кг) внутрибрюшинно в мышь-реципиент для анестезии. Вводят бупренорфин пролонгированного высвобождения (0,5-1,0 мг/кг) подкожно для обезболивания. Подтвердите хирургическую плоскость анестезии с защемлением пальца ноги и хвоста.
- Подготовьте хирургическую область, сбрив волосы из шейной области с помощью электрической бритвы. Наносите стерильную, немедикаментозную офтальмологическую мазь на глаза для предотвращения высыхания роговицы.
- Поместите животное в лежачее положение с передними конечностями, прилегающими к телу, и головой, слегка повернутой влево. Закрепите передние и задние конечности хирургическим скотчем. Дезинфицируйте кожу тремя чередующимися скрабами 0,75% йода и 70% этанола.
- Сделайте шейный разрез средней линии от нижней нижней челюсти до грудины.
- Трансекция правой грудино-ключично-сосцевидной мышцы. Иссечь правую долю подчелюстной железы, чтобы создать пространство для имплантации трансплантата.
- Завяжите скользящий узел над проксимальной наружной яремной веной с помощью шелкового шва 6-0. Лигировать дистальную наружную яремную вену и прилегающие ветви с помощью 8-0 шелковый шов. Сделайте поперечный разрез через переднюю стенку наружной яремной вены.
- Поместите нейлоновый шов 10-0 через край проксимальной наружной яремной вены и подлежащую ткань, чтобы закрепить вену во время введения манжеты (рисунок 1D).
- Лигат дистальной правой общей сонной артерии с помощью 8-0 шелковый шов просто уступает каротидному бифуркации. Завяжите скользящий узел над проксимальной общей сонной артерией с помощью шелкового шва 6-0. Трансекция артерии дистально между швами.
- Подобно донорской манжете, поместите манжету ангиокатетера длиной 0,6 мм 24 Г над правой общей сонной артерией реципиента. Используя тонкие щипцы, аккуратно сложите края артерии обратно над манжетой. Закрепите сложенный сосуд на манжете с помощью нейлоновой завязки 10-0.
- Поместите донорское сердце выше правой шейной области.
- Капайте холодный физиологический раствор на сердечный трансплантат каждые несколько минут во время имплантации.
- Поместите нейлоновый шов 10-0 через край донорской аорты и через поверхностный прикус подлежащей ткани, чтобы закрепить трансплантат на месте (рисунок 1E).
- Промыть донорскую аорту 0,5 мл 0,9% гепаринизированного физиологического раствора.
- Вставьте общую манжету сонной артерии реципиента в донорскую аорту. Обезопасьте анастомоз со счетом 8-0 шелковый галстук (рисунок 1F). Снимите анкерный шов аорты.
- Обезвреживание наружной яремной вены путем промывки наружной яремной вены реципиента 0,5 мл 0,9% гепаринизированного физиологического раствора.
- Выполните анастомоз легочной артерии, вставив манжету легочной артерии донора в наружную яремную вену реципиента и закрепив 8-0 шелковый галстук (рисунок 1G). Снимите шов якоря наружной яремной вены и перерезайте оставшуюся заднюю стенку наружной яремной вены, чтобы освободить трансплантат от подлежащей ткани. Убедитесь, что трансплантат правильно ориентирован без перегиба или скручивания анастомозов.
- Отпустите скользящие узелки на наружной яремной вене реципиента, а затем общую сонную артерию, чтобы инициировать реперфузию сердечного трансплантата (рисунок 1H).
- Закройте узи кожи шейки матки прерывистым нейлоновым швом 6-0.
3. Послеоперационный уход
- Поместите реципиента в теплую восстановительную камеру сразу после операции и внимательно следите за тем, чтобы полностью восстановиться после анестезии (примерно 1 ч).
- Продолжайте внимательно наблюдать за животным (каждые 6-8 ч) в течение не менее 72 ч после операции на наличие признаков ненормального поведения, таких как вялость, дрожь, учащенное дыхание или анорексия.
- Для контроля боли вводят карпрофен (5 мг/кг) подкожно каждые 8-12 ч для анальгезии, в дополнение к подкожному бупренорфину (0,05 мг/кг) каждые 8-12 ч в течение 24-48 ч, начиная с конца операции.
4. Прижизненная двухфотонная визуализация трафика лейкоцитов в сердечном трансплантате
- Вводят кетамин (80-100 мг/кг) и ксилазин (8-10 мг/кг) внутрибрюшинно в мышь-реципиент B6 LysM-GFPчерез 17 2 ч после реперфузии трансплантата для анестезии.
- Выполняют оротрахеальную интубацию с помощью ангиокатетера 20 G, как описано ранее18.
- Подключите ангиокатетер к трубке от мышиного аппарата искусственной вентиляции легких и проветривайте воздухом комнаты со скоростью 120 вдохов/мин и приливным объемом 0,5 мл18.
- Вводят 12 мкл 655 нм нецелевых квантовых точек (см. Таблицу материалов), суспендированных в 50 мкл PBS внутривенно, как описано ранее13.
- Повторно откройте разрез шеи, чтобы обнажить сердечный трансплантат. Поместите мышь в стабилизационную камеру.
- Закрепите часть свободной стенки левого желудочка с помощью тонкого кольца тканевого клея (см. Таблицу материалов), нанесенного на стеклянный покров, прикрепленный к пластине верхней камеры.
- Поместите камеру под объектив двухфотонного микроскопа для получения изображений и видео, как описано ранее13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эта модель гетеротопной трансплантации шейки матки мыши была использована для выполнения более 1000 трансплантаций в нашей лаборатории с выживаемостью около 97%. Показатель успеха немного выше, чем в предыдущих отчетах с использованием других методов трансплантации сердца шейки матки у мышей 10,11,20. Это потенциально может быть связано с более крупной манжетой 20 Г, помещенной на легочную артерию донора, чтобы обеспечить достаточный возврат кровотока к реципиенту (рисунок 1B, C). Кроме того, выравнивание кровотока с размещением манжеты в настоящей методике минимизирует риск тромбоза и анастомотической турбулентности (рисунок 1,2). В то время как магнитно-резонансная томография (МРТ) или ультразвук могли оценить турбулентность перфузии трансплантата 22,23, мы еще не использовали эти методы в экспериментах. Интраоперационная смерть с использованием этой методики редко встречается у опытных микрохирургов. Послеоперационная смертность чаще всего обусловлена осложнениями кровотечения. Среднее время работы реципиента составило 36,5 ± 3,5 мин, со средним временем холодной ишемии 20 мин. Для исследований выживаемости сердечные трансплантаты оценивались ежедневно путем прямой визуализации и цифровой пальпации сердцебиения. Мышей обычно приносят в жертву для оценки трансплантата примерно через 7-14 дней после операции. Прижизненная двухфотонная визуализация является терминальной процедурой, обычно выполняемой на ранней стадии после трансплантации для оценки трафика лейкоцитов (рисунок 3).
Большинство сингенных трансплантатов поддерживали сильное сердцебиение до жертвоприношения, до 6 месяцев после трансплантации. При грубом осмотре большинство сингенных трансплантатов казались нормальными, а гистологическое исследование не выявило никаких признаков отторжения. У всех неиммуносупрессированных аллогенных трансплантатов (BALB/c в B6) развивалось уменьшенное сердцебиение в течение 1-2 недель после приживления. Иссеченные аллогенные трансплантаты от таких мышей были сильно расширены, а гистологическое исследование показало диффузную инфильтрацию лимфоцитов и участков некроза миокарда.
Рисунок 1: Подготовка сердечного трансплантата к трансплантации. (А) Сердце иссекается у донорской мыши. (В,С) Ствол легочной артерии обнажается и протягивается через манжету 20 G, складывается назад и закрепляется нейлоновым швом 10-0. (D) Нейлоновый шов 10-0 помещается через край наружной яремной вены реципиента и фиксируется на подлежащей ткани. (E) Нейлоновый шов 10-0 помещается через край донорской аорты и крепится к подлежащей ткани, прилегающей к сонной артерии реципиента. (F) Манжета общей сонной артерии реципиента вводится в донорскую аорту и закрепляется с помощью 8-0 шелковый шов. (G) Манжета легочной артерии донора вводится в наружную яремную вену реципиента и закрепляется 8-0 шелковый шов. (H) Проксимальный скользящий узел на наружной яремной вене реципиента высвобождается, после чего высвобождается общий скользящий узел сонной артерии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Интраоперационный вид сердечного трансплантата. Манжета 1 мм 20 G натягивается на легочную артерию донора и закрепляется нейлоновой завязкой 10-0. Манжета 0,6 мм 24 G натягивается на правую общую сонную артерию реципиента и закрепляется нейлоновой завязкой 10-0. Анкерные швы (10-0 нейлона) помещаются в стенку донорской аорты и правую наружную яремную вену реципиента и крепятся к подлежащей ткани для предотвращения движения во время введения манжеты. (AO = аорта, PA = легочная артерия, CCA = общая сонная артерия, EJV = наружная яремная вена). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Прижизненная двухфотонная визуализация динамики лейкоцитов в сердечном трансплантате. Прижизненная двухфотонная визуализация бьющегося сердца, пересаженного от мыши B6 к реципиенту B6 LysM-GFP, демонстрирует трафик нейтрофилов реципиента в ткани сердечного трансплантата между 2-3 ч после операции. (Зеленый = нейтрофилы, красный = сосуды, помеченные квантовыми точками). Шкала = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Сложность | Возможные причины | Решения |
| Смерть получателя | Гипотермия | Грелку |
| Обезвоживание | 0,9% физиологического раствора в послеоперационном периоде | |
| Плохая перфузия трансплантата | Перекрут сонной артерии | Повторный анастомоз, или |
| Тромб или воздушная эмболия | Открытый артериальный анастомоз и промывка гепаринизированным физиологическим раствором | |
| Венозная обструкция | Тромб или воздушная эмболия | Повторный анастомоз, или |
| Открытый венозный анастомоз и промывка гепаринизированным физиологическим раствором | ||
| Послеоперационное кровотечение | Кровоточащие ветви яремных вен | Ветви яремных вен Ligate |
| Компрессия ватного тампона | ||
| Свободные манжеты | Затягивайте манжеты | |
| Слабое сердцебиение | Холодный сердечный трансплантат | Капните теплый физиологический раствор на поверхность сердца |
| Скручивание трансплантата | Неправильное положение трансплантата | Убедитесь, что трансплантат правильно ориентирован перед закрытием кожи |
| Беспорядочная деятельность (например, бег по кругу) | Ишемия головного мозга | Лигатовая общая сонная артерия, уступающая бифуркации сонной артерии |
Таблица 1: Устранение неполадок при возникновении осложнений. Часто встречаются осложнения с растворами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Используя эту технику, гетеротопическая трансплантация шейного отдела сердца мыши может быть выполнена менее чем за 40 минут опытным микрохирургом и примерно за 60 минут микрохирургом начального уровня. В то время как трансплантация шейного сердца была изучена на многочисленных животных моделях, мышиная модель остается золотым стандартом из-за нескольких четко определенных генетических штаммов, возможностей генетического изменения и доступности многочисленных реагентов, включая моноклональные антитела24. Метод, описанный здесь, предоставляет уникальную возможность для посттрансплантационного мониторинга, такого как электрокардиография или прижизненная визуализация, включая двухфотонную микроскопию (рисунок 3) или последовательную неинвазивную ПЭТ-визуализацию 13,14,15,25. Этот метод обеспечивает поверхностное расположение сердечного трансплантата, которое легче стабилизировать для прижизненной визуализации, что позволяет избежать сложности, присущей методу абдоминальной трансплантации из-за более глубокого расположения трансплантата и окружающих органов брюшной полости. Кроме того, этот метод особенно полезен в контексте повторной трансплантации. Модели ретрансплантации представляют собой мощные инструменты для идентификации резидентных клеток в трансплантированных сердечных трансплантатах, которые опосредуют аллоиммунные реакции. Хотя мы ранее использовали этот метод в модели повторной трансплантации сердца мыши для оценки краткосрочных результатов, этот подход может быть расширен в будущих экспериментах для изучения долгосрочных исходов16. С этой целью в настоящих исследованиях до сих пор использовался короткий период холодной ишемии (примерно 20 минут). Будущие исследования могут исследовать влияние длительной холодной или теплой ишемии на краткосрочные и долгосрочные результаты, чтобы более точно имитировать клиническую трансплантацию.
Необходимо рассмотреть несколько критических этапов этой техники. Предыдущие методы включают введение манжеты на меньшую наружную яремную вену в большой просвет донорской легочной артерии 6,8. Размещение большей манжеты на донорской легочной артерии для установления правильной ориентации с кровотоком немного затрудняет введение манжеты в меньшую наружную яремную вену. Фиксация края вены к подлежащей ткани и лишь частичное разрезание передней стенки вены облегчает введение манжеты. Кроме того, размещение манжеты на общей сонной артерии реципиента может быть довольно сложным из-за небольшого калибра сосуда. Таким образом, предыдущие методы сообщали об использовании меньших манжет (например, 26 G) для этого анастомоза12. Тем не менее, текущий подход использует большую манжету 24 G для обеспечения адекватной перфузии трансплантата, которая, по нашему мнению, может предложить некоторые преимущества для выживания. Выбор более крупных мышей-реципиентов может помочь начинающим микрохирургам. Анкерные швы удаляются после реперфузии, и трансплантат не фиксируется в правильной ориентации, как другие описали3. Таким образом, важно проверить, что трансплантат правильно расположен и ориентирован до закрытия кожи шейки матки, чтобы предотвратить скручивание или перекрут (таблица 1). Иссечение правой подчелюстной железы выполняется для обеспечения достаточного пространства для сердечного трансплантата, что позволяет избежать компрессии трансплантата после закрытия кожи.
Модель, описанная здесь, предлагает несколько преимуществ. Размещая манжеты на стволе легочной артерии донора и общей сонной артерии реципиента, ориентация манжеты выравнивается с направлением кровотока. Это снижает вероятность турбулентного течения и образования тромбов. Во-вторых, более крупная манжета легочной артерии весом 20 г используется для обеспечения достаточного возвращения кровотока к реципиенту. В-третьих, большая манжета 24 G помещается на общую сонную артерию, чтобы обеспечить адекватную перфузию трансплантата. Наконец, 10-0 нейлоновых анкерных швов используются для фиксации трансплантата к подлежащим тканям и облегчения введения манжеты. Эти модификации помогают в преодолении технических проблем процедуры, предотвращают анастомотическую турбулентность и уменьшают послеоперационные осложнения, такие как образование тромбов.
Важным ограничением всех моделей трансплантации сердца мышей является то, что физиологический кровоток не восстанавливается через камеры сердца. Вместо этого эти модели полагаются на циркуляцию через коронарные сосуды. Последствия этого ретроградного потока на клеточное повреждение трансплантата и иммунные реакции не были четко очерчены; однако возможно, что механические силы сдвига, возникающие в результате этого нефизиологического кровообращения, влияют на иммунные реакции. Хирургическая модель трансплантации сердца у мышей, которая восстанавливает физиологический кровоток, еще не разработана и потребует значительных технических достижений. Замечено, что небольшая часть мышей (<3%) испытывают преходящее неустойчивое поведение (например, бег по кругу) после процедуры. Это поведение длится примерно 1-2 ч до разрешения. Учитывая, что такое поведение не наблюдается после других процедур с использованием того же режима анестезии, оно может быть связано с транзиторной ишемией головного мозга из-за изменений кровотока после трансплантации шейного сердца. Полное выздоровление произошло у всех мышей без какого-либо хронического дефицита.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
DK поддерживается грантами Национальных институтов здравоохранения 1P01AI116501, R01HL094601, R01HL151078, грантом Veterans Administration Merit Review 1I01BX002730 и Фондом для Barnes-Jewish Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 braided silk ties | Henry Schein Inc | 7718729 | |
| 0.75% Providone iosine scrub | Priority Care Inc | NDC 57319-327-0 | |
| 10-0 nylon suture | Surgical Specialties Corporation | AK-0106 | |
| 655-nm nontargeted Q-dots | Invitrogen | Q21021MP | |
| 70% Ethanol | Pharmco Products Inc | 111000140 | |
| 8-0 braided silk ties | Henry Schein Inc | 1005597 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools Inc | 91127-12 | |
| BALB/c and C57BL/6 mice (6-8 weeks) | Jackson Laboratories | ||
| Bipolar coagulator | Valleylab Inc | SurgII-20, E6008/E6008B | |
| Carprofen (Rimadyl) injection | Transpharm | 35844 | |
| Carprofen (Rimadyl) oral chewable tablet | Transpharm | 38995/37919 | |
| Custom-built 2P microscope running ImageWarp acquisition software | A&B Software | ||
| Dumont no. 5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11251-20 | |
| Fine vannas style spring scissors | Fine Science Tools Inc | 15000-03 | |
| GraphPad Prism 5.0 | Sun Microsystems Inc. | ||
| Halsey needle holder | Fine Science Tools Inc | 91201-13 | |
| Halsted-Mosquito clamp curved tip | Fine Science Tools Inc | 91309-12 | |
| Harvard Apparatus mouse ventilator model 687 | Harvard Apparatus | MA1 55-0001 | |
| Heparin solution (100 U/mL) | Abraxis Pharmaceutical Products | 504031 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine (50 mg/kg) | Wyeth | 206205-01 | |
| Microscope—Leica Wild M651 × 6–40 magnification | Leica Microsystems | ||
| Moria extra fine spring scissors | Fine Science Tools Inc | 15396-00 | |
| Ohio isoflurane vaporizer | Parkland Scientific | V3000i | |
| Qdots | ThermoFisher | 1604036 | |
| S&T SuperGrip Forceps angled tip | Fine Science Tools Inc | 00649-11 | |
| S&T SuperGrip Forceps straight tip | Fine Science Tools Inc | 00632-11 | |
| Sterile normal saline (0.9% (wt/vol) sodium chloride | Hospira Inc | NDC 0409-4888-20 | |
| Sterile Q-tips (tapered mini cotton tipped 3-inch applicators) | Puritan Medical Company LLC | 823-WC | |
| Surflow 20 gauge 1/4-inch Teflon angiocatheter | Terumo Medical Corporation | SR-OX2032CA | |
| Surflow 24 gauge 3/4-inch Teflon angiocatheter | Terumo Medical Corporation | R-OX2419CA | |
| ThermoCare Small Animal ICU System (recovery settings 3 L/min O2, 80 °C, 40% humidity) | Thermocare Inc | ||
| VetBond | Santa Cruz Biotechnology SC361931 | NC0846393 | |
| Xylazine (10 mg/kg) | Lloyd Laboratories | 139-236 |
References
- Abbott, C. P., Lindsey, E. S., Creech, O., Dewitt, C. W. A technique for heart transplantation in the rat. The Archives of Surgery. 89, 645-652 (1964).
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplantation Proceedings. 5 (1), 733-735 (1973).
- Heron, I. A technique for accessory cervical heart transplantation in rabbits and rats. Acta Pathologica Microbiologica Scandinavica Section A Pathology. 79 (4), 366-372 (1971).
- Chen, Z. H. A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice. Transplantation. 52 (6), 1099-1101 (1991).
- Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51 (4), 896-898 (1991).
- Yu, Y., et al. Cuff anastomosis of both renal artery and vein to minimize thrombosis: a novel method of kidney transplantation in mice. Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 56-60 (2022).
- Tomita, Y., et al. Improved technique of heterotopic cervical heart transplantation in mice. Transplantation. 64 (11), 1598-1601 (1997).
- Wang, Q., Liu, Y., Li, X. K. Simplified technique for heterotopic vascularized cervical heart transplantation in mice. Microsurgery. 25 (1), 76-79 (2005).
- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. Journal of Visualized Experiments. (92), e50753 (2014).
- Ratschiller, T., et al. Heterotopic cervical heart transplantation in mice. Journal of Visualized Experiments. (102), e52907 (2015).
- Mao, X., Xian, P., You, H., Huang, G., Li, J. A modified cuff technique for mouse cervical heterotopic heart transplantation model. Journal of Visualized Experiments. (180), e63504 (2022).
- Li, W., et al. Intravital 2-photon imaging of leukocyte trafficking in beating heart. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2499-2508 (2012).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Li, W., et al. Visualization of monocytic cells in regressing atherosclerotic plaques by intravital 2-photon and positron emission tomography-based imaging-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (5), 1030-1036 (2018).
- Li, W., et al. Lung transplant acceptance is facilitated by early events in the graft and is associated with lymphoid neogenesis. Mucosal Immunology. 5 (5), 544-554 (2012).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Krupnick, A. S., et al. Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology. Nature Protocols. 4 (1), 86-93 (2009).
- Westhofen, S., et al. The heterotopic heart transplantation in mice as a small animal model to study mechanical unloading - Establishment of the procedure, perioperative management and postoperative scoring. PLoS One. 14 (4), 0214513 (2019).
- Ma, Y., et al. Optimization of the cuff technique for murine heart transplantation. Journal of Visualized Experiments. (160), e61103 (2020).
- Latchana, N., Peck, J. R., Whitson, B., Black, S. M. Preservation solutions for cardiac and pulmonary donor grafts: a review of the current literature. Journal of Thoracic Disease. 6 (8), 1143-1149 (2014).
- Hartley, C. J., et al. Doppler velocity measurements from large and small arteries of mice. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 301 (2), 269-278 (2011).
- Bovenkamp, P. R., et al. Velocity mapping of the aortic flow at 9.4 T in healthy mice and mice with induced heart failure using time-resolved three-dimensional phase-contrast MRI (4D PC MRI). MAGMA. 28 (4), 315-327 (2015).
- Wang, H.
- Martins, P. N. Assessment of graft function in rodent models of heart transplantation. Microsurgery. 28 (7), 565-570 (2008).
