Summary
Fare kardiyak transplantasyon modelleri, transplantasyon immünolojisini incelemek için değerli araştırma araçlarını temsil etmektedir. Mevcut protokol, laminer kan akışına izin vermek için alıcının ortak karotis arterine ve donörün pulmoner arter gövdesine manşetlerin yerleştirilmesini içeren fare heterotopik servikal kardiyak transplantasyonunu detaylandırmaktadır.
Abstract
Kardiyak transplantasyonun murin modelleri, iskemi-reperfüzyon hasarını, transplantasyon sonrası doğuştan gelen ve adaptif immün yanıtları ve immünomodülatör tedavilerin greft reddi üzerindeki etkisini incelemek için sıklıkla kullanılmaktadır. Farelerde heterotopik servikal kalp transplantasyonu ilk olarak 1991 yılında dikişli anastomozlar kullanılarak tanımlanmış ve daha sonra manşet tekniklerini içerecek şekilde modifiye edilmiştir. Bu değişiklik, başarı oranlarının iyileştirilmesine izin verdi ve o zamandan beri, daha fazla teknik iyileştirme öneren birden fazla rapor yapıldı. Bununla birlikte, greft anastomozları ile ilişkili teknik zorluk nedeniyle daha yaygın kullanıma çeviri sınırlı kalmaktadır, bu da vasküler anastomoz bükülmesini veya aşırı gerginliği önlemek için manşetlerin yeterli uzunluğunu ve kalibresini elde etmek için hassasiyet gerektirir ve bu da greftin zarar görmesine neden olabilir. Bu protokol, farelerde heterotopik servikal kardiyak transplantasyon için modifiye edilmiş bir tekniği tanımlamaktadır ve bu da alıcının ortak karotis arterine ve donörün pulmoner arterine kan akışının yönü ile uyumlu olarak manşet yerleştirilmesini içerir.
Introduction
Abbott ve ark.1964 yılında sıçanlarda heterotopik abdominal kalp transplantasyonunun ilk tanımını 1 kez yayınlamıştır. Bu cerrahi teknikler 1969 yılında Ono ve ark. tarafından rafine edilmiş ve basitleştirilmiştir2. Corry ve ark. ilk olarak 1973 yılında farelerde heterotopik abdominal kalp nakli için bir yöntem tanımladılar; Daha önce bildirilen sıçan modellerine benzer şekilde, bu, donörün pulmoner arterinin uçtan yana anastomozları ve alıcının inferior vena kava ve abdominal aortuna yükselen aort ile revaskülarizasyon ile konakçının karnına engraftasyonu içeriyordu, sırasıyla3. Sıçanlarda heterotopik servikal kalp transplantasyonu 1971 yılında Heron tarafından 16 G (1.6 mm dış çaplı) intravenöz kateterlerden yapılmış Teflon manşetler kullanılarak tanımlanmıştır4. Chen5 ve Matsuura ve ark.6 daha sonra 1991 yılında farelerde heterotopik servikal kalp transplantasyonunu bildirmişlerdir ve bu transplantasyonlar öncelikle re-anastomoz yöntemlerinde farklılık göstermiştir. Chen'in yaklaşımı, donörün yükselen aortunun alıcının karotis arterine ve donörün pulmoner arterinin alıcının dış juguler venine dikişli anastomozlarını içeriyordu5. Bu mikrocerrahi dikişli anastomozlar için gereken ileri teknik beceri nedeniyle, yüksek bir başarı oranı elde etmek için önemli miktarda zaman ve deneyim gerekliydi. Matsuura ve ark., Heron tarafından kullanılana benzer, manşetlerin ekstra luminal yerleşimini kullanarak uçtan uca anastomozları içeren sütür olmayan bir manşet tekniği kullanan bir yöntem tanımlamıştır. 22 G (0.8 mm dış çap) ve 24 G (0.67 mm dış çap) intravenöz kateterlerden Teflon manşetler tasarladı ve bunları sırasıyla alıcının dış juguler veni ve ortak karotis arteri üzerine yerleştirdi6. Bu manşetler daha sonra donörün pulmoner arterinin ve aortunun içine yerleştirildi ve bağlantı etrafında bir sütür bağı bağlanarak sabitlendi. Bu yaklaşım gelişmiş bir başarı oranına dönüştü. En önemlisi, her iki servikal anastomozu tamamlamak için gereken sürenin kısalmasına neden oldu, böylece greftin sıcak iskemik zamanını abdominal dikiş yöntemi kullanılarak üçte birinden daha azına düşürdü. Ayrıca, manşetler damarın dış yüzeyinin etrafına yerleştirildiğinden, damar lümenine maruz kalan yabancı cisim yoktur, bu da ameliyat sonrası tromboz olasılığını büyük ölçüde azaltır7. Bu arada, manşet tekniğinin kullanılması, herhangi bir dikiş gerektirmeden anastomoz bölgesindeki damarların etrafında destek sağlar ve bu da revaskülarizasyon sonrası kanama riskini azaltır6.
Bu tekniğin çok sayıda revizyonu önerilmiştir. Fare ortak karotis arterinin kısa uzunluğunu (yaklaşık 5 mm) karşılamak için Tomita ve ark.8, bu tekniğin daha küçük bir arteriyel manşetle (0.6 mm dış çap) bir modifikasyonunu geliştirirken, tutma sütürlerini atlamış ve arteri doğrudan manşetten ince forseps ile çekmiştir. Wang ve ark., donörün sağ pulmoner arterine ve alıcının sağ ortak karotis arterine sırasıyla22 G ve 24 G manşetler yerleştirerek bu yaklaşımı daha da basitleştirdiler, 9. Çeşitli raporlar, özel manşetler, mikrocerrahi kelepçeler, damar dilatatörleri ve kardiyopleji10,11,12 kullanımı da dahil olmak üzere bu yaklaşımlardaki değişiklikleri tanımlamıştır. Özellikle, tüm bu yöntemler, kanın kalpten retrograd dolaşımını içerir; kan, alıcı ortak karotis arterden donör aort, koroner arterler, koroner sinüs için akar, daha sonra sağ atriyuma boşalır ve pulmoner arterden alıcının dış juguler venine çıkar.
Karındaki engraftmanla karşılaştırıldığında, servikal kalp nakli birçok avantaj sunar. Daha önce de belirtildiği gibi, servikal maruziyet daha hızlı revaskülarizasyon ve daha kısa sıcak iskemik zamanlar6 sağlar. Servikal yöntem de daha az invazivdir ve laparotomi6'dan kaçındığı için daha kısa postoperatif iyileşme süreleri ile ilişkilidir. Daha da önemlisi, uçtan uca anastomozlar yerine manşetlerle uçtan uca anastomozlar yapılabilir, bu da anastomoz kanaması gibi komplikasyon riskini azaltır. Abdominal yaklaşım ayrıca abdominal aort veya inferior vena kavada trombotik komplikasyonlar gelişme riski taşır ve omurilik iskemisi ve arka bacak felcine yol açar. Transplantasyonun yüzeysel servikal lokalizasyonu, palpasyon, elektrokardiyografi ve invaziv veya non-invaziv görüntüleme ile greft canlılığı değerlendirmesine kolay erişim sağlar. Servikal greftler reperfüzyon sonrası spontan kardiyak aktiviteye devam etmelerine rağmen, alıcının sistolik ve diyastolik parametrelerini anlamlı olarak etkilemezler. Bu model, transplantasyon sonrası iskemi-reperfüzyon hasarı ve greft reddi gibi hücresel yanıtları incelemek için değerli bilgiler sağlar. Ayrıca, bu model intravital iki foton mikroskopisi veya pozitron emisyon tomografisi (PET) görüntüleme gibi nakil sonrası görüntülemeye izin vermek için ideal bir yaklaşım sunmaktadır. Bu amaçla, laboratuvarımız daha önce iskemi-reperfüzyon hasarı sırasında ve aterosklerotik plaklar içinde lökosit kaçakçılığını görselleştirmek için heterotopik servikal transplantasyonu takiben murin kalpleri ve aort ark greftlerini atarak murin kalpleri ve aort ark greftlerini de içeren faredeki hareketli doku ve organları görüntülemek için yöntemler bildirmiştir, sırasıyla13,14,15 . Ek olarak, yüzeysel konumu ve maruz kalma kolaylığı nedeniyle, bu model kardiyak re-transplantasyon için uygundur16.
Bu raporda, kan akışının kaynaklandığı damarlara vasküler manşetlerin dışarıdan yerleştirilmesiyle laminer kan akışına izin veren bir teknik açıklanmaktadır. Bu, kan akışının bir damardan diğerine yumuşak bir şekilde geçmesine izin verir ve distal damar kenarının vasküler lümene maruz kalmasını önler. Ek olarak, teknik, donör pulmoner arterin alıcıya kan akışının bol miktarda geri dönmesini sağlamak için daha önce kullanılan 22 G manşet yerine daha büyük bir 20 G manşet kullanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan taşıma prosedürleri, NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı kılavuzlarına uygun olarak yürütülmüş ve Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi Hayvan Çalışmaları Komitesi tarafından onaylanmıştır. C57BL / 6 (B6) ve BALB / c farelerinden (20-25 g ağırlığında) gelen kalpler, cinsiyete uygun B6 alıcılarına (6-8 haftalık) nakledildi. Fareler ticari kaynaklardan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu). İskemi-reperfüzyon hasarına bağlı hücresel yanıtları değerlendirmek için sinjenik transplantasyonlar yapıldı ve greft toleransı ve reddinde rol oynayan immün mekanizmaları araştırmak için allojenik transplantasyonlar yapıldı. B6 lizozim M-yeşil floresan proteini (LysM-GFP) muhabir fareleri17, aslen La Jolla Alerji ve İmmünoloji Enstitüsü, La Jolla, CA'dan Klaus Ley'den elde edilen ve daha sonra tesisimizde yetiştirilen, nötrofil infiltrasyonunu kardiyak greftlere görselleştirmek için seçilen deneyler için alıcı olarak kullanılmıştır. Sağkalım cerrahisi aseptik prosedürler kullanılarak yapıldı.
1. Donör prosedürü
- Ketamin (80-100 mg / kg) ve ksilazin (8-10 mg / kg) (bkz. Malzeme Tablosu) intraperitoneal olarak donör fareye enjekte ederek fareleri anestezi altına alın. Ayak parmağı ve kuyruk sıkışması ile anestezinin cerrahi düzlemini onaylayın.
- Elektrikli tıraş bıçağı kullanarak saçları göğüs ve karından tıraş ederek cerrahi bölgeyi hazırlayın.
- 100 birim heparini ( bakınız Malzeme Tablosu) intravenöz olarak penis damarına (erkekler) veya dış juguler venlere (erkekler veya kadınlar) uygulayın.
- Fareleri, ön ayakları tepede olacak şekilde sırtüstü bir pozisyona yerleştirin. Ön ayakları ve arka bacakları cerrahi bantla sabitleyin ve cildi % 0.75 iyot ve% 70 etanolden oluşan üç alternatif ovma ile dezenfekte edin.
- Umbilikustan sternal açıya (3-4 cm) kadar bir insizyon, medyan laparosteronotomi, ardından her kostal sınır boyunca (iki taraflı 2 cm) bilateral bir torakotomi uygulayın. Mediastenin tam olarak maruz kalması için ön göğüs duvarını boynun üzerine katlayın.
- Timüsü tüketin ve intratorasik inferior vena kavayı açığa çıkarın.
- Ekssanguinasyon için abdominal aortun genişliği boyunca transekt.
- Retrograd perfüzyon için, intratorasik inferior vena kavaya 1.5 mL'lik 4 °C salin enjekte edin ve iğne greftin üzerine üstün bir şekilde yönlendirildi, daha önce tarif edildiği gibi13.
- Superior vena kava'yı 8-0 kullanarak bağlayın ipek dikiş ve distal bölün.
- İnferior vena kava yoluyla 1.5 mL'lik 4 °C salin enjekte ederek retrograd perfüzyonu tekrarlayın.
- İnferior vena kavayı 8-0 kullanarak bağlayın ipek dikiş ve distal bölün.
- Greft hasadı için aort arkı ve pulmoner arter gövdesini disekte edin ve her ikisini de distal olarak transekte edin. Kalbin arka yüzeyindeki pulmoner damarları 6-0 ipek sütür kullanarak bağlayın ve distal olarak bölün.
- Donör kalbi göğüs boşluğundan çıkararak greft hazırlığı yapın. Eksize edilen kalbi 1-2 dakika boyunca 4 °C heparinize salin ile doldurulmuş plastik bir kaba koyun. Grefti manşet yerleştirilmesi için buzla doldurulmuş steril bir plastik şişeye aktarın (Şekil 1A).
NOT: Donör pulmoner arter manşetinin yerleştirilmesi için kalp greftinin şişe üzerinde yaklaşık 5 dakika kalması gerekir. - Donör manşet için pulmoner arterin üzerine 1 mm uzunluğunda 20 G anjiyokateter (bakınız Malzeme Tablosu) manşet yerleştirin. İnce forseps kullanarak, arterin kenarlarını manşetin üzerine yavaşça geri katlayın. Katlanmış kabı, daha önce18'de açıklandığı gibi 10-0 naylon bir bağ kullanarak manşete sabitleyin (Şekil 1B, C).
- Donör kalbini heparinize salin veya başka bir koruma solüsyonunda 4 ° C'de saklayın.
NOT: Bazıları uzun süreli iskemik koruma için özel koruma çözümlerini (örneğin, Wisconsin Üniversitesi çözümü) tercih etse de, maliyetli olabilir19. Salin, kısa süreli iskemi için uygun bir alternatif olabilir (<1 saat)20. Sonuçta, koruma çözümünün seçimi deneysel tasarıma bağlıdır21.
2. Alıcı prosedürü
- Anestezi için alıcı fareye intraperitoneal olarak ketamin (80-100 mg / kg) ve ksilazin (8-10 mg / kg) enjekte edin. Analjezi için deri altından sürekli salınımlı buprenorfin (0.5-1.0 mg / kg) enjekte edin. Ayak parmağı ve kuyruk sıkışması ile anestezinin cerrahi düzlemini onaylayın.
- Elektrikli tıraş bıçağı kullanarak saçları servikal bölgeden tıraş ederek cerrahi bölgeyi hazırlayın. Kornea kurumasını önlemek için gözlere steril, ilaçsız oftalmik merhem uygulayın.
- Hayvanı vücuda bitişik ön ayaklarla sırtüstü bir pozisyona yerleştirin ve kafa hafifçe sola döndü. Ön ayakları ve arka bacakları cerrahi bantla sabitleyin. Cildi %0.75 iyot ve %70 etanolden oluşan üç alternatif ovma ile dezenfekte edin.
- Alt mandibuladan sternuma orta hat servikal kesi yapın.
- Sağ sternokleidomastoid kası transekte edin. Greft implantasyonu için alan yaratmak üzere submandibuler bezin sağ lobunu tüketin.
- 6-0 ipek sütür kullanarak proksimal dış juguler ven üzerine bir kayma düğümü bağlayın. Distal dış juguler veni ve bitişik dalları 8-0 kullanarak bağlayın ipek dikiş. Dış juguler venin ön duvarı boyunca enine bir kesi yapın.
- Manşet yerleştirme sırasında damarı sabitlemek için proksimal eksternal juguler venin kenarından ve altta yatan dokudan 10-0 naylon bir sütür yerleştirin (Şekil 1D).
- Distal sağ ortak karotis arteri 8-0 kullanarak bağlayın ipek sütür, karotis bifurkasyonundan hemen daha düşüktür. 6-0 ipek sütür kullanarak proksimal ortak karotis arter üzerine bir kayma düğümü bağlayın. Arteri dikişler arasında distal olarak transekte edin.
- Donör manşete benzer şekilde, alıcının sağ ortak karotis arterinin üzerine 0.6 mm uzunluğunda 24 G anjiyokateter manşet yerleştirin. İnce forseps kullanarak, arterin kenarlarını manşetin üzerine yavaşça geri katlayın. Katlanmış kabı 10-0 naylon bir bağ kullanarak manşete sabitleyin.
- Donör kalbi sağ servikal bölgeden üstün tutun.
- İmplantasyon sırasında birkaç dakikada bir kalp greftine soğuk salin damlatın.
- Grefti yerine sabitlemek için donör aortun kenarından ve altta yatan dokunun yüzeysel bir ısırığından 10-0 naylon bir sütür yerleştirin (Şekil 1E).
- Donör aortu 0.5 mL% 0.9 heparinize salin ile yıkayın.
- Alıcının ortak karotis arter manşetini donör aortuna yerleştirin. Anastomozu 8-0 ile sabitleyin ipek kravat (Şekil 1F). Aort ankraj dikişini çıkarın.
- Alıcının dış juguler venini 0.5 mL% 0.9 heparinize salin ile yıkayarak dış juguler veni havalandırın.
- Donör pulmoner arter manşetini alıcının dış juguler venine yerleştirerek pulmoner arter anastomozu yapın ve 8-0 ile sabitleyin ipek kravat (Şekil 1G). Dış juguler ven ankraj sütürünü çıkarın ve grefti altta yatan dokudan serbest bırakmak için dış juguler venin kalan arka duvarını transekte edin. Greftin anastomozların bükülmeden veya bükülmeden düzgün bir şekilde yönlendirildiğinden emin olun.
- Kalp grefti reperfüzyonunu başlatmak için alıcının dış juguler venindeki kaymaları ve ardından ortak karotis arteri serbest bırakın (Şekil 1H).
- Servikal cilt insizyonunu kesilmiş 6-0 naylon sütür kullanarak kapatın.
3. Postoperatif bakım
- Alıcıyı ameliyattan hemen sonra sıcak bir iyileşme odasına yerleştirin ve anesteziden tamamen iyileşene kadar (yaklaşık 1 saat) yakından izleyin.
- Uyuşukluk, titreme, hızlı nefes alma veya anoreksiya gibi anormal davranış belirtileri için ameliyattan sonra hayvanı en az 72 saat boyunca (her 6-8 saatte bir) yakından izlemeye devam edin.
- Ağrı kontrolü için, analjezi için her 8-12 saatte bir deri altından karprofen (5 mg / kg), ameliyatın sonundan başlayarak 24-48 saat boyunca her 8-12 saatte bir deri altı büprenorfin (0.05 mg / kg) enjekte edin.
4. Kalp greftinde lökosit kaçakçılığının intravital iki fotonlu görüntülenmesi
- Anestezi için greft reperfüzyonundan 17 2 saat sonra B6 LysM-GFP alıcı fareye intraperitoneal olarak ketamin (80-100 mg/kg) ve ksilazin (8-10 mg/kg) enjekte edin.
- Daha önce tarif edildiği gibi 20 G anjiyokateter kullanarak orotrakeal entübasyon yapın18.
- Anjiyokateteri bir fare mekanik ventilatöründen tüpe bağlayın ve oda havası ile 120 nefes / dak hızında ve 0,5 mL18 gelgit hacminde havalandırın.
- Daha önce tarif edildiği gibi, intravenöz olarak 50 μL PBS'de asılı olan 655 nm hedeflenmemiş Kuantum noktalarının12 μL'sini enjekte edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Kalp greftini ortaya çıkarmak için boyun insizyonunu tekrar açın. Fareyi bir stabilizasyon odasına yerleştirin.
- Sol ventrikülün serbest duvarının bir kısmını, üst hazne plakasına tutturulmuş bir cam kapak kaymasına uygulanan ince bir doku yapıştırıcısı halkası kullanarak sabitleyin (bkz.
- Daha önce açıklandığı gibi görüntü ve video elde etmek için odayı iki foton mikroskobunun altına yerleştirin13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu fare servikal heterotopik kardiyak transplantasyon modeli, laboratuvarımızda yaklaşık %97'lik bir sağkalım oranı ile 1.000'den fazla nakil gerçekleştirmek için kullanılmıştır. Başarı oranı, farelerde diğer servikal heterotopik kalp nakli teknikleri kullanılarak yapılan önceki raporlardan biraz daha yüksektir10,11,20. Bu potansiyel olarak, alıcıya kan akışının bol miktarda geri dönüşünü sağlamak için donör pulmoner artere yerleştirilen daha büyük 20 G manşete bağlanabilir (Şekil 1B, C). Ek olarak, mevcut teknikte kan akımının manşet yerleştirilmesi ile hizalanması, tromboz ve anastomoz türbülansı riskini en aza indirmektedir (Şekil 1,2). Manyetik rezonans görüntüleme (MRG) veya ultrason greft perfüzyonu22,23'ün türbülansını değerlendirebilirken, bu teknikleri deneylerde henüz kullanmadık. Bu tekniği kullanarak intraoperatif ölüm deneyimli mikrocerrahlar için nadirdir. Postoperatif mortalite en sık kanama komplikasyonlarına bağlıdır. Ortalama alıcı ameliyat süresi 36.5 ± 3.5 dakika, ortalama soğuk iskemi süresi 20 dakika idi. Sağkalım çalışmaları için, kalp greftleri günlük olarak kalp atışının doğrudan görselleştirilmesi ve dijital palpasyonu ile değerlendirildi. Fareler tipik olarak ameliyat sonrası 7-14 gün civarında greft değerlendirmesi için kurban edilir. İntravital iki foton görüntüleme, lökosit kaçakçılığını değerlendirmek için genellikle transplantasyondan sonra erken dönemde yapılan terminal bir prosedürdür (Şekil 3).
Çoğu sinjenik nakil, transplantasyondan 6 ay sonrasına kadar fedakarlığa kadar güçlü kalp atışlarını korudu. Brüt muayenede çoğu sinjenik greft normal görünüyordu ve histolojik incelemede reddedilme bulgusu saptanmadı. Tüm immünsüprese olmayan allojenik transplantasyonlar (BALB / c'den B6'ya), engraftmadan sonraki 1-2 hafta içinde azalmış bir kalp atışı geliştirdi. Bu tür farelerden eksize edilen allojenik greftler aşırı derecede dilate edildi ve histolojik incelemede lenfositlerin ve miyokard nekrozu alanlarının diffüz infiltrasyonu görüldü.
Şekil 1: Transplantasyon için kalp greftinin hazırlanması . (A) Kalp, donör fareden eksize edilir. (B,C) Pulmoner arter gövdesi açığa çıkarılır ve 20 G'lık bir manşetten çekilir, geriye doğru katlanır ve 10-0 naylon sütür ile sabitlenir. (D) Alıcının dış juguler veninin kenarından 10-0 naylon sütür yerleştirilir ve altta yatan dokuya sabitlenir. (E) Donör aortun kenarından 10-0 naylon sütür yerleştirilir ve alıcı karotis artere bitişik altta yatan dokuya sabitlenir. (F) Alıcının ortak karotis arter manşeti donör aortuna yerleştirilir ve 8-0 ile sabitlenir. ipek dikiş. (G) Donör pulmoner arter manşeti, alıcının dış juguler damarına yerleştirilir ve 8-0 ile sabitlenir. ipek dikiş. (H) Alıcının eksternal juguler venindeki proksimal kayma notu serbest bırakılır, bunu ortak karotis arter kayma notunun salınması izler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kardiyak greftin intraoperatif görünümü. Donörün pulmoner arteri üzerinden 1 mm 20 G'lik bir manşet çekilir ve 10-0 naylon bir bağ ile sabitlenir. 0.6 mm 24 G'lik bir manşet, alıcının sağ ortak karotis arteri üzerine çekilir ve 10-0 naylon bir bağ ile sabitlenir. Ankraj sütürleri (10-0 naylon) donör aortun duvarına ve alıcının sağ dış juguler venine yerleştirilir ve manşet yerleştirme sırasında hareketi önlemek için altta yatan dokuya sabitlenir. (AO = aort, PA = pulmoner arter, CCA = ortak karotis arter, EJV = eksternal juguler ven). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kalp greftindeki lökosit dinamiklerinin intravital iki fotonlu görüntülenmesi. B6 fareden B6 LysM-GFP alıcısına nakledilen atan kalbin intravital iki foton görüntülemesi, alıcı nötrofillerin postoperatif 2-3 saat arasında kardiyak greft dokularına kaçırıldığını göstermektedir. (Yeşil = nötrofiller, kırmızı = kuantum noktalarıyla etiketlenmiş kaplar). Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Komplikasyon | Olası Nedenler | Çözümleri |
| Alıcının ölümü | Hipotermi | Isıtma yastığı |
| Dehidratasyon | Postoperatif %0.9 salin i.p. | |
| Kötü greft perfüzyonu | Karotis arter torsiyonu | Re-anastomoz veya |
| Trombüs veya hava embolisi | Açık arteriyel anastomoz ve heparinize salin ile yıkama | |
| Venöz obstrüksiyon | Trombüs veya hava embolisi | Re-anastomoz veya |
| Açık venöz anastomoz ve heparinize salin ile yıkama | ||
| Postoperatif kanama | Kanayan juguler ven dalları | Ligat juguler ven dalları |
| Pamuklu çubukla sıkıştırma | ||
| Gevşek manşetler | Manşetleri sıkın | |
| Zayıf kalp atışı | Soğuk kardiyak greft | Kalbin yüzeyine ılık salin damlatın |
| Greft büküm | Yanlış greft pozisyonu | Cilt kapanmadan önce greftin doğru yönlendirildiğinden emin olun |
| Düzensiz aktivite (örneğin daireler halinde koşmak) | Serebral iskemi | Ligat ortak karotis arter karotis bifurkasyondan inferior |
Tablo 1: Komplikasyonlar için sorun giderme. Solüsyonlarla sık karşılaşılan komplikasyonlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu tekniği kullanarak, fare heterotopik servikal kalp nakli, deneyimli bir mikrocerrah tarafından 40 dakikadan daha kısa bir sürede ve giriş seviyesi bir mikrocerrah tarafından yaklaşık 60 dakika içinde gerçekleştirilebilir. Servikal kalp nakli çok sayıda hayvan modelinde incelenmiş olsa da, bir fare modeli, çok sayıda iyi tanımlanmış genetik suş, genetik değişiklik yetenekleri ve monoklonal antikorlar da dahil olmak üzere çok sayıda reaktifin mevcudiyeti nedeniyle altın standart olmaya devam etmektedir24. Burada açıklanan teknik, iki foton mikroskobu (Şekil 3) veya seri non-invaziv PET görüntüleme13,14,15,25 dahil olmak üzere elektrokardiyografi veya intravital görüntüleme gibi nakil sonrası izleme için eşsiz bir fırsat sunmaktadır. Bu yöntem, kalp grefti için intravital görüntüleme için stabilize edilmesi daha kolay olan yüzeysel bir yer sağlar, böylece greftin ve çevresindeki abdominal organların daha derin konumu nedeniyle abdominal transplantasyon yönteminin doğasında bulunan karmaşıklığı önler. Ayrıca, bu teknik özellikle yeniden nakil bağlamında yararlıdır. Retransplantasyon modelleri, alloimmün yanıtlara aracılık eden nakledilen kardiyak greftlerde yerleşik hücreleri tanımlamak için güçlü araçları temsil eder. Bu tekniği daha önce kısa vadeli sonuçları değerlendirmek için bir fare kalbi yeniden nakil modelinde kullanmış olsak da, bu yaklaşım uzun vadeli sonuçları keşfetmek için gelecekteki deneylerde genişletilebilir16. Bu amaçla, şu ana kadar yapılan araştırmalarda kısa süreli soğuk iskemi (yaklaşık 20 dakika) kullanılmıştır. Gelecekteki çalışmalar, uzun süreli soğuk veya sıcak iskeminin klinik transplantasyonu daha yakından taklit etmek için kısa ve uzun vadeli sonuçlar üzerindeki etkisini araştırabilir.
Bu tekniğin birkaç kritik adımının dikkate alınması gerekir. Önceki yöntemler, daha küçük eksternal juguler ven üzerinde, donör pulmoner arterin büyük lümenine manşet yerleştirilmesini içerir 6,8. Kan akışı ile uygun oryantasyon sağlamak için daha büyük manşetin donör pulmoner arter üzerine yerleştirilmesi, manşetin daha küçük dış juguler ven içine yerleştirilmesini biraz daha zorlaştırır. Damarın kenarını altta yatan dokuya sabitlemek ve damarın ön duvarını sadece kısmen kesmek manşet yerleştirilmesini kolaylaştırır. Ek olarak, alıcının ortak karotis arterine manşet yerleştirilmesi, damarın küçük kalibresi nedeniyle oldukça zor olabilir. Bu nedenle, önceki teknikler bu anastomoz12 için daha küçük manşetlerin (örneğin, 26 G) kullanıldığını bildirmiştir. Bununla birlikte, mevcut yaklaşım, bazı sağkalım yararları sunabileceğine inandığımız yeterli greft perfüzyonunu sağlamak için daha büyük bir 24 G manşet kullanmaktadır. Daha büyük alıcı farelerin seçilmesi acemi mikrocerrahlara yardımcı olabilir. Ankraj sütürleri reperfüzyonu takiben çıkarılır ve greft diğerlerinin tanımladığı gibi uygun bir yönde sabitlenmez3. Bu nedenle, bükülmeyi veya burulmayı önlemek için servikal cilt kapanmadan önce greftin uygun şekilde konumlandırıldığını ve yönlendirildiğini kontrol etmek önemlidir (Tablo 1). Sağ submandibuler bezin eksizyonu kalp grefti için yeterli alan sağlamak için yapılır, böylece cilt kapandıktan sonra greft sıkışmasından kaçınılır.
Burada açıklanan model çeşitli avantajlar sunar. Manşetleri donör pulmoner arter gövdesine ve alıcının ortak karotis arterine yerleştirerek, manşet oryantasyonu kan akışının yönü ile hizalanır. Bu, türbülanslı akış ve trombüs oluşumu olasılığını azaltır. İkincisi, alıcıya kan akışının bol miktarda geri dönüşünü sağlamak için daha büyük bir 20 G pulmoner arter manşeti kullanılır. Üçüncüsü, greftin yeterli perfüzyonunu sağlamak için ortak karotis arter üzerine daha büyük bir 24 G manşet yerleştirilir. Son olarak greftin altta yatan dokulara sabitlenmesi ve manşet yerleştirilmesinin kolaylaştırılması için 10-0 naylon ankraj sütür kullanılır. Bu modifikasyonlar, prosedürün teknik zorluklarının üstesinden gelmeye, anastomoz türbülansını önlemeye ve trombüs oluşumu gibi postoperatif komplikasyonları azaltmaya yardımcı olur.
Tüm fare kalp nakli modellerinin önemli bir sınırlaması, fizyolojik kan akışının kalbin odacıklarından geri yüklenmemesidir. Bunun yerine, bu modeller koroner damarlar boyunca dolaşıma dayanır. Bu retrograd akış paterninin greftin hücresel hasarı ve immün yanıtları üzerindeki sonuçları açıkça tanımlanmamıştır; Bununla birlikte, bu fizyolojik olmayan dolaşımdan kaynaklanan mekanik kesme kuvvetlerinin bağışıklık tepkilerini etkilemesi mümkündür. Farelerde fizyolojik kan akışını geri kazandıran cerrahi bir kalp nakli modeli henüz geliştirilmemiştir ve önemli teknik ilerlemeler gerektirecektir. Farelerin küçük bir kısmının (<% 3) prosedürü takiben geçici düzensiz davranış (örneğin, daireler halinde koşma) yaşadığı gözlenmiştir. Bu davranış, çözünürlükten önce yaklaşık 1-2 saat sürer. Bu davranışın aynı anestezik rejimi kullanan diğer işlemlerden sonra gözlenmediği göz önüne alındığında, servikal kalp nakli sonrası kan akımı değişikliklerine bağlı olarak geçici serebral iskemi ile ilişkili olabilir. Tam iyileşme, herhangi bir kronik eksiklik gözlenmeden tüm farelerde meydana gelmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
DK, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibeleri 1P01AI116501, R01HL094601, R01HL151078, Gaziler İdaresi Liyakat İncelemesi hibesi 1I01BX002730 ve Barnes-Yahudi Hastanesi Vakfı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 braided silk ties | Henry Schein Inc | 7718729 | |
| 0.75% Providone iosine scrub | Priority Care Inc | NDC 57319-327-0 | |
| 10-0 nylon suture | Surgical Specialties Corporation | AK-0106 | |
| 655-nm nontargeted Q-dots | Invitrogen | Q21021MP | |
| 70% Ethanol | Pharmco Products Inc | 111000140 | |
| 8-0 braided silk ties | Henry Schein Inc | 1005597 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools Inc | 91127-12 | |
| BALB/c and C57BL/6 mice (6-8 weeks) | Jackson Laboratories | ||
| Bipolar coagulator | Valleylab Inc | SurgII-20, E6008/E6008B | |
| Carprofen (Rimadyl) injection | Transpharm | 35844 | |
| Carprofen (Rimadyl) oral chewable tablet | Transpharm | 38995/37919 | |
| Custom-built 2P microscope running ImageWarp acquisition software | A&B Software | ||
| Dumont no. 5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11251-20 | |
| Fine vannas style spring scissors | Fine Science Tools Inc | 15000-03 | |
| GraphPad Prism 5.0 | Sun Microsystems Inc. | ||
| Halsey needle holder | Fine Science Tools Inc | 91201-13 | |
| Halsted-Mosquito clamp curved tip | Fine Science Tools Inc | 91309-12 | |
| Harvard Apparatus mouse ventilator model 687 | Harvard Apparatus | MA1 55-0001 | |
| Heparin solution (100 U/mL) | Abraxis Pharmaceutical Products | 504031 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine (50 mg/kg) | Wyeth | 206205-01 | |
| Microscope—Leica Wild M651 × 6–40 magnification | Leica Microsystems | ||
| Moria extra fine spring scissors | Fine Science Tools Inc | 15396-00 | |
| Ohio isoflurane vaporizer | Parkland Scientific | V3000i | |
| Qdots | ThermoFisher | 1604036 | |
| S&T SuperGrip Forceps angled tip | Fine Science Tools Inc | 00649-11 | |
| S&T SuperGrip Forceps straight tip | Fine Science Tools Inc | 00632-11 | |
| Sterile normal saline (0.9% (wt/vol) sodium chloride | Hospira Inc | NDC 0409-4888-20 | |
| Sterile Q-tips (tapered mini cotton tipped 3-inch applicators) | Puritan Medical Company LLC | 823-WC | |
| Surflow 20 gauge 1/4-inch Teflon angiocatheter | Terumo Medical Corporation | SR-OX2032CA | |
| Surflow 24 gauge 3/4-inch Teflon angiocatheter | Terumo Medical Corporation | R-OX2419CA | |
| ThermoCare Small Animal ICU System (recovery settings 3 L/min O2, 80 °C, 40% humidity) | Thermocare Inc | ||
| VetBond | Santa Cruz Biotechnology SC361931 | NC0846393 | |
| Xylazine (10 mg/kg) | Lloyd Laboratories | 139-236 |
References
- Abbott, C. P., Lindsey, E. S., Creech, O., Dewitt, C. W. A technique for heart transplantation in the rat. The Archives of Surgery. 89, 645-652 (1964).
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplantation Proceedings. 5 (1), 733-735 (1973).
- Heron, I. A technique for accessory cervical heart transplantation in rabbits and rats. Acta Pathologica Microbiologica Scandinavica Section A Pathology. 79 (4), 366-372 (1971).
- Chen, Z. H. A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice. Transplantation. 52 (6), 1099-1101 (1991).
- Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51 (4), 896-898 (1991).
- Yu, Y., et al. Cuff anastomosis of both renal artery and vein to minimize thrombosis: a novel method of kidney transplantation in mice. Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 56-60 (2022).
- Tomita, Y., et al. Improved technique of heterotopic cervical heart transplantation in mice. Transplantation. 64 (11), 1598-1601 (1997).
- Wang, Q., Liu, Y., Li, X. K. Simplified technique for heterotopic vascularized cervical heart transplantation in mice. Microsurgery. 25 (1), 76-79 (2005).
- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. Journal of Visualized Experiments. (92), e50753 (2014).
- Ratschiller, T., et al. Heterotopic cervical heart transplantation in mice. Journal of Visualized Experiments. (102), e52907 (2015).
- Mao, X., Xian, P., You, H., Huang, G., Li, J. A modified cuff technique for mouse cervical heterotopic heart transplantation model. Journal of Visualized Experiments. (180), e63504 (2022).
- Li, W., et al. Intravital 2-photon imaging of leukocyte trafficking in beating heart. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2499-2508 (2012).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Li, W., et al. Visualization of monocytic cells in regressing atherosclerotic plaques by intravital 2-photon and positron emission tomography-based imaging-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (5), 1030-1036 (2018).
- Li, W., et al. Lung transplant acceptance is facilitated by early events in the graft and is associated with lymphoid neogenesis. Mucosal Immunology. 5 (5), 544-554 (2012).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Krupnick, A. S., et al. Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology. Nature Protocols. 4 (1), 86-93 (2009).
- Westhofen, S., et al. The heterotopic heart transplantation in mice as a small animal model to study mechanical unloading - Establishment of the procedure, perioperative management and postoperative scoring. PLoS One. 14 (4), 0214513 (2019).
- Ma, Y., et al. Optimization of the cuff technique for murine heart transplantation. Journal of Visualized Experiments. (160), e61103 (2020).
- Latchana, N., Peck, J. R., Whitson, B., Black, S. M. Preservation solutions for cardiac and pulmonary donor grafts: a review of the current literature. Journal of Thoracic Disease. 6 (8), 1143-1149 (2014).
- Hartley, C. J., et al. Doppler velocity measurements from large and small arteries of mice. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 301 (2), 269-278 (2011).
- Bovenkamp, P. R., et al. Velocity mapping of the aortic flow at 9.4 T in healthy mice and mice with induced heart failure using time-resolved three-dimensional phase-contrast MRI (4D PC MRI). MAGMA. 28 (4), 315-327 (2015).
- Wang, H.
- Martins, P. N. Assessment of graft function in rodent models of heart transplantation. Microsurgery. 28 (7), 565-570 (2008).
