Summary
该协议演示了如何使用简单的实验室规模台式设置分离人脐带衍生间充质干细胞的小细胞外囊泡（hUC-MSC-sEVs）。采用纳米颗粒示踪分析、BCA蛋白测定、蛋白质印迹和透射电子显微镜分别对分离的hUC-MSC-sEV的粒径分布、蛋白浓度、sEVs标志物和形貌进行了表征。
Abstract
基于超速离心的过程被认为是小细胞外囊泡（sEV）分离的常用方法。然而，这种分离方法的产量相对较低，并且这些方法在分离sEV亚型方面效率低下。本研究展示了一种简单的台式过滤方法，用于分离人脐带衍生的MSC小细胞外囊泡（hUC-MSC-sEVs），通过超滤成功地从hUC-MSC的条件培养基中分离出来。采用纳米颗粒示踪分析、BCA蛋白测定、蛋白质印迹和透射电镜分别对分离的hUC-MSC-sEVs的尺寸分布、蛋白浓度、外泌体标志物（CD9、CD81、TSG101）和形貌进行了表征。分离出的hUC-MSC-sEVs的尺寸为30-200 nm，颗粒浓度为7.75 ×10 10 颗粒/mL，蛋白质浓度为80 μg/mL。观察到外泌体标志物CD9，CD81和TSG101的阳性条带。本研究表明，hUC-MSC-sEVs已成功从hUC-MSCs条件培养基中分离出来，表征表明分离出的产物符合2018年细胞外囊泡研究最小信息（MISEV 2018）提到的标准。
Introduction
根据MISEV 2018，sEV是非复制的脂质双层颗粒，不存在功能核，尺寸为30-200 nm1。MSC 衍生的 sEV 含有重要的信号分子，在组织再生中起重要作用，例如 microRNA、细胞因子或蛋白质。它们日益成为再生医学和无细胞疗法的研究“热点”。许多研究表明，间充质干细胞衍生的sEV在治疗不同疾病方面与间充质干细胞一样有效，例如免疫调节2，3，4，5，增强成骨6，糖尿病7，8或血管再生9，10。随着早期试验的进展，与MSCs-EVs的临床转化相关的三个主要关键问题得到了强调：EVs的产量，EVs的纯度（不含细胞碎片和其他生物污染物，如蛋白质和细胞因子），以及分离后EV磷脂双层膜的完整性。
已经开发了各种方法来分离sEV，利用sEV的密度，形状，大小和表面蛋白11。sEV分离中最常见的两种方法是基于超速离心和基于超滤的技术。
基于超速离心的方法被认为是sEV分离的金标准方法。通常采用的两种类型的超速离心技术是差分超速离心和密度梯度超速离心。然而，超速离心方法通常会导致低产量，并且需要昂贵的高速超速离心设备（100，000-200，000 × g）11。此外，单独的超速离心技术在分离EV亚型（sEV和大型EV）方面效率低下，导致沉积层不纯11。最后，密度梯度超速离心也可能非常耗时，并且需要额外的预防措施，例如添加蔗糖缓冲液以抑制加速和减速步骤12期间的梯度损伤。因此，超速离心通常会导致相对较低的产率，并且无法区分不同EV群体13，这限制了其在大规模EV制备中的应用11。
EV隔离的第二种方法是通过超滤，它基于尺寸过滤。与超速离心相比，超滤相对省时且具有成本效益，因为它不涉及昂贵的设备或较长的处理时间14。因此，超滤似乎是一种比上述两种超速离心方法更有效的分离技术。分离的产品可以根据孔径和更高的产量更具体15。然而，在过滤过程中产生的额外力可能导致EV变形或喷发16。
本文提出了一种经济高效的台式方案，用于分离MSC衍生的sEV用于下游分析和治疗目的。本文描述的方法将简单的过滤方法与台式离心相结合，从hUC-MSC中分离出高产量和高质量的EV，用于下游分析，包括粒度分析，生物标志物测定和电子显微镜成像。
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Protocol
注意：有关此协议中使用的所有材料、设备和软件的详细信息，请参阅 材料表 。
1. 人脐带间充质干细胞及培养
- 在DMEM中以5×103 / cm2 的接种密度培养hUC-MSC，并补充有8%的人血小板裂解物和1%笔链球菌。将细胞在37°C的5%CO2中孵育。每3天更换一次细胞培养基，以确保细胞正常生长。
- 将细胞扩增至T175烧瓶中的传代5进行sEV分离。
注意：收获高产量的sEV需要许多烧瓶（产量随着细胞数量的增加而增加）。
2. 从 hUC - MSC 中分离的小细胞外囊泡
- 当培养物在第5代达到70%-80%汇合度时，用补充有1%Pen-Strep [条件培养基（CM）]的新鲜无酚红DMEM替换培养基。
注意：仅使用基础培养基;避免补充FBS和人血小板裂解物，以避免外部sEV污染。 - 24小时后，将CM在4°C下以200× g 离心5分钟以除去细胞碎片。通过0.22μm过滤器收集并过滤上清液，以去除大于220nm的颗粒。
- 用 30 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 填充离心过滤装置，该盐水通过 0.2 μm 过滤器过滤。在4°C下以3，500× g 离心离心过滤单元5分钟。
- 将过滤后的CM填充到离心过滤单元中（每个单元的最大体积为70 mL）。在4°C下以3，500× g 离心CM。
注意：应不时监测离心的持续时间，直到溶液到达过滤器表面。 - 将溶液丢弃在滤液溶液杯中。在4°C下以1，000×g反向离心带有浓缩收集杯的样品过滤杯2分钟。
- 将浓缩的CM转移回离心过滤装置。将30mL过滤的PBS加入离心过滤单元中，并在4°C下以3，500×g离心该单元。
- 将溶液丢弃在滤液溶液杯中。在过滤单元上安装浓缩收集杯，并在4°C下以1，000× g 反向离心2分钟以获得纯化的sEV。
- 通过0.22μm注射器过滤器过滤sEV。
- 将样品转移到新管中，并将其储存在-80°C以进行进一步分析。
3. hUC-MSC-sEV的表征
- 纳米颗粒跟踪分析
- 将过滤PBS中分离的hUC-MSC-sEV稀释至20-100个颗粒/帧。
- 使用 1 mL 一次性注射器将 1 mL 稀释的样品引入 NTA 室。
- 相应地设置测量设置：将 相机级别 调整为 14级，确定 检测阈值 以包含尽可能多的颗粒，限制计数 10-100个红 叉， 蓝叉计数 限制为 5个。
- 对于每次测量，记录五个 1 分钟的视频，并使用检测阈值为 5 的 NanoSight 软件对其进行分析。
- 对每个样品进行一式三份的测量。
- 蛋白质印迹分析
- 用冰冷的放射免疫沉淀测定（RIPA）裂解缓冲液裂解hUC-MSC-sEV，在4°C孵育30分钟，并在4°C下以200× g 离心5分钟。 收集上清液。
- 使用二辛可宁酸 （BCA） 蛋白质检测试剂盒定量蛋白质。相应地组装凝胶电泳装置，并在90 V下进行凝胶电泳，直到蛋白质到达堆叠凝胶的末端。将电压更改为200 V以分离蛋白质，直到分离凝胶结束。
- 进行半干转印，以15 V将蛋白质从凝胶转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上1小时。
- 在室温下摇床上用3%牛血清白蛋白（BSA）/Tris缓冲盐水-0.1%v / v 吐温20（TBS-T）封闭PVDF膜1小时。将PVDF膜与一抗孵育如下：小鼠抗CD 9单克隆抗体（1：500），小鼠抗CD 81单克隆抗体（1：500），小鼠抗GRP 94单克隆小鼠抗TSG 101单克隆抗体（1：500）在4°C下持续振荡过夜。
- 第二天，用TBS-T洗涤PVDF膜5 x 5分钟，并进一步与二抗孵育：辣根过氧化物酶偶联小鼠IgG κ结合蛋白（m-IgGκ BP-HRP）（1：5，000）在室温下搅拌1小时。
- 再次，用TBS-T洗涤PVDF膜五次，并使用化学发光检测试剂在电荷耦合（CCD）成像仪中可视化膜。使用 ImageJ 软件分析蛋白质的表达水平。首先，在 ImageJ 中打开图像文件（文件 |打开...通过调整亮度和对比度来提高图像质量（图片 |调整 |亮度/对比度）。调整图像，直到印迹清晰可见，单击“应用”按钮，然后将图像保存为TIFF格式（文件|另存为 |啧...
- 透射电子显微镜
- 用四份过滤的PBS稀释一部分hUC-MSC-sEVs样品至总体积为10μL，并在碳涂层铜网格上孵育15分钟。
- 使用实验室擦拭布去除多余的样品，使其风干3分钟。
- 孵育 10 μL 1% 磷钨酸 （PTA） 溶液以染色样品 3 分钟。
- 使用实验室擦拭布去除多余的 1% PTA 溶液，使其风干 3 分钟。
- 使用样品进行透射电子显微镜成像。
注意：有关总结的原理图实验步骤，请参阅 图1 。
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Representative Results
图2 显示hUC-MSC-sEV在53 nm处具有粒径模式，而其他显著的粒径峰分别为96和115 nm。NTA测量的hUC-MSC-sEVs浓度为7.75×1010 个颗粒/mL。用BCA测定法测量的hUC-MSC-sEVs的蛋白质浓度约为80μg/ mL。
在蛋白质印迹分析中，hUC-MSC-sEVs的外泌体标志物CD9、CD81和TSG101呈阳性条带，但GRP94呈阴性（图3）。GRP94是一种内质网标记物，通常用作sEV的阴性标记物。分离的hUC-MSC-sEV在TEM下可视化以确定其大小和形态。hUC-MSCs-sEVs尺寸为~100 nm，并显示出杯状双层膜结构（图4）。
图 1：sEV 的隔离、清洁和表征工作原理图。从MSC培养物中收集条件培养基，并通过0.22μm过滤器过滤以去除大颗粒。将过滤后的培养基转移到离心过滤单元以浓缩sEV，并反向离心以收集浓缩的sEV。然后将浓缩的sEV用冷的过滤PBS重悬，并使用离心过滤装置重复这些步骤以进行洗涤步骤。最后，通过0.22 μm过滤对sEV进行灭菌，然后使用纳米颗粒跟踪分析，蛋白质印迹分析和透射电子显微镜进行表征。请点击此处查看此图的大图。
图 2：分离的 hUC-MSC-sEV 的纳米颗粒跟踪分析。 hUC-MSC-sEV用澄清的PBS稀释100-1，000倍，并使用配备CMOS相机，20倍物镜，蓝色激光模块（488 nm）和NTA软件的Nanosight NS300进行测量。该图是NTA一式三份的表示形式。缩写：hUC-MSC-sEVs = 人脐带来源的 MSC 小细胞外囊泡;NTA = 纳米颗粒跟踪分析;CMOS = 互补金属氧化物半导体。 请点击此处查看此图的大图。
图3：hUC-MSC-sEVs的生物标志物表达 。 （A）CD9外泌体阳性标志物的蛋白质印迹分析。（B）CD81外泌体阳性标志物的蛋白质印迹分析。（C）TSG101外泌体阳性标志物的蛋白质印迹分析。（D）GRP94阴性标志物的蛋白质印迹分析。将所有四种标记物与细胞裂解物作为对照进行比较。从左到右，梯形，细胞裂解物，hUC-MSC-sEVs（A，B）;梯形图，hUC-MSC-sEVs，细胞裂解物，hUC-MSC-sEVs，细胞裂解物（C）;梯形，细胞裂解物，hUC-MSC-sEVs（D）。细胞裂解物对来自两个重复，这些图像是一式三份进行的实验的代表性图像。缩写：hUC-MSC-sEVs = 人脐带衍生的 MSC 小细胞外囊泡。 请点击此处查看此图的大图。
图4：透射电子显微镜下单个hUC-MSC-sEVs的形态。 将hUC-MSC-sEVs在碳涂层铜网格上孵育并用1%磷钨酸染色，然后在透射电子显微镜下观察。尺寸约为100 nm的hUC-MSC-sEV表现出杯状双层膜结构。比例尺 = 100 nm。该图像是三个独立捕获的代表。缩写：hUC-MSC-sEVs = 人脐带衍生的 MSC 小细胞外囊泡。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
EV是间充质干细胞分泌组的重要子集之一，在正常和病理过程中起着至关重要的作用。然而，在过去十年中，尺寸范围在30至200nm之间的sEV已成为无细胞治疗的潜在工具。开发了各种技术来从间充质干细胞中分离sEV。然而，差示超速离心、超滤、基于聚合物的沉淀、免疫亲和捕获和基于微流体的沉淀具有不同的优缺点17。这些分离技术都无法实现高回收率和特异性。因此，研究人员必须根据自己的喜好，根据高回收率或高特异性选择合适的方法。
在分离MSC sEV之前，通过流式细胞术评估MSC的阳性表面标志物（CD90，CD105，CD73）和阴性标志物（CD34，CD11b，CD19，CD45和HLA-DR），如前所述18。这项sEV研究的技术优势可能为当前情况提供解决方案。它只需要在实验室中设置一个基本的台式，以避免使用高端设备来隔离sEV。MSCs在所述方案中缺乏培养基，而不添加任何血清。这对于防止血清补充剂对EV的任何污染至关重要。然而，考虑到血清补充剂在某些情况下是不可避免的，在配制完全培养基时可以考虑使用去除外泌体的血清补充剂。此外，无酚红培养基可用作标准培养基的替代品，因为这种常见的pH指示剂可能会导致比色测量出现问题15。在去除大于220nm的颗粒期间，可以通过使用0.22μm泵式过滤器而不是传统的注射器过滤器来改进该方案。应采取预防措施以提高sEV的产量。在最后一次通过离心过滤单元离心CM时，应避免长时间离心，以确保有足够的溶液体积从过滤器中洗脱sEV。忽视这一点可能会降低在反向离心步骤中收集的sEV的产量。
该方案仅限于实验室规模，因此可能不适合工业中的大规模分离。这是由于一次性使用离心过滤单元的成本很高，这对于大规模隔离是不可行的，这通常涉及高达数千升CM的体积。总之，我们提供了一种简单的台式过滤方案，用于分离来自MSC的sEV。该协议也适用于纯化分离的sEV，以进行进一步的下游分析。尽管该协议是专门为源自MSC的sEV设计的，但所述协议的一部分可用于从不同来源（例如体液，细胞系或其他液体类型来源）分离sEV。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
该视频的发布得到了My CytoHealth Sdn. Bhd的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
| 95% ethanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Disinfectants |
| Absolute Methanol | Chemiz | 45081 | To activate PVDF membrane (Western blot) |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell dissociation enzyme |
| ammonium persulfate | Chemiz | 14475 | catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis |
| anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | Antibody for sEVs marker |
| anti-TSG 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | Antibody for sEVs marker |
| Bovine serum albumin | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF membrane blocking |
| bromophenol blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | electrophoretic color marker |
| Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | sEVs isolation |
| ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | chemiluminescence detection reagent |
| CryoStor Freezing Media | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Cell cryopreserve |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Cell culture media |
| ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker | SMOBIO | PM2610 | Protein molecular weight markers |
| Extra thick blotting paper | ATTO | buffer reservior (Western blot) | |
| Glycerol | Merck | G5516 | Chemicals for western blot |
| Glycine | 1st Base | BIO-2085-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | Secondary antibody (Western Blot) |
| Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia | ||
| mouse antibodies anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | Antibody for sEVs marker |
| Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
| paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 02890-45 | Sample Fixation during TEM |
| penicillin–streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Antibiotic for media |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Nacalai Tesque | 27327-81 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Washing, sample dilution |
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size |
ATTO | To hold protein during protein transfer (Western blot) | |
| protease inhibitor cocktail | Nacalai Tesque | 25955-11 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| Protein Assay Bicinchoninate Kit | Nacalai Tesque | 06385-00 | Protein measurement |
| sample buffer solution with 2-ME | Nacalai Tesque | 30566-22 | Reducing agent for western blot |
| sodium chloride | Nacalai Tesque | 15266-64 | Chemicals for western blot |
| sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31606-62 | ionic surfactant during gel electrophoresis |
| Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope | FEI, USA | ||
| tetramethylethylenediamine | Nacalai Tesque | 33401-72 | chemicals to prepare gel |
| tris-base | 1st Base | BIO-1400-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Chemicals for western blot |
| UVP (Ultra Vision Product) CCD imager | CCD imager for western blot signal detection |
References
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