Summary
Denne protokollen demonstrerer hvordan man isolerer humane navlestrengsavledede mesenkymale stamcellers små ekstracellulære vesikler (hUC-MSC-sEVs) med en enkel benkeplateinnstilling i laboratorieskala. Størrelsesfordelingen, proteinkonsentrasjonen, sEVs markører og morfologi av isolerte hUC-MSC-sEVs er preget av henholdsvis nanopartikkelsporingsanalyse, BCA-proteinanalyse, western blot og transmisjonselektronmikroskop.
Abstract
Den ultrasentrifugeringsbaserte prosessen regnes som den vanlige metoden for isolasjon av små ekstracellulære vesikler (sEVs). Utbyttet fra denne isolasjonsmetoden er imidlertid relativt lavere, og disse metodene er ineffektive for å skille sEV-undertyper. Denne studien demonstrerer en enkel stasjonær filtreringsmetode for å isolere MSC små ekstracellulære vesikler (hUC-MSC-sEVs) fra mennesker, vellykket separert ved ultrafiltrering fra det kondisjonerte mediet til hUC-MSC. Størrelsesfordelingen, proteinkonsentrasjonen, eksosomale markører (CD9, CD81, TSG101) og morfologien til de isolerte hUC-MSC-sEVene ble karakterisert med henholdsvis nanopartikkelsporingsanalyse, BCA-proteinanalyse, western blot og transmisjonselektronmikroskop. De isolerte hUC-MSC-sEVs størrelse var 30-200 nm, med en partikkelkonsentrasjon på 7,75 × 10 10 partikler/ml og en proteinkonsentrasjon på80 μg/ml. Positive bånd for eksosomale markører CD9, CD81 og TSG101 ble observert. Denne studien viste at hUC-MSC-sEVs ble vellykket isolert fra hUC-MSCs betingede medium, og karakterisering viste at det isolerte produktet oppfylte kriteriene nevnt av Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).
Introduction
I følge MISEV 2018 er sEV ikke-replikerende lipid-dobbeltlagspartikler uten funksjonell kjerne tilstede, med en størrelse på 30-200 nm1. MSC-avledede sEV-er inneholder viktige signalmolekyler som spiller viktige roller i vevregenerering, for eksempel mikroRNA, cytokiner eller proteiner. De har i økende grad blitt et forsknings-"hotspot" innen regenerativ medisin og cellefri terapi. Mange studier har vist at MSC-avledede sEV-er er like effektive som MSC ved behandling av forskjellige forhold, for eksempel immunmodulering 2,3,4,5, forsterkende osteogenese 6, diabetes mellitus 7,8 eller vaskulær regenerering 9,10. Etter hvert som forsøkene i tidlig fase skrider frem, har tre hovednøkkelspørsmål i forhold til den kliniske oversettelsen av MSC-EV-er blitt fremhevet: utbyttet av elbilene, renheten til elbilene (fri for cellerester og andre biologiske forurensninger som protein og cytokiner) og integriteten til fosfolipid-dobbeltlagsmembranen til elbilene etter isolering.
Ulike metoder har blitt utviklet for å isolere sEVs, utnytte tettheten, formen, størrelsen og overflateproteinet til sEVs11. De to vanligste metodene i sEV-isolasjoner er ultrasentrifugeringsbaserte og ultrafiltreringsbaserte teknikker.
Ultrasentrifugeringsbaserte metoder regnes som gullstandardmetoder i sEVs isolasjon. To typer ultracentrifugation teknikker som vanligvis brukes er differensiell ultracentrifugation og tetthet gradient ultracentrifugation. Imidlertid resulterer ultrasentrifugeringsmetoder ofte i lavt utbytte og krever dyrt utstyr for høyhastighets ultrasentrifuge (100.000-200.000 × g)11. Videre er ultrasentrifugeringsteknikker alene ineffektive for å separere EV-subtyper (sEV og store EV), noe som resulterer i et urent sedimentlag11. Til slutt kan ultrasentrifugering av tetthetsgradient også være tidkrevende og kreve ytterligere forholdsregler som sukrosebuffertillegg for å hemme gradientskaden under akselerasjon og retardasjonstrinn12. Derfor fører ultrasentrifugering vanligvis til et relativt lavt utbytte og er ikke i stand til å diskriminere mellom forskjellige populasjoner av EV13, noe som begrenser søknaden om storskala EV-forberedelse11.
Den andre metoden for EV-isolasjon er via ultrafiltrering, som er basert på størrelsesfiltrering. Ultrafiltrering er relativt tids- og kostnadseffektivt sammenlignet med ultrasentrifugering, da det ikke innebærer dyrt utstyr eller lang saksbehandlingstid14. Derfor synes ultrafiltrering å være en mer effektiv isolasjonsteknikk enn begge de nevnte ultrasentrifugeringsmetodene. De isolerte produktene kan være mer spesifikke basert på porestørrelser og høyere utbytte15. Den ekstra kraften som påløper under filtreringsprosessen kan imidlertid føre til deformasjon eller utbrudd av elbilene16.
Det nåværende papiret foreslo en kostnads- og tidseffektiv benchtop-protokoll for isolering av MSC-avledede sEV-er for nedstrømsanalyse og terapeutiske formål. Metoden beskrevet i dette papiret kombinerte en enkel filtreringsmetode med benksentrifugering for å isolere høy avkastning og god kvalitet EV fra hUC-MSCs for nedstrømsanalyse, inkludert partikkelstørrelsesanalyse, biomarkøranalyse og elektronmikroskopisk avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer om alle materialer, utstyr og programvare som brukes i denne protokollen.
1. Human navlestreng, mesenkymale stamceller og kultur
- Dyrkning av hUC-MSC ved en såtetthet på 5 × 103/cm2 i DMEM, supplert med 8 % humant blodplatelysat og 1 % pen-streptokokker. Inkuber cellene ved 37 °C i 5% CO2. Bytt ut cellekulturmediet hver 3. dag for å sikre riktig cellevekst.
- Utvid cellene til passasje 5 i T175-kolber for sEV-isolasjon.
MERK: Mange kolber er nødvendig for å høste et høyt utbytte av sEV (utbyttet øker med antall celler).
2. Liten ekstracellulær vesikkelisolasjon fra hUC - MSC
- Erstatt dyrkningsmediet med fersk fenolrødt fritt DMEM supplert med 1% pen-streptokokker [betinget medium (CM)] når kulturen når 70% -80% sammenløp ved passasje 5.
FORSIKTIG: Bruk kun basalmedier; unngå FBS og humant blodplatelysattilskudd for å unngå forurensning av eksterne sEV-er. - Etter 24 timer, sentrifuger CM ved 200 × g i 5 minutter ved 4 °C for å fjerne celleavfall. Samle og filtrer supernatanten gjennom et 0,22 μm filter for å fjerne partikler større enn 220 nm.
- Fyll sentrifugalfilterenheten med 30 ml fosfatbufret saltvann (PBS) filtrert gjennom et 0,2 μm filter. Sentrifuger sentrifugalfilterenheten ved 3 500 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Fyll den filtrerte CM i sentrifugalfilterenheten (hver enhets maksimale volum er 70 ml). Sentrifuger CM ved 3 500 × g ved 4 °C.
MERK: Sentrifugeringens varighet bør overvåkes fra tid til annen til oppløsningen har nådd filterets overflate. - Kast oppløsningen i filtratoppløsningskoppen. Sentrifuge filterkoppen med oppsamlingskopp for kraftfôr ved 1000 x g ved 4 °C i 2 minutter.
- Overfør konsentrert CM tilbake til sentrifugalfilterenheten. Tilsett 30 ml filtrert PBS i sentrifugalfilterenheten og sentrifuger enheten ved 3 500 × g ved 4 °C.
- Kast oppløsningen i filtratoppløsningskoppen. Monter en oppsamlingskopp for kraftfôr på filterenheten og omvendt sentrifuge ved 1000 × g i 2 minutter ved 4 °C for å oppnå de rensede sEV-ene.
- Filtrer sEV-ene gjennom et 0,22 μm sprøytefilter.
- Overfør prøvene til nye rør og oppbevar dem ved -80 °C for videre analyse.
3. Karakterisering av hUC-MSC-sEVs
- Analyse av sporing av nanopartikler
- Fortynn de isolerte hUC-MSC-sEVene i filtrert PBS til 20-100 partikler/ramme.
- Før 1 ml av den fortynnede prøven inn i NTA-kammeret ved bruk av 1 ml engangssprøyter.
- Still inn måleinnstillingene tilsvarende: juster kameranivået til nivå 14, bestem deteksjonsterskelen for å inkludere så mange partikler som mulig med begrensningen om at 10-100 røde kryss telles, og det blå korsantallet er begrenset til fem.
- For hver måling tar du opp fem videoer på 1 minutt og analyserer dem ved hjelp av NanoSight-programvaren med en deteksjonsterskel på fem.
- Ta målinger i triplikat for hver prøve.
- Vestlig blottingsanalyse
- Lyse hUC-MSC-sEVs med iskald radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysisbuffer, inkuber i 30 minutter ved 4 °C og sentrifuge ved 200 × g i 5 minutter ved 4 °C. Samle supernatanten.
- Kvantifiser proteinet ved hjelp av et Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit. Monter gelelektroforesesettet tilsvarende og utfør gelelektroforese ved 90 V til proteinet når stablingsgelens ende. Endre spenningen til 200 V for å skille proteinene til slutten av oppløsningsgelen.
- Utfør halvtørr overføring for å overføre proteinene fra gelen til en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran ved 15 V i 1 time.
- Blokker PVDF-membranen med 3% bovint serumalbumin (BSA) / Tris-bufret saltvann-0,1% v / v Tween 20 (TBS-T) i 1 time på en shaker ved romtemperatur. Inkuber PVDF-membranen med primære antistoffer som følger: mus anti-CD 9 monoklonalt antistoff (1:500), mus anti-CD 81 monoklonalt antistoff (1:500), mus anti-GRP 94 monoklonalt mus anti-TSG 101 monoklonalt antistoff (1:500) ved 4 °C over natten med konstant risting.
- Neste dag, vask PVDF-membranen 5 x 5 min med TBS-T og inkuber videre med et sekundært antistoff: pepperrotperoksidase-konjugert mus IgG kappa bindende protein (m-IgGκ BP-HRP) (1:5,000) i 1 time med omrøring ved romtemperatur.
- Igjen, vask PVDF-membranen med TBS-T fem ganger, og visualiser membranen i et ladningskoblet (CCD) bildeapparat ved hjelp av et kjemiluminescensdeteksjonsreagens. Analyser ekspresjonsnivået til proteinene ved hjelp av ImageJ-programvare. Først åpner du bildefilen i ImageJ (File | Åpen...). Forbedre kvaliteten på bildet ved å justere lysstyrken og kontrasten (Bilde | Justere | Lysstyrke/kontrast). Juster bildet til flekkene er godt synlige, klikk på Bruk-knappen , og lagre deretter bildene i TIFF-format (File | Lagre som | TIFF...).
- Transmisjon elektronmikroskop
- Fortynn en del av hUC-MSC-sEV-prøven med fire deler filtrert PBS til et totalt volum på 10 μL og inkuber på et karbonbelagt kobbergitter i 15 minutter.
- Fjern overflødig prøve med en laboratorieserviett og la den lufttørke i 3 minutter.
- Inkuber 10 μL 1% fosfotungstisk syre (PTA) løsning for å farge prøven i 3 minutter.
- Fjern overflødig 1% PTA-oppløsning ved hjelp av en laboratorieserviett og la den lufttørke i 3 minutter.
- Bruk prøven til avbildning av transmisjonselektronmikroskop.
MERK: Se figur 1 for de oppsummerte skjematiske eksperimenttrinnene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser at hUC-MSC-sEV har en partikkelstørrelsesmodus ved 53 nm, mens andre signifikante topper av partikkelstørrelse var 96 og 115 nm. Konsentrasjonen av hUC-MSC-sEVs målt av NTA var 7,75 × 1010 partikler/ml. Proteinkonsentrasjonen av hUC-MSC-sEVs målt med BCA-analysen var ca. 80 μg / ml.
I vestlig blottinganalyse viste hUC-MSC-sEV positive bånd for eksosommarkørene CD9, CD81 og TSG101, men var negative for GRP94 (figur 3). GRP94 er en endoplasmatisk retikulummarkør som vanligvis brukes som en negativ markør for sEV. De isolerte hUC-MSC-sEVene ble visualisert under TEM for å bestemme størrelse og morfologi. hUC-MSCs-sEVs størrelse ~ 100 nm og viste en kopplignende tolags membranstruktur (figur 4).
Figur 1: Arbeidsskjema for isolering, rengjøring og karakterisering av sEV. Det kondisjonerte mediet ble samlet fra MSC-kultur og filtrert gjennom et 0,22 μm filter for å fjerne store partikler. Det filtrerte mediet ble overført til en sentrifugalfilterenhet for å konsentrere sEV-ene og reverssentrifugert for å samle de konsentrerte sEV-ene. De konsentrerte sEV-ene ble deretter resuspendert med kald, filtrert PBS, og trinnene ble gjentatt med en sentrifugalfilterenhet for vasketrinnene. Til slutt ble sEVene sterilisert med 0,22 μm filtrering før de ble karakterisert ved hjelp av nanopartikkelsporingsanalyse, vestlig blottingsanalyse og transmisjonselektronmikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Nanopartikkelsporingsanalyse av isolerte hUC-MSC-sEVs. hUC-MSC-sEV-ene var 100-1000x fortynnet med klargjort PBS og målt med Nanosight NS300 utstyrt med et CMOS-kamera, en 20x objektivlinse, en blå lasermodul (488 nm) og NTA-programvare. Figuren er en representasjon av NTA i tre eksemplarer. Forkortelser: hUC-MSC-sEVs = human navlestrengsavledede MSC små ekstracellulære vesikler; NTA = nanopartikkelsporingsanalyse; CMOS = komplementær metalloksid halvleder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Biomarkøruttrykket av hUC-MSC-sEVs . (A) Western blot analyse av CD9 eksosomal positiv markør. (B) Western blot analyse av CD81 eksosomal positiv markør. (C) Western blot analyse av TSG101 eksosomal positiv markør. (D) Western blot analyse av GRP94 negativ markør. Alle fire markørene ble sammenlignet med cellelysat som kontroll. Fra venstre til høyre, stige, cellelysat, hUC-MSC-sEVs (A,B); Stige, hUC-MSC-sEVs, Cellelysat, hUC-MSC-sEVs, Cellelysat (C); Stige, Cellelysat, hUC-MSC-sEVs (D). Cellelysatparene er fra to replikater, og disse bildene er representative bilder fra eksperimenter utført i triplikat. Forkortelse: hUC-MSC-sEVs = MSC små ekstracellulære vesikler avledet fra navlestrengen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Morfologi av enkle hUC-MSC-sEVs under transmisjonselektronmikroskopi. HUC-MSC-sEVene ble inkubert på et karbonbelagt kobbergitter og farget med 1% fosfotungstisk syre før de ble sett under transmisjonselektronmikroskopet. HUC-MSC-sEVene, med en størrelse på rundt 100 nm, viste en kopplignende tolags membranstruktur. Skala bar = 100 nm. Bildet er en representant for tre uavhengige fanger. Forkortelse: hUC-MSC-sEVs = MSC små ekstracellulære vesikler avledet fra navlestrengen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Elbiler er en av de viktige undergruppene av sekretomet i MSC som spiller en avgjørende rolle under normale og patologiske prosesser. Imidlertid har sEV, med et størrelsesområde mellom 30 og 200 nm, steget som et potensielt verktøy for cellefri terapi det siste tiåret. Ulike teknikker ble utviklet for å isolere sEV-er fra MSC-er. Imidlertid har differensiell ultrasentrifugering, ultrafiltrering, polymerbasert nedbør, immunoaffinitetsfangst og mikrofluidikkbasert nedbør forskjellige fordeler og ulemper17. Ingen av disse isolasjonsteknikkene kan oppnå en høy utvinningsgrad og spesifisitet. Dermed må forskere velge de riktige metodene i henhold til deres preferanser basert på høy utvinningsgrad eller høy spesifisitet.
Før isolering av MSCs sEV ble MSC vurdert for positive overflatemarkører (CD90, CD105, CD73) og negative markører (CD34, CD11b, CD19, CD45 og HLA-DR) ved flowcytometri som beskrevet tidligere18. Den tekniske fordelen med denne studien av elbiler kan gi en løsning på dagens situasjon. Det krever bare en grunnleggende benkeplate satt opp i laboratoriet for å unngå å bruke avansert utstyr for å isolere sEV-er. MSC-ene ble sulteforet med kulturmedier i den beskrevne protokollen uten å tilsette noe serum. Dette er avgjørende for å forhindre forurensning av elbiler som stammer fra serumtilskudd. Imidlertid, med tanke på at serumtilskudd er uunngåelig i noen tilfeller, kan eksosomutarmede serumtilskudd vurderes ved formulering av komplette kulturmedier. I tillegg kan fenolfrie medier brukes som erstatning for standard kulturmedier, da denne vanlige pH-indikatoren potensielt kan forårsake problemer med kolorimetriske målinger15. Protokollen kan forbedres ved å bruke et 0,22 μm pumpefilter i stedet for et konvensjonelt sprøytefilter under fjerning av partikler større enn 220 nm. Forholdsregler bør tas for å forbedre utbyttet av sEV-ene. Ved siste sentrifugering av CM gjennom en sentrifugalfilterenhet, bør langvarig sentrifugering unngås for å sikre at det er tilstrekkelig volum av oppløsning til å eluere sEV-ene fra filteret. Å overse dette kan redusere utbyttet av sEV-er samlet inn under omvendt sentrifugeringstrinn.
Denne protokollen er begrenset til laboratorieskala og kan som sådan ikke være egnet for storskala isolasjon i industrien. Dette skyldes de høye kostnadene ved engangsbruk av en sentrifugalfilterenhet, som ikke er mulig for storskala isolasjon, som vanligvis innebærer et volum på opptil tusenvis av liter CM. Oppsummert tilbyr vi en enkel filtreringsprotokoll i stasjonær skala for isolering av elbiler avledet fra MSC-er. Denne protokollen er også egnet for rensing av isolerte sEV-er for videre nedstrømsanalyse. Selv om denne protokollen er designet spesielt for sEV-er avledet fra MSC-er, kan en del av den beskrevne protokollen brukes til å isolere sEV-er fra forskjellige kilder, for eksempel kroppsvæske, cellelinjer eller andre væskekilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Publiseringen av denne videoen ble støttet av My CytoHealth Sdn. Bhd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
| 95% ethanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Disinfectants |
| Absolute Methanol | Chemiz | 45081 | To activate PVDF membrane (Western blot) |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell dissociation enzyme |
| ammonium persulfate | Chemiz | 14475 | catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis |
| anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | Antibody for sEVs marker |
| anti-TSG 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | Antibody for sEVs marker |
| Bovine serum albumin | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF membrane blocking |
| bromophenol blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | electrophoretic color marker |
| Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | sEVs isolation |
| ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | chemiluminescence detection reagent |
| CryoStor Freezing Media | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Cell cryopreserve |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Cell culture media |
| ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker | SMOBIO | PM2610 | Protein molecular weight markers |
| Extra thick blotting paper | ATTO | buffer reservior (Western blot) | |
| Glycerol | Merck | G5516 | Chemicals for western blot |
| Glycine | 1st Base | BIO-2085-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | Secondary antibody (Western Blot) |
| Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia | ||
| mouse antibodies anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | Antibody for sEVs marker |
| Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
| paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 02890-45 | Sample Fixation during TEM |
| penicillin–streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Antibiotic for media |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Nacalai Tesque | 27327-81 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Washing, sample dilution |
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size |
ATTO | To hold protein during protein transfer (Western blot) | |
| protease inhibitor cocktail | Nacalai Tesque | 25955-11 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| Protein Assay Bicinchoninate Kit | Nacalai Tesque | 06385-00 | Protein measurement |
| sample buffer solution with 2-ME | Nacalai Tesque | 30566-22 | Reducing agent for western blot |
| sodium chloride | Nacalai Tesque | 15266-64 | Chemicals for western blot |
| sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31606-62 | ionic surfactant during gel electrophoresis |
| Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope | FEI, USA | ||
| tetramethylethylenediamine | Nacalai Tesque | 33401-72 | chemicals to prepare gel |
| tris-base | 1st Base | BIO-1400-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Chemicals for western blot |
| UVP (Ultra Vision Product) CCD imager | CCD imager for western blot signal detection |
References
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Jayabalan, N., et al. Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes. Frontiers in Endocrinology. 8, 239 (2017).
- Li, T., et al. Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis. Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).
- Wang, C., et al. Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils. Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).
- Wei, Y., et al. MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia. Biomaterials. 204, 13-24 (2019).
- Liu, W., et al. MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).
- Li, F. X. Z., et al. The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications. Frontiers in Endocrinology. 12, 1741 (2021).
- Jayabalan, N., et al. Frontiers in Endocrinology. 8, Front Endocrinol. Lausanne. (2017).
- Wei, Y., et al. Biomaterials. 204, Biomaterials. 13-24 (2019).
- Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. 133, 70-81 (2017).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V.
- Kırbaş, O. K., et al. Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
- Ev, B., Ms, K. Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).
- Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, San Diego, Calif. 64-74 (2015).
- Tan, K. L., et al. Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells. Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).
