Summary
Este protocolo demonstra como isolar pequenas vesículas extracelulares de células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano (hUC-MSC-sEVs) com uma configuração simples de bancada em escala laboratorial. A distribuição de tamanho, concentração de proteínas, marcadores de sEVs e morfologia de hUC-MSC-sEVs isolados são caracterizados por análise de rastreamento de nanopartículas, ensaio de proteína BCA, western blot e microscópio eletrônico de transmissão, respectivamente.
Abstract
O processo baseado em ultracentrifugação é considerado o método comum para o isolamento de pequenas vesículas extracelulares (EVs). No entanto, o rendimento desse método de isolamento é relativamente menor, e esses métodos são ineficientes na separação dos subtipos de sEV. Este estudo demonstra um método simples de filtração de bancada para isolar pequenas vesículas extracelulares de CTM derivadas do cordão umbilical humano (hUC-MSC-sEVs), separadas com sucesso por ultrafiltração do meio condicionado de hUC-MSCs. A distribuição de tamanho, concentração de proteínas, marcadores exossômicos (CD9, CD81, TSG101) e morfologia dos hUC-MSC-sEVs isolados foram caracterizados com análise de rastreamento de nanopartículas, ensaio de proteína BCA, western blot e microscópio eletrônico de transmissão, respectivamente. O tamanho das hUC-MSC-sEVs isoladas foi de 30-200 nm, com concentração de partículas de 7,75 × 10 10 partículas/mL e concentração proteica de80 μg/mL. Bandas positivas para os marcadores exossômicos CD9, CD81 e TSG101 foram observadas. Este estudo mostrou que hUC-MSC-sEVs foram isolados com sucesso do meio condicionado hUC-MSCs, e a caracterização mostrou que o produto isolado preencheu os critérios mencionados pelo Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).
Introduction
De acordo com o MISEV 2018, sEVs são partículas de bicamada lipídica não replicantes sem núcleo funcional presente, com um tamanho de 30-200 nm1. Os sEVs derivados de CTM contêm moléculas sinalizadoras importantes que desempenham papéis importantes na regeneração tecidual, como microRNA, citocinas ou proteínas. Eles têm se tornado cada vez mais um "hotspot" de pesquisa em medicina regenerativa e terapia livre de células. Muitos estudos têm demonstrado que as EVs derivadas das CTM são tão eficazes quanto as CTMs no tratamento de diferentes condições, como imunomodulação2,3,4,5, potencialização da osteogênese6, diabetes mellitus7,8ou regeneração vascular9,10. À medida que os ensaios de fase inicial avançam, três questões-chave principais em relação à tradução clínica das CTMs-EVs têm sido destacadas: o rendimento dos EVs, a pureza dos EVs (livres de restos celulares e outros contaminantes biológicos, como proteínas e citocinas) e a integridade da membrana bicamada fosfolipídica dos EVs após o isolamento.
Vários métodos têm sido desenvolvidos para isolar os sEVs, explorando a densidade, forma, tamanho e proteína de superfície dos sEVs11. Os dois métodos mais comuns em isolamentos de sEVs são técnicas baseadas em ultracentrifugação e técnicas baseadas em ultrafiltração.
Métodos baseados em ultracentrifugação são considerados métodos padrão-ouro no isolamento de sEVs. Dois tipos de técnicas de ultracentrifugação que são usualmente empregadas são a ultracentrifugação diferencial e a ultracentrifugação por gradiente de densidade. No entanto, os métodos de ultracentrifugação frequentemente resultam em baixo rendimento e requerem equipamentos caros para ultracentrifugação de alta velocidade (100.000-200.000 × g)11. Além disso, as técnicas de ultracentrifugação isoladamente são ineficientes na separação dos subtipos de EV (sEVs e grandes EVs), resultando em uma camada de sedimento impura11. Por fim, a ultracentrifugação por gradiente de densidade também pode ser demorada e exigir precauções adicionais, como a adição de tampão de sacarose para inibir o dano do gradiente durante as etapas de aceleração e desaceleração12. Assim, a ultracentrifugação geralmente leva a um rendimento relativamente baixo e não é capaz de discriminar diferentes populações de EVs13, o que limita sua aplicação para a preparação em larga escala de EV11.
O segundo método de isolamento de EV é via ultrafiltração, que é baseada na filtração de tamanho. A ultrafiltração é relativamente eficaz em termos de tempo e custo em comparação com a ultracentrifugação, pois não envolve equipamentos caros ou longos tempos de processamento14. Assim, a ultrafiltração parece ser uma técnica de isolamento mais eficaz do que os dois métodos de ultracentrifugação já mencionados. Os produtos isolados podem ser mais específicos com base no tamanho dos poros e maior rendimento15. No entanto, a força adicional incorrida durante o processo de filtração pode resultar na deformação ou erupção dos EVs16.
O presente artigo propôs um protocolo de bancada custo-efetivo e tempo-efetivo para isolar sEVs derivadas de CTM para análise a jusante e fins terapêuticos. O método descrito neste artigo combinou um método de filtração simples com centrifugação de bancada para isolar EVs de alto rendimento e boa qualidade de hUC-MSCs para análise a jusante, incluindo análise de tamanho de partículas, ensaio de biomarcadores e imagens por microscopia eletrônica.
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Protocol
NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, equipamentos e software usados neste protocolo.
1. Células-tronco mesenquimais do cordão umbilical humano e cultura
- Cultivar as CTMs-hUC na densidade de semeadura de 5 × 103/cm2 em DMEM, suplementada com 8% de lisado plaquetário humano e 1% de caneta-Strep. Incubar as células a 37 °C em 5% de CO2. Substitua o meio de cultura celular a cada 3 dias para garantir o crescimento celular adequado.
- Expandir as células para a passagem 5 em frascos T175 para isolamento de sEV.
NOTA: Muitos frascos são necessários para colher um alto rendimento de sEVs (o rendimento aumenta com o número de células).
2. Isolamento de pequenas vesículas extracelulares de hUC - CTMs
- Substituir o meio de cultura por DMEM fresco livre de fenol isento de suplementação com Pen-Strep [meio condicionado (MC)] a 1% quando a cultura atingir 70%-80% de confluência na passagem 5.
CUIDADO: Use apenas meios basais; evitar FBS e suplemento de lisado de plaquetas humanas para evitar a contaminação por sEVs externos. - Após 24 h, centrifugar o CM a 200 × g por 5 min a 4 °C para remover restos celulares. Recolher e filtrar o sobrenadante através de um filtro de 0,22 μm para remover partículas maiores que 220 nm.
- Encher a unidade filtrante centrífuga com 30 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) filtrada através de um filtro de 0,2 μm. Centrifugar a unidade filtrante centrífuga a 3.500 × g durante 5 min a 4 °C.
- Encha o CM filtrado na unidade de filtro centrífugo (o volume máximo de cada unidade é de 70 mL). Centrifugar o CM a 3.500 × g a 4 °C.
NOTA: A duração da centrifugação deve ser monitorizada de tempos a tempos até que a solução tenha atingido a superfície do filtro. - Eliminar a solução no copo da solução filtrada. Centrifugar o copo do filtro de amostra com o copo de recolha de concentrado a 1.000 x g a 4 °C durante 2 minutos.
- Transfira o CM concentrado de volta para a unidade de filtro centrífugo. Adicionar 30 ml de PBS filtrado à unidade filtrante centrífuga e centrifugar a unidade a 3.500 × g a 4 °C.
- Eliminar a solução no copo da solução filtrada. Instale um copo coletor de concentrado na unidade filtrante e centrífuga reversa a 1.000 × g por 2 min a 4 °C para obter os sEVs purificados.
- Filtre os sEVs através de um filtro de seringa de 0,22 μm.
- Transfira as amostras para novos tubos e armazene-as a -80 °C para análise posterior.
3. Caracterização de hUC-MSC-sEVs
- Análise de rastreamento de nanopartículas
- Diluir os hUC-MSC-sEVs isolados em PBS filtrado para 20-100 partículas/quadro.
- Introduzir 1 ml da amostra diluída na câmara NTA utilizando seringas descartáveis de 1 ml.
- Defina as configurações de medição de acordo: ajuste o nível da câmera para o nível 14, determine o limite de detecção para incluir o maior número possível de partículas com a restrição de que 10-100 cruzes vermelhas são contadas, e a contagem de cruzes azuis é limitada a cinco.
- Para cada medição, grave cinco vídeos de 1 min e analise-os usando o Software NanoSight com um limiar de detecção de cinco.
- Fazer medições em triplicata para cada amostra.
- Análise de Western blotting
- Lisar os hUC-MSC-sEVs com tampão de lise de ensaio de radioimunoprecipitação gelado (RIPA), incubar por 30 min a 4 °C e centrifugar a 200 × g por 5 min a 4 °C. Colete o sobrenadante.
- Quantifique a proteína usando um Kit de Ensaio de Proteína de Ácido Biconínico (BCA). Monte a eletroforese em gel ajustada de acordo e realize a eletroforese em gel a 90 V até que a proteína atinja o final do gel de empilhamento. Mude a tensão para 200 V para separar as proteínas até o final do gel de resolução.
- Realizar transferência semi-seca para transferir as proteínas do gel para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) a 15 V por 1 h.
- Bloquear a membrana de PVDF com albumina de soro bovino a 3% (BSA)/solução salina tamponada com Tris-0,1% v/v Tween 20 (TBS-T) por 1 h em um agitador à temperatura ambiente. Incubar a membrana de PVDF com anticorpos primários da seguinte forma: anticorpo monoclonal anti-CD 9 de camundongo (1:500), anticorpo monoclonal anti-CD 81 de camundongo (1:500), anticorpo monoclonal anti-GRP 94 de camundongo anti-TSG 101 de camundongo (1:500) a 4 °C durante a noite com agitação constante.
- No dia seguinte, lavar a membrana de PVDF 5 x 5 min com TBS-T e incubar com um anticorpo secundário: proteína ligadora IgG kappa conjugada à horseradish peroxidase de camundongo (m-IgGκ BP-HRP) (1:5.000) por 1 h com agitação à temperatura ambiente.
- Novamente, lave a membrana de PVDF com TBS-T cinco vezes e visualize a membrana em um imageador de carga acoplada (CCD) usando um reagente de detecção por quimioluminescência. Analise o nível de expressão das proteínas utilizando o software ImageJ. Primeiro, abra o arquivo de imagem no ImageJ (Arquivo | Aberto...). Melhorar a qualidade da imagem ajustando o brilho e o contraste (Imagem | Ajustar | Brilho/Contraste). Ajuste a imagem até que as manchas estejam claramente visíveis, clique no botão Aplicar e, em seguida, salve as imagens no formato TIFF (Arquivo | Salvar como | TIFF...).
- Microscópio eletrônico de transmissão
- Diluir uma parte da amostra de hUC-MSC-sEVs com quatro partes de PBS filtrado para um volume total de 10 μL e incubar em uma grade de cobre revestida de carbono por 15 min.
- Retire o excesso de amostra usando um lenço de laboratório e deixe secar ao ar por 3 min.
- Incubar 10 μL de solução de ácido fosfotúngstico (PTA) a 1% para manchar a amostra durante 3 minutos.
- Retire o excesso de solução de PTA a 1% com um lenço de laboratório e deixe secar ao ar por 3 min.
- Use a amostra para imagens de microscópio eletrônico de transmissão.
NOTA: Consulte a Figura 1 para obter as etapas resumidas do experimento esquemático.
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Representative Results
A Figura 2 mostra que hUC-MSC-sEVs têm um modo de tamanho de partícula em 53 nm, enquanto outros picos significativos de tamanho de partícula foram 96 e 115 nm. A concentração de hUC-MSC-sEVs medida por NTA foi de 7,75 × 1010 partículas/mL. A concentração proteica de hUC-MSC-sEVs medida com o ensaio de BCA foi de aproximadamente 80 μg/mL.
Na análise de western blotting, hUC-MSC-sEVs demonstraram bandas positivas para os marcadores exossômicos CD9, CD81 e TSG101, mas foram negativas para GRP94 (Figura 3). O GRP94 é um marcador de retículo endoplasmático comumente usado como marcador negativo para sEVs. As hUC-MSC-sEVs isoladas foram visualizadas sob MET para determinar seu tamanho e morfologia. hUC-MSCs-sEVs de tamanho ~100 nm e mostraram uma estrutura de membrana bicamada semelhante a uma taça (Figura 4).
Figura 1: Esquema de trabalho do isolamento, limpeza e caracterização de sEVs. O meio condicionado foi coletado da cultura MSC e filtrado através de um filtro de 0,22 μm para remover partículas grandes. O meio filtrado foi transferido para uma unidade de filtro centrífugo para concentrar os sEVs e centrifugado reversamente para coletar os sEVs concentrados. Os sEVs concentrados foram então ressuspensos com PBS filtrado a frio, e os passos foram repetidos com um aparelho de filtro centrífugo para as etapas de lavagem. Por fim, os sEVs foram esterilizados por filtração de 0,22 μm antes de serem caracterizados usando análise de rastreamento de nanopartículas, western blotting e microscopia eletrônica de transmissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise de rastreamento de nanopartículas de hUC-MSC-sEVs isolados. Os hUC-MSC-sEVs foram diluídos 100-1.000x com PBS clarificado e medidos usando Nanosight NS300 equipado com uma câmera CMOS, uma lente objetiva de 20x, um módulo de laser azul (488 nm) e software NTA. A figura é uma representação de NTA em triplicata. Abreviações: hUC-MSC-sEVs = pequenas vesículas extracelulares derivadas do cordão umbilical humano; NTA = análise de rastreamento de nanopartículas; CMOS = semicondutor de óxido de metal complementar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Expressão de biomarcadores de hUC-MSC-sEVs . (A) Análise por Western blot do marcador exossomal positivo CD9. (B) Análise por Western blot do marcador exossomal positivo CD81. (C) Análise por Western blot do marcador exossomal positivo TSG101. (D) Análise de Western blot do marcador negativo GRP94. Todos os quatro marcadores foram comparados com o lisado celular como controle. Da esquerda para a direita, Escada, Lisado celular, hUC-MSC-sEVs (A,B); Escada, hUC-MSC-sEVs, Lisado celular, hUC-MSC-sEVs, Lisado celular (C); Ladder, Cell lysate, hUC-MSC-sEVs (D). Os pares de lisados celulares são de duas réplicas, e essas imagens são imagens representativas de experimentos realizados em triplicata. Abreviação: hUC-MSC-sEVs = pequenas vesículas extracelulares derivadas do cordão umbilical humano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Morfologia de hUC-MSC-sEVs simples sob microscopia eletrônica de transmissão. Os hUC-MSC-sEVs foram incubados em uma grade de cobre revestida com carbono e corados com ácido fosfotúngstico a 1% antes de serem vistos ao microscópio eletrônico de transmissão. Os hUC-MSC-sEVs, com tamanho em torno de 100 nm, mostraram uma estrutura de membrana bicamada tipo taça. Barra de escala = 100 nm. A imagem é representativa de três capturas independentes. Abreviação: hUC-MSC-sEVs = pequenas vesículas extracelulares derivadas do cordão umbilical humano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os EVs são um dos subgrupos importantes do secretoma nas CTMs que desempenham um papel crucial durante processos normais e patológicos. No entanto, os sEVs, com uma faixa de tamanho entre 30 e 200 nm, surgiram como uma ferramenta potencial para terapia livre de células na última década. Várias técnicas foram desenvolvidas para isolar sEVs de CTMs. Entretanto, ultracentrifugação diferencial, ultrafiltração, precipitação à base de polímero, captura de imunoafinidade e precipitação baseada em microfluídica possuem diferentes vantagens e desvantagens17. Nenhuma dessas técnicas de isolamento pode alcançar uma alta taxa de recuperação e especificidade. Assim, os pesquisadores devem selecionar os métodos apropriados de acordo com suas preferências com base em uma alta taxa de recuperação ou alta especificidade.
Antes do isolamento das CTMs, as CTMs foram avaliadas para marcadores de superfície positivos (CD90, CD105, CD73) e negativos (CD34, CD11b, CD19, CD45 e HLA-DR) por citometria de fluxo, conforme descrito anteriormente18. A vantagem técnica deste estudo de sEVs pode fornecer uma solução para a situação atual. Ele requer apenas uma bancada básica montada no laboratório para evitar o uso de equipamentos de ponta para isolar sEVs. As CTMs foram carentes de meios de cultura no protocolo descrito, sem adição de soro. Isso é crucial para evitar qualquer contaminação de EVs provenientes da suplementação sérica. No entanto, considerando que suplementos séricos são inevitáveis em alguns casos, suplementos séricos esgotados em exossomos podem ser considerados na formulação de meios de cultura completos. Além disso, o meio livre de fenol pode ser usado como um substituto para os meios de cultura padrão, uma vez que esse indicador de pH comum poderia potencialmente causar problemas com medidas colorimétricas15. O protocolo pode ser melhorado com o uso de um filtro bomba de 0,22 μm em vez de um filtro de seringa convencional durante a remoção de partículas maiores que 220 nm. Precauções devem ser tomadas para melhorar o rendimento dos sEVs. Na última centrifugação do CM através de uma unidade de filtro centrífugo, a centrifugação prolongada deve ser evitada para garantir que haja volume suficiente de solução para eluir os sEVs do filtro. Ignorar isso pode reduzir o rendimento de sEVs coletados durante a etapa de centrifugação reversa.
Este protocolo é limitado à escala laboratorial e, como tal, pode não ser adequado para isolamento em larga escala na indústria. Isso se deve ao alto custo do uso único de uma unidade filtrante centrífuga, o que não é viável para o isolamento em larga escala, que geralmente envolve um volume de até milhares de litros de CM. Em resumo, fornecemos um protocolo de filtração simples em escala de bancada para isolar sEVs derivados de MSCs. Este protocolo também é adequado para purificar sEVs isolados para análise posterior a jusante. Embora este protocolo seja projetado especificamente para sEVs derivados de MSCs, uma parte do protocolo descrito pode ser usada para isolar sEVs de diferentes fontes, como fluido corporal, linhagens celulares ou outras fontes do tipo líquido.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
A publicação deste vídeo foi apoiada por My CytoHealth Sdn. Bhd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
| 95% ethanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Disinfectants |
| Absolute Methanol | Chemiz | 45081 | To activate PVDF membrane (Western blot) |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell dissociation enzyme |
| ammonium persulfate | Chemiz | 14475 | catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis |
| anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | Antibody for sEVs marker |
| anti-TSG 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | Antibody for sEVs marker |
| Bovine serum albumin | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF membrane blocking |
| bromophenol blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | electrophoretic color marker |
| Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | sEVs isolation |
| ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | chemiluminescence detection reagent |
| CryoStor Freezing Media | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Cell cryopreserve |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Cell culture media |
| ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker | SMOBIO | PM2610 | Protein molecular weight markers |
| Extra thick blotting paper | ATTO | buffer reservior (Western blot) | |
| Glycerol | Merck | G5516 | Chemicals for western blot |
| Glycine | 1st Base | BIO-2085-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | Secondary antibody (Western Blot) |
| Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia | ||
| mouse antibodies anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | Antibody for sEVs marker |
| Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
| paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 02890-45 | Sample Fixation during TEM |
| penicillin–streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Antibiotic for media |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Nacalai Tesque | 27327-81 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Washing, sample dilution |
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size |
ATTO | To hold protein during protein transfer (Western blot) | |
| protease inhibitor cocktail | Nacalai Tesque | 25955-11 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| Protein Assay Bicinchoninate Kit | Nacalai Tesque | 06385-00 | Protein measurement |
| sample buffer solution with 2-ME | Nacalai Tesque | 30566-22 | Reducing agent for western blot |
| sodium chloride | Nacalai Tesque | 15266-64 | Chemicals for western blot |
| sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31606-62 | ionic surfactant during gel electrophoresis |
| Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope | FEI, USA | ||
| tetramethylethylenediamine | Nacalai Tesque | 33401-72 | chemicals to prepare gel |
| tris-base | 1st Base | BIO-1400-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Chemicals for western blot |
| UVP (Ultra Vision Product) CCD imager | CCD imager for western blot signal detection |
References
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