Summary
Ce protocole montre comment isoler les petites vésicules extracellulaires des cellules souches mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical humain (hUC-MSC-sEVs) avec un simple réglage de paillasse à l’échelle du laboratoire. La distribution granulométrique, la concentration en protéines, les marqueurs de sEVs et la morphologie des hUC-MSC-sEVs isolés sont caractérisés par l’analyse de suivi des nanoparticules, le dosage de la protéine BCA, le transfert Western et le microscope électronique à transmission, respectivement.
Abstract
Le procédé basé sur l’ultracentrifugation est considéré comme la méthode courante pour l’isolement des petites vésicules extracellulaires (EV). Cependant, le rendement de cette méthode d’isolement est relativement plus faible, et ces méthodes sont inefficaces pour séparer les sous-types de sEV. Cette étude démontre une méthode de filtration de paillasse simple pour isoler les petites vésicules extracellulaires MSC dérivées du cordon ombilical humain (hUC-MSC-sEV), séparées avec succès par ultrafiltration du milieu conditionné des hUC-MSC. La distribution granulométrique, la concentration en protéines, les marqueurs exosomaux (CD9, CD81, TSG101) et la morphologie des hUC-MSC-sEV isolés ont été caractérisés par analyse de suivi des nanoparticules, dosage de la protéine BCA, transfert Western et microscope électronique à transmission, respectivement. La taille des hUC-MSC-sEVs isolés était de 30 à 200 nm, avec une concentration de particules de 7,75 × 1010 particules/mL et une concentration de protéines de 80 μg/mL. Des bandes positives pour les marqueurs exosomiques CD9, CD81 et TSG101 ont été observées. Cette étude a montré que les hUC-MSC-sEVs ont été isolés avec succès à partir d’un milieu conditionné par des hUC-MSC, et la caractérisation a montré que le produit isolé répondait aux critères mentionnés par Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).
Introduction
Selon MISEV 2018, les sEV sont des particules bicouches lipidiques non réplicatives sans noyau fonctionnel présent, d’une taille de 30-200 nm1. Les sEV dérivés de la CSM contiennent d’importantes molécules de signalisation qui jouent un rôle important dans la régénération des tissus, telles que les microARN, les cytokines ou les protéines. Ils sont devenus de plus en plus un « point chaud » de la recherche en médecine régénérative et en thérapie acellulaire. De nombreuses études ont montré que les sEV dérivés des CSM sont aussi efficaces que les CSM dans le traitement de différentes affections, telles que l’immunomodulation 2,3,4,5, l’amélioration de l’ostéogenèse 6, le diabète sucré 7,8 ou la régénération vasculaire 9,10. Au fur et à mesure que les essais de phase préliminaire progressent, trois questions clés principales liées à la traduction clinique des CSM-VE ont été mises en évidence : le rendement des VE, la pureté des VE (exemptes de débris cellulaires et d’autres contaminants biologiques tels que les protéines et les cytokines) et l’intégrité de la membrane bicouche phospholipide des VE après isolement.
Diverses méthodes ont été développées pour isoler les sEV, en exploitant la densité, la forme, la taille et la protéine de surface des sEV11. Les deux méthodes les plus courantes dans les isolements de sEV sont les techniques basées sur l’ultracentrifugation et l’ultrafiltration.
Les méthodes basées sur l’ultracentrifugation sont considérées comme des méthodes de référence dans l’isolation des sEV. Deux types de techniques d’ultracentrifugation qui sont généralement utilisées sont l’ultracentrifugation différentielle et l’ultracentrifugation par gradient de densité. Cependant, les méthodes d’ultracentrifugation entraînent souvent un faible rendement et nécessitent un équipement coûteux pour l’ultracentrifugeuse à grande vitesse (100 000-200 000 × g)11. De plus, les techniques d’ultracentrifugation seules sont inefficaces pour séparer les sous-types de VE (sEV et gros EV), ce qui donne une couche de sédiments impurs11. Enfin, l’ultracentrifugation du gradient de densité pourrait également prendre beaucoup de temps et nécessiter des mesures de précaution supplémentaires telles que l’ajout d’un tampon saccharose pour inhiber les dommages du gradient pendant les étapes d’accélération et de décélération12. Par conséquent, l’ultracentrifugation conduit généralement à un rendement relativement faible et n’est pas capable de faire la distinction entre les différentes populations de VE13, ce qui limite son application pour la préparation à grande échelledes VE 11.
La deuxième méthode d’isolation des véhicules électriques est l’ultrafiltration, qui est basée sur la filtration de taille. L’ultrafiltration est relativement rapide et économique par rapport à l’ultracentrifugation, car elle n’implique pas d’équipement coûteux ou de longs temps de traitement14. Par conséquent, l’ultrafiltration semble être une technique d’isolement plus efficace que les deux méthodes d’ultracentrifugation susmentionnées. Les produits isolés peuvent être plus spécifiques en fonction de la taille des pores et du rendement plus élevé15. Cependant, la force supplémentaire encourue pendant le processus de filtration peut entraîner la déformation ou l’éruption des VE16.
Le présent document proposait un protocole de paillasse rentable et rapide pour isoler les EVs dérivés des CSM à des fins d’analyse en aval et à des fins thérapeutiques. La méthode décrite dans cet article combinait une méthode de filtration simple avec une centrifugation sur paillasse pour isoler les véhicules électriques à haut rendement et de bonne qualité des CSM-hUC pour l’analyse en aval, y compris l’analyse granulométrique, le test de biomarqueurs et l’imagerie au microscope électronique.
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Protocol
REMARQUE : Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, équipements et logiciels utilisés dans ce protocole.
1. Cellules souches mésenchymateuses du cordon ombilical humain et culture
- Culture des hUC-MSCs à une densité d’ensemencement de 5 × 103/cm2 dans du DMEM, complétée par 8% de lysat plaquettaire humain et 1% de Pen-Strep. Incuber les cellules à 37 °C dans 5% de CO2. Remplacez le milieu de culture cellulaire tous les 3 jours pour assurer une bonne croissance cellulaire.
- Étendre les cellules au passage 5 dans les flacons T175 pour l’isolation de la sEV.
REMARQUE: De nombreux flacons sont nécessaires pour récolter un rendement élevé de sEV (le rendement augmente avec le nombre de cellules).
2. Petite vésicule extracellulaire isolée de hUC - CSM
- Remplacer le milieu de culture par du DMEM frais sans rouge de phénol complété par 1% Pen-Strep [milieu conditionné (CM)] lorsque la culture atteint une confluence de 70% à 80% au passage 5.
ATTENTION : Utilisez uniquement les milieux basaux; éviter FBS et supplément de lysat de plaquettes humaines pour éviter la contamination par des sEV externes. - Après 24 h, centrifuger le CM à 200 × g pendant 5 min à 4 °C pour éliminer les débris cellulaires. Recueillir et filtrer le surnageant à travers un filtre de 0,22 μm pour éliminer les particules de plus de 220 nm.
- Remplir l’unité de filtration centrifuge avec 30 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) filtrée à travers un filtre de 0,2 μm. Centrifuger le filtre centrifuge à 3 500 × g pendant 5 min à 4 °C.
- Remplissez le CM filtré dans l’unité de filtration centrifuge (le volume maximal de chaque unité est de 70 mL). Centrifuger le CM à 3 500 × g à 4 °C.
REMARQUE : La durée de la centrifugation doit être surveillée de temps en temps jusqu’à ce que la solution ait atteint la surface du filtre. - Jeter la solution dans le gobelet de solution de filtrat. Centrifuger à l’envers la coupelle filtrante de l’échantillon avec la coupelle de collecte du concentré à 1 000 x g à 4 °C pendant 2 min.
- Transférez le CM concentré dans l’unité de filtration centrifuge. Ajouter 30 mL de PBS filtré dans l’unité de filtration centrifuge et centrifuger l’unité à 3 500 × g à 4 °C.
- Jeter la solution dans le gobelet de solution de filtrat. Installer un gobelet de collecte de concentré sur l’unité de filtration et une centrifugeuse inversée à 1 000 × g pendant 2 min à 4 °C pour obtenir les sEV purifiés.
- Filtrer les sEV à travers un filtre à seringue de 0,22 μm.
- Transférer les échantillons dans de nouveaux tubes et les conserver à -80 °C pour une analyse plus approfondie.
3. Caractérisation des CVM-sEV hUC-MSC
- Analyse de suivi des nanoparticules
- Diluer les hUC-MSC-sEV isolés dans du PBS filtré à 20-100 particules/image.
- Introduire 1 mL de l’échantillon dilué dans la chambre NTA à l’aide de seringues jetables de 1 mL.
- Réglez les paramètres de mesure en conséquence : réglez le niveau de la caméra au niveau 14, déterminez le seuil de détection pour inclure autant de particules que possible avec la restriction que 10 à 100 croix rouges sont comptées, et le nombre de croix bleues est limité à cinq.
- Pour chaque mesure, enregistrez cinq vidéos de 1 min et analysez-les à l’aide du logiciel NanoSight avec un seuil de détection de cinq.
- Prendre des mesures en triple exemplaire pour chaque échantillon.
- Analyse Western blot
- Lyser les EV hUC-MSC-sEV avec un tampon de lyse pour le test de radioimmunoprécipitation glacée (RIPA), incuber pendant 30 min à 4 °C et centrifuger à 200 × g pendant 5 min à 4 °C. Récupérez le surnageant.
- Quantifier la protéine à l’aide d’un kit de dosage des protéines de l’acide bicinchoninique (BCA). Assemblez le jeu d’électrophorèse sur gel en conséquence et effectuez l’électrophorèse sur gel à 90 V jusqu’à ce que la protéine atteigne la fin du gel d’empilement. Changez la tension à 200 V pour séparer les protéines jusqu’à la fin du gel de résolution.
- Effectuer un transfert semi-sec pour transférer les protéines du gel à une membrane de polyfluorure de vinylidène (PVDF) à 15 V pendant 1 h.
- Bloquer la membrane PVDF avec 3 % d’albumine sérique bovine (BSA)/solution saline tamponnée Tris-0,1 % v/v Tween 20 (TBS-T) pendant 1 h sur un agitateur à température ambiante. Incuber la membrane PVDF avec des anticorps primaires comme suit : anticorps monoclonal anti-CD 9 de souris (1:500), anticorps monoclonal anti-CD 81 de souris (1:500), anticorps monoclonal anti-GRP 94 anti-TSG 101 de souris anti-GRP 94 (1:500) à 4 °C pendant une nuit avec agitation constante.
- Le lendemain, laver la membrane PVDF 5 x 5 min avec TBS-T et incuber avec un anticorps secondaire : la protéine de liaison IgG kappa de souris conjuguée à la peroxydase de raifort (m-IgGκ BP-HRP) (1:5 000) pendant 1 h en agitant à température ambiante.
- Encore une fois, lavez la membrane PVDF avec TBS-T cinq fois et visualisez la membrane dans un imageur à couplage de charge (CCD) à l’aide d’un réactif de détection par chimiluminescence. Analysez le niveau d’expression des protéines à l’aide du logiciel ImageJ. Tout d’abord, ouvrez le fichier image dans ImageJ (Fichier | Ouvert...). Améliorez la qualité de l’image en ajustant la luminosité et le contraste (Image | Ajuster | Luminosité/Contraste). Ajustez l’image jusqu’à ce que les taches soient clairement visibles, cliquez sur le bouton Appliquer , puis enregistrez les images au format TIFF (Fichier | Enregistrer sous | TIFF...).
- Microscope électronique à transmission
- Diluer une partie de l’échantillon hUC-MSC-sEVs avec quatre parties de PBS filtré jusqu’à un volume total de 10 μL et incuber sur une grille en cuivre revêtue de carbone pendant 15 min.
- Retirer l’échantillon excédentaire à l’aide d’une lingette de laboratoire et le laisser sécher à l’air libre pendant 3 minutes.
- Incuber 10 μL de solution d’acide phosphotungstique (PTA) à 1% pour colorer l’échantillon pendant 3 min.
- Retirer l’excès de solution de PTA à 1 % à l’aide d’une lingette de laboratoire et laisser sécher à l’air libre pendant 3 min.
- Utiliser l’échantillon pour l’imagerie au microscope électronique à transmission.
REMARQUE : reportez-vous à la figure 1 pour les étapes schématiques résumées de l’expérience.
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Representative Results
La figure 2 montre que les hUC-MSC-sEV ont un mode granulométrique à 53 nm, tandis que les autres pics significatifs de taille des particules étaient de 96 et 115 nm. La concentration de hUC-MSC-sEVs mesurée par NTA était de 7,75 × 1010 particules/mL. La concentration protéique des hUC-MSC-sEVs mesurée avec le test BCA était d’environ 80 μg/mL.
Dans l’analyse par transfert Western, les hUC-MSC-sEV ont montré des bandes positives pour les marqueurs exosomiques CD9, CD81 et TSG101, mais étaient négatives pour GRP94 (Figure 3). GRP94 est un marqueur du réticulum endoplasmique couramment utilisé comme marqueur négatif pour les sEV. Les hUC-MSC-sEV isolés ont été visualisés sous TEM pour déterminer leur taille et leur morphologie. Les hUC-MSCs-sEVs mesuraient ~100 nm et présentaient une structure membranaire bicouche en forme de coupelle (Figure 4).
Figure 1 : Schéma de travail de l’isolement, du nettoyage et de la caractérisation des véhicules électriques. Le milieu conditionné a été prélevé à partir de la culture MSC et filtré à travers un filtre de 0,22 μm pour éliminer les grosses particules. Le milieu filtré a été transféré dans une unité de filtration centrifuge pour concentrer les sEV et centrifugé inverse pour recueillir les sEV concentrés. Les sEV concentrés ont ensuite été remis en suspension avec du PBS filtré à froid, et les étapes ont été répétées avec une unité de filtration centrifuge pour les étapes de lavage. Enfin, les sEV ont été stérilisés par filtration de 0,22 μm avant d’être caractérisés par analyse de suivi des nanoparticules, analyse Western blot et microscopie électronique à transmission. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Analyse du suivi des nanoparticules des hUC-MSC-sEV isolés. Les hUC-MSC-sEV ont été dilués de 100 à 1 000x avec du PBS clarifié et mesurés à l’aide de Nanosight NS300 équipé d’une caméra CMOS, d’un objectif 20x, d’un module laser bleu (488 nm) et du logiciel NTA. La figure est une représentation de NTA en triplicate. Abréviations : hUC-MSC-sEVs = petites vésicules extracellulaires MSC dérivées du cordon ombilical humain; NTA = analyse de suivi des nanoparticules; CMOS = semi-conducteur complémentaire à oxyde métallique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Expression du biomarqueur des EV hUC-MSC-sEV. (A) Analyse par transfert Western du marqueur exosomal positif CD9. (B) Analyse par transfert Western du marqueur positif exosomal CD81. (C) Analyse par transfert Western du marqueur positif exosomal TSG101. (D) Analyse par transfert Western du marqueur négatif GRP94. Les quatre marqueurs ont été comparés au lysat cellulaire comme témoin. De gauche à droite, échelle, lysat cellulaire, hUC-MSC-sEVs (A,B); Échelle, hUC-MSC-sEVs, Lysat cellulaire, hUC-MSC-sEVs, Lysat cellulaire (C); Échelle, lysat cellulaire, hUC-MSC-sEVs (D). Les paires de lysats cellulaires proviennent de deux répliques, et ces images sont des images représentatives d’expériences réalisées en triplicate. Abréviation : hUC-MSC-sEVs = petites vésicules extracellulaires MSC dérivées du cordon ombilical humain. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Morphologie des hUC-MSC-sEV simples en microscopie électronique à transmission. Les hUC-MSC-sEV ont été incubés sur une grille de cuivre recouverte de carbone et colorés avec de l’acide phosphotungstique à 1% avant d’être observés au microscope électronique à transmission. Les hUC-MSC-sEV, d’une taille d’environ 100 nm, présentaient une structure membranaire bicouche en forme de coupe. Barre d’échelle = 100 nm. L’image est représentative de trois captures indépendantes. Abréviation : hUC-MSC-sEVs = petites vésicules extracellulaires MSC dérivées du cordon ombilical humain. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les VE sont l’un des sous-ensembles importants du sécrétome dans les CSM qui jouent un rôle crucial au cours des processus normaux et pathologiques. Cependant, les sEV, dont la taille varie entre 30 et 200 nm, sont devenues un outil potentiel pour la thérapie acellulaire au cours de la dernière décennie. Diverses techniques ont été développées pour isoler les sEV des CSM. Cependant, l’ultracentrifugation différentielle, l’ultrafiltration, la précipitation à base de polymères, la capture d’immunoaffinité et la précipitation microfluidique présentent différents avantages et inconvénients17. Aucune de ces techniques d’isolement ne peut atteindre un taux de récupération élevé et une spécificité. Ainsi, les chercheurs doivent sélectionner les méthodes appropriées en fonction de leurs préférences en fonction d’un taux de récupération élevé ou d’une spécificité élevée.
Avant l’isolement des MV, les CSM ont été évaluées pour les marqueurs de surface positifs (CD90, CD105, CD73) et négatifs (CD34, CD11b, CD19, CD45 et HLA-DR) par cytométrie de flux comme décrit précédemment18. L’avantage technique de cette étude des sEV pourrait apporter une solution à la situation actuelle. Il suffit d’installer une paillasse de base en laboratoire pour éviter d’utiliser un équipement haut de gamme pour isoler les véhicules électriques. Les CSM ont été affamés avec des milieux de culture dans le protocole décrit sans ajouter de sérum. Ceci est crucial pour prévenir toute contamination des VE provenant de la supplémentation en sérum. Cependant, étant donné que les suppléments de sérum sont inévitables dans certains cas, les suppléments de sérum appauvris en exosomes peuvent être envisagés dans la formulation de milieux de culture complets. En outre, des milieux sans rouge de phénol pourraient être utilisés en remplacement des milieux de culture standard, car cet indicateur de pH commun pourrait potentiellement causer des problèmes avec les mesures colorimétriques15. Le protocole peut être amélioré en utilisant un filtre pompe de 0,22 μm au lieu d’un filtre à seringue conventionnel lors de l’élimination des particules supérieures à 220 nm. Des précautions doivent être prises pour améliorer le rendement des sEV. Lors de la dernière centrifugation de CM à travers une unité de filtration centrifuge, une centrifugation prolongée doit être évitée pour s’assurer qu’il y a suffisamment de volume de solution pour éluer les sEV du filtre. Négliger cela peut réduire le rendement des sEV collectés lors de l’étape de centrifugation inverse.
Ce protocole est limité à l’échelle du laboratoire et, en tant que tel, peut ne pas convenir à l’isolement à grande échelle dans l’industrie. Cela est dû au coût élevé de l’utilisation unique d’une unité de filtration centrifuge, ce qui n’est pas possible pour une isolation à grande échelle, qui implique généralement un volume allant jusqu’à des milliers de litres de CM. En résumé, nous fournissons un protocole de filtration simple à l’échelle de paillasse pour isoler les sEV dérivés des CSM. Ce protocole convient également à la purification des sEV isolés pour une analyse ultérieure en aval. Bien que ce protocole soit conçu spécifiquement pour les sEV dérivés de CSM, une partie du protocole décrit peut être utilisée pour isoler les sEV de différentes sources, telles que les fluides corporels, les lignées cellulaires ou d’autres sources de type liquide.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
La publication de cette vidéo a été soutenue par My CytoHealth Sdn. Bhd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
| 95% ethanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Disinfectants |
| Absolute Methanol | Chemiz | 45081 | To activate PVDF membrane (Western blot) |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell dissociation enzyme |
| ammonium persulfate | Chemiz | 14475 | catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis |
| anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | Antibody for sEVs marker |
| anti-TSG 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | Antibody for sEVs marker |
| Bovine serum albumin | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF membrane blocking |
| bromophenol blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | electrophoretic color marker |
| Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | sEVs isolation |
| ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | chemiluminescence detection reagent |
| CryoStor Freezing Media | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Cell cryopreserve |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Cell culture media |
| ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker | SMOBIO | PM2610 | Protein molecular weight markers |
| Extra thick blotting paper | ATTO | buffer reservior (Western blot) | |
| Glycerol | Merck | G5516 | Chemicals for western blot |
| Glycine | 1st Base | BIO-2085-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | Secondary antibody (Western Blot) |
| Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia | ||
| mouse antibodies anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | Antibody for sEVs marker |
| Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
| paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 02890-45 | Sample Fixation during TEM |
| penicillin–streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Antibiotic for media |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Nacalai Tesque | 27327-81 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Washing, sample dilution |
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size |
ATTO | To hold protein during protein transfer (Western blot) | |
| protease inhibitor cocktail | Nacalai Tesque | 25955-11 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| Protein Assay Bicinchoninate Kit | Nacalai Tesque | 06385-00 | Protein measurement |
| sample buffer solution with 2-ME | Nacalai Tesque | 30566-22 | Reducing agent for western blot |
| sodium chloride | Nacalai Tesque | 15266-64 | Chemicals for western blot |
| sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31606-62 | ionic surfactant during gel electrophoresis |
| Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope | FEI, USA | ||
| tetramethylethylenediamine | Nacalai Tesque | 33401-72 | chemicals to prepare gel |
| tris-base | 1st Base | BIO-1400-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Chemicals for western blot |
| UVP (Ultra Vision Product) CCD imager | CCD imager for western blot signal detection |
References
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