Summary
Dieses Protokoll demonstriert, wie die kleinen extrazellulären Vesikel (hUC-MSC-sEVs) von humanen Nabelschnurstammzellen (hUC-MSC-sEVs) mit einer einfachen Laborumgebung isoliert werden können. Die Größenverteilung, Proteinkonzentration, sEVs-Marker und Morphologie isolierter hUC-MSC-sEVs werden durch Nanopartikel-Tracking-Analyse, BCA-Protein-Assay, Western Blot bzw. Transmissionselektronenmikroskop charakterisiert.
Abstract
Das auf Ultrazentrifugation basierende Verfahren gilt als die gängigste Methode zur Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel (sEVs). Die Ausbeute dieser Isolationsmethode ist jedoch relativ gering, und diese Methoden sind ineffizient bei der Trennung von sEV-Subtypen. Diese Studie demonstriert eine einfache Benchtop-Filtrationsmethode zur Isolierung von aus humanen Nabelschnur gewonnenen kleinen extrazellulären MSC-Vesikeln (hUC-MSC-sEVs), die erfolgreich durch Ultrafiltration aus dem konditionierten Medium von hUC-MSCs getrennt wurden. Die Größenverteilung, die Proteinkonzentration, die exosomalen Marker (CD9, CD81, TSG101) und die Morphologie der isolierten hUC-MSC-sEVs wurden mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse, BCA-Protein-Assay, Western Blot bzw. Transmissionselektronenmikroskop charakterisiert. Die Größe der isolierten hUC-MSC-sEVs betrug 30-200 nm, mit einer Partikelkonzentration von 7,75 × 10 10 Partikeln/ml und einer Proteinkonzentration von80 μg/ml. Es wurden positive Banden für die exosomalen Marker CD9, CD81 und TSG101 beobachtet. Diese Studie zeigte, dass hUC-MSC-sEVs erfolgreich aus hUC-MSCs konditioniertem Medium isoliert wurden, und die Charakterisierung zeigte, dass das isolierte Produkt die in Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018) genannten Kriterien erfüllte.
Introduction
Laut MISEV 2018 handelt es sich bei sEVs um nicht-replizierende Lipiddoppelschichtpartikel ohne funktionellen Zellkern mit einer Größe von 30-200nm1. MSC-abgeleitete sEVs enthalten wichtige Signalmoleküle, die eine wichtige Rolle bei der Geweberegeneration spielen, wie z. B. microRNA, Zytokine oder Proteine. Sie haben sich zunehmend zu einem Forschungs-"Hotspot" in der regenerativen Medizin und der zellfreien Therapie entwickelt. Viele Studien haben gezeigt, dass MSC-abgeleitete sEVs bei der Behandlung verschiedener Erkrankungen genauso wirksam sind wie MSCs, wie z. B. Immunmodulation 2,3,4,5, Verbesserung der Osteogenese 6, Diabetes mellitus7,8 oder vaskuläre Regeneration 9,10. Im Laufe der frühen Phase der Studien wurden drei Hauptprobleme in Bezug auf die klinische Translation von MSCs-EVs hervorgehoben: die Ausbeute der EVs, die Reinheit der EVs (frei von Zelltrümmern und anderen biologischen Verunreinigungen wie Proteinen und Zytokinen) und die Integrität der Phospholipid-Doppelschichtmembran der EVs nach der Isolierung.
Es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um sEVs zu isolieren, wobei die Dichte, Form, Größe und das Oberflächenprotein der sEVs ausgenutzt werden11. Die beiden gebräuchlichsten Methoden bei der Isolierung von sEVs sind ultrazentrifugationsbasierte und ultrafiltrationsbasierte Techniken.
Ultrazentrifugationsbasierte Methoden gelten als Goldstandardmethoden bei der Isolierung von sEVs. Zwei Arten von Ultrazentrifugationstechniken, die normalerweise verwendet werden, sind die differentielle Ultrazentrifugation und die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Ultrazentrifugationsmethoden führen jedoch oft zu einer geringen Ausbeute und erfordern teure Geräte für Hochgeschwindigkeits-Ultrazentrifugen (100.000-200.000 × g)11. Darüber hinaus sind Ultrazentrifugationstechniken allein ineffizient bei der Trennung von EV-Subtypen (sEVs und große EVs), was zu einer unreinen Sedimentschichtführt 11. Schließlich könnte die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation auch zeitaufwändig sein und zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen erfordern, wie z. B. die Zugabe von Saccharosepuffer, um die Gradientenschädigung während der Beschleunigungs- und Verzögerungsschritte12 zu verhindern. Daher führt die Ultrazentrifugation in der Regel zu einer relativ geringen Ausbeute und ist nicht in der Lage, zwischen verschiedenen Populationen von EVs13 zu unterscheiden, was ihre Anwendung für die großtechnische EV-Präparation11 einschränkt.
Die zweite Methode der EV-Isolierung ist die Ultrafiltration, die auf der Größenfiltration basiert. Die Ultrafiltration ist im Vergleich zur Ultrazentrifugation relativ zeit- und kosteneffizient, da sie keine teuren Geräte oder langen Verarbeitungszeiten erfordert14. Daher scheint die Ultrafiltration eine effektivere Isolationstechnik zu sein als die beiden oben genannten Ultrazentrifugationsmethoden. Die isolierten Produkte können je nach Porengröße und höherer Ausbeute spezifischer sein15. Die zusätzliche Kraft, die während des Filtrationsprozesses entsteht, kann jedoch zur Verformung oder zum Ausbruch der EVs16 führen.
In der vorliegenden Arbeit wird ein kosten- und zeiteffizientes Benchtop-Protokoll zur Isolierung von MSC-abgeleiteten sEVs für nachgelagerte Analysen und therapeutische Zwecke vorgeschlagen. Die in diesem Artikel beschriebene Methode kombinierte eine einfache Filtrationsmethode mit einer Tischzentrifugation, um ertragreiche und qualitativ hochwertige EVs aus hUC-MSCs für die nachgelagerte Analyse zu isolieren, einschließlich Partikelgrößenanalyse, Biomarker-Assay und elektronenmikroskopischer Bildgebung.
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Protocol
HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Geräten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. Mesenchymale Stammzellen und Kultur der menschlichen Nabelschnur
- Kultivieren Sie die hUC-MSCs bei einer Aussaatdichte von 5 × 103/cm2 in DMEM, ergänzt mit 8 % humanem Thrombozytenlysat und 1 % Pen-Streptokokken. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in 5% CO2. Tauschen Sie das Zellkulturmedium alle 3 Tage aus, um ein ordnungsgemäßes Zellwachstum zu gewährleisten.
- Erweitern Sie die Zellen auf Passage 5 in T175-Kolben zur sEV-Isolierung.
HINWEIS: Es werden viele Kolben benötigt, um eine hohe Ausbeute an sEVs zu erzielen (die Ausbeute steigt mit der Anzahl der Zellen).
2. Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus hUC - MSCs
- Ersetzen Sie das Nährmedium durch frisches, phenolrotfreies DMEM, das mit 1 % Pen-Streptokokken [konditioniertes Medium (CM)] ergänzt wird, wenn die Kultur bei Passage 5 eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreicht.
VORSICHT: Verwenden Sie nur Basalmedien; Vermeiden Sie FBS und humane Thrombozytenlysat-Ergänzung, um eine Kontamination durch externe sEVs zu vermeiden. - Nach 24 h zentrifugieren Sie den CM bei 200 × g für 5 min bei 4 °C, um Zellreste zu entfernen. Sammeln und filtern Sie den Überstand durch einen 0,22-μm-Filter, um Partikel zu entfernen, die größer als 220 nm sind.
- Füllen Sie die Zentrifugalfiltereinheit mit 30 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die durch einen 0,2-μm-Filter gefiltert wird. Zentrifugieren Sie die Zentrifugalfiltereinheit bei 3.500 × g für 5 min bei 4 °C.
- Füllen Sie das gefilterte CM in die Zentrifugalfiltereinheit (das maximale Volumen jeder Einheit beträgt 70 ml). Zentrifugieren Sie den CM bei 3.500 × g bei 4 °C.
Anmerkungen: Die Dauer der Zentrifugation sollte von Zeit zu Zeit überwacht werden, bis die Lösung die Oberfläche des Filters erreicht hat. - Entsorgen Sie die Lösung im Filtratlösungsbecher. Den Probenfilterbecher mit dem Konzentratauffangbecher bei 1.000 x g bei 4 °C für 2 min rückwärts zentrifugieren.
- Übertragen Sie das konzentrierte CM zurück in die Zentrifugalfiltereinheit. Geben Sie 30 ml filtriertes PBS in die Zentrifugalfiltereinheit und zentrifugieren Sie das Gerät bei 3.500 × g bei 4 °C.
- Entsorgen Sie die Lösung im Filtratlösungsbecher. Installieren Sie einen Konzentratsammelbecher auf der Filtereinheit und zentrifugieren Sie 2 Minuten lang bei 4 °C bei 1.000 × g zurück, um die gereinigten sEVs zu erhalten.
- Filtern Sie die sEVs durch einen 0,22 μm Spritzenvorsatzfilter.
- Übertragen Sie die Proben in neue Röhrchen und lagern Sie sie zur weiteren Analyse bei -80 °C.
3. Charakterisierung von hUC-MSC-sEVs
- Nanopartikel-Tracking-Analyse
- Verdünnen Sie die isolierten hUC-MSC-sEVs in gefiltertem PBS auf 20-100 Partikel/Frame.
- Geben Sie 1 ml der verdünnten Probe mit 1 ml Einwegspritzen in die NTA-Kammer.
- Stellen Sie die Messeinstellungen entsprechend ein: Stellen Sie die Kameraebene auf Stufe 14 ein, bestimmen Sie die Erkennungsschwelle , um so viele Partikel wie möglich einzuschließen, mit der Einschränkung, dass 10-100 rote Kreuze gezählt werden und die Anzahl der blauen Kreuze auf fünf begrenzt ist.
- Nehmen Sie für jede Messung fünf 1-minütige Videos auf und analysieren Sie sie mit der NanoSight-Software mit einer Nachweisschwelle von fünf.
- Nehmen Sie für jede Probe Messungen in dreifacher Ausfertigung vor.
- Western-Blotting-Analyse
- Die hUC-MSC-sEVs werden mit einem RIPA-Lysepuffer (Ice-Cold Radioimmunoprecipitation Assay) lysiert, 30 min bei 4 °C inkubiert und bei 200 × g 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Sammle den Überstand ein.
- Quantifizieren Sie das Protein mit einem Bicinchoninsäure (BCA) Protein-Assay-Kit. Stellen Sie das Gelelektrophorese-Set entsprechend zusammen und führen Sie die Gelelektrophorese bei 90 V durch, bis das Protein das Ende des Stapelgels erreicht. Ändern Sie die Spannung auf 200 V, um die Proteine bis zum Ende des auflösenden Gels zu trennen.
- Führen Sie einen halbtrockenen Transfer durch, um die Proteine aus dem Gel auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran bei 15 V für 1 h zu übertragen.
- Blockieren Sie die PVDF-Membran mit 3 % Rinderserumalbumin (BSA)/Tris-gepufferter Kochsalzlösung-0,1 % v/v Tween 20 (TBS-T) für 1 h auf einem Schüttler bei Raumtemperatur. Die PVDF-Membran wird mit Primärantikörpern wie folgt inkubiert: monoklonaler Anti-CD-9-Antikörper der Maus (1:500), monoklonaler Anti-CD-81-Antikörper der Maus (1:500), monoklonaler Anti-TSG 101-Antikörper der Maus (1:500) bei 4 °C über Nacht unter ständigem Schütteln.
- Am nächsten Tag wird die PVDF-Membran 5 x 5 min mit TBS-T gewaschen und mit einem sekundären Antikörper, dem Meerrettichperoxidase-konjugierten Maus-IgG-kappa-bindenden Protein (m-IgGκ BP-HRP) (1:5.000), 1 h lang unter Rühren bei Raumtemperatur inkubiert.
- Waschen Sie die PVDF-Membran erneut fünfmal mit TBS-T und visualisieren Sie die Membran in einem ladungsgekoppelten (CCD) Imager mit einem Chemilumineszenz-Detektionsreagenz. Analysieren Sie das Expressionsniveau der Proteine mit der ImageJ-Software. Öffnen Sie zunächst die Bilddatei in ImageJ (Datei | Öffnen...). Verbessern Sie die Bildqualität, indem Sie Helligkeit und Kontrast anpassen ("Bild | Anpassen | Helligkeit/Kontrast). Passen Sie das Bild an, bis die Flecken deutlich sichtbar sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Übernehmen und speichern Sie die Bilder im TIFF-Format (Datei | Speichern unter | TIFF...).
- Transmissionselektronenmikroskop
- Verdünnen Sie einen Teil der hUC-MSC-sEVs-Probe mit vier Teilen filtriertem PBS auf ein Gesamtvolumen von 10 μl und inkubieren Sie ihn 15 Minuten lang auf einem kohlenstoffbeschichteten Kupfergitter.
- Entfernen Sie die überschüssige Probe mit einem Labortuch und lassen Sie sie 3 Minuten lang an der Luft trocknen.
- Inkubieren Sie 10 μl 1%ige Phosphowolframsäure (PTA)-Lösung, um die Probe 3 Minuten lang zu färben.
- Entfernen Sie die überschüssige 1%ige PTA-Lösung mit einem Labortuch und lassen Sie sie 3 Minuten lang an der Luft trocknen.
- Verwenden Sie die Probe für die transmissionselektronenmikroskopische Bildgebung.
HINWEIS: In Abbildung 1 finden Sie die zusammengefassten schematischen Experimentschritte.
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Representative Results
Abbildung 2 zeigt, dass hUC-MSC-sEVs einen Partikelgrößenmodus bei 53 nm aufweisen, während andere signifikante Peaks der Partikelgröße bei 96 und 115 nm lagen. Die mit NTA gemessene Konzentration von hUC-MSC-sEVs betrug 7,75 × 1010 Partikel/ml. Die mit dem BCA-Assay gemessene Proteinkonzentration der hUC-MSC-sEVs betrug ca. 80 μg/ml.
In der Western-Blotting-Analyse zeigten hUC-MSC-sEVs positive Banden für die exosomalen Marker CD9, CD81 und TSG101, waren aber negativ für GRP94 (Abbildung 3). GRP94 ist ein endoplasmatischer Retikulummarker, der häufig als negativer Marker für sEVs verwendet wird. Die isolierten hUC-MSC-sEVs wurden unter TEM visualisiert, um ihre Größe und Morphologie zu bestimmen. hUC-MSCs-sEVs hatten eine Größe von ~100 nm und zeigten eine becherartige Doppelschicht-Membranstruktur (Abbildung 4).
Abbildung 1: Arbeitsschema der Isolierung, Reinigung und Charakterisierung von sEVs. Das konditionierte Medium wurde aus der MSC-Kultur entnommen und durch einen 0,22 μm Filter filtriert, um große Partikel zu entfernen. Das filtrierte Medium wurde in eine Zentrifugalfiltereinheit überführt, um die sEVs zu konzentrieren, und umgekehrt zentrifugiert, um die konzentrierten sEVs zu sammeln. Die konzentrierten sEVs wurden dann mit kaltem, gefiltertem PBS resuspendiert und die Schritte mit einer Zentrifugalfiltereinheit für die Waschschritte wiederholt. Schließlich wurden die sEVs durch 0,22 μm Filtration sterilisiert, bevor sie mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse, Western-Blotting-Analyse und Transmissionselektronenmikroskopie charakterisiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Nanopartikel-Tracking-Analyse von isolierten hUC-MSC-sEVs. Die hUC-MSC-sEVs wurden 100-1.000-fach mit geklärtem PBS verdünnt und mit Nanosight NS300 gemessen, das mit einer CMOS-Kamera, einer 20-fachen Objektivlinse, einem blauen Lasermodul (488 nm) und NTA-Software ausgestattet war. Die Abbildung ist eine Darstellung von NTA in dreifacher Ausfertigung. Abkürzungen: hUC-MSC-sEVs = humane Nabelschnur-abgeleitete MSC-kleine extrazelluläre Vesikel; NTA = Nanopartikel-Tracking-Analyse; CMOS = komplementärer Metalloxid-Halbleiter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Die Biomarker-Expression von hUC-MSC-sEVs . (A) Western-Blot-Analyse des exosomal positiven CD9-Markers. (B) Western-Blot-Analyse des exosomal positiven CD81-Markers. (C) Western-Blot-Analyse des exosomal positiven TSG101-Markers. (D) Western-Blot-Analyse des GRP94-Negativmarkers. Alle vier Marker wurden mit Zelllysat als Kontrolle verglichen. Von links nach rechts: Leiter, Zelllysat, hUC-MSC-sEVs (A,B); Leiter, hUC-MSC-sEVs, Zelllysat, hUC-MSC-sEVs, Zelllysat (C); Leiter, Zelllysat, hUC-MSC-sEVs (D). Die Zelllysatpaare stammen aus zwei Replikaten, und diese Bilder sind repräsentative Bilder aus Experimenten, die in dreifacher Ausführung durchgeführt wurden. Abkürzung: hUC-MSC-sEVs = humane Nabelschnur-abgeleitete MSC-kleine extrazelluläre Vesikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Morphologie einzelner hUC-MSC-sEVs unter Transmissionselektronenmikroskopie. Die hUC-MSC-sEVs wurden auf einem kohlenstoffbeschichteten Kupfergitter inkubiert und mit 1%iger Phosphowolframsäure gefärbt, bevor sie unter dem Transmissionselektronenmikroskop betrachtet wurden. Die hUC-MSC-sEVs mit einer Größe von etwa 100 nm zeigten eine becherartige Doppelschicht-Membranstruktur. Maßstabsbalken = 100 nm. Das Bild ist repräsentativ für drei unabhängige Aufnahmen. Abkürzung: hUC-MSC-sEVs = humane Nabelschnur-abgeleitete MSC-kleine extrazelluläre Vesikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
EVs sind eine der wichtigen Untergruppen des Sekretoms in MSCs, die eine entscheidende Rolle bei normalen und pathologischen Prozessen spielen. Allerdings haben sEVs mit einem Größenbereich zwischen 30 und 200 nm in den letzten zehn Jahren als potenzielles Werkzeug für die zellfreie Therapie zugenommen. Es wurden verschiedene Techniken entwickelt, um sEVs aus MSCs zu isolieren. Differentielle Ultrazentrifugation, Ultrafiltration, polymerbasierte Fällung, Immunaffinitätserfassung und mikrofluidikbasierte Fällung weisen jedoch unterschiedliche Vor- und Nachteileauf 17. Keine dieser Isolationstechniken kann eine hohe Wiederfindungsrate und Spezifität erreichen. Daher müssen die Forscher die geeigneten Methoden nach ihren Präferenzen auswählen, basierend auf einer hohen Wiederfindungsrate oder einer hohen Spezifität.
Vor der Isolierung von MSCs sEVs wurden die MSCs auf positive Oberflächenmarker (CD90, CD105, CD73) und negative Marker (CD34, CD11b, CD19, CD45 und HLA-DR) mittels Durchflusszytometrie untersucht, wie zuvor beschrieben18. Der technische Vorteil dieser Studie über sEVs könnte eine Lösung für die aktuelle Situation darstellen. Es erfordert nur eine einfache Tischeinrichtung im Labor, um die Verwendung von High-End-Geräten zur Isolierung von sEVs zu vermeiden. Die MSCs wurden im beschriebenen Protokoll ohne Zugabe von Serum mit Nährmedien ausgehungert. Dies ist von entscheidender Bedeutung, um eine Kontamination von EVs zu verhindern, die aus der Serumsupplementierung stammen. In Anbetracht der Tatsache, dass Serumpräparate in einigen Fällen unvermeidlich sind, können Exosomen-depletierte Serumpräparate jedoch bei der Formulierung kompletter Nährmedien in Betracht gezogen werden. Darüber hinaus könnten phenolrotfreie Medien als Ersatz für Standard-Nährmedien verwendet werden, da dieser gängige pH-Indikator möglicherweise Probleme bei kolorimetrischen Messungen verursachen könnte15. Das Protokoll kann durch die Verwendung eines 0,22-μm-Pumpfilters anstelle eines herkömmlichen Spritzenvorsatzfilters bei der Entfernung von Partikeln größer als 220 nm verbessert werden. Es sollten Vorkehrungen getroffen werden, um die Ausbeute der sEVs zu verbessern. Bei der letzten Zentrifugation von CM durch eine Zentrifugalfiltereinheit sollte eine längere Zentrifugation vermieden werden, um sicherzustellen, dass genügend Lösungsvolumen vorhanden ist, um die sEVs aus dem Filter zu eluieren. Wenn dies übersehen wird, kann die Ausbeute an sEVs, die während des Rückwärtszentrifugationsschritts gesammelt werden, verringert werden.
Dieses Protokoll ist auf den Labormaßstab beschränkt und daher möglicherweise nicht für die großflächige Isolierung in der Industrie geeignet. Dies ist auf die hohen Kosten für den einmaligen Einsatz einer Zentrifugalfiltereinheit zurückzuführen, die für eine großflächige Isolierung, die in der Regel ein Volumen von bis zu Tausenden von Litern CM umfasst, nicht realisierbar ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir ein einfaches Filtrationsprotokoll im Labormaßstab für die Isolierung von sEVs aus MSCs bereitstellen. Dieses Protokoll eignet sich auch für die Aufreinigung isolierter sEVs für die weitere nachgelagerte Analyse. Obwohl dieses Protokoll speziell für sEVs entwickelt wurde, die von MSCs abgeleitet sind, kann ein Teil des beschriebenen Protokolls verwendet werden, um sEVs aus verschiedenen Quellen zu isolieren, wie z. B. Körperflüssigkeiten, Zelllinien oder anderen flüssigen Quellen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Veröffentlichung dieses Videos wurde unterstützt von My CytoHealth Sdn. Bhd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
| 95% ethanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Disinfectants |
| Absolute Methanol | Chemiz | 45081 | To activate PVDF membrane (Western blot) |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell dissociation enzyme |
| ammonium persulfate | Chemiz | 14475 | catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis |
| anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | Antibody for sEVs marker |
| anti-TSG 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | Antibody for sEVs marker |
| Bovine serum albumin | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF membrane blocking |
| bromophenol blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | electrophoretic color marker |
| Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | sEVs isolation |
| ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | chemiluminescence detection reagent |
| CryoStor Freezing Media | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Cell cryopreserve |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Cell culture media |
| ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker | SMOBIO | PM2610 | Protein molecular weight markers |
| Extra thick blotting paper | ATTO | buffer reservior (Western blot) | |
| Glycerol | Merck | G5516 | Chemicals for western blot |
| Glycine | 1st Base | BIO-2085-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | Secondary antibody (Western Blot) |
| Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia | ||
| mouse antibodies anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | Antibody for sEVs marker |
| Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
| paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 02890-45 | Sample Fixation during TEM |
| penicillin–streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Antibiotic for media |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Nacalai Tesque | 27327-81 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Washing, sample dilution |
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size |
ATTO | To hold protein during protein transfer (Western blot) | |
| protease inhibitor cocktail | Nacalai Tesque | 25955-11 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| Protein Assay Bicinchoninate Kit | Nacalai Tesque | 06385-00 | Protein measurement |
| sample buffer solution with 2-ME | Nacalai Tesque | 30566-22 | Reducing agent for western blot |
| sodium chloride | Nacalai Tesque | 15266-64 | Chemicals for western blot |
| sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31606-62 | ionic surfactant during gel electrophoresis |
| Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope | FEI, USA | ||
| tetramethylethylenediamine | Nacalai Tesque | 33401-72 | chemicals to prepare gel |
| tris-base | 1st Base | BIO-1400-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Chemicals for western blot |
| UVP (Ultra Vision Product) CCD imager | CCD imager for western blot signal detection |
References
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