Summary
Denne protokol demonstrerer, hvordan man isolerer humane navlestrengsafledte mesenkymale stamcellers små ekstracellulære vesikler (hUC-MSC-sEV'er) med en simpel bænkindstilling i laboratorieskala. Størrelsesfordelingen, proteinkoncentrationen, sEVs markører og morfologi af isolerede hUC-MSC-sEV'er er karakteriseret ved henholdsvis nanopartikelsporingsanalyse, BCA-proteinanalyse, western blot, og transmissionselektronmikroskop.
Abstract
Den ultracentrifugeringsbaserede proces betragtes som den almindelige metode til isolering af små ekstracellulære vesikler (sEV'er). Udbyttet fra denne isolationsmetode er imidlertid relativt lavere, og disse metoder er ineffektive til at adskille sEV-undertyper. Denne undersøgelse demonstrerer en simpel benchtop-filtreringsmetode til isolering af humane navlestrengsafledte MSC små ekstracellulære vesikler (hUC-MSC-sEV'er), der med succes adskilles ved ultrafiltrering fra det konditionerede medium af hUC-MSC'er. Størrelsesfordelingen, proteinkoncentrationen, eksosomale markører (CD9, CD81, TSG101) og morfologien af de isolerede hUC-MSC-sEV'er blev karakteriseret med henholdsvis nanopartikelsporingsanalyse, BCA-proteinanalyse, western blot, og transmissionselektronmikroskop. De isolerede hUC-MSC-sEV'er var 30-200 nm med en partikelkoncentration på 7,75 × 10 10 partikler/ml og en proteinkoncentration på80 μg/ml. Positive bånd for exosomale markører CD9, CD81 og TSG101 blev observeret. Denne undersøgelse viste, at hUC-MSC-sEV'er med succes blev isoleret fra hUC-MSC's konditionerede medium, og karakterisering viste, at det isolerede produkt opfyldte kriterierne nævnt af Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).
Introduction
Ifølge MISEV 2018 er sEV'er ikke-replikerende lipid-dobbeltlagspartikler uden funktionel kerne til stede med en størrelse på 30-200 nm1. MSC-afledte sEV'er indeholder vigtige signalmolekyler, der spiller vigtige roller i vævsregenerering, såsom mikroRNA, cytokiner eller proteiner. De er i stigende grad blevet et forsknings "hotspot" inden for regenerativ medicin og cellefri terapi. Mange undersøgelser har vist, at MSC-afledte sEV'er er lige så effektive som MSC'er til behandling af forskellige tilstande, såsom immunmodulation 2,3,4,5, forbedring af osteogenese 6, diabetes mellitus7,8 eller vaskulær regenerering 9,10. Efterhånden som de tidlige faseforsøg skrider frem, er tre hovednøglespørgsmål i forbindelse med den kliniske oversættelse af MSC'er-EV'er blevet fremhævet: udbyttet af EV'erne, EV'ernes renhed (fri for celleaffald og andre biologiske forurenende stoffer såsom protein og cytokiner) og integriteten af EV'ernes phospholipid-dobbeltlagsmembran efter isolering.
Der er udviklet forskellige metoder til isolering af sEV'er ved at udnytte densiteten, formen, størrelsen og overfladeproteinet i sEV'erne11. De to mest almindelige metoder i sEVs isolationer er ultracentrifugeringsbaserede og ultrafiltreringsbaserede teknikker.
Ultracentrifugeringsbaserede metoder betragtes som guldstandardmetoder i sEVs isolering. To typer ultracentrifugeringsteknikker, der normalt anvendes, er differentiel ultracentrifugering og densitetsgradient ultracentrifugering. Imidlertid resulterer ultracentrifugeringsmetoder ofte i lavt udbytte og kræver dyrt udstyr til højhastighedsultracentrifuge (100.000-200.000 × g)11. Desuden er ultracentrifugeringsteknikker alene ineffektive til at adskille EV-undertyper (sEV'er og store EV'er), hvilket resulterer i et urent sedimentlag11. Endelig kan densitetsgradientultracentrifugering også være tidskrævende og kræve yderligere forsigtighedstrin såsom tilsætning af saccharosebuffer for at hæmme gradientskaden under accelerations- og decelerationstrin12. Derfor fører ultracentrifugering normalt til et relativt lavt udbytte og er ikke i stand til at skelne mellem forskellige populationer af elektriske køretøjer13, hvilket begrænser dets anvendelse til forberedelse af elektriske køretøjer i stor skala11.
Den anden metode til EV-isolering er via ultrafiltrering, som er baseret på størrelsesfiltrering. Ultrafiltrering er relativt tids- og omkostningseffektiv sammenlignet med ultracentrifugering, da det ikke involverer dyrt udstyr eller lange behandlingstider14. Derfor synes ultrafiltrering at være en mere effektiv isolationsteknik end begge ovennævnte ultracentrifugeringsmetoder. De isolerede produkter kan være mere specifikke baseret på porestørrelser og højere udbytte15. Den ekstra kraft, der opstår under filtreringsprocessen, kan imidlertid resultere i deformation eller udbrud af elbilerne16.
Det nuværende papir foreslog en omkostnings- og tidseffektiv benchtop-protokol til isolering af MSC-afledte sEV'er til downstream-analyse og terapeutiske formål. Metoden beskrevet i dette papir kombinerede en simpel filtreringsmetode med bænkcentrifugering for at isolere højtydende elbiler af god kvalitet fra hUC-MSC'er til downstream-analyse, herunder partikelstørrelsesanalyse, biomarkøranalyse og elektronmikroskopisk billeddannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Se materialefortegnelsen for detaljer om alle materialer, udstyr og software, der bruges i denne protokol.
1. Humane navlesnorsmesenkymale stamceller og kultur
- Dyrk hUC-MSC'erne med en såtæthed på 5 × 103/cm2 i DMEM, suppleret med 8% humant trombocytlysat og 1% pen-strep. Cellerne inkuberes ved 37 °C i 5% CO2. Udskift cellekulturmediet hver 3. dag for at sikre korrekt cellevækst.
- Udvid cellerne til passage 5 i T175-kolber til sEV-isolering.
BEMÆRK: Mange kolber er nødvendige for at høste et højt udbytte af sEV'er (udbyttet stiger med antallet af celler).
2. Lille ekstracellulær vesikelisolering fra hUC - MSC'er
- Udskift dyrkningsmediet med frisk phenolrødfrit DMEM suppleret med 1% Pen-Strep [Conditioned medium (CM)], når kulturen når 70% -80% sammenløb ved passage 5.
FORSIGTIG: Brug kun basalmedier; undgå FBS og humant blodpladelysattilskud for at undgå forurening med eksterne sEV'er. - Efter 24 timer centrifugeres CM ved 200 × g i 5 minutter ved 4 °C for at fjerne celleaffald. Supernatanten opsamles og filtreres gennem et 0,22 μm filter for at fjerne partikler større end 220 nm.
- Centrifugalfilterenheden fyldes med 30 ml fosfatbufret saltvand (PBS) filtreret gennem et 0,2 μm filter. Centrifugalfilterenheden centrifugeres ved 3.500 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Fyld den filtrerede CM i centrifugalfilterenheden (hver enheds maksimale volumen er 70 ml). CM centrifugeres ved 3.500 × g ved 4 °C.
BEMÆRK: Centrifugeringsvarigheden skal overvåges fra tid til anden, indtil opløsningen har nået filterets overflade. - Kassér opløsningen i filtratopløsningskoppen. Omvendt centrifugeres prøvefilterbægeret med koncentratopsamlingsbæger ved 1.000 x g ved 4 °C i 2 min.
- Overfør den koncentrerede CM tilbage til centrifugalfilterenheden. Der tilsættes 30 ml filtreret PBS i centrifugalfilterenheden, og enheden centrifugeres ved 3.500 × g ved 4 °C.
- Kassér opløsningen i filtratopløsningskoppen. Der anbringes et koncentratopsamlingsbæger på filterenheden, og der centrifugeres omvendt ved 1 000 × g i 2 minutter ved 4 °C for at opnå de rensede EV'er.
- Filtrer EV'erne gennem et 0,22 μm sprøjtefilter.
- Prøverne overføres til nye reagensglas og opbevares ved -80 °C til yderligere analyse.
3. Karakterisering af hUC-MSC-sEV'er
- Analyse af nanopartikelsporing
- De isolerede hUC-MSC-sEV'er fortyndes i filtreret PBS til 20-100 partikler/ramme.
- 1 ml af den fortyndede prøve føres ind i NTA-kammeret ved hjælp af 1 ml engangssprøjter.
- Indstil måleindstillingerne i overensstemmelse hermed: juster kameraniveauet til niveau 14, bestem detektionstærsklen for at inkludere så mange partikler som muligt med begrænsningen om, at 10-100 røde kryds tælles , og det blå krydsantal er begrænset til fem.
- For hver måling skal du optage fem videoer på 1 min og analysere dem ved hjælp af NanoSight-softwaren med en detektionstærskel på fem.
- Der foretages målinger i tre eksemplarer for hver prøve.
- Western blotting analyse
- HUC-MSC-sEV'erne lyses med iskold radioimmunudfældningsanalyse (RIPA) lysisbuffer, inkuberes i 30 minutter ved 4 °C og centrifugeres ved 200 × g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten hentes.
- Kvantificer proteinet ved hjælp af et bicinchoninsyre (BCA) proteinanalysesæt. Saml gelelektroforesesættet i overensstemmelse hermed, og udfør gelelektroforese ved 90 V, indtil proteinet når stablingsgelens ende. Skift spændingen til 200 V for at adskille proteinerne indtil slutningen af opløsningsgelen.
- Udfør halvtør overførsel for at overføre proteinerne fra gelen til en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran ved 15 V i 1 time.
- PVDF-membranen blokeres med 3% bovin serumalbumin (BSA)/Tris-bufret saltvand-0,1% v/v Tween 20 (TBS-T) i 1 time på en ryster ved stuetemperatur. PVDF-membranen inkuberes med primære antistoffer som følger: museanti-CD 9 monoklonalt antistof (1:500), museanti-CD 81 monoklonalt antistof (1:500), museanti-GRP 94 monoklonalt museanti-TSG 101 monoklonalt antistof (1:500) ved 4 °C natten over med konstant omrystning.
- Næste dag vaskes PVDF-membranen 5 x 5 min med TBS-T og inkuberes yderligere med et sekundært antistof: peberrodsperoxidase-konjugeret mus IgG kappa-bindende protein (m-IgGκ BP-HRP) (1:5.000) i 1 time med omrøring ved stuetemperatur.
- Vask igen PVDF-membranen med TBS-T fem gange, og visualiser membranen i et ladningskoblet (CCD) billedkamera ved hjælp af et kemiluminescensdetekteringsreagens. Analyser proteinernes ekspressionsniveau ved hjælp af ImageJ-software. Åbn først billedfilen i ImageJ (File | Åben...). Forbedre billedets kvalitet ved at justere lysstyrken og kontrasten (Billede | Juster | Lysstyrke/kontrast). Juster billedet, indtil blotterne er tydeligt synlige, klik på knappen Anvend , og gem derefter billederne i TIFF-format (File | Gem som | TIFF...).
- Transmission elektron mikroskop
- En del af hUC-MSC-sEVs-prøven fortyndes med fire dele filtreret PBS til et samlet volumen på 10 μL og inkuberes på et kulstofbelagt kobbergitter i 15 minutter.
- Fjern overskydende prøve ved hjælp af en laboratorieserviet og lad den lufttørre i 3 min.
- Der inkuberes 10 μL 1% phosphorwolframsyre (PTA) opløsning for at plette prøven i 3 min.
- Fjern overskydende 1% PTA-opløsning ved hjælp af en laboratorieserviet og lad den lufttørre i 3 minutter.
- Brug prøven til transmissionselektronmikroskopbilleddannelse.
BEMÆRK: Se figur 1 for de opsummerede skematiske eksperimenttrin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser, at hUC-MSC-sEV'er har en partikelstørrelsestilstand ved 53 nm, mens andre signifikante toppe af partikelstørrelse var 96 og 115 nm. Koncentrationen af hUC-MSC-sEV'er målt ved NTA var 7,75 × 1010 partikler/ml. Proteinkoncentrationen af hUC-MSC-sEV'er målt med BCA-analysen var ca. 80 μg/ml.
I western blotting-analyse viste hUC-MSC-sEV'er positive bånd for exosomale markører CD9, CD81 og TSG101, men var negative for GRP94 (figur 3). GRP94 er en endoplasmatisk retikulummarkør, der almindeligvis anvendes som en negativ markør for sEV'er. De isolerede hUC-MSC-sEV'er blev visualiseret under TEM for at bestemme deres størrelse og morfologi. hUC-MSCs-sEV'er i størrelse ~100 nm og viste en koplignende membranstruktur i to lag (figur 4).
Figur 1: Arbejdsskema over isolering, rengøring og karakterisering af elbiler. Det konditionerede medium blev opsamlet fra MSC-kultur og filtreret gennem et 0,22 μm filter for at fjerne store partikler. Det filtrerede substrat blev overført til en centrifugalfilterenhed for at koncentrere sEV'erne og omvendt centrifugeret for at opsamle de koncentrerede sEV'er. De koncentrerede EV'er blev derefter resuspenderet med kold, filtreret PBS, og trinene blev gentaget med en centrifugalfilterenhed til vasketrinnene. Endelig blev sEV'erne steriliseret ved 0,22 μm filtrering, før de blev karakteriseret ved hjælp af nanopartikelsporingsanalyse, western blotting-analyse og transmissionselektronmikroskopi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Nanopartikelsporingsanalyse af isolerede hUC-MSC-sEV'er. hUC-MSC-sEV'erne blev 100-1.000 gange fortyndet med klaret PBS og målt ved hjælp af Nanosight NS300 udstyret med et CMOS-kamera, et 20x objektivobjektiv, et blåt lasermodul (488 nm) og NTA-software. Figuren er en repræsentation af NTA i tre eksemplarer. Forkortelser: hUC-MSC-sEVs = små ekstracellulære vesikler afledt af human navlesnor; NTA = nanopartikelsporingsanalyse; CMOS = komplementær metaloxid halvleder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Biomarkørekspressionen af hUC-MSC-sEV'er . (A) Western blot-analyse af CD9 exosomal positiv markør. (B) Western blot-analyse af CD81 exosomal positiv markør. (C) Western blot-analyse af TSG101 exosomal positiv markør. D) Western blot-analyse af GRP94-negativmarkør. Alle fire markører blev sammenlignet med cellelysat som kontrol. Fra venstre mod højre, stige, cellelysat, hUC-MSC-sEV'er (A, B); Stige, hUC-MSC-sEV'er, cellelysat, hUC-MSC-sEV'er, cellelysat (C); Stige, cellelysat, hUC-MSC-sEV'er (D). Cellelysatparrene er fra to replikater, og disse billeder er repræsentative billeder fra eksperimenter udført i tre eksemplarer. Forkortelse: hUC-MSC-sEVs = human navlestrengsafledt MSC små ekstracellulære vesikler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Morfologi af enkelte hUC-MSC-sEV'er under transmissionselektronmikroskopi. hUC-MSC-sEV'erne blev inkuberet på et kulstofbelagt kobbergitter og farvet med 1% phosphowolframsyre, før de blev set under transmissionselektronmikroskopet. hUC-MSC-sEV'erne, der var omkring 100 nm, viste en koplignende membranstruktur i to lag. Skala bar = 100 nm. Billedet er en repræsentant for tre uafhængige optagelser. Forkortelse: hUC-MSC-sEVs = human navlestrengsafledt MSC små ekstracellulære vesikler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EV'er er en af de vigtige delmængder af sekretomet i MSC'er, der spiller en afgørende rolle under normale og patologiske processer. Imidlertid er sEV'er med et størrelsesinterval mellem 30 og 200 nm steget som et potentielt værktøj til cellefri terapi i det sidste årti. Der blev udviklet forskellige teknikker til at isolere elbiler fra MSC'er. Imidlertid har differentiel ultracentrifugering, ultrafiltrering, polymerbaseret udfældning, immunoaffinitetsindfangning og mikrofluidikbaseret udfældning forskellige fordele og ulemper17. Ingen af disse isolationsteknikker kan opnå en høj restitutionsgrad og specificitet. Således skal forskere vælge de passende metoder i henhold til deres præferencer baseret på en høj genopretningsgrad eller høj specificitet.
Før isolering af MSC'er sEV'er blev MSC'erne vurderet for positive overflademarkører (CD90, CD105, CD73) og negative markører (CD34, CD11b, CD19, CD45 og HLA-DR) ved flowcytometri som beskrevet tidligere18. Den tekniske fordel ved denne undersøgelse af sEV kan være en løsning på den nuværende situation. Det kræver kun en grundlæggende bordplade oprettet i laboratoriet for at undgå at bruge avanceret udstyr til at isolere elbiler. MSC'erne blev udsultet med kulturmedier i den beskrevne protokol uden at tilføje noget serum. Dette er afgørende for at forhindre kontaminering af elbiler, der stammer fra serumtilskud. I betragtning af at serumtilskud er uundgåelige i nogle tilfælde, kan exosom-depleterede serumtilskud overvejes ved formulering af komplette kulturmedier. Derudover kan phenolrødfrie medier anvendes som erstatning for standardkulturmedier, da denne almindelige pH-indikator potentielt kan forårsage problemer med kolorimetriske målinger15. Protokollen kan forbedres ved at bruge et 0,22 μm pumpefilter i stedet for et konventionelt sprøjtefilter under fjernelse af partikler større end 220 nm. Der bør træffes forholdsregler for at forbedre udbyttet af EV'erne. Ved den sidste centrifugering af CM gennem en centrifugalfilterenhed bør langvarig centrifugering undgås for at sikre, at der er tilstrækkelig mængde opløsning til at eluere EV'erne fra filteret. Hvis du overser dette, kan det reducere udbyttet af sEV'er, der indsamles under omvendt centrifugering.
Denne protokol er begrænset til laboratorieskalaen og er som sådan muligvis ikke egnet til isolering i stor skala i industrien. Dette skyldes de høje omkostninger ved engangsbrug af en centrifugalfilterenhed, hvilket ikke er muligt for storskala isolering, hvilket generelt involverer et volumen på op til tusindvis af liter CM. Kort sagt leverer vi en enkel filtreringsprotokol i benchtopskala til isolering af elbiler afledt af MSC'er. Denne protokol er også velegnet til rensning af isolerede sEV'er til yderligere downstream-analyse. Selvom denne protokol er designet specielt til sEV'er afledt af MSC'er, kan en del af den beskrevne protokol bruges til at isolere sEV'er fra forskellige kilder, såsom kropsvæske, cellelinjer eller andre væskekilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Offentliggørelsen af denne video blev støttet af My CytoHealth Sdn. Bhd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
| 95% ethanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Disinfectants |
| Absolute Methanol | Chemiz | 45081 | To activate PVDF membrane (Western blot) |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell dissociation enzyme |
| ammonium persulfate | Chemiz | 14475 | catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis |
| anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | Antibody for sEVs marker |
| anti-TSG 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | Antibody for sEVs marker |
| Bovine serum albumin | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF membrane blocking |
| bromophenol blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | electrophoretic color marker |
| Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | sEVs isolation |
| ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | chemiluminescence detection reagent |
| CryoStor Freezing Media | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Cell cryopreserve |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Cell culture media |
| ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker | SMOBIO | PM2610 | Protein molecular weight markers |
| Extra thick blotting paper | ATTO | buffer reservior (Western blot) | |
| Glycerol | Merck | G5516 | Chemicals for western blot |
| Glycine | 1st Base | BIO-2085-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | Secondary antibody (Western Blot) |
| Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia | ||
| mouse antibodies anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | Antibody for sEVs marker |
| Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
| paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 02890-45 | Sample Fixation during TEM |
| penicillin–streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Antibiotic for media |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Nacalai Tesque | 27327-81 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Washing, sample dilution |
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size |
ATTO | To hold protein during protein transfer (Western blot) | |
| protease inhibitor cocktail | Nacalai Tesque | 25955-11 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| Protein Assay Bicinchoninate Kit | Nacalai Tesque | 06385-00 | Protein measurement |
| sample buffer solution with 2-ME | Nacalai Tesque | 30566-22 | Reducing agent for western blot |
| sodium chloride | Nacalai Tesque | 15266-64 | Chemicals for western blot |
| sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31606-62 | ionic surfactant during gel electrophoresis |
| Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope | FEI, USA | ||
| tetramethylethylenediamine | Nacalai Tesque | 33401-72 | chemicals to prepare gel |
| tris-base | 1st Base | BIO-1400-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Chemicals for western blot |
| UVP (Ultra Vision Product) CCD imager | CCD imager for western blot signal detection |
References
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Jayabalan, N., et al. Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes. Frontiers in Endocrinology. 8, 239 (2017).
- Li, T., et al. Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis. Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).
- Wang, C., et al. Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils. Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).
- Wei, Y., et al. MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia. Biomaterials. 204, 13-24 (2019).
- Liu, W., et al. MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).
- Li, F. X. Z., et al. The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications. Frontiers in Endocrinology. 12, 1741 (2021).
- Jayabalan, N., et al. Frontiers in Endocrinology. 8, Front Endocrinol. Lausanne. (2017).
- Wei, Y., et al. Biomaterials. 204, Biomaterials. 13-24 (2019).
- Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. 133, 70-81 (2017).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V.
- Kırbaş, O. K., et al. Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
- Ev, B., Ms, K. Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).
- Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, San Diego, Calif. 64-74 (2015).
- Tan, K. L., et al. Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells. Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).
