Summary
Das Küken ist ein kostengünstiger, zugänglicher und weit verbreiteter Modellorganismus für eine Vielzahl von Studien. Hier wird eine Reihe von Protokollen detailliert beschrieben, um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der Entwicklung und Regeneration des Vogelinnenohrs zugrunde liegen.
Abstract
Das Innenohr nimmt Geräusche wahr und hält das Gleichgewicht über die Cochlea und den Vorraum aufrecht. Dies geschieht durch die Verwendung eines dedizierten mechanosensorischen Zelltyps, der als Haarzelle bekannt ist. Die Grundlagenforschung im Innenohr hat zu einem tiefen Verständnis geführt, wie die Haarzellen funktionieren und wie Dysregulation zu Hörverlust und Schwindel führen kann. Für diese Forschung war die Maus das herausragende Modellsystem. Mäuse haben jedoch, wie alle Säugetiere, die Fähigkeit verloren, Haarzellen zu ersetzen. Wenn man also versucht, zelluläre Therapien zur Wiederherstellung der Innenohrfunktion zu verstehen, könnten ergänzende Studien an anderen Wirbeltierarten weitere Erkenntnisse liefern. Das auditorische Epithel von Vögeln, die Basilarpapille (BP), ist eine Epithelschicht, die aus mechanosensorischen Haarzellen (HCs) besteht, die von Stützzellen (SCs) interkaliert werden. Obwohl sich die anatomische Architektur der Basilarpapille und der Säugetier-Cochlea unterscheidet, sind die molekularen Mechanismen der Innenohrentwicklung und des Hörens ähnlich. Dies macht die Basilarpapille zu einem nützlichen System nicht nur für vergleichende Studien, sondern auch für das Verständnis der Regeneration. Hier beschreiben wir Sezier- und Manipulationstechniken für das Hühnerinnenohr. Die Technik zeigt genetische und niedermolekulare Hemmungsmethoden, die ein potentes Werkzeug zur Untersuchung der molekularen Mechanismen der Innenohrentwicklung bieten. In diesem Artikel diskutieren wir in Ovo-Elektroporationstechniken, um die Basilarpapille unter Verwendung von CRIPSR-Cas9-Deletionen genetisch zu stören, gefolgt von der Dissektion der Basilarpapille. Wir demonstrieren auch die BP-Organkultur und die optimale Verwendung von Kulturmatrices, um die Entwicklung des Epithels und der Haarzellen zu beobachten.
Introduction
Das Innenohr aller Wirbeltiere leitet sich von einem einfachen Epithel ab, das als otische Placode 1,2 bekannt ist. Dadurch entstehen alle strukturellen Elemente und Zelltypen, die notwendig sind, um die mechanosensorischen Informationen zu übertragen, die mit dem Hören und der Gleichgewichtswahrnehmung verbunden sind. Haarzellen (HCs), der Flimmersensor des Innenohrs, sind von Stützzellen (SCs) umgeben. HCs leiten Informationen über die Neuronen des achten Hirnnervs an das auditorische Hinterhirn weiter. Diese werden ebenfalls aus dem otischen Placode3 generiert. Die primäre Schalltransduktion wird an der apikalen Oberfläche des auditorischen HC durch ein mechanisch empfindliches Haarbündel4 erreicht. Dies wird durch modifizierte Aktin-basierte Vorsprünge, sogenannte Stereozilien, vermittelt, die in einem abgestuften Treppenmusterangeordnet sind 5. Darüber hinaus organisiert ein modifiziertes primäres Zilium, das sogenannte Kinocilium, die Haarbündelbildung und grenzt an die höchste Reihe von Stereozilien 6,7,8. Die Architektur der Stereozilien ist entscheidend für diese Rolle bei der Umwandlung mechanischer Reize, die von akustischer Energie in elektrische neuronale Signale abgeleitet werden9. Eine Schädigung des auditiven HC durch Alterung, Infektion, otoakustisches Trauma oder ototoxischer Schock kann zu einem teilweisen oder vollständigen Hörverlust führen, der bei Säugetieren irreversibel ist10.
Es wurden zelluläre Ersatztherapien vorgeschlagen, die solche Schäden reparieren könnten11,12. Der Ansatz dieser Forschung bestand darin, die normale Entwicklung der Haarzelle von Säugetieren zu verstehen und zu fragen, ob Entwicklungsprogramme in vorläuferähnlichen Zellen, die im Innenohr existieren können, wieder aufgenommen werden können13. Ein zweiter Ansatz bestand darin, außerhalb von Säugetieren auf Nicht-Säugetier-Wirbeltiere zu schauen, bei denen eine robuste Regeneration von Gehörhaarzellen stattfindet, wie z.B. Vögel14,15. Bei Vögeln erfolgt die Haarzellregeneration überwiegend durch die Dedifferenzierung einer Stützzelle in einen vorläuferähnlichen Zustand, gefolgt von einer asymmetrischen mitotischen Teilung zur Erzeugung einer Haarzelle und einer Stützzelle16. Darüber hinaus wurde auch eine direkte Differenzierung einer Stützzelle zur Erzeugung einer Haarzelle beobachtet17.
Während die Mechanismen der auditiven Entwicklung von Vögeln signifikante Ähnlichkeiten mit denen von Säugetieren aufweisen, gibt es Unterschiede18. Die HC- und SC-Differenzierung beim Küken-BP ist ab dem embryonalen Tag (E) 7 erkennbar und wird im Laufe der Zeit deutlicher. Durch E12 kann eine gut strukturierte und gut polarisierte Basilarpapille (BP) sichtbar gemacht werden, und durch E17 können gut entwickelte Haarzellen gesehen werden19. Diese Zeitpunkte bieten Fenster in die Mechanismen der Differenzierung, Strukturierung und Polarität sowie in die Reifung der Haarzellen. Es ist wichtig zu verstehen, ob solche Mechanismen konserviert oder divergent sind, da sie Einblicke in die tiefe Homologie der Ursprünge mechanosensorischer Haarzellen geben.
Hier demonstrieren wir eine Reihe von Techniken, die in frühen und späten embryonalen Stadien durchgeführt werden, um zelluläre Prozesse wie Proliferation, Schicksalsspezifikation, Differenzierung, Musterung und Aufrechterhaltung während der gesamten Entwicklung des Innenohrorgans zu untersuchen. Dies ergänzt andere Protokolle zum Verständnis der Innenohrentwicklung in der Explantatkultur20,21,22. Wir diskutieren zunächst die Einführung von exogener DNA oder RNA in BP-Vorläufer innerhalb der E3.5-Otozyste unter Verwendung der In-Ovo-Elektroporation. Obwohl genetische Manipulationen wertvolle Erkenntnisse liefern können, können die so erzeugten Phänotypen pleiotrop und folglich verwirrend sein. Dies gilt insbesondere für die spätere Innenohrentwicklung, wo grundlegende Prozesse wie der Umbau des Zytoskeletts vielfältige Rollen bei der Zellteilung, der Gewebemorphogenese und der zellulären Spezialisierung spielen. Wir präsentieren Protokolle zur pharmakologischen Hemmung in kultivierten Explantaten, die Vorteile bei der Kontrolle von Dosierung und Behandlungszeitpunkt und -dauer bieten und eine präzise raumzeitliche Manipulation von Entwicklungsmechanismen ermöglichen.
Je nach Behandlungsdauer kleiner Inhibitoren können unterschiedliche Organkulturmethoden eingesetzt werden. Hier zeigen wir zwei Methoden der Organkultur, die Einblicke in die epitheliale Morphogenese und zelluläre Spezialisierung ermöglichen. Eine Methode zur 3D-Kultur mit Kollagen als Matrix zur Kultur des Cochlea-Gangs ermöglicht eine robuste Kultivierung und Live-Visualisierung des sich entwickelnden BP. Um die Bildung von Stereozilien zu verstehen, stellen wir eine Membrankulturmethode vor, bei der Epithelgewebe auf einer steifen Matrix kultiviert wird, so dass Aktinvorsprünge frei wachsen können. Beide Methoden ermöglichen die Weiterverarbeitung wie Lebendzellbildgebung, Immunhistochemie, Rasterelektronenmikroskopie (REM), Zellaufzeichnung usw. Diese Techniken bieten eine Roadmap für die effektive Nutzung des Kükens als Modellsystem, um die Entwicklung, Reifung und Regeneration des aviären Gehörepithels zu verstehen und zu manipulieren.
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Protocol
Protokolle, die die Beschaffung, Kultur und Verwendung von befruchteten Hühnereiern und nicht geschlüpften Embryonen beinhalten, wurden von der Institutional Animal Ethics Committee des National Centre for Biological Sciences, Bengaluru, Karnataka, genehmigt.
1. Bei der Elektroporation von Gehörvorläufern von Küken
- sgRNA-Design und Klonierung für CRISPR/Cas9-Gen-Knockout
- Um Gen-Knockouts zu erzeugen, entwerfen Sie RNAs, um die Exon-Regionen des Gens zu stören, vorzugsweise näher am 5'-Ende der kodierenden Region.
- Wählen Sie die potentiellen Guide-RNAs mit einem Web-Tool CRISPOR23 aus. Stellen Sie die Browserdaten auf Gallus gallus und die Protospacer-Nachbarmotivsequenz (PAM) auf 5'- NGG -3' ein. Das Programm bestimmt Guide-RNAs aus der Eingangssequenz und weist unterschiedliche Scores basierend auf On-Target- und Off-Target-Aktivität zu. Wählen Sie die vier besten Leitfäden für weitere Studien aus.
- Für das Design von vorlagenspezifischen Oligos für die Guide-(g)RNA-Produktion entfernen Sie die PAM-Sequenz (5′- NGG -3′) aus der Ausgabe des gRNA-Design-Tools. Diese wird für das Targeting nicht benötigt, enthält aber die Cas9-Spaltungserkennungssequenz. Synthese von zwei HPLC-gereinigten komplementären Oligos mit BsmBI-Restriktionsstelle an beiden Enden für jede potentielle gRNA.
- Klonen Sie die Führungssequenz im Rahmen mit einem tracrRNA-Gerüst eines Vektors Ihrer Wahl (hier wurde pcU6_1sgRNA Vektor verwendet24).
- Die sgRNA-Oligonukleotide werden in einer Konzentration von 100 μM in DNase/RNase-freiem Wasser gelöst. Führen Sie das Glühen der beiden Sensor- und Antisense-Oligoführungen mit einem Thermocycler mit folgenden Parametern durch: 95 °C für 3 min, dann 37 °C für 15 min und dann auf 4 °C abnehmen.
- Unter Verwendung molekularbiologischer Standardtechniken, wie in25 beschrieben, Restriktionsverdauung der geglühten Oligos und pcU6_1sgRNA Klonierungsvektor mit BsmBI-Enzym über Nacht. Setup-Ligation mit dem gelgereinigten linearen BsmBI-verdauten pcU6_1sgRNA-Vektor und den aufgeschlossenen sgRNA-Oligos. Verwandeln Sie sich in eine DH5-alpha-kompetente Zelle und bestätigen Sie die Sequenz des erhaltenen Klons.
- Handhabung und Fensterung von Eiern
- Beschaffen Sie frisch gelegte Eier und reinigen Sie sie, indem Sie sie mit 70% Ethanol abwischen, um eine Kontamination zu vermeiden. Bei 37-38 °C bei 45% Luftfeuchtigkeit 3,5-4 Tage inkubieren.
- Nach der Inkubation legen Sie das Ei für mindestens 5 Minuten auf die Seite, bevor Sie es öffnen. Dies ermöglicht es dem Embryo, sich an die Spitze des Eigelbs zu positionieren. Verwenden Sie eine Pinzette, um kleine Löcher am oberen und stumpfen Ende des Eies zu machen, so dass eine 21G-Nadel hindurchgehen kann.
- Um Schäden während des Fensters zu vermeiden, entfernen Sie Albumin, um den Embryo von der Schale wegzusenken. Verwenden Sie dazu eine 5-ml-Spritze und eine 21G-Nadel, um vorsichtig 2 ml Albumin aus einem Loch am stumpfen Ende des Eies zu ziehen. Verwenden Sie durchsichtiges Klebeband, um das Loch am stumpfen Ende abzudecken.
- Um das Eierfenster zu machen, befestigen Sie durchsichtiges Klebeband an der Oberseite der Eierschale. Schneiden Sie ein etwa 2 cm langes und 1,5 cm breites Fenster mit einer Federbogenschere auf und legen Sie den Embryo frei. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Chorionmembranen über dem Embryo zu öffnen, um den Zugang zum Embryo zu ermöglichen.
- Mikroinjizierende Plasmide
- Für das Gen-Knockout-Experiment bereiten Sie zwei Lösungen vor: die Knock-Down-Mischung mit SpCas9-Protein und Guide-Plasmid-pcU6_1sgRNA und die Tracerplasmidmischung aus T2K-eGFP (dies ist ein Chick-ß-Aktin-Promotor, der die GFP-Kassette antreibt, umgeben von den Transposonstellen von Tol2) zusammen mit der T2TP (die Tol2-Transposase, die in Tol2-Konstrukt26,27 kloniert wurde). Der Tracer wird verwendet, um die Effizienz der Elektroporation zu verfolgen.
- Stellen Sie bei der Elektropolierung mehrerer Plasmide sicher, dass die Endkonzentration der DNA mindestens 4 μg/μL beträgt. Mischen Sie die drei Konstrukte Leitplasmid - pcU6_1sgRNA, T2K-eGFP und T2TP im Verhältnis 1:1:1 mit 1 μg SpCas9-Protein, 30% Saccharose und 0,1% Fast Green-Farbstoff in einem Endvolumen von 10 μL.
- Ziehen Sie Nadeln für die Mikroinjektion aus Standardglaskapillaren (Länge 3 Zoll, OD 1,0 mm) mit einem vertikalen Pipettenzieher. Verwenden Sie feine Pinzetten, um die Kapillarspitze nach dem Ziehen abzubrechen, um einen Spitzendurchmesser von ca. 50 μm mit einem konischen Ende zu erhalten.
- Legen Sie die Embryonen bei E3.5 auf ihre linke Seite mit dem Kopf nach rechts. Auf diese Weise ist nur das richtige otische Vesikel für die Mikroinjektion zugänglich. Mikroinjizieren Sie die Knock-Down-Mischung in das otische Vesikel. Injizieren Sie etwa 200 nL Volumen DNA-Lösungsmischung, um das otische Vesikel zu füllen.
- Bestimmung der Leiteffizienz unter Verwendung eines T7-Endonuklease-Assays28.
- Elektroporation
- Fügen Sie vor der Elektroporation einige Tropfen 0,719% Kochsalzlösung auf den Embryo hinzu, um den elektrischen Widerstand zu senken und eine Überhitzung des Embryos zu verhindern.
- Führen Sie die positive Elektrode durch das Loch, das an der stumpfen Seite des Eies gemacht wurde, als das Albumin entfernt wurde. Manövrieren Sie die Elektrode so, dass sie sich unter dem Eigelb befindet. Legen Sie die negative Elektrode über die gefüllte Otozyste.
- Verwenden Sie die Elektroporation, um Plasmide in die Zellen des Embryos zu transfizieren. Verwenden Sie einen quadratischen Impulsgenerator und wenden Sie fünf Impulse von jeweils 25 V und 100 ms Dauer im Abstand von 50 ms an. Bestimmen Sie die Bedingungen empirisch basierend auf einem individuellen Elektroporationsaufbau.
- Hydratisieren Sie den Embryo nach der Elektroporation, indem Sie einige Tropfen 0,719% Kochsalzlösung hinzufügen. Um denaturiertes Albumin von der Oberfläche der Elektroden zu reinigen, spülen Sie es gründlich mit destilliertem Wasser ab. Verschließen Sie das Ei mit durchsichtigem Klebeband wieder und kehren Sie zur weiteren Inkubation bei 37-38 °C in den befeuchteten Inkubator zurück.
HINWEIS: Embryonen können bis zum Schlüpfen nach der Elektroporation kultiviert werden, es gibt jedoch eine starke Verringerung der Lebensfähigkeit.
2. Basilarpapille Dissektion
- Verwenden Sie 70% Ethanol, um den OP-Tisch, den Mikroskoptisch und die Umgebung zu desinfizieren. Hitze oder Alkohol sterilisieren Mikrodissektionsgeräte, die eine minimale Federbogenschere, eine Mikrokürette und zwei Paar feine Pinzetten enthalten.
- Bereiten Sie die folgenden Präparierplatten vor: eine Glas-Petrischale mit schwarzer Silikonbasis, eine 90-mm-Kunststoff-Petrischale und eine 60-mm-Petrischale. Kühlen Sie entweder phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) für Dissektionen.
- Knacken Sie das Ei vorsichtig in die 90 mm Petrischale. Identifizieren Sie das äußere Ohr des Kükens. Enthaupten Sie den Embryo, indem Sie den Hals mit einer Schere knapp unter die Höhe des Unterkiefers schneiden. Den Kopf in eine 60 mm große Petrischale geben, die mit eiskaltem PBS gefüllt ist.
- Richten Sie den Embryo mit der Spitze des Schnabels zum Experimentator aus und halten Sie den Schnabel mit einer der #5-Pinzetten. Schöpfen Sie die Augen mit der zweiten #5 Pinzette aus. Gehen Sie von rostral zu kaudal, schneiden Sie den Schädel entlang seiner Mittellinie. Schöpfen Sie das Gehirn aus.
- Fügen Sie mehr eiskaltes PBS oder HBSS hinzu und lokalisieren Sie die beiden glänzenden Strukturen in der Nähe der Höhe der Ohrmuschel. Dies sind die Otolithen der Lagena am Ende des Cochlea-Gangs und befinden sich nahe der Mittellinie.
- Schneiden Sie grob zwischen den beiden Lagenas und weit über und unter dieser Region, um zwei Innenohren zu isolieren. Visualisieren Sie unter schräger Beleuchtung die Umrisse des Innenohrs. Entfernen Sie Fremdgewebe und den Vorraum.
- Übertragen Sie die isolierte Cochlea auf eine schwarze Silikongrundplatte mit eiskaltem PBS. Ziehen Sie mit einer Pinzette #5 die knorpelige Cochlea-Kapsel ab, um den Cochlea-Gang zu erhalten. Suchen Sie die wellenförmige Schicht (Tegmentum) des Cochlea-Gangs und entfernen Sie sie mit einer #55-Pinzette, um den BP freizulegen. Entfernen Sie mit einer Zange #55 die tektoriale Membran, um HCs und SCs freizulegen.
3. Kultur von Basilarpapille-Explantaten
- Membrankultur des BP
- Nehmen Sie eine Gewebekulturplatte mit sechs Vertiefungen und ordnen Sie einen Kulturmembraneinsatz pro Vertiefung an.
- Die sezierte Basilarpapille (Explantat) in einer 200 μL Pipette mit 1x HBSS-Puffer auffangen und auf eine Membran übertragen. Um zu verhindern, dass das Gewebe an der Wand der Pipette klebt, ziehen Sie einige Medien auf, bevor Sie das Gewebe absaugen.
- Richten Sie die Explantat so aus, dass die Basilarpapille nach oben zeigt, so dass die Haare und Stützzellen von oben29 sichtbar sind. Sobald die Explantat positioniert ist, saugen Sie den HBSS-Puffer langsam von der Oberfläche der Kulturmembran ab. In diesem Prozess wird sich die Explantat an die Kulturmembran anheften.
- Fügen Sie 1,2 ml des modifizierten Eagle-Medium-Kulturmediums (DMEM) von Dulbecco zwischen dem Membraneinsatz und der Bohrlochwand hinzu, um die Vertiefungen der Sechs-Well-Platte zu füllen. Bis zu sechs Explantate können auf einer einzigen 30 mm Kulturmembran kultiviert werden.
- Kollagenkultur des Cochlea-Gangs
- Bereiten Sie die Kollagenmischung durch Zugabe von 400 μL 3 mg/ml Rattenschwanzkollagen, 50 μL 10x DMEM, 30 μL 7,5% NaHCO3 und 5 μL HEPES in einer Gewebekulturhaube vor.
- Nehmen Sie eine Vier-Well-Platte und fügen Sie drei Tropfen Kollagenmischung in jede Vertiefung hinzu. Übertragen Sie den präparierten Cochlea-Gang auf jeden Kollagentropfen. Inkubieren Sie die Platte für 10 min bei 37 °C, 5%CO2 , um die Kollagenmatrix auszuhärten.
- Kleinmolekulare Behandlung von Kulturen
- Bereiten Sie Kulturmedien (DMEM, N-2-Ergänzung, Penicillin) entweder mit dem pharmakologischen Modulator oder seinem Lösungsmittel allein (zur Verwendung als Kontrolle) vor. Ersetzen Sie das Kulturmedium durch 700 μL Medien, die mit dem Inhibitor ergänzt sind. Kultur der Explantate in einem Inkubator bei 37 °C, 5% CO2.
- Ersetzen Sie jeden Tag 50% der Kulturmedien. Nach angemessener Inkubationszeit werden die Nährmedien entfernt und die Explantate für nachgeschaltete Assays verwendet.
4. Bildgebung und Analyse
- Immunfluoreszenzanalyse
- Nährmedien aus Vertiefungen entfernen und die Explantate zweimal mit 1x HBSS waschen. Mit einer Pipette 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) in die Vertiefung geben und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Entfernen Sie PFA und waschen Sie die Explantate dreimal mit 1x PBS bei Raumtemperatur. Um die Explantate von der Kulturmembran zu sammeln, machen Sie einen kleinen Schnitt um die Membran, die das Stück des Gewebes enthält, mit einer kleinen Federbogenschere und übertragen Sie das Gewebe zusammen mit der Membran mit einer Pinzette auf eine 48-Well-Kulturplatte.
HINWEIS: Wenn das Gewebe nach der Fixierung schwimmt, aspirieren Sie mit einer 200 μL Pipette und übertragen Sie sie zur weiteren Verarbeitung auf 48-Well-Platten. Vermeiden Sie eine gewaltsame Ablösung des Gewebes von der Membran. - Verwenden Sie für die Kollagentröpfchenkultur eine Pinzette, um den gesamten Kollagentropfen auf eine Silikonplatte zu übertragen. Fügen Sie 200 μL 1x PBS hinzu und entfernen Sie Kollagen mit Hilfe einer Pinzette und übertragen Sie dann das Gewebe auf eine 48-Well-Kulturplatte.
- Permeabilisieren Sie die Explantate mit 1 mL 1x PBS ergänzt mit 0,3% Tween-20 (PBST) für 30 min bei Raumtemperatur. Die Explantate mit 200 μL Blockierpuffer (10% Ziegenserum + 1% Rinderserumalbumin in PBST) für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
- Die Explantate mit 200 μL primärer Antikörperlösung (1:300, im Blockierpuffer) über Nacht bei 4 °C inkubieren. Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie die Explantate gründlich 5 x 20 min mit PBST.
- Die Explantate mit 200 μL Phalloidin und sekundärer Antikörperlösung (im Blockierpuffer) für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Entfernen Sie das Phalloidin und die sekundäre Antikörperlösung und waschen Sie die Explantate gründlich 5 x 20 min mit PBST.
HINWEIS: Die sekundäre Antikörperkonzentration und die Waschlänge müssen für jede einzelne bildgebende Anwendung bestimmt werden. Für die Bildgebung mit hochauflösender Mikroskopie erhöhen wir typischerweise die Konzentration des sekundären Antikörpers von 1:500 auf 1:200 und erhöhen die Konzentration von Phalloidin von 1:400 auf 1:200. - Inkubieren Sie die Explantate mit einer Lösung von DAPI (1:1000 in PBST) für 15 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie die Explantate 3 x 5 min mit PBST.
- Verwenden Sie die Montagemedien, um Explantate auf einem Objektträger mit BP nach oben (gegen das Deckglas) zu montieren. Für konfokale Bildgebung verwenden Sie Antifade-Montagemedien. Lassen Sie die Montagemedien über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln trocknen. Bilder Sie entweder direkt oder lagern Sie die Dias bis zur Bildgebung bei 4 °C.
- OTOTO-Fixierung für die REM-Analyse
- Bereiten Sie alle Lösungen frisch vor und handhaben Sie sie gemäß den lokalen Sicherheitsrichtlinien. Membrankultivierte Explantate (aus Schritt 4.1.4) in 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer (pH 7,3) mit 3 mM CaCl2 fixieren. Die Fixierung bei 4 °C für 24 bis 72 h mit einem Wechsel des Fixiermittels alle 24 h durchführen.
- Entfernen Sie das Fixiermittel und waschen Sie das Gewebe mit 0,1 M Natriumcacodylat 3 x 5 min bei Raumtemperatur. Sekundäre Lösung mit 1% OsO4 (verdünnt aus einem 4%OsO4-Bestand unter Verwendung von 0,1 M Natriumcacodylatpuffer) für 1 h bei Raumtemperatur. Führen Sie diese und die nachfolgenden Schritte bis zur Dehydrierung in einem Abzug durch.
- Mit 0,1 M Natriumcacodylatpuffer 3 x 5 min bei Raumtemperatur abspülen. Anschließend in doppelt destilliertem oder Reinstwasser 3 x 5 min bei Raumtemperatur abspülen.
- Bereiten Sie eine 0,5% ige Lösung von Thiocarbohydrazid (TCH) in Reinstwasser vor. Bei 75 °C 10 min umrühren und die Lösung filtrieren, wenn sie auf Raumtemperatur abgekühlt ist.
HINWEIS: TCH ist extrem gefährlich. Die Verwendung muss vom örtlichen Sicherheitsausschuss genehmigt werden, und bei der Handhabung ist Vorsicht geboten. - Entfernen Sie Reinstwasser aus der Probe und fügen Sie 0,5% TCH Tropfen für Tropfen hinzu. Wenn die Lösung braun wird, stoppen und spülen Sie die Probe mit Reinstwasser, bevor Sie vorsichtig die 0,5% ige TCH-Lösung hinzufügen. Sobald die Lösung klar ist, ersetzen Sie sie durch 0,5% TCH. Bei Raumtemperatur 20 min30,31 inkubieren.
- Spülen Sie die Probe mit Reinstwasser 3 x 5 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.2, 4.2.3 und 4.2.5 noch zwei weitere Male und enden Sie mit einer OsO 4-Inkubation und anschließendem Spülen.
- Dehydrieren Sie die Proben in einer Ethanolserie zu 100% wasserfreiem Ethanol (EtOH). Inkubieren Sie zuerst in 25% ETOH für 10 min, dann 50% ETOH für 10 min, 75% EtOH für 10 min, 95% ETOH für 10 min, bevor sie insgesamt 3x für jeweils 10 min in 100% ETOH inkubieren.
- Führen Sie eine kritische Punkttrocknung mit flüssigemCO2 durch. Montieren Sie die Proben sofort auf einem REM-Stummel mit doppelseitigem Kohleklebeband. Fahren Sie mit der Sputterschicht fort, um 5-10 nm Beschichtung bereitzustellen. Wenn Sie nicht sofort bildgeben, lagern Sie die Proben in einem Exsikkator unter Vakuum.
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Representative Results
Im Elektroporationsaufbau kann die Elektrodenpositionierung eine Rolle im Bereich der Transfektion spielen. Die positive Elektrode wird unter das Eigelb und die negative über dem Embryo platziert (Abbildung 1A). Dies führt zu einer höheren GFP-Expression in einem Großteil des Innenohrs und beider vestibulären Organe (Abbildung 1B) und der auditorischen Basilarpapille (Abbildung 1C,D), was die Transfektion bestätigt.
Bei der Beurteilung des Phänotyps von CRISPR-Knockdowns haben wir Leit-RNAs zum Haarzell-Transkriptionsfaktor Atonal homolog 1 (Atoh1) entwickelt. Mausmutanten von Atoh1 sind nicht in der Lage, Haarzellen zu bilden32; Nach der Elektroporation von Atoh1-Guide-RNAs und der Inkubation bis E10 stellen wir fest, dass die HC-Entwicklung im Vergleich zur kontrollierten, leeren Plasmidkontrolle beeinträchtigt ist (Abbildung 2). Obwohl die Elektroporation ein Mosaik ist (Abbildung 2E,F), sind elektropolierte Kontrollzellen in der Lage, Haarzellen zu bilden. In elektropolierten Atoh1-gRNA-Proben zeigen GFP-positive Zellen niemals die Marker der HC-Entwicklung (Abbildung 2B).
Organkultur des BP bietet Zugang zum Gewebe. Kulturen in einer 3D-Matrix, wie Kollagen, bieten eine hervorragende Erhaltung der Gewebemorphologie für bis zu 5 Tage. Die Organisation von HC und SC wird unter diesen Kulturbedingungen aufrechterhalten (Abbildung 3).
Organkulturen auf einer Membran sind für die Bildgebung von Stereozilien vorzuziehen. Solche Kulturen können bis zu 5 Tage kultiviert werden, während die Integrität des Haarbündels erhalten bleibt. Dies zeigt sich an der Lokalisation des Tip-Link-Proteins Protocadherin 1533 (Pcdh15) (Abbildung 4). Um die Entwicklung des Haarbündels abzufragen, ist eine höher aufgelöste Bildgebung erforderlich, und solche Ansätze, die entweder hochauflösende Mikroskopie (Abbildung 4D) oder Rasterelektronenmikroskopie (Abbildung 4E) verwenden, liefern vollständigere Informationen.
Abbildung 1. Die GFP-Expression ist bei E10 nach der Inovo-Elektroporation bei E4 sichtbar. (A) Schematische Darstellung der Ovo-Mikroinjektion und Elektroporation in kükenotischen Vesikeln bei E4. Die Injektionspipette ist mit Tol2-eGFP (T2K-eGFP) und Tol2-Transposasen (T2TP) Plasmiden gefüllt, zusammen mit schnellem grünen Farbstoff zur Visualisierung. (B) Aufnahme des elektropolierten Innenohrs bei E10 mit einem 0,63-fachen Luftobjektiv auf einem Stereomikroskop. Das linke Innenohr ist die innere Kontrolle. Der rote Pfeil markiert die GFP-Expression im Cochlea-Gang des rechten Innenohrs, und das rote Sternchen zeigt die GFP-Expression in vestibulären Organen; Maßstabsbalken ist 2 cm. (C) Weitfeld-Fluoreszenzaufnahme eines Querschnitts des rechten Cochlea-Kanals mit einem 20-fachen Luftobjektiv von 0,5 NA. Die GFP-Expression ist meist auf das sensorische Epithel beschränkt; Der Maßstabsbalken beträgt 10 μm. (D) Konfokales Bild der gesamten Basilarpapille, aufgenommen mit einem 10-fachen Luftobjektiv von 0,5 NA, gefärbt mit Phalloidin, konjugiert mit Alexa 647 Fluorophor. Die GFP-Expression wird vom proximalen bis zum distalen Ende auf der neuronalen Seite des BP beobachtet; Der Maßstabsbalken beträgt 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2. CRISPR / Cas9-vermittelter Atoh1-Gen-Knockout durch Ovo-Elektroporation führt zum Verlust von Haarzellen (HCs). Das Atoh1-Genleitplasmid pcU6_1-Atoh1sgRNA und die Tracerplasmide Tol2-eGFP (T2K-eGFP) und Tol2-Transposasen (T2TP) mit SpCas9-Protein werden mikroinjiziert und in kükenotischen Vesikeln bei E4 elektropoliert. Alle Bilder stammen von einer Küken-E10-Basilarpapille mit einem 10-μm-Maßstabsbalken, die mit einem 60-fachen Ölimmersionsobjektiv von 1,42 NA mit einem konfokalen Lasermikroskop aufgenommen wurde. Für alle Bilder stehen vergrößerte Einschübe zur Verfügung. (A, B, C, D) Das linke Feld enthält BP mit Haarzellen (HCs), elektropoliert mit leerem pcU6_1sgRNA und T2K-eGFP und T2TP mit SpCas9-Protein. (E,F,G,H) Das rechte Seitenteil enthält BP mit HC-Verlust, elektropoliert mit Atoh1-Führung (pcU6_1-Atoh1sgRNA) und T2K-eGFP und T2TP mit SpCas9-Protein. (A,E) Verschmolzenes Bild mit Haarzellen (HCs) in der Basilarpapille. Diese sind immunreaktiv für Myosin 7a (blau); F-Aktin gefärbt mit Phalloidin konjugiert mit Alexa 647 (rot); Die GFP-Expression aus Tol2-eGFP-Plasmiden wird mit einem Anti-GFP-Antikörper nachgewiesen (grün). Der Verlust von HCs zeigt sich an der Immunreaktivität von Myosin 7a, wenn Behandlungen mit leerem pcU6_1sgRNA (D) und pcU6_1-Atoh1sgRNA (H) verglichen werden. Die F-Aktin-Bildgebung beider Behandlungen hebt das Haarbündel des HC (B,F) hervor. (C,G) T2K-eGFP und T2TP werden verwendet, um den Ort und die Effizienz der Transfektion zu messen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3. Die Organkultur des Cochlea-Gangs in 3D-Kollagen-Tröpfchenkultur erhält die Organisation des sensorischen Epithels aufrecht. Der BP bei E10 wird 1 Tag lang in einer 3D-Kollagentröpfchenkultur kultiviert und mit einem 60-fachen Ölimmersionsobjektiv von 1,42 NA mit einem konfokalen Lasermikroskop abgebildet. (A) Bild des gesamten BP von E10, kultiviert für 1 Tag in einem Kollagentröpfchen und angefärbt mit Antikörpern gegen Haarzellantigen (HCA)34. Der Maßstabsbalken beträgt 100 μm. (B) Zusammengeführtes Bild, das die erhaltene Organisation des sensorischen Epithels von der distalen Seite des BP zeigt, gefärbt mit (C) Phalloidin (grün) und (D) HCA (blau); Der Maßstabsbalken beträgt 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Stereoziliäre Bündel der Basilarpapille unter Elektronen- und Lichtmikroskop. 0,1% Dimethylsulphoxid (DMSO)-behandelte BP wurden bei E10 explantiert und 3 Tage lang in vitro (DIV) auf Membrankultureinsätzen kultiviert. (A) Explant wird mit einem 60-fachen Ölimmersionsobjektiv von 1,42 NA mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop abgebildet. Das zusammengeführte Bild zeigt die Expression des Protocadherins 15 (Pcdh15) und der Stereozilien, die durch Phalloidin markiert sind, konjugiert mit Alexa 488 (grün). Einkanalbilder von F-Aktin ( B ) und Pcdh15 (C) werden gezeigt. Der Maßstabsbalken beträgt 10 μm. (D) Hochauflösendes Bild von Stereozilien, die mit Phalloidin konjugiert mit Alexa 488-Färbung in Grün gefärbt sind. Das Bild wurde mit einem 63-fachen Ölimmersionsobjektiv von 1,42 NA im Airyscan-Modus des konfokalen Laserscanning-Mikroskops aufgenommen. Der Maßstabsbalken beträgt 5 μm. (E) Das REM-Bild wurde mit 16340-facher Vergrößerung unter Verwendung einer 7-kV-Elektronenhochspannungsspannung (EHT ) aufgenommen. Rotes Sternchen markiert Kinocilia und roter Keil markiert Stereozilien. Helligkeit und Kontrast wurden auf Auto eingestellt und das Bild mit FIJI geschärft. Der Maßstabsbalken beträgt 1 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Das Küken ist eine kostengünstige und bequeme Ergänzung zu den Modellorganismen, mit denen ein Labor das Innenohr erforschen kann. Die hier beschriebenen Methoden werden routinemäßig in unserem Labor eingesetzt und ergänzen die laufende Forschung im Innenohr von Säugetieren. In der Ovo wird Elektroporation verwendet, um genetische Manipulationen in das Kükengenom einzuführen. Die Elektroporation kann auch verwendet werden, um Konstrukte einzuführen, die fluoreszierende Proteine kodieren, die auf bestimmte Organellen oder subzelluläre Strukturen abzielen35,36. Während dies ein einfaches Verfahren ist, wirkt sich die Manipulation von Embryonen im Ovo auf die Lebensfähigkeit aus. Für eine effiziente Elektroporation sollten die Eier frisch (kurz nach dem Legen) beschafft werden. Ein Anstieg der Mortalität und/oder eine abnormale Entwicklung wird häufig bei Eiern beobachtet, die länger als 5 Tage gelagert wurden. Die Verwendung steriler Techniken, die sicherstellen, dass das Ei ordnungsgemäß versiegelt ist, damit es keine Feuchtigkeit verliert, und die Minimierung der am Embryo durchgeführten Manipulationen verbessern die Lebensfähigkeit.
Wir fanden heraus, dass das Targeting der Otozyste bei E3,5 bis E4 das Trauma reduziert, mit dem der Embryo konfrontiert ist, und die Verwendung sorgfältig positionierter Elektroden ermöglicht ein gutes Targeting der sensorischen Vorläufer des BP. Zu diesem Zeitpunkt sind die Vorläufer des akustisch-vestibulären Ganglions jedoch bereits vom Innenohr weggewandert37,38. Um diese Zellen anzusprechen, müssen frühere Zeitpunkte für die Otozystenelektroporation ausgewählt und Anpassungen für die entsprechende Abnahme der Lebensfähigkeit vorgenommen werden. Ein weiterer Hinweis zur Vorsicht ist die Möglichkeit von Mosaikismus in elektropolierten Embryonen. Nicht alle Zellen nehmen das gesamte Plasmid auf, und daher kann Mosaizismus die Interpretation verwirren. Die Verwendung von Tracerplasmiden hilft bei der Dateninterpretation und bietet eine gewisse Kontrolle über mögliche Mosaikeffekte. Die Verwendung mehrerer Wiederholungen, sorgfältiger Analysen und statistischer Methoden hilft bei der Beurteilung von Mosaikphänotypen. Ein alternativer Ansatz ist die Verwendung genetisch veränderter Wachteln39. Derzeit sind diese Zahlen begrenzt und stehen nicht immer vielen Laboren zur Verfügung. Die Verfügbarkeit wird jedoch zunehmen, und Wachtelembryonen, die subzellulär gezielt fluoreszierende Proteine exprimieren, sind ein attraktives Angebot für bildgebende Experimente.
Bei dieser Methode elektropolieren wir Protein und DNA für CRISPR-vermittelte Knockdowns durch nicht-homologe Endverbindungen (NHEJ)24. Die CRISPR/Cas9-vermittelte Erzeugung von Fusionskonstrukten durch homologiegesteuerte Reparatur (HDR) bleibt in diesem speziellen Paradigma ineffizient (Singh et al., unveröffentlichte Beobachtungen). Die Elektroporationsmethode kann für die Verwendung mit anderen Arten von DNA-Konstrukten (dies könnten Konstrukte sein, die Fusionsproteine kodieren) sowie für RNA und Protein angepasst werden. Es sollte beachtet werden, dass während der Entwicklung (und Zellteilung) DNA-basierte Expressionskonstrukte verdünnt werden, es sei denn, der Vektor enthält Stellen, die die Insertion der exogenen DNA in das Genom dieser Zellen vermitteln (z. B. Tol2 oder PiggyBac). Dies ermöglicht einen stabileren Ausdruck des Konstrukts.
Nach der Elektroporation werden die Embryonen in der Regel im Ovo bis zum E10-Stadium für Haarzelldifferenzierungs- und Entwicklungsstudien kultiviert. Aber wenn nötig, kann in ovo Kultur fortgesetzt werden, bis die Eier schlüpfen; Mit zunehmender Inkubationsdauer sinkt jedoch die Lebensfähigkeit. Um dies zu umgehen, kann die Elektroporation im Ovo mit BP-Dissektionen kombiniert werden, gefolgt von einer langfristigen Ex-Ovo-Kultur . Die Kultivierung von Explantaten innerhalb einer 3D-Matrix ermöglicht eine gute Erhaltung der Gewebemorphologie. Diese Methode kann verwendet werden, um Veränderungen der Gewebestrukturierung, Polarität und Differenzierung zu untersuchen. Die Kultur des BP auf einer Membran ermöglicht die Visualisierung der apikalen Seite des Gewebes27, insbesondere eine hochauflösende Bildgebung der Stereozilien.
In einigen Fällen können die Einschränkungen der genetischen Veränderung durch den Einsatz verschiedener niedermolekularer Behandlungen überwunden werden. Die pharmakologisch aktiven Verbindungen wirken als Inhibitoren oder Agonisten für Signalwege oder zellbiologische Prozesse. Ihre Anwendung ist besonders nützlich, um die zeitliche Anforderung zu sezieren. Genaue Verabreichungsmodi und optimale Konzentrationen müssen jedoch empirisch bestimmt werden, da in einigen Fällen die Standardisierung in Zelllinien nicht mit der in Geweben erforderlichen Dosierung vergleichbar ist. Die Geburt innerhalb des Embryos kann problematisch sein, und die benötigte Menge in Kombination mit den Auswirkungen auf andere Organsysteme kann die Lebensfähigkeit erheblich beeinträchtigen. Eine fertige Alternative sind die Organkulturmethoden20,21,22. Die genaue Kulturmethode hängt jedoch von der Art der beabsichtigten Studien und Analysen ab. Während die Kollagenkultur die Gewebemorphologie des BP bewahrt, eignet sich die Membrankultur besser zur Untersuchung der apikalen Haarbündel des HC. Das Gewebe kann einfach auf die Membran gelegt werden, um die apikale Oberfläche mittels Rasterelektronenmikroskopie oder hochauflösender Mikroskopie sichtbar zu machen. Dissektionen für die Organkultur erfordern eine gute Praxis. Dazu gehören die Aufrechterhaltung eines sterilen Arbeitsplatzes und die Verwendung geschärfter Instrumente. Solche Mikrodissektionswerkzeuge sind empfindlich, und wir finden die Verwendung von Silikonschalen wichtig, um die Integrität mikrochirurgischer Instrumente zu erhalten.
Zusammen stellen die Techniken wertvolle Ansätze dar, um das Verständnis der Innenohrentwicklung zu fördern. Die Erkenntnisse in vergleichender Biologie und Regeneration, die die Hühnerembryonen bieten, können wichtige Einblicke in die Entwicklung und Funktion von Haarzellen liefern.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken Ihnen für die Unterstützung von NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB und dem Royal National Institute for the Deaf. Wir möchten uns bei der Central Poultry Development Organization and Training Institute, Hesaraghatta, Bengaluru, bedanken. Wir danken dem CIFF und der EM-Einrichtung und der Laborunterstützung bei NCBS. Wir danken Yoshiko Takahashi und Koichi Kawakami für die Tol2-eGFP- und T2TP-Konstrukte und Guy Richardson für HCA und G19 Pcdh15-Antikörper. Wir danken den Earlab-Mitgliedern für ihre ständige Unterstützung und ihr wertvolles Feedback zum Protokoll.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 | Integrated DNA Technologies | 1081061 | High fidelity Cas9 protein |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Thermo Fisher Scientific | Q12135 | |
| Collagen I, rat tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | |
| Critical Point Dryer Leica EM CPD300 | Leica | ||
| CUY-21 Electroporator | Nepagene | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DM5000B Widefield Microscope | Leica | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Fluoroshield | Sigma-Aldrich | F6182 | |
| FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Glutaraldehyde (25 %) | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Goat Serum Sterile filtered | HiMedia | RM10701 | Heat inactivated |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| LSM980 Airyscan Microscope | Zeiss | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Sigma-Aldrich | PICM03050 | |
| MVX10 Stereo Microscope | Olympus | ||
| MYO7A antibody | DSHB | 138-1 | Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa |
| MZ16 Dissecting microscope | Leica | ||
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Noyes Scissors, 14cm (5.5'') | World Precision Instruments | 501237 | |
| Osmium tetroxide (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PC-10 Puller | Narishige | ||
| pcU6_1sgRNA | Addgene | 92395 | Mini vector with modified chicken U6 promoter |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
| SMZ1500 Dissecting microscope | Nikon | ||
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M | Electron Microscopy Sciences | 11652 | |
| Sodium chloride | HiMedia | GRM853 | |
| Sputtre Coater K550X | Emitech | ||
| Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament | World Precision Instruments | 1B100-3 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| The MERLIN Compact VP | Zeiss | ||
| Thiocarbohydrazide | Alfa Aesar | L01205 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 |
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