Fremstilling av cytoplasmatiske og nukleære lange RNA fra primære og dyrkede celler

Summary

Den nåværende protokollen tilbyr en effektiv og fleksibel metode for å isolere RNA fra nukleære og cytoplasmatiske fraksjoner ved bruk av dyrkede celler, og deretter validere ved hjelp av qPCR. Dette fungerer effektivt som en erstatning for andre RNA-forberedelsessett.

Abstract

Separasjonen av intracellulære komponenter har vært et sentralt verktøy i cellebiologi i mange år nå, og har vært i stand til å gi nyttig innsikt i hvordan deres plassering kan påvirke deres funksjon. Spesielt har separasjonen av nukleært og cytoplasmatisk RNA blitt viktig i sammenheng med kreftceller og søken etter å finne nye mål for medisiner. Innkjøpssett for kjernefysisk-cytoplasmatisk RNA-ekstraksjon kan være kostbart når mange av de nødvendige materialene finnes i en typisk laboratorieinnstilling. Ved å bruke den nåværende metoden, som kan erstatte dyrere sett eller andre tidkrevende prosesser, er det bare nødvendig med en hjemmelaget lysisbuffer, en stasjonær sentrifuge og RNA-isolasjonsrensingskolonner for å isolere nukleært og cytoplasmatisk RNA. Lysisbuffer brukes til å forsiktig lyse cellens ytre membran uten å påvirke integriteten til den nukleære konvolutten, noe som gjør det mulig å frigjøre sine intracellulære komponenter. Deretter kan kjernene isoleres ved et enkelt sentrifugeringstrinn siden de har en høyere tetthet enn lysisløsningen. Sentrifugering benyttes til å skille disse områdene basert på deres tetthetsforskjeller for å isolere subcellulære elementer i kjernen fra de i cytoplasma. Når sentrifugeringen har isolert de forskjellige komponentene, brukes et RNA-oppryddingssett for å rense RNA-innholdet, og qPCR utføres for å validere separasjonskvaliteten, kvantifisert av mengden nukleært og cytoplasmatisk RNA i de forskjellige fraksjonene. Statistisk signifikante nivåer av separasjon ble oppnådd, noe som illustrerer protokollens effektivitet. I tillegg kan dette systemet tilpasses for isolering av forskjellige typer RNA (totalt, lite RNA, etc.), noe som muliggjør målrettet studie av cytoplasma-kjerneinteraksjoner, og hjelpemidler til å forstå forskjellene i funksjonen til RNA som ligger i kjernen og cytoplasma.

Introduction

Cellulær fraksjonering i subcellulære komponenter muliggjør isolering og studier av definerte biokjemiske domener og hjelpemidler for å bestemme lokaliseringen av spesifikke cellulære prosesser og hvordan dette kan påvirke deres funksjon¹. Isolering av RNA fra forskjellige intracellulære steder kan muliggjøre forbedret nøyaktighet av genetisk og biokjemisk analyse av transkripsjonsnivåhendelser og andre interaksjoner mellom kjernen og cytoplasma, som tjener som hovedformålet med gjeldende protokoll². Denne protokollen ble utviklet for å sikre isolering av cytoplasmatiske og nukleære RNA for å bestemme deres respektive roller i kjernefysisk eksport og for å forstå hvordan subcellulær lokalisering av RNA i kjernen og cytoplasma kan påvirke deres funksjon i cellulære prosesser. Ved å bruke materialer fra en typisk laboratorieinnstilling var det mulig å oppnå nukleær og cytoplasmatisk fraksjonering mer effektivt og billigere enn tidligere etablerte protokoller uten å sette kvaliteten på resultatene i fare³.

I tillegg kan utvekslingen av molekyler mellom cytoplasma og kjernen studeres direkte ved å separere disse områdene. Mer spesifikt er forståelse av transkriptomet avgjørende for å forstå utvikling og sykdom. Imidlertid kan RNA være på forskjellige modningsnivåer til enhver tid og kan komplisere nedstrøms analyse. Denne protokollen tillater muligheten til å isolere RNA fra nukleære og cytoplasmatiske subcellulære fraksjoner, noe som kan hjelpe til med studier av RNA og muliggjøre en bedre forståelse av et bestemt RNA av interesse, for eksempel lokalisering av ikke-kodende RNA eller analyse av spleisekryss i kjernen.

Denne protokollen er optimalisert for å isolere cytoplasmatiske og nukleære lange RNAer, inkludert mRNAer, rRNA og lange ikke-kodende RNA (lncRNAer), på grunn av størrelsesselektiviteten til RNA-rensingskolonnen som brukes, som kan modifiseres for å isolere andre RNA av interesse. Tidligere var funksjonen til lange RNAer, som mRNA og lncRNA, sterkt avhengig av deres respektive lokalisering i cellen ^4,5. Derfor har studiet av eksporten fra kjernen til subcellulære domener blitt mer målrettet mot å forstå hvilken rolle eksport av RNA eller andre cellulære komponenter kan ha på cellen. lncRNA tjener som et godt eksempel på dette, da deres oversettelse og påfølgende effekter i stor grad er avhengige av nærhet og interaksjoner med andre former for RNA⁶. Videre er utveksling av cellulære elementer mellom nukleære og cytoplasmatiske regioner knyttet til resistensmekanismer mot ulike kreftbehandlinger⁷. Isoleringen av intracellulære rom har gjort det mulig å utvikle kjernefysiske eksporthemmere, noe som har redusert effekten av resistensmekanismer mot forskjellige terapier⁸.

Etter separering av nukleært og cytoplasmatisk RNA utføres trinn for å rense RNA av interesse. Siden RNA-rensesett ofte finnes i laboratorier og fungerer for å rense og isolere lange RNA, tjener de formålet med denne protokollen godt. For RNA-rensing er generering av 260: 280-forhold større enn 1,8 avgjørende for å sikre kvaliteten på prøver for RNA-sekvensering eller andre lignende prosedyrer som krever høye nivåer av renhet og isolasjon. Uregelmessige 260:280-verdier indikerer fenolforurensning, noe som viser dårlig isolasjon og gir unøyaktige resultater⁹.

Når RNA-rensingen er fullført og 260:280-verdiene er bekreftet å være over et akseptabelt område, ble qPCR brukt til å validere isolasjonsresultatene av nukleære og cytoplasmatiske fraksjoner. Ved å gjøre dette ble primere som var spesifikke for interesseområdet brukt til å demonstrere nukleære og cytoplasmatiske fraksjoneringsnivåer. I denne protokollen ble MALAT1 og TUG1 brukt som henholdsvis nukleære og cytoplasmatiske markører¹⁰. Sammen tillater de demonstrasjon av høye nivåer av nukleær fraksjonering med MALAT1, mens cytoplasmatisk fraksjonering forventes å være lav. Omvendt, når TUG1 brukes, forventes cytoplasmatiske fraksjoneringsnivåer å være høyere enn nukleære fraksjoneringsnivåer.

Ved hjelp av denne protokollen var det mulig å isolere RNA basert på deres virkningsposisjon i cellen. På grunn av utbredt tilgang til mange materialer og utnyttelse av bare lysisbuffer og tetthetsbaserte sentrifugeringsteknikker under dette eksperimentet, er anvendelighet for andre RNA-typer og andre cellulære komponenter utbredt. Dette kan gi viktig informasjon ved å belyse stedsspesifikke uttrykkshendelser som ellers ikke ville kunne skilles uten separasjon.

Protocol

K562-celler brukes til denne studien. Denne protokollen er optimalisert for å fungere for 1 x 10 6-5 x 10⁶ millioner celler. Prosedyren kan imidlertid skaleres opp for større cellemengder ved å øke volumene på riktig måte.

1. Klargjøring av 0,25x lysebuffer

1. Klargjør 0,25x lysebuffer ved å blande følgende komponenter i tabell 1A.
   MERK: Prøver krever ca. 300 μL 0,25x lysebuffer. Anbefalt volum = antall prøver x 300 μL.

2. Separasjon av nukleære og cytoplasmatiske fraksjoner

1. Pellet cellene ved hjelp av 1,5 ml rør via sentrifugering i 5 minutter ved 2000 x g (romtemperatur). Kast supernatanten ved hjelp av en aspirasjonspipette.
   MERK: K562-celler ble brukt under denne protokollen. Protokollen kan imidlertid tilpasses forskjellige cellelinjer.
2. Resuspender pelleten i 300 μL iskald 0,25x lysisbuffer.
   MERK: Hold på is i 2 min og roter røret hver 45. s for å sikre riktig lysering av cellene.
3. Spinn rørene med høyeste hastighet (12 000 x g) ved 4 °C i 2 minutter.
4. Etter sentrifugering, fjern forsiktig supernatanten og legg den i et nytt 1,5 ml rør. Dette vil være den cytoplasmatiske fraksjonen. Omtrent 300 μL av den cytoplasmatiske fraksjonen vil bli oppnådd.
5. Den gjenværende pelleten vil være kjernefraksjonen. Tilsett 500 μL iskald PBS til pelleten og sentrifuge ved 2000 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
   MERK: I løpet av dette trinnet blir overflødig DNA fjernet.

3. RNA-opprydding ved hjelp av et RNA-rensesett

MERK: Denne protokollen ble oppnådd ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig RNA-rensesett (se materialfortegnelse).

1. Separat cytoplasmatiske RNA-prøver og nukleære cytoplasmatiske prøver (da fraksjoneringstrinnene varierer mellom dem).
   1. For å separere cytoplasmatisk fraksjon, tilsett 1,050 μL av 3,5x RLT lysisbuffer (se materialtabell) og vortex kort. Deretter tilsettes 750 μL 90% etanol og legger det på kolonnen fra RNA-oppryddingssettet.
      MERK: Oppløsningen må blandes godt før den legges på kolonnen.
   2. For å skille kjernefraksjonen, tilsett 600 μL 3, 5x lysisbuffer og hvirvel. Deretter tilsettes 600 μL 70% etanol.
2. Last både cytoplasmatiske og nukleære fraksjoner på RNA-kolonner (se materialtabell).
   MERK: For resten av trinn 3 følger både cytoplasmatiske og nukleære prøver samme prosedyre. Sørg imidlertid for at disse prøvene forblir uavhengige av hverandre.
   1. Last både cytoplasmatiske og nukleære fraksjoner på RNA-kolonner og spinn i 30 s ved 8000 x g ved romtemperatur. Kast overflødig gjennomstrømning.
   2. Tilsett 350 μL vaskebuffer fra et kommersielt tilgjengelig rensesett (RW1-buffer, se materialfortegnelse), spinn igjen og kast gjennomstrømningen.
   3. Tilsett DNAse oppløsning (1U/uL) i 15 minutter ved romtemperatur. Tilsett deretter 350 μL vaskebuffer, spinn igjen og kast strømmen gjennom.
   4. Tilsett 500 μL mild vaskebuffer (RPE, se materialfortegnelse), snurr igjen og kast gjennomstrømningen. Tilsett 500 μL mild vaskebuffer, snurr igjen, men bare i 2 minutter.
   5. Flytt kolonnen til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør og tilsett 30 μL vann til sentrifugeringskolonnen. La kolonnen sitte i 1 min før du spinner ned.

4. Validering av kjernefysisk-cytoplasmatisk separasjon

1. Utfør cDNA-syntese
   1. Når subcellulære rom av RNA er ekstrahert og renset, bekreft separasjonen av rommene ved hjelp av qPCR. For å gjøre dette, konverter først RNA til cDNA ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig sett i henhold til produsentens instruksjoner (se Materialfortegnelse).
   2. Forbered revers transkriptase mastermix. Legg til mal-RNA. Inkubere reaksjoner i en termosyklist.
      MERK: For tilfeldige hexamere er syklusparametrene som brukes gitt i tabell 2A. Bruk revers transkriptasereaksjonen umiddelbart eller oppbevar ved -20 °C (tabell 1B).
2. Utfør den kvantitative polymerasekjedereaksjonen (qPCR) og analysen.
   1. Fortynn cDNA-syntesen med DEPC-vann (se materialtabell) for å få en endelig konsentrasjon på 20 ng / ml.
   2. Bruk en PCR-masterblanding til å forberede reaksjonen for hver prøve ved hjelp av manuelle instruksjoner som listet opp nedenfor.
   3. Skaff kommersielle sonder som er nødvendige for å oppdage cytoplasmatisk og nukleær fraksjonering. Bruk MALAT1 som nukleær markør og TUG1 som cytoplasmatisk markør (se materialtabell).
      MERK: Sekvenser for MALAT1 og TUG1 er gitt i tabell 3.
   4. Beregn hver komponents volum ved å multiplisere hver komponent med 3 for hver av de tekniske replikatene for den enkelte prøve.
   5. For hver nukleær og cytoplasmatisk prøve, oppnå følgende blandinger for hver: (a) Nukleær fraksjon med MALAT1, (b) Cytoplasmatisk fraksjon med MALAT1, (c) Nukleær fraksjon med TUG1, og (d) Cytoplasmatisk fraksjon med TUG1 (tabell 1C).
   6. Vortex kort for å blande løsninger og overføre 20 μL av blandingen til hver brønn i en optisk reaksjonsplate (se materialfortegnelse).
   7. Dekk platen med en klar selvklebende film som brukes til qPCR (se materialfortegnelse) og sentrifuger platen kort for å eliminere luftbobler, og spinn deretter prøven ned ved 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
   8. Ved hjelp av design- og analyseprogramvare (se Materialfortegnelse) velger du standardkurven for syklingsparametrene (tabell 2B).
   9. Bruk qPCR-programvaren til å velge Oppsettkjøring (tilleggsfigur 1).
   10. På siden Egenskaper for datafil velger du Parametere for metode og inndatasyklus fra tabell 2B (tilleggsfigur 2).
   11. Når du har angitt syklusparametere, velger du kategorien Plate og skriver inn prøvene som skal kjøres (tilleggsfigur 3). Velg Start kjøring.
       MERK: De beskrevne trinnene ble utført i en qPCR-maskin ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig mastermiks (se materialfortegnelse).
3. Utføre dataanalyse
   1. Når kjøringen er fullført, oppretter du et dataregneark med eksempelnavnet, målnavnet og kvantifiseringssyklusen (Cq) (tilleggstabell 1).
   2. Begynn med MALAT1-prøvene for å beregne kjernefraksjonen. Trekk MALAT1 cytoplasmatisk fraksjon fra MALAT1 nukleær fraksjon (tabell 4).
   3. Deretter beregner du ΔCq (2^(-verdi)) (tabell 5).
   4. Fortsett med MALAT1-prøvene for å beregne cytoplasmafraksjonen, trekk MALAT1 nukleær fraksjon fra MALAT1 cytoplasmatisk fraksjon, og beregn deretter ΔCq (2^(-verdi)) (tabell 6).
      MERK: Når man ser på ΔCq, observeres det at den nukleære MALAT1-fraksjonen (grønn utheving) har en større MALAT1-markør enn cytoplasma (rød utheving), men nå er det nødvendig med bekreftelse for å sikre at cytoplasmatisk fraksjon hovedsakelig er cytoplasma og at nukleær fraksjon ikke inneholder cytoplasmatisk forurensning.
   5. Med TUG1-prøver gjør du samme beregning som ovenfor (trinn 4.3.2-4.3.4) (tabell 7).
      MERK: Når man ser på ΔCq, observeres det at den cytoplasmatiske TUG1-fraksjonen (grønn utheving) har en større TUG1-markør enn nukleær fraksjon (rød utheving), og bekrefter dermed god separasjon av cytoplasmatiske og nukleære fraksjoner (tabell 8, figur 1).

Representative Results

For å sikre at nukleær og cytoplasmatisk isolasjon var oppnådd, ble det utført en qPCR for å validere resultatene. Ved å gjøre dette ble primere som var spesifikke for interesseområdet benyttet for å demonstrere nukleære og cytoplasmatiske fraksjoneringsnivåer. I denne studien ble MALAT1 og TUG1 brukt som henholdsvis nukleære og cytoplasmatiske primere. Sammen tillater de demonstrasjon av høye nivåer av nukleær fraksjonering med MALAT1 som en positiv kontroll for nukleære elementer, mens cytoplasmatisk fraksjonering forventes å være lav. Omvendt, når TUG1 er tilstede som en positiv kontroll for cytoplasmatiske elementer, forventes cytoplasmatiske fraksjoneringsnivåer å være høyere enn nukleære fraksjoneringsnivåer. Dette kan sees i figur 2, et eksempel på et positivt resultat som bekrefter kjernefysisk og cytoplasmatisk RNA-separasjon.

Et negativt resultat kan ses i figur 3, der cytoplasmatisk fraksjoneringsnivå observeres i utvalget med MALAT1. Dette indikerer forurensning av RNA isolert fra kjernefraksjonen, potensielt på grunn av lysiskonsentrasjoner som er for lave eller for høye. Denne studien prøvde også andre primere, men MALAT1 og TUG1 viste den høyeste korrelasjonen med nukleær og cytoplasmatisk separasjon, som bekreftet gjennom en vestlig blot- og RNA-elektroforese, som bekreftet renheten og kvaliteten på prøvene (figur 4 og figur 5).

I tillegg kan renheten av nukleære og cytoplasmatiske ekstrakter demonstreres ved en vestlig blot ved bruk av lamin som markør for nukleær fraksjon og alfa-tubulin som en positiv markør for cytoplasmatisk fraksjon¹⁰, som vist i figur 4. Det er et klart uttrykk av lamin utelukkende innenfor nukleær fraksjon, med et klart uttrykk av alfa-tubulin i cytoplasmatisk fraksjon, noe som indikerer relativ renhet i hver prøve.

På grunn av tendensen til RNA å nedbryte under prosessen med qPCR, er det nødvendig å bekrefte kvaliteten på RNA-utbyttet ved hjelp av RNA-elektroforese. RNA-elektroforese ble utført og demonstrert en høy kvalitet på RNA på grunn av tilstedeværelsen av en topp ved 32S rRNA-underenheten, som er en funksjon som bare er tilstede i nukleære fraksjoner. Tilstedeværelsen av denne toppen indikerer kjernefysisk renhet og tilstrekkelig fraksjonering. Omvendt ble det ikke observert noen topp i cytoplasmatisk RNA-elektroforese, som viste høy kvalitet og liten eller ingen forurensning i cytoplasmatisk RNA-prøve¹¹ (figur 5).

Figur 1: Skjematisk over protokolltrinn. Etter at cellene er behandlet, lyseres de og sentrifugeres for isolering. Deretter utføres RNA-isolasjon, og cDNA genereres før validering av isolasjon ved bruk av qPCR. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Positive resultatdata. Figuren fremhever protokollsuksess utvist av høye nivåer av separasjon av nukleære og cytoplasmatiske komponenter. MALAT1, en kjernefysisk RNA-primer, viste statistisk signifikante høyere nivåer av kjernefraksjonen. I TUG1, en cytoplasmatisk RNA-primer, ble det observert statistisk signifikante høyere nivåer av cytoplasmatisk fraksjon. Høy statistisk signifikans ble observert i begge utvalgene via t-test. p < 0,0001. Feilfelt angir standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Negative resultatdata. Figuren fremhever et eksempel på negative resultater ved bruk av protokoll vist ved høye nivåer av separasjon av nukleære og cytoplasmatiske komponenter. MALAT1, en kjernefysisk RNA-primer, viste cytoplasmatiske fraksjonsnivåer forårsaket av kjernefysisk forurensning. Ingen forskjeller er observert i statistisk signifikans mellom fraksjonene via t-test. Feilfelt angir standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Western Blot som demonstrerer renheten av cytoplasmatiske og nukleære fraksjoner. Figuren fremhever en vestlig flekk av de nukleære og cytoplasmatiske fraksjonene. Lamin ble brukt til å verifisere kjerneprøvens renhet, mens alfa-tubulin ble brukt til å demonstrere renheten av cytoplasmatisk fraksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Bekreftelse av RNA-renhet av cytoplasmatiske og nukleære fraksjoner via RNA-elektroforese. (A) RNA-elektroforese av kjernefraksjonen. Arrow demonstrerer 32S rRNA, som bare observeres i kjernefysiske fraksjoner. (B) RNA-elektroforese av cytoplasmatisk fraksjon. Fraværet av en 32S-topp indikerer RNA-renhet av cytoplasmatisk fraksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Sammensetning av lysisbuffer, reaksjonsblandinger og prøver. (A) Sammensetning av 0,25x lysisbuffer. (B) Sammensetning av revers transkriptaseblanding benyttet under transkripsjon av RNA til cDNA. (C) Sammensetning av nukleære og cytoplasmatiske prøver ved bruk av et revers transkriptasesett. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Sykliske parametere. (A) Sykkelparametrene for termosyklist. Disse parametrene ble brukt under qPCR for amplifisering av målsekvensen. (B) Syklingsparametrene for nukleære og cytoplasmatiske prøver. Disse parametrene ble brukt under qPCR for amplifisering av målsekvensen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: Sekvenser av nukleære og cytoplasmatiske markører. Tabellen inneholder sekvensene av markørene som brukes til å bekrefte nukleær og cytoplasmatisk separasjon. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 4: Prosedyre for subtrahering av MALAT1 nukleære og cytoplasmatiske fraksjoner. Et eksempel på datablad brukt til å trekke MALAT1 nukleær fraksjon - MALAT1 cytoplasmatisk fraksjon. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 5: Prosedyre for beregning av ΔCq (2^(-verdi). Et eksempel på databladet som brukes til å beregne ΔCq (2^(-verdien)). Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 6: Prosedyre for beregning av cytoplasmatisk fraksjon. Et eksempel på databladet som brukes til å beregne cytoplasmatisk fraksjon. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 7: Prosedyre for beregning av nukleær fraksjon. Et eksempel på databladet som brukes til å beregne kjernefraksjonen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 8: Prosedyre for bekreftelse av vellykket fraksjoneringsresultat. Et eksempel på datablad som brukes til å verifisere vellykket fraksjonering. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tilleggsfigur 1: Bilde av programvare for maskindesign og -analyse av qPCR. Et bilde som demonstrerer driften av qPCR-maskinen. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 2: Bilde av qPCR "Egenskaper for datafil". Et bilde som demonstrerer prosedyren for å sette opp parametere for qPCR-kjøring. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 3: Bilde av lasting av prøver i qPCR-maskinen. Et bilde som demonstrerer prosedyren for å legge prøver til qPCR-programvaren for analyse. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 1: Dataark for eksempelnavn. Et eksempel på et dataark med eksempelnavnet, målnavnet og Cq-verdien. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Gjennom protokollen ble det tatt noen skritt for å optimalisere elementene for å være mest effektive for cellelinjen av interesse. Selv om trinnene i protokollen er relativt enkle, kan analyse og mindre justeringer under kritiske aspekter av protokollen være nødvendig. Det mest kritiske trinnet i protokollen er å endre konsentrasjonen av lysisbufferen til en riktig konsentrasjon basert på cellelinjen av interesse og det cellulære målet. Siden utnyttelsen av lysisbuffer i stor grad avhenger av forstyrrelsen av cellemembraner, er det naturlig variasjon i effektiviteten av lysisbuffer på forskjellige cellelinjer, da det er små forskjeller i celleskjørhet og membranpermeabilitet mellom forskjellige cellelinjer¹². Fra og med en baseline på 1x lysisbuffer ble trinnene i protokollen utført mens konsentrasjonen av lysisbufferen gradvis ble redusert til 0,25x, noe som berettiget mer effektive resultater. Siden eksperimentet tar sikte på å isolere et stort antall subcellulære komponenter, er det avgjørende å sikre at konsentrasjonen av lysisbuffer er optimalisert for cellelinjen av interesse for å oppnå høyest utbytte og best resultat.

I tillegg til justering av lysisbufferkonsentrasjoner, er det viktig å merke seg sårbarheten til RNA og stressforsiktighet under isolering av RNA. RNA er mer utsatt for nedbrytning enn DNA og mange andre cellulære elementer, da dens 2 'hydroksylgruppe kan tjene som et bindingspunkt for RNaser, en familie av enzymer som kan nedbryte RNA og føre til dårlige resultater. RNaser er svært i stand til RNA-nedbrytning, selv når de presenteres i mindre mengder¹³. Siden RNaser frigjøres fra celler under og etter lyseringstrinn, må det utvises forsiktighet for å forhindre forurensning, noe som kan føre til uønsket RNA-nedbrytning¹⁴. Trinnene inkluderer bruk av hansker under forsøket og endre disse ofte for å unngå å overføre RNaser fra miljøet eller overflater til prøver. I tillegg bør RNase-frie løsninger benyttes, og et eget arbeidsområde bør brukes ved håndtering av RNA. Til slutt, siden RNase kan være svært motstandsdyktig mot lysisbuffer og denaturering, kan RNase-hemmere brukes til å redusere deres negative effekter på RNA-isolasjon¹⁵.

Mens trinnene under protokollen ga svært vellykkede resultater, er det noen begrensninger. For å begynne, mens RNA og cytoplasmatiske komponenter i stor grad kan isoleres fra hverandre, kan de to ikke skilles helt uten å sette kvaliteten på RNA i fare for studier. På grunn av dette kan enhver konklusjon basert på forskjeller i aktiviteten eller funksjonen til molekyler fra disse separate områdene bli skjevt noe ved manglende evne til å utlede fullt isolerte prøver. Det er også viktig å merke seg at hvis protokollen er tilpasset andre cellemolekyler, som proteiner, kan noen proteiner eller andre cellulære elementer nedbrytes under separasjon av kjernefysiske ekstrakter, noe som fører til tap av aktivitet og påvirker ens resultater¹⁶. Det er også viktig å merke seg at under denne protokollen ble qPCR av nukleære og cytoplasmatiske fraksjoner ved bruk av MALAT1 og TUG1 utført ganske enkelt som validering av renheten og kvaliteten på prøvene. For å utvide denne ideen ble de relative proporsjonene av nukleært og cytoplasmatisk RNA ikke analysert eller sammenlignet under denne protokollen, da den bare ble brukt til validering. Denne protokollen kan imidlertid tilpasses til andre bruksområder, for eksempel å sammenligne de relative proporsjonene av nukleare og cytoplasmatiske fraksjoner, men disse verdiene må normaliseres til mengden totalt RNA for en nøyaktig analyse eller sammenligning. Trinnene for normalisering av cytoplasmatiske og nukleære fraksjoner til totale RNA-nivåer er tidligere beskrevet i andre protokoller¹¹.

Imidlertid, som tidligere nevnt, bruker denne metoden vanlige laboratoriematerialer for å generere RNA-ekstrakter av høy kvalitet kostnadseffektivt. Også denne metoden for å studere nukleære og cytoplasmatiske interaksjoner viser seg å være blant de mest tidseffektive prosedyrene. Bruk av RNA-renhetssett fører til svært effektiv RNA-opprydding og bidrar til å sikre høye nivåer av RNA-isolasjon fra forskjellige cellulære regioner, noe som fører til mer effektive prøver å studere. Endelig presenterer tilpasningsevnen til denne protokollen seg som en viktig fordel, da modifisering av lysisbufferkonsentrasjonen kan gi tilgang til studiet av mange forskjellige cellelinjer, og en tetthetsseparasjonsteknikk som sentrifugering kan føre til isolering av flere forskjellige cellulære elementer. Etter hvert som studier på cytoplasmatiske og nukleære interaksjoner blir mer utbredt, kan virkningen av lokalisering på cellulære komponenter bli bedre forstått. Utvekslingen mellom cytoplasma og kjerne kan analyseres, noe som indikerer om visse molekyler under disse utvekslingene kan føre til kreftutvikling, som studier på nukleære proteiner som XPO1 har indikert¹⁷.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent Tapestation	Agilent	G2991BA	The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples.
0.5% Nonidet P-40	Thermo-Fischer	28324	Used in the making of lysis buffer
50 mM Tris-Cl pH 8.0	Thermo-Fischer	15568025	Used in the making of lysis buffer
MALAT1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00273907_s1	Utilized for confirmation of Nuclear fraction.
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode	Thermo-Fischer	4326659	The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo-Fischer	4311971	The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR
PBS	Gibco	20012-023	Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents.
Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit	Qiagen	74106	RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol.
QuantStudio 6	Thermo-Fischer	A43180	qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples
RLT Buffer	Qiagen	79216	Lysis Buffer from RNA clean-up kit
RPE Buffer	Qiagen	1018013	Wash Buffer from RNA clean-up kit
RW1 Buffer	Qiagen	1053394	Wash Buffer from RNA clean-up kit
Taqman Gene Expression Assays	Thermo-Fischer	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves.
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo-Fischer	4305719	TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time.
TUG1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00215501_m1	Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction.
UltraPure DEPC-Treated Water	Thermo-Fischer	750024	UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered.