Beredning av cytoplasmatiska och nukleära långa RNA från primära och odlade celler

Summary

Det nuvarande protokollet erbjuder en effektiv och flexibel metod för att isolera RNA från nukleära och cytoplasmatiska fraktioner med hjälp av odlade celler och sedan validera med qPCR. Detta fungerar effektivt som en ersättning för andra RNA-preparatsatser.

Abstract

Separationen av intracellulära komponenter har varit ett viktigt verktyg inom cellbiologi i många år nu och har kunnat ge användbar inblick i hur deras placering kan påverka deras funktion. I synnerhet har separationen av nukleärt och cytoplasmatiskt RNA blivit viktigt i samband med cancerceller och strävan att hitta nya mål för läkemedel. Inköpssatser för nukleär-cytoplasmatisk RNA-extraktion kan vara kostsamt när många av de nödvändiga materialen finns inom en typisk laboratorieinställning. Med den nuvarande metoden, som kan ersätta dyrare kit eller andra tidskrävande processer, behövs endast en hemlagad lysbuffert, en bänkcentrifug och RNA-isoleringsreningskolonner för att isolera nukleärt och cytoplasmatiskt RNA. Lysbuffert används för att försiktigt lysera cellens yttre membran utan att påverka kärnhöljets integritet, vilket möjliggör frisättning av dess intracellulära komponenter. Därefter kan kärnorna isoleras genom ett enkelt centrifugeringssteg eftersom de har en högre densitet än lyslösningen. Centrifugering används för att separera dessa områden baserat på deras densitetsskillnader för att isolera subcellulära element i kärnan från de i cytoplasman. När centrifugeringen har isolerat de olika komponenterna används ett RNA-rengöringskit för att rena RNA-innehållet och qPCR utförs för att validera separationskvaliteten, kvantifierad av mängden kärn- och cytoplasmatiskt RNA i de olika fraktionerna. Statistiskt signifikanta separationsnivåer uppnåddes, vilket illustrerar protokollets effektivitet. Dessutom kan detta system anpassas för isolering av olika typer av RNA (totalt, litet RNA, etc.), vilket möjliggör riktad studie av cytoplasma-kärninteraktioner och hjälper till att förstå skillnaderna i funktionen av RNA som bor i kärnan och cytoplasman.

Introduction

Cellulär fraktionering i subcellulära komponenter möjliggör isolering och studier av definierade biokemiska domäner och hjälper till att bestämma lokaliseringen av specifika cellulära processer och hur detta kan påverka deras funktion¹. Isolering av RNA från olika intracellulära platser kan möjliggöra förbättrad noggrannhet i genetisk och biokemisk analys av transkriptionsnivåhändelser och andra interaktioner mellan kärnan och cytoplasman, vilket tjänar som det primära syftet med det nuvarande protokollet². Detta protokoll utvecklades för att säkerställa isolering av cytoplasmatiska och nukleära RNA för att bestämma deras respektive roller i kärnexport och för att förstå hur den subcellulära lokaliseringen av RNA i kärnan och cytoplasman kan påverka deras funktion i cellulära processer. Med hjälp av material från en typisk laboratoriemiljö var det möjligt att uppnå kärn- och cytoplasmatisk fraktionering mer effektivt och billigare än tidigare etablerade protokoll utan att äventyra kvaliteten på resultaten³.

Dessutom kan utbytet av molekyler mellan cytoplasman och kärnan studeras direkt genom att separera dessa regioner. Mer specifikt är det viktigt att förstå transkriptomet för att förstå utveckling och sjukdom. RNA kan emellertid vara vid olika mognadsnivåer vid varje given tidpunkt och kan komplicera nedströmsanalys. Detta protokoll möjliggör förmågan att isolera RNA från nukleära och cytoplasmatiska subcellulära fraktioner, vilket kan hjälpa till i studier av RNA och möjliggöra en bättre förståelse av ett visst RNA av intresse, såsom lokalisering av icke-kodande RNA eller analys av skarvkorsningar i kärnan.

Detta protokoll har optimerats för att isolera cytoplasmatiska och nukleära långa RNA, inklusive mRNA, rRNA och långa icke-kodande RNA (lncRNA), på grund av storlekselektiviteten hos den använda RNA-reningskolonnen, som kan modifieras för att isolera andra RNA av intresse. Tidigare var funktionen hos långa RNA, såsom mRNA och lncRNA, starkt beroende av deras respektive lokalisering inom cellen ^4,5. Därför har studien av exporten från kärnan till subcellulära domäner blivit mer inriktad på att förstå den roll som exporterande RNA eller andra cellulära komponenter kan ha på cellen. lncRNA fungerar som ett utmärkt exempel på detta, eftersom deras översättning och efterföljande effekter till stor del beror på närhet och interaktioner med andra former av RNA⁶. Vidare är utbytet av cellulära element mellan kärn- och cytoplasmatiska regioner kopplat till resistensmekanismer mot olika cancerbehandlingar⁷. Isoleringen av intracellulära kompartment har möjliggjort utvecklingen av nukleära exporthämmare, vilket har minskat effekterna av resistensmekanismer mot olika terapier⁸.

Efter separering av kärn- och cytoplasmatiskt RNA utförs steg för att rena RNA av intresse. Eftersom RNA-reningssatser vanligtvis finns i laboratorier och fungerar för att rena och isolera långa RNA, tjänar de syftet med detta protokoll väl. För RNA-rening är generering av 260: 280-förhållanden större än 1,8 avgörande för att säkerställa kvaliteten på prover för RNA-sekvensering eller andra liknande procedurer som kräver höga renhetsnivåer och isolering. Oregelbundna 260:280-värden indikerar fenolförorening, vilket visar dålig isolering och ger felaktiga resultat⁹.

När RNA-reningen är klar och 260: 280-värden bekräftas vara över ett acceptabelt intervall, användes qPCR för att validera isoleringsresultaten av kärn- och cytoplasmatiska fraktioner. På så sätt användes primers specifika för regionen av intresse för att demonstrera kärn- och cytoplasmatiska fraktioneringsnivåer. I detta protokoll användes MALAT1 och TUG1 som nukleära respektive cytoplasmatiska markörer¹⁰. Tillsammans möjliggör de demonstration av höga nivåer av kärnfraktionering med MALAT1, medan cytoplasmatisk fraktionering förväntas vara låg. Omvänt, när TUG1 används, förväntas cytoplasmatiska fraktioneringsnivåer vara högre än nukleära fraktioneringsnivåer.

Med hjälp av detta protokoll var det möjligt att isolera RNA baserat på deras verkningsposition i cellen. På grund av utbredd tillgång till många material och användning av endast lysbuffert- och densitetsbaserade centrifugeringstekniker under detta experiment är tillämpligheten på andra RNA-typer och andra cellulära komponenter utbredd. Detta kan ge viktig information genom att belysa platsspecifika uttryckshändelser som annars inte skulle kunna särskiljas utan separation.

Protocol

K562-celler används för den aktuella studien. Detta protokoll har optimerats för att fungera för 1 x 10 6-5 x 10⁶ miljoner celler. Proceduren kan dock skalas upp för större cellmängder genom att öka volymerna på lämpligt sätt.

1. Beredning av 0,25x lysbufferten

1. Bered 0,25x lyseringsbuffert genom att blanda följande komponenter i tabell 1A.
   OBS: Prover kräver cirka 300 μL 0,25x lysbuffert. Rekommenderad volym = antal prover x 300 μl.

2. Separation av kärn- och cytoplasmatiska fraktioner

1. Pellet cellerna med 1,5 ml rör via centrifugering i 5 min vid 2000 x g (rumstemperatur). Kassera supernatanten med en aspirerande pipett.
   K562-celler användes under detta protokoll. Protokollet kan dock anpassas till olika cellinjer.
2. Återsuspendera pelleten i 300 μL iskall 0,25x lysbuffert.
   OBS: Håll på is i 2 minuter och rotera röret var 45: e sekund för att säkerställa korrekt lys av cellerna.
3. Snurra rören med högsta hastighet (12 000 x g) vid 4 °C i 2 minuter.
4. Efter centrifugering, ta försiktigt bort supernatanten och placera den i ett nytt 1,5 ml rör. Detta kommer att vara den cytoplasmatiska fraktionen. Cirka 300 μL av den cytoplasmatiska fraktionen kommer att uppnås.
5. Den återstående pelleten kommer att vara kärnfraktionen. Tillsätt 500 μL iskall PBS till pelleten och centrifugera vid 2 000 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
   OBS: Under detta steg tas överflödigt DNA bort.

3. RNA-sanering med hjälp av ett RNA-reningssats

OBS: Detta protokoll uppnåddes med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt RNA-reningssats (se materialtabell).

1. Separera cytoplasmatiska RNA-prover och kärncytoplasmatiska prover (eftersom fraktioneringsstegen varierar mellan dem).
   1. För att separera den cytoplasmatiska fraktionen, tillsätt 1,050 μL 3,5x RLT-lysbuffert (se materialtabell) och virvel kort. Tillsätt sedan 750 μL 90% etanol och ladda den på kolonnen från RNA-rengöringssatsen.
      OBS: Lösningen måste blandas väl innan den laddas på kolonnen.
   2. För att separera kärnfraktionen, tillsätt 600 μL 3,5x lysbuffert och virvel. Tillsätt sedan 600 μL 70% etanol.
2. Ladda både cytoplasmatiska och nukleära fraktioner på RNA-kolonner (se materialförteckning).
   OBS: För resten av steg 3 följer både cytoplasmatiska och kärnprover samma procedur. Se dock till att dessa prover förblir oberoende av varandra.
   1. Ladda både cytoplasmatiska och nukleära fraktioner på RNA-kolonner och snurra i 30 s vid 8 000 x g vid rumstemperatur. Kassera överskottsflödet genom.
   2. Tillsätt 350 μl tvättbuffert från en kommersiellt tillgänglig reningssats (RW1-buffert, se materialtabell), snurra igen och kasta flödet igenom.
   3. Tillsätt DNAse-lösning (1U/uL) i 15 minuter vid rumstemperatur. Tillsätt sedan 350 μL tvättbuffert, snurra igen och kasta flödet igenom.
   4. Tillsätt 500 μL mild tvättbuffert (RPE, se materialförteckning), snurra igen och kasta flödet igenom. Tillsätt 500 μL mild diskbuffert, snurra igen, men bara i 2 minuter.
   5. Flytta kolonnen till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör och tillsätt 30 μL vatten till rotationskolonnen. Låt kolonnen sitta i 1 min innan du snurrar ner.

4. Validering av kärncytoplasmatisk separation

1. Utför cDNA-syntes
   1. När subcellulära fack av RNA har extraherats och renats, bekräfta separationen av facken med qPCR. För att göra detta, konvertera först RNA till cDNA med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning).
   2. Förbered omvänd transkriptas mastermix. Lägg till mall-RNA. Inkubera reaktioner i en termocykler.
      Anmärkning: För slumpmässiga hexamerer anges de cykelparametrar som används i tabell 2A. Använd omedelbart den omvända transkriptasreaktionen eller förvara vid -20 °C (tabell 1B).
2. Utför kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR) och analys.
   1. Späd cDNA-syntesen med DEPC-vatten (se materialtabell) för att få en slutlig koncentration på 20 ng / ml.
   2. Förbered reaktionen för varje prov med hjälp av en PCR-masterblandning med hjälp av manuella instruktioner enligt listan nedan.
   3. Förvärva kommersiella sonder som är nödvändiga för att detektera cytoplasmatisk och nukleär fraktionering. Använd MALAT1 som kärnmarkör och TUG1 som cytoplasmatisk markör (se materialtabell).
      OBS: Sekvenser för MALAT1 och TUG1 finns i tabell 3.
   4. Beräkna varje komponents volym genom att multiplicera varje komponent med 3 för vart och ett av de tekniska replikaten för det enskilda provet.
   5. För varje kärnprov och cytoplasmatiskt prov, förvärva följande blandningar för varje: (a) kärnfraktion med MALAT1, (b) cytoplasmatisk fraktion med MALAT1, (c) kärnfraktion med TUG1 och (d) cytoplasmatisk fraktion med TUG1 (tabell 1C).
   6. Vortex kort för att blanda lösningar och överföra 20 μL av blandningen till varje brunn på en optisk reaktionsplatta (se Materialtabell).
   7. Täck plattan med en klar självhäftande film som används för qPCR (se materialtabell) och centrifugera plattan kort för att eliminera luftbubblor och snurra sedan provet ner vid 300 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
   8. Använd design- och analysprogramvara (se Materialförteckning) och välj standardkurvan för cykelparametrarna (tabell 2B).
   9. Använd qPCR-programvaran och välj Konfigurera körning (kompletterande bild 1).
   10. På sidan Egenskaper för datafil väljer du Metod - och indatacykelparametrar från tabell 2B (kompletterande bild 2).
   11. När du har matat in cykelparametrar väljer du fliken Platta och matar in proverna som ska köras (kompletterande bild 3). Välj Starta körning.
       De beskrivna stegen utfördes i en qPCR-maskin med en kommersiellt tillgänglig mastermix (se materialförteckning).
3. Utför dataanalys
   1. När körningen är klar skapar du ett datakalkylblad med exempelnamn, målnamn och kvantifieringscykel (Cq) (kompletterande tabell 1).
   2. Börja med MALAT1-proverna för att beräkna kärnfraktionen. Subtrahera MALAT1 cytoplasmatisk fraktion från MALAT1-kärnfraktionen (tabell 4).
   3. Beräkna sedan ΔCq (2^(-värde)) (tabell 5).
   4. Fortsätt med MALAT1-proverna för att beräkna den cytoplasmatiska fraktionen, subtrahera MALAT1-kärnfraktionen från MALAT1-cytoplasmatisk fraktion och beräkna sedan ΔCq (2 ^ (-värde)) (tabell 6).
      OBS: Om man tittar på ΔCq observeras att den nukleära MALAT1-fraktionen (grön höjdpunkt) har en större MALAT1-markör än cytoplasman (röd markering), men nu krävs bekräftelse för att säkerställa att den cytoplasmatiska fraktionen huvudsakligen är cytoplasma och att kärnfraktionen inte innehåller cytoplasmatisk kontaminering.
   5. Med TUG1-prover utför du samma beräkning som ovan (steg 4.3.2–4.3.4) (tabell 7).
      OBS: När man tittar på ΔCq observeras att den cytoplasmatiska TUG1-fraktionen (grön höjdpunkt) har en större TUG1-markör än kärnfraktionen (röd markering), vilket bekräftar god separation av cytoplasmatiska och nukleära fraktioner (tabell 8, figur 1).

Representative Results

För att säkerställa att nukleär och cytoplasmatisk isolering hade uppnåtts utfördes en qPCR för att validera resultaten. På så sätt användes primers specifika för regionen av intresse för att demonstrera kärn- och cytoplasmatiska fraktioneringsnivåer. I denna studie användes MALAT1 och TUG1 som nukleära respektive cytoplasmatiska primrar. Tillsammans möjliggör de demonstration av höga nivåer av kärnfraktionering med MALAT1 som en positiv kontroll för kärnelement, medan cytoplasmatisk fraktionering förväntas vara låg. Omvänt, när TUG1 är närvarande som en positiv kontroll för cytoplasmatiska element, förväntas cytoplasmatiska fraktioneringsnivåer vara högre än kärnfraktioneringsnivåer. Detta kan ses i figur 2, ett exempel på ett positivt resultat som bekräftar kärn- och cytoplasmatisk RNA-separation.

Ett negativt resultat kan ses i figur 3, där nivåer av cytoplasmatisk fraktionering observeras i provet med MALAT1. Detta indikerar kontaminering av RNA isolerat från kärnfraktionen, potentiellt på grund av lyskoncentrationer som är för låga eller för höga. Denna studie testade också andra primers, men MALAT1 och TUG1 uppvisade den högsta korrelationen med kärn- och cytoplasmatisk separation, vilket bekräftades genom en western blot och RNA-elektrofores, vilket bekräftade renheten och kvaliteten på proverna (figur 4 och figur 5).

Dessutom kan renheten hos kärn- och cytoplasmatiska extrakt demonstreras genom en western blot med lamin som markör för kärnfraktion och alfa-tubulin som en positiv markör för den cytoplasmatiska fraktionen¹⁰, som visas i figur 4. Det finns ett tydligt uttryck av lamin enbart inom kärnfraktionen, med ett tydligt uttryck av alfa-tubulin inom den cytoplasmatiska fraktionen, vilket indikerar relativ renhet inom varje prov.

På grund av RNA: s tendens att försämras under processen med qPCR är det nödvändigt att bekräfta kvaliteten på RNA-utbytet med användning av RNA-elektrofores. RNA-elektrofores utfördes och visade en hög kvalitet av RNA på grund av närvaron av en topp vid 32S rRNA-subenheten, vilket är en egenskap som endast finns i kärnfraktioner. Närvaron av denna topp indikerar kärnrenhet och tillräcklig fraktionering. Omvänt observerades ingen topp i cytoplasmatisk RNA-elektrofores, vilket visar hög kvalitet och liten eller ingen kontaminering i cytoplasmatiskt RNA-prov¹¹ (figur 5).

Figur 1: Schematisk bild av protokollsteg. Efter att cellerna har behandlats lyseras de och centrifugeras för isolering. Därefter utförs RNA-isolering och cDNA genereras före validering av isolering med qPCR. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Uppgifter om positiva resultat. Figuren belyser protokollframgång som uppvisas av höga nivåer av separation av nukleära och cytoplasmatiska komponenter. MALAT1, en nukleär RNA-primer, uppvisade statistiskt signifikanta högre nivåer av kärnfraktionen. I TUG1, en cytoplasmatisk RNA-primer, observerades statistiskt signifikanta högre nivåer av cytoplasmatisk fraktion. Hög statistisk signifikans observerades i båda proverna via t-test. p < 0,0001. Felstaplar anger standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: Data om negativt resultat. Figuren belyser ett exempel på negativa resultat med hjälp av protokoll som uppvisas av höga nivåer av separation av kärn- och cytoplasmatiska komponenter. MALAT1, en nukleär RNA-primer, uppvisade cytoplasmatiska fraktionsnivåer orsakade av nukleär kontaminering. Inga skillnader observeras i statistisk signifikans mellan fraktionerna via t-test. Felstaplar anger standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4: Western Blot som visar renheten hos cytoplasmatiska och nukleära fraktioner. Figuren belyser en västerländsk fläck av kärn- och cytoplasmatiska fraktioner. Lamin användes för att verifiera kärnprovets renhet, medan alfa-tubulin användes för att visa renheten hos den cytoplasmatiska fraktionen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5: Bekräftelse av RNA-renhet hos cytoplasmatiska och nukleära fraktioner via RNA-elektrofores. (A) RNA-elektrofores av kärnfraktionen. Arrow demonstrerar 32S rRNA, som endast observeras i kärnfraktioner. (B) RNA-elektrofores av den cytoplasmatiska fraktionen. Frånvaron av en 32S-topp indikerar RNA-renhet av cytoplasmatisk fraktion. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Sammansättning av lysbuffert, reaktionsblandningar och prover. (A) Sammansättning av 0,25x lysbuffert. (B) Sammansättning av omvänd transkriptasblandning som används under transkription av RNA till cDNA. c) Sammansättning av kärnprover och cytoplasmatiska prover med användning av ett omvänt transkriptaskit. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: Cykliska parametrar. (A) Cykelparametrarna för termocykler. Dessa parametrar användes under qPCR för amplifiering av målsekvensen. b) Cykelparametrarna för kärnprover och cytoplasmatiska prover. Dessa parametrar användes under qPCR för amplifiering av målsekvensen. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 3: Sekvenser av nukleära och cytoplasmatiska markörer. Tabellen innehåller sekvenserna av markörerna som används för att bekräfta kärn- och cytoplasmatisk separation. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 4: Förfarande för subtrahering av MALAT1-kärn- och cytoplasmatiska fraktioner. Ett exempel på datablad som används för att subtrahera MALAT1 kärnfraktion - MALAT1 cytoplasmatisk fraktion. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 5: Förfarande för beräkning av ΔCq (2^(-värde). Ett exempel på databladet som används för att beräkna ΔCq (2^(-värde)). Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 6: Förfarande för beräkning av cytoplasmatisk fraktion. Ett exempel på databladet som används för att beräkna den cytoplasmatiska fraktionen. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 7: Förfarande för beräkning av kärnfraktion. Ett exempel på databladet som används för att beräkna kärnfraktionen. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 8: Förfarande för att bekräfta framgångsrikt fraktioneringsresultat. Ett exempel på datablad som används för att verifiera framgångsrik fraktionering. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Kompletterande figur 1: Bild av qPCR-maskindesign och analysprogramvara. En bild som visar driften av qPCR-maskinen. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande bild 2: Bild av qPCR "Egenskaper för datafil". En bild som visar proceduren för att ställa in parametrar för qPCR-körning. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 3: Bild av laddning av prover i qPCR-maskinen. En bild som visar proceduren för att lägga till prover i qPCR-programvaran för analys. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell 1: Datablad för exempelnamn. Ett exempel på datablad med exempelnamn, målnamn och Cq-värde. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Under hela protokollet togs några steg för att optimera elementen för att vara mest effektiva för cellinjen av intresse. Även om stegen i protokollet är relativt enkla kan analys och mindre justeringar under kritiska aspekter av protokollet vara nödvändiga. Det mest kritiska steget i protokollet är att modifiera koncentrationen av lysbufferten till en korrekt koncentration baserat på cellinjen av intresse och det cellulära målet. Eftersom användningen av lysbuffert till stor del beror på störningen av cellmembran, finns det en naturlig variation i effektiviteten av lysbuffert på olika cellinjer eftersom det finns små skillnader i cellbräcklighet och membranpermeabilitet mellan olika cellinjer¹². Från och med en baslinje på 1x lysbuffert utfördes stegen i protokollet samtidigt som koncentrationen av lysbufferten gradvis minskade till 0,25x, vilket motiverade effektivare resultat. Eftersom experimentet syftar till att slutligen isolera ett stort antal subcellulära komponenter, är det viktigt att säkerställa att koncentrationen av lysbuffert optimeras till cellinjen av intresse för att uppnå högsta utbyte och bästa resultat.

Förutom justeringen av lysbuffertkoncentrationer är det viktigt att notera bräckligheten hos RNA och stressförsiktighet under isoleringen av RNA. RNA är mer sårbart för nedbrytning än DNA och många andra cellulära element, eftersom dess 2 'hydroxylgrupp kan fungera som en bindningspunkt för RNaser, en familj av enzymer som kan bryta ner RNA och leda till dåliga resultat. RNaser är mycket kapabla till RNA-nedbrytning, även när de presenteras i mindre mängder¹³. Eftersom RNaser frigörs från celler under och efter lyssteg måste försiktighet iakttas för att förhindra kontaminering, vilket kan leda till oönskad RNA-nedbrytning¹⁴. Stegen inkluderar att bära handskar under experimentet och byta dessa ofta för att undvika överföring av RNaser från miljön eller ytorna till prover. Dessutom bör RNase-fria lösningar användas, och en separat arbetsyta bör användas vid hantering av RNA. Slutligen, eftersom RNas kan vara mycket resistent mot lysbuffert och denaturering, kan RNase-hämmare användas för att mildra deras negativa effekter på RNA-isolering¹⁵.

Medan stegen under protokollet gav mycket framgångsrika resultat finns det vissa begränsningar. Till att börja med, medan RNA och cytoplasmatiska komponenter till stor del kan isoleras från varandra, kan de två inte separeras helt utan att äventyra kvaliteten på RNA för studier. På grund av detta kan varje slutsats baserad på skillnader i molekylernas aktivitet eller funktion från dessa separata regioner snedvridas något av oförmågan att härleda helt isolerade prover. Det är också viktigt att notera att om protokollet är anpassat till andra cellmolekyler, såsom proteiner, kan vissa proteiner eller andra cellulära element brytas ned under separationen av kärnextrakt, vilket leder till förlust av aktivitet och påverkar resultaten¹⁶. Det är också viktigt att notera att under detta protokoll utfördes qPCR av kärn- och cytoplasmatiska fraktioner med användning av MALAT1 och TUG1 helt enkelt som validering av provernas renhet och kvalitet. För att utöka denna idé analyserades eller jämfördes inte de relativa proportionerna av nukleärt och cytoplasmatiskt RNA under detta protokoll, eftersom det endast användes för validering. Detta protokoll kan emellertid anpassas till andra användningsområden, såsom att jämföra de relativa proportionerna av kärn- och cytoplasmatiska fraktioner, men dessa värden måste normaliseras till mängden totalt RNA för en noggrann analys eller jämförelse. Stegen för normalisering av cytoplasmatiska och nukleära fraktioner till totala RNA-nivåer har tidigare beskrivits i andra protokoll¹¹.

Emellertid, som tidigare nämnts, använder denna metod vanliga laboratoriematerial för att generera högkvalitativa RNA-extrakt kostnadseffektivt. Denna metod för att studera kärn- och cytoplasmatiska interaktioner visar sig också vara bland de mest tidseffektiva förfarandena. Användning av RNA-renhetssatser leder till mycket effektiv RNA-sanering och hjälper till att säkerställa höga nivåer av RNA-isolering från olika cellulära regioner, vilket leder till effektivare prover att studera. Slutligen presenterar anpassningsförmågan hos detta protokoll sig som en viktig fördel, eftersom modifiering av lysbuffertkoncentrationen kan ge tillgång till studier av många olika cellinjer, och en densitetsseparationsteknik såsom centrifugering kan leda till isolering av flera olika cellulära element. Eftersom studier av cytoplasmatiska och nukleära interaktioner blir mer utbredda kan lokaliseringens inverkan på cellulära komponenter bli bättre förstådd. Utbytet mellan cytoplasman och kärnan kan analyseras, vilket indikerar om vissa molekyler under dessa utbyten kan leda till cancerutveckling, som studier på kärnproteiner såsom XPO1 har indikerat¹⁷.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent Tapestation	Agilent	G2991BA	The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples.
0.5% Nonidet P-40	Thermo-Fischer	28324	Used in the making of lysis buffer
50 mM Tris-Cl pH 8.0	Thermo-Fischer	15568025	Used in the making of lysis buffer
MALAT1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00273907_s1	Utilized for confirmation of Nuclear fraction.
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode	Thermo-Fischer	4326659	The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo-Fischer	4311971	The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR
PBS	Gibco	20012-023	Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents.
Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit	Qiagen	74106	RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol.
QuantStudio 6	Thermo-Fischer	A43180	qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples
RLT Buffer	Qiagen	79216	Lysis Buffer from RNA clean-up kit
RPE Buffer	Qiagen	1018013	Wash Buffer from RNA clean-up kit
RW1 Buffer	Qiagen	1053394	Wash Buffer from RNA clean-up kit
Taqman Gene Expression Assays	Thermo-Fischer	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves.
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo-Fischer	4305719	TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time.
TUG1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00215501_m1	Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction.
UltraPure DEPC-Treated Water	Thermo-Fischer	750024	UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered.