Summary
הפרוטוקול הנוכחי מציע שיטה יעילה וגמישה לבודד RNA משברים גרעיניים וציטופלזמיים באמצעות תאים בתרבית, ולאחר מכן לאמת באמצעות qPCR. זה משמש למעשה כתחליף לערכות הכנת RNA אחרות.
Abstract
ההפרדה של רכיבים תוך-תאיים היא כלי מרכזי בביולוגיה התאית כבר שנים רבות, והיא מסוגלת לספק תובנה שימושית לגבי האופן שבו מיקומם יכול להשפיע על תפקודם. בפרט, ההפרדה בין RNA גרעיני וציטופלזמי הפכה חשובה בהקשר של תאים סרטניים והחיפוש אחר מטרות חדשות לתרופות. רכישת ערכות למיצוי RNA גרעיני-ציטופלזמי יכולה להיות יקרה כאשר רבים מהחומרים הדרושים נמצאים בסביבת מעבדה טיפוסית. בשיטה הנוכחית, שיכולה להחליף ערכות יקרות יותר או תהליכים אחרים שגוזלים זמן, נדרשים רק חיץ ליזיס תוצרת בית, צנטריפוגה וספסל ועמודות טיהור בידוד RNA כדי לבודד RNA גרעיני וציטופלזמי. חיץ ליזיס משמש לליזה עדינה של הקרום החיצוני של התא מבלי להשפיע על שלמות מעטפת הגרעין, ומאפשר שחרור מרכיביו התוך-תאיים. לאחר מכן, ניתן לבודד את הגרעינים על ידי צעד צנטריפוגה פשוט מכיוון שהם בעלי צפיפות גבוהה יותר מתמיסת הליזיס. צנטריפוגה משמשת להפרדת אזורים אלה בהתבסס על הבדלי הצפיפות שלהם כדי לבודד יסודות תת-תאיים בגרעין מאלה שבציטופלסמה. לאחר שהצנטריפוגה בודדה את הרכיבים השונים, נעשה שימוש בערכת ניקוי RNA לטיהור תכולת הרנ"א, ומתבצע qPCR כדי לאמת את איכות ההפרדה, המכומתת על ידי כמות הרנ"א הגרעיני והציטופלזמי בשברים השונים. הושגו רמות מובהקות סטטיסטית של הפרדה, הממחישות את יעילות הפרוטוקול. בנוסף, ניתן להתאים מערכת זו לבידוד סוגים שונים של RNA (סה"כ, רנ"א קטן וכו'), מה שמאפשר מחקר ממוקד של אינטראקציות ציטופלסמה-גרעין, ומסייע בהבנת ההבדלים בתפקוד הרנ"א השוכנים בגרעין ובציטופלסמה.
Introduction
שבירה תאית לרכיבים תת-תאיים מאפשרת בידוד ולימוד של תחומים ביוכימיים מוגדרים ומסייעת בקביעת לוקליזציה של תהליכים תאיים ספציפיים וכיצד זה עשוי להשפיע על תפקודם1. בידוד הרנ"א ממקומות תוך-תאיים שונים יכול לאפשר דיוק משופר של ניתוח גנטי וביוכימי של אירועים ברמת השעתוק ואינטראקציות אחרות בין הגרעין לציטופלסמה, המשמש כמטרה העיקרית של פרוטוקול2 הנוכחי. פרוטוקול זה פותח כדי להבטיח בידוד של רנ"א ציטופלזמי וגרעיני, לקבוע את תפקידם בהתאמה בייצוא גרעיני, ולהבין כיצד לוקליזציה תת-תאית של רנ"א בגרעין ובציטופלסמה עשויה להשפיע על תפקודם בתהליכים תאיים. באמצעות שימוש בחומרים מסביבת מעבדה טיפוסית, ניתן היה להשיג שבר גרעיני וציטופלזמי בצורה יעילה יותר וזולה יותר מאשר פרוטוקולים שנקבעו בעבר מבלי לסכן את איכות התוצאות3.
בנוסף, חילופי מולקולות בין הציטופלסמה לגרעין יכולים להיחקר ישירות על ידי הפרדת אזורים אלה. באופן ספציפי יותר, הבנת התמליל חיונית להבנת התפתחות ומחלות. עם זאת, רנ"א עשוי להיות ברמות הבשלה שונות בכל זמן נתון ויכול לסבך את הניתוח במורד הזרם. פרוטוקול זה מאפשר את היכולת לבודד RNA משברים תת-תאיים גרעיניים וציטופלזמיים, מה שיכול לסייע במחקרים של RNA ולאפשר הבנה טובה יותר של RNA מסוים מעניין, כגון לוקליזציה של RNA לא מקודד או ניתוח של צמתים splice בתוך הגרעין.
פרוטוקול זה הותאם לבידוד רנ"א ארוך ציטופלזמי וגרעיני, כולל mRNAs, rRNA ורנ"א ארוך שאינו מקודד (lncRNAs), בשל סלקטיביות הגודל של עמודת טיהור הרנ"א המנוצלת, הניתנת לשינוי כדי לבודד רנ"א אחרים בעלי עניין. בעבר, תפקודם של רנ"א ארוך, כגון mRNA ו-lncRNAs, היה תלוי מאוד בלוקליזציה שלהם בתוך התא 4,5. לכן, חקר הייצוא מהגרעין לתחומים תת-תאיים נעשה ממוקד יותר לקראת הבנת התפקיד שיכול להיות לייצוא רנ"א או רכיבים תאיים אחרים על התא. lncRNA משמשים דוגמה מצוינת לכך, שכן תרגומם והשפעותיהם לאחר מכן מסתמכים במידה רבה על קרבה ואינטראקציות עם צורות אחרות של RNA6. יתר על כן, חילופי יסודות תאיים בין אזורים גרעיניים וציטופלזמיים קשורים למנגנוני עמידות לטיפולים שונים בסרטן7. בידודם של תאים תוך-תאיים איפשר פיתוח מעכבי יצוא גרעיני, אשר הפחית את ההשפעות של מנגנוני התנגדות לטיפולים שונים8.
לאחר הפרדת RNA גרעיני וציטופלזמי, מבוצעים צעדים לטיהור הרנ"א מעניין. מכיוון שערכות טיהור RNA נמצאות בדרך כלל במעבדות ותפקידן לטהר ולבודד רנ"א ארוך, הן משרתות היטב את מטרת פרוטוקול זה. עבור טיהור RNA, יצירת יחסים של 260:280 גדולים מ-1.8 היא קריטית כדי להבטיח את איכות הדגימות לריצוף RNA או הליכים דומים אחרים הדורשים רמות גבוהות של טוהר ובידוד. ערכים לא סדירים של 260:280 מצביעים על זיהום פנול, מה שמדגים בידוד לקוי ומניב תוצאות לא מדויקות9.
לאחר השלמת טיהור הרנ"א ואושר כי ערכי 260:280 גבוהים מטווח מקובל, נעשה שימוש ב-qPCR כדי לאמת את תוצאות הבידוד של שברים גרעיניים וציטופלזמיים. בעשותם כן, נעשה שימוש בפריימרים ספציפיים לאזור העניין כדי להדגים את רמות השבר הגרעיני והציטופלזמי. בפרוטוקול זה, MALAT1 ו- TUG1 שימשו כסמנים גרעיניים וציטופלזמיים, בהתאמה10. יחד, הם מאפשרים הדגמה של רמות גבוהות של שבר גרעיני עם MALAT1, בעוד שבר ציטופלזמי צפוי להיות נמוך. לעומת זאת, כאשר משתמשים ב-TUG1, רמות השבר הציטופלזמי צפויות להיות גבוהות יותר מרמות השבר הגרעיני.
באמצעות פרוטוקול זה ניתן היה לבודד רנ"א על סמך מיקום פעולתם בתוך התא. בשל גישה נרחבת לחומרים רבים ושימוש רק בחיץ ליזה ובטכניקות צנטריפוגות מבוססות צפיפות במהלך ניסוי זה, היישום על סוגי RNA אחרים ורכיבים תאיים אחרים הוא נרחב. זה יכול לספק מידע חשוב על ידי שפיכת אור על אירועי ביטוי ספציפיים למיקום שאחרת לא ניתן היה להבחין בהם ללא הפרדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
תאי K562 משמשים במחקר הנוכחי. פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לעבודה עבור 1 x 10 6-5 x 106 מיליון תאים. עם זאת, ניתן להגדיל את ההליך עבור כמויות תאים גדולות יותר על ידי הגדלת הנפחים כראוי.
1. הכנת חיץ ליזיס 0.25x
- הכן מאגר ליזיס 0.25x על-ידי ערבוב הרכיבים הבאים המופיעים בטבלה 1A.
הערה: הדגימות דורשות כ- 300 μL של מאגר ליזיס 0.25x. נפח מומלץ = מספר הדגימות x 300 μL.
2. הפרדת שברים גרעיניים וציטופלזמיים
- גלולה את התאים באמצעות צינורות 1.5 מ"ל באמצעות צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 2000 x גרם (טמפרטורת החדר). השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה שואפת.
הערה: תאי K562 נוצלו במהלך פרוטוקול זה. עם זאת, ניתן להתאים את הפרוטוקול לקווי תאים שונים. - השהה מחדש את הגלולה ב 300 μL של חיץ ליזיס קר כקרח 0.25x.
הערה: יש לשמור על קרח למשך 2 דקות ולסובב את הצינור כל 45 שניות כדי להבטיח ליזה תקינה של התאים. - סובב את הצינורות במהירות הגבוהה ביותר (12,000 x גרם) ב- 4 ° C למשך 2 דקות.
- לאחר הצנטריפוגה, בזהירות להסיר את supernatant ומניחים אותו בתוך צינור חדש 1.5 מ"ל. זה יהיה החלק הציטופלזמי. כ 300 μL של החלק הציטופלזמי יושג.
- הגלולה הנותרת תהיה החלק הגרעיני. הוסף 500 μL של PBS קר כקרח לגלולה ולצנטריפוגה ב 2,000 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: במהלך שלב זה, דנ"א עודף מוסר.
3. ניקוי RNA באמצעות ערכת טיהור RNA
הערה: פרוטוקול זה הושג באמצעות ערכת טיהור RNA זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים).
- הפרידו בין דגימות הרנ"א הציטופלזמי לבין הדגימות הציטופלזמיות הגרעיניות (מכיוון ששלבי השבר משתנים ביניהן).
- כדי להפריד את החלק הציטופלזמי, הוסף 1,050 μL של חיץ ליזה RLT 3.5x (ראה טבלת חומרים) ומערבולת לזמן קצר. לאחר מכן, הוסף 750 μL של 90% אתנול וטען אותו על העמוד מתוך ערכת ניקוי RNA.
הערה: הפתרון חייב להיות מעורבב היטב לפני הטעינה על העמודה. - כדי להפריד את החלק הגרעיני, הוסף 600 μL של חיץ ליזה 3.5x ומערבולת. לאחר מכן, להוסיף 600 μL של 70% אתנול.
- כדי להפריד את החלק הציטופלזמי, הוסף 1,050 μL של חיץ ליזה RLT 3.5x (ראה טבלת חומרים) ומערבולת לזמן קצר. לאחר מכן, הוסף 750 μL של 90% אתנול וטען אותו על העמוד מתוך ערכת ניקוי RNA.
- טען שברים ציטופלזמיים וגרעיניים על עמודות RNA (ראה טבלת חומרים).
הערה: במשך שארית שלב 3, הן הדגימה הציטופלזמית והן הדגימה הגרעינית עוקבות אחר אותו הליך. עם זאת, ודא כי דגימות אלה נשארות בלתי תלויות זו בזו.- טען הן שברים ציטופלזמיים והן גרעיניים על עמודות RNA והסתובב במשך 30 שניות ב 8,000 x גרם בטמפרטורת החדר. השליכו את עודפי הזרימה דרכה.
- הוסיפו 350 מיקרוליטר של חיץ כביסה מערכת טיהור מסחרית (מאגר RW1, ראו טבלת חומרים), סובבו שוב והשליכו את הזרימה.
- הוסף תמיסת DNAse (1U/uL) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו 350 מיקרוליטר של חיץ כביסה, סובבו שוב והשליכו את הזרימה.
- הוסיפו 500 מיקרוליטר של חיץ כביסה עדין (RPE, ראו טבלת חומרים), סחררו שוב והשליכו את הזרימה. מוסיפים 500 μL של חיץ כביסה עדין, מסתובבים שוב, אבל רק למשך 2 דקות.
- העבר את העמוד לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל והוסף 30 מיקרוליטר מים לעמוד הסחרור. הניחו לטור לשבת דקה אחת לפני הסיבוב כלפי מטה.
4. אימות ההפרדה הגרעינית-ציטופלזמית
- ביצוע סינתזת cDNA
- לאחר מיצוי וטיהור תאים תת-תאיים של RNA, אשרו את הפרדת התאים באמצעות qPCR. לשם כך, ראשית, המירו את הרנ"א ל-cDNA באמצעות ערכה מסחרית בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים).
- הכן מאסטרמיקס תמלול הפוך. הוסף RNA של תבנית. לדגור תגובות thermocycler.
הערה: עבור הקסמרים אקראיים, פרמטרי הרכיבה המשמשים מופיעים בטבלה 2A. השתמש מיד בתגובת התעתיק ההפוך או אחסן בטמפרטורה של -20°C (טבלה 1B).
- בצע את תגובת השרשרת הכמותית של פולימראז (qPCR) וניתוח.
- לדלל את סינתזת cDNA עם מי DEPC (ראה טבלה של חומרים) כדי לקבל ריכוז סופי של 20 ng/mL.
- באמצעות תערובת מאסטר PCR, הכן את התגובה עבור כל דגימה באמצעות הוראות ידניות כמפורט להלן.
- לרכוש בדיקות מסחריות הדרושות כדי לזהות שבר ציטופלזמי וגרעיני. השתמש ב- MALAT1 כסמן גרעיני וב- TUG1 כסמן ציטופלזמי (ראה טבלת חומרים).
הערה: רצפים עבור MALAT1 ו- TUG1 מוצגים בטבלה 3. - חשב את הנפח של כל רכיב על-ידי הכפלת כל רכיב ב- 3 עבור כל אחד מהעותקים הטכניים המשוכפלים עבור המדגם הבודד.
- עבור כל דגימה גרעינית וציטופלזמית, רכוש את התערובות הבאות עבור כל אחת מהן: (א) שבר גרעיני עם MALAT1, (ב) מקטע ציטופלזמי עם MALAT1, (ג) שבר גרעיני עם TUG1, ו-(ד) שבר ציטופלזמי עם TUG1 (טבלה 1C).
- מערבלים לזמן קצר כדי לערבב תמיסות ולהעביר 20 μL מהתערובת לכל באר של צלחת תגובה אופטית (ראה טבלת חומרים).
- כסו את הצלחת בסרט דבק שקוף המשמש ל-qPCR (ראו טבלת חומרים) וצנטריפוגו את הצלחת לזמן קצר כדי למנוע בועות אוויר, ולאחר מכן סובבו את הדגימה כלפי מטה ב-300 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- באמצעות תוכנת תכנון וניתוח (ראה טבלת חומרים), בחר את העקומה הסטנדרטית עבור פרמטרי המחזור (טבלה 2B).
- באמצעות תוכנת qPCR, בחר הגדר הפעלה (איור משלים 1).
- בדף מאפייני קובץ נתונים, בחר פרמטרים של שיטה ומחזור קלט מטבלה 2B (איור משלים 2).
- לאחר הזנת פרמטרים של מחזור, בחר בכרטיסיה צלחת והזן את הדגימות שיש להפעיל (איור משלים 3). בחר התחל הפעלה.
הערה: השלבים המתוארים בוצעו במכשיר qPCR באמצעות תערובת אב זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים).
- ביצוע ניתוח נתונים
- לאחר השלמת ההפעלה, צור גיליון אלקטרוני של נתונים עם שם המדגם, שם היעד ומחזור הכימות (Cq) (טבלה משלימה 1).
- התחל עם דגימות MALAT1 כדי לחשב את החלק הגרעיני. החסר את המקטע הציטופלזמי MALAT1 מהמקטע הגרעיני MALAT1 (טבלה 4).
- לאחר מכן, חשב את ΔCq (2^(-value)) (טבלה 5).
- המשך עם דגימות MALAT1 כדי לחשב את המקטע הציטופלזמי, החסר את החלק הגרעיני MALAT1 מהמקטע הציטופלזמי MALAT1, ולאחר מכן חשב את ΔCq (2^(-value)) (טבלה 6).
הערה: כאשר מסתכלים על ΔCq, נצפה כי לשבר MALAT1 הגרעיני (הדגשה ירוקה) יש סמן MALAT1 גדול יותר מאשר לציטופלסמה (הדגשה אדומה), אך כעת נדרש אישור כדי להבטיח שהמקטע הציטופלזמי הוא בעיקר ציטופלסמה וכי החלק הגרעיני אינו מכיל זיהום ציטופלזמי. - עם דגימות TUG1, בצע את אותו חישוב כמו לעיל (שלבים 4.3.2-4.3.4) (טבלה 7).
הערה: כשמסתכלים על ΔCq, רואים שלשבר TUG1 הציטופלזמי (הדגשה ירוקה) יש סמן TUG1 גדול יותר מהשבר הגרעיני (הדגשה אדומה), ובכך מאשר הפרדה טובה בין שברים ציטופלזמיים וגרעיניים (טבלה 8, איור 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להבטיח בידוד גרעיני וציטופלזמי, בוצע qPCR כדי לאמת את התוצאות. בעשותם כן, נעשה שימוש בפריימרים ספציפיים לאזור העניין כדי להדגים את רמות השבר הגרעיני והציטופלזמי. במחקר זה, MALAT1 ו- TUG1 שימשו כפריימרים גרעיניים וציטופלזמיים, בהתאמה. יחד, הם מאפשרים הדגמה של רמות גבוהות של שבר גרעיני עם MALAT1 כבקרה חיובית עבור יסודות גרעיניים, בעוד ששבר ציטופלזמי צפוי להיות נמוך. לעומת זאת, כאשר TUG1 קיים כבקרה חיובית עבור יסודות ציטופלזמיים, אז רמות השבר הציטופלזמי צפויות להיות גבוהות יותר מרמות השבר הגרעיני. ניתן לראות זאת באיור 2, דוגמה לתוצאה חיובית המאשרת הפרדה בין רנ"א גרעיני וציטופלזמי.
תוצאה שלילית ניתן לראות באיור 3, שבו רמות של שבר ציטופלזמי נצפות במדגם עם MALAT1. הדבר מצביע על זיהום של RNA שבודד מהחלק הגרעיני, אולי בגלל ריכוזי ליזה נמוכים מדי או גבוהים מדי. מחקר זה בחן גם פריימרים אחרים, אולם MALAT1 ו-TUG1 הציגו את המתאם הגבוה ביותר עם הפרדה גרעינית וציטופלזמית, כפי שאושר באמצעות כתם מערבי ואלקטרופורזה של RNA, שאישרו את הטוהר והאיכות של הדגימות (איור 4 ואיור 5).
נוסף על כך, ניתן להדגים את הטוהר של תמציות גרעיניות וציטופלזמיות על-ידי כתם מערבי המשתמש בלמין כסמן לשבר גרעיני ובאלפא-טובולין כסמן חיובי עבור המקטע הציטופלזמי10, כפי שמוצג באיור 4. יש ביטוי ברור של למין אך ורק בתוך החלק הגרעיני, עם ביטוי ברור של אלפא-טובולין בתוך החלק הציטופלזמי, המציין טוהר יחסי בתוך כל דגימה.
בשל הנטייה של RNA להתפרק במהלך תהליך qPCR, יש צורך לאשר את איכות התשואה RNA באמצעות אלקטרופורזה RNA. אלקטרופורזה RNA בוצעה והדגימה איכות גבוהה של RNA בשל נוכחות שיא בתת-יחידת rRNA 32S, שהיא תכונה הקיימת רק בשברים גרעיניים. נוכחותו של שיא זה מעידה על טוהר גרעיני ושבר מספיק. לעומת זאת, לא נצפה שיא באלקטרופורזה של הרנ"א הציטופלזמי, מה שמדגים איכות גבוהה וזיהום מועט, אם בכלל, בדגימת הרנ"א הציטופלזמי11 (איור 5).
איור 1: סכמטיות של שלבי פרוטוקול. לאחר הטיפול בתאים, הם עוברים ליזה וצנטריפוגה לבידוד. לאחר מכן, בידוד RNA מבוצע, ו cDNA נוצר לפני אימות של בידוד באמצעות qPCR. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
תרשים 2: נתוני תוצאות חיוביות. האיור מדגיש את הצלחת הפרוטוקול המוצגת על ידי רמות גבוהות של הפרדה בין רכיבים גרעיניים וציטופלזמיים. MALAT1, פריימר RNA גרעיני, הציג רמות גבוהות יותר מובהקות סטטיסטית של החלק הגרעיני. ב-TUG1, פריימר RNA ציטופלזמי, נצפו רמות גבוהות יותר של מקטע ציטופלזמי מובהק סטטיסטית. מובהקות סטטיסטית גבוהה נצפתה בשתי הדגימות באמצעות מבחן t. עמ' < 0.0001. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
תרשים 3: נתוני תוצאות שליליות. האיור מדגיש דוגמה לתוצאות שליליות באמצעות פרוטוקול המוצג על ידי רמות גבוהות של הפרדה של רכיבים גרעיניים וציטופלזמיים. MALAT1, פריימר RNA גרעיני, הציג רמות שבר ציטופלזמי שנגרמו על ידי זיהום גרעיני. לא נצפו הבדלים בחדות סטטיסטית בין השברים באמצעות מבחן t. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: כתם מערבי שמדגים את טוהר השברים הציטופלזמיים והגרעיניים. האיור מדגיש כתם מערבי של השברים הגרעיניים והציטופלזמיים. לאמין שימש כדי לאמת את טוהר הדגימה הגרעינית, בעוד אלפא-טובולין שימש כדי להדגים את טוהר החלק הציטופלזמי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: אישור טוהר RNA של שברים ציטופלזמיים וגרעיניים באמצעות אלקטרופורזה של RNA. (A) אלקטרופורזה RNA של החלק הגרעיני. חץ מדגים 32S rRNA, אשר נצפה רק בשברים גרעיניים. (B) אלקטרופורזה RNA של החלק הציטופלזמי. היעדר שיא של 32S מצביע על טוהר RNA של חלק ציטופלזמי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: הרכב חיץ ליזיס, תערובות תגובה ודגימות. (A) הרכב של חיץ ליזיס 0.25x. (B) הרכב תערובת שעתוק לאחור המשמשת במהלך שעתוק RNA ל-cDNA. (C) הרכב דגימות גרעיניות וציטופלזמיות באמצעות ערכת שעתוק לאחור. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: פרמטרים מחזוריים. (A) פרמטרי הרכיבה עבור thermocycler. פרמטרים אלה נוצלו במהלך qPCR להגברה של רצף המטרה. (B) פרמטרי המחזור של דגימות גרעיניות וציטופלזמיות. פרמטרים אלה נוצלו במהלך qPCR להגברה של רצף המטרה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 3: רצפים של סמנים גרעיניים וציטופלזמיים. הטבלה כוללת את רצפי הסמנים המשמשים לאישור הפרדה גרעינית וציטופלזמית. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 4: נוהל חיסור שברים גרעיניים וציטופלזמיים MALAT1. דוגמה לגליון נתונים המשמש לחיסור מקטע גרעיני MALAT1 - מקטע ציטופלזמי MALAT1. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 5: הליך חישוב ΔCq (2^(-value). דוגמה לגליון הנתונים המשמש לחישוב ΔCq (2^(-value)). אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 6: נוהל חישוב שבר ציטופלזמי. דוגמה לגיליון הנתונים המשמש לחישוב החלק הציטופלזמי. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 7: נוהל חישוב שבר גרעיני. דוגמה לדף הנתונים המשמש לחישוב החלק הגרעיני. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 8: נוהל לאישור תוצאת שבר מוצלחת. דוגמה לגליון נתונים המשמש לאימות שבירה מוצלחת. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
איור משלים 1: תמונה של תוכנת תכנון וניתוח מכונות qPCR. תמונה המדגימה את פעולת מכונת qPCR. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 2: תמונה של qPCR "מאפייני קובץ נתונים". תמונה המדגימה את ההליך להגדרת פרמטרים להפעלת qPCR. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 3: תמונה של טעינת דגימות למכשיר qPCR. תמונה המדגימה את ההליך להוספת דגימות לתוכנת qPCR לניתוח. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה 1: גליון נתונים של שמות לדוגמה. דוגמה לגליון נתונים עם שם המדגם, שם היעד וערך Cq. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לאורך הפרוטוקול, ננקטו כמה צעדים כדי לייעל את האלמנטים כדי להיות היעילים ביותר עבור קו התא של עניין. בעוד השלבים בתוך הפרוטוקול הם פשוטים יחסית, ניתוח והתאמות קלות במהלך היבטים קריטיים של הפרוטוקול עשויים להיות נחוצים. השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול הוא שינוי ריכוז חיץ הליזיס לריכוז תקין בהתבסס על קו העניין של התא והמטרה התאית. מאחר שניצול חיץ הליזה תלוי במידה רבה בהפרעה של קרומי התא, קיימת שונות טבעית ביעילות של חיץ ליזה על קווי תאים שונים, שכן ישנם הבדלים קלים בשבריריות התא ובחדירות הממברנה בין קווי תאים שונים12. החל מקו בסיס של 1x lysis buffer, השלבים בפרוטוקול בוצעו תוך הפחתה הדרגתית של ריכוז חיץ הליזה ל 0.25x, אשר הצדיק תוצאות יעילות יותר. מכיוון שהניסוי נועד בסופו של דבר לבודד מספר רב של רכיבים תת-תאיים, הבטחת ריכוז חיץ הליזה מותאם לקו העניין של התא היא קריטית להשגת התפוקה הגבוהה ביותר והתוצאות הטובות ביותר.
בנוסף להתאמת ריכוזי חיץ הליזיס, חשוב לציין את שבריריות ה-RNA ואת זהירות הלחץ במהלך בידוד ה-RNA. RNA פגיע יותר לפירוק מאשר DNA ואלמנטים תאיים רבים אחרים, שכן קבוצת ההידרוקסיל 2' שלו יכולה לשמש כנקודת קישור ל- RNases, משפחה של אנזימים שיכולים לפרק RNA ולהוביל לתוצאות גרועות. RNases הם בעלי יכולת גבוהה לפירוק RNA, גם כאשר הם מוצגים בכמויות מינוריות13. מכיוון ש-RNases משתחררים מתאים במהלך ולאחר שלבי הליזה, יש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע זיהום, שעלול להוביל לפירוק RNA לא רצוי14. השלבים כוללים לבישת כפפות במהלך הניסוי והחלפתן לעתים קרובות כדי למנוע העברת RNases מהסביבה או משטחים לדגימות. בנוסף, יש להשתמש בפתרונות נטולי RNase, ולהשתמש בסביבת עבודה נפרדת בעת הטיפול ב- RNA. לבסוף, מכיוון ש-RNase יכול להיות עמיד מאוד בפני חיץ ליזה ודנטורציה, ניתן להשתמש במעכבי RNase כדי למתן את ההשפעות השליליות שלהם על בידוד RNA15.
בעוד השלבים במהלך הפרוטוקול הניבו תוצאות מוצלחות מאוד, יש כמה מגבלות. ראשית, בעוד RNA ורכיבים ציטופלזמיים יכולים להיות מבודדים במידה רבה זה מזה, לא ניתן להפריד לחלוטין בין השניים מבלי לסכן את איכות הרנ"א למחקר. בשל כך, כל מסקנה המבוססת על הבדלים בפעילות או בתפקוד של מולקולות מאזורים נפרדים אלה עשויה להיות מוטה מעט על ידי חוסר היכולת להפיק דגימות מבודדות לחלוטין. חשוב גם לציין כי אם הפרוטוקול מותאם למולקולות תא אחרות, כגון חלבונים, חלבונים מסוימים או אלמנטים תאיים אחרים עלולים להתפרק במהלך הפרדת תמציות הגרעין, מה שיוביל לאובדן פעילות וישפיע על התוצאות16. חשוב גם לציין כי במהלך פרוטוקול זה, qPCR של שברים גרעיניים וציטופלזמיים באמצעות MALAT1 ו- TUG1 בוצעו פשוט כאימות של טוהר ואיכות הדגימות. כדי להרחיב רעיון זה, הפרופורציות היחסיות של RNA גרעיני וציטופלזמי לא נותחו או הושוו במהלך פרוטוקול זה, שכן הוא שימש אך ורק לצורך אימות. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם, עם זאת, לשימושים אחרים, כגון השוואת הפרופורציות היחסיות של שברים גרעיניים וציטופלזמיים, אך ערכים אלה חייבים להיות מנורמלים לכמות הרנ"א הכולל לצורך ניתוח או השוואה מדויקים. השלבים לנרמול השברים הציטופלזמיים והגרעיניים לרמות RNA כוללות תוארו בעבר בפרוטוקולים אחרים11.
עם זאת, כאמור, שיטה זו משתמשת בחומרי מעבדה נפוצים כדי לייצר תמציות RNA באיכות גבוהה בצורה חסכונית. כמו כן, שיטה זו של לימוד אינטראקציות גרעיניות וציטופלזמיות מוכיחה להיות בין ההליכים היעילים ביותר בזמן. שימוש בערכות טוהר RNA מוביל לניקוי RNA יעיל מאוד ומסייע להבטיח רמות גבוהות של בידוד RNA מאזורים תאיים שונים, מה שמוביל לדגימות יעילות יותר למחקר. לבסוף, יכולת ההסתגלות של פרוטוקול זה מציגה את עצמה כיתרון מרכזי, שכן שינוי ריכוז חיץ הליזיס יכול לתת גישה לחקר קווי תאים רבים ושונים, וטכניקת הפרדת צפיפות כגון צנטריפוגה יכולה להוביל לבידוד של מספר אלמנטים תאיים שונים. ככל שמחקרים על אינטראקציות ציטופלזמיות וגרעיניות הופכים נפוצים יותר, ההשפעה של לוקליזציה על רכיבים תאיים יכולה להיות מובנת טוב יותר. ניתן לנתח את חילופי הדברים בין הציטופלסמה לגרעין, ולציין אם מולקולות מסוימות במהלך חילופים אלה יכולות להוביל להתפתחות סרטן, כפי שמחקרים על חלבונים גרעיניים כגון XPO1 הצביעו על17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
נתמך על ידי מענקים מהאגודה האמריקאית להמטולוגיה, קרן רוברט ווד ג'ונסון, קרן הצדקה דוריס דיוק, קרן אדוארד פ. אוונס והמכון הלאומי לסרטן (1K08CA230319).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent Tapestation | Agilent | G2991BA | The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples. |
| 0.5% Nonidet P-40 | Thermo-Fischer | 28324 | Used in the making of lysis buffer |
| 50 mM Tris-Cl pH 8.0 | Thermo-Fischer | 15568025 | Used in the making of lysis buffer |
| MALAT1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00273907_s1 | Utilized for confirmation of Nuclear fraction. |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode | Thermo-Fischer | 4326659 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers. |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo-Fischer | 4311971 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR |
| PBS | Gibco | 20012-023 | Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents. |
| Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol. |
| QuantStudio 6 | Thermo-Fischer | A43180 | qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | Lysis Buffer from RNA clean-up kit |
| RPE Buffer | Qiagen | 1018013 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
| RW1 Buffer | Qiagen | 1053394 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
| Taqman Gene Expression Assays | Thermo-Fischer | 4331182 | Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves. |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo-Fischer | 4305719 | TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time. |
| TUG1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00215501_m1 | Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction. |
| UltraPure DEPC-Treated Water | Thermo-Fischer | 750024 | UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered. |
References
- Conrad, T., Orom, U. A. Cellular fractionation and isolation of chromatin-associated RNA. Methods in Molecular Biology. 1468, 1-9 (2017).
- Bashirullah, A., Cooperstock, R. L., Lipshitz, H. D.
- Liu, X., Fagotto, F. A method to separate nuclear, cytosolic, and membrane-associated signaling molecules in cultured cells. Science Signaling. 4 (203), (2011).
- Jansen, R. P. mRNA localization: message on the move. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (4), 247-256 (2001).
- Carlevaro-Fita, J., Johnson, R. Global positioning system: Understanding long noncoding RNAs through subcellular localization. Molecular Cell. 73 (5), 869-883 (2019).
- Voit, E. O., Martens, H. A., Omholt, S. W. 150 years of the mass action law. PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004012 (2015).
- El-Tanani, M., Dakir el, H., Raynor, B., Morgan, R. Mechanisms of nuclear export in cancer and resistance to chemotherapy. Cancers (Basel). 8 (3), 35 (2016).
- Turner, J. G., Dawson, J., Sullivan, D. M. Nuclear export of proteins and drug resistance in cancer). Biochemical Pharmacology. 83 (8), 1021-1032 (2012).
- Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. Assessment of DNA yield and purity: an overlooked detail of PCR troubleshooting. Clinical Microbiology Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).
- Taylor, J., et al. Altered nuclear export signal recognition as a driver of oncogenesis altered nuclear export signal recognition drives oncogenesis. Cancer Discovery. 9 (10), 1452-1467 (2019).
- Ayupe, A. C., et al. Global analysis of biogenesis, stability and sub-cellular localization of lncRNAs mapping to intragenic regions of the human genome. RNA Biology. 12 (8), 877-892 (2015).
- Ghuysen, J. -M., Hakenbeck, R. Bacterial Cell Wall. , Elsevier. (1994).
- Fersht, A. Enzyme Structure and Mechanism. , (1985).
- Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. 2019 (2), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).
- Blumberg, D. D.
- Abmayr, S. M., Yao, T., Parmely, T., Workman, J. L. Preparation of nuclear and cytoplasmic extracts from mammalian cells. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 12, Unit 12.1 (2006).
- Taylor, J., et al. Selinexor, a first-in-class XPO1 inhibitor, is efficacious and tolerable in patients with myelodysplastic syndromes refractory to hypomethylating agents. Blood. 132, Supplement 1 233 (2018).
