Summary
Il presente protocollo offre un metodo efficiente e flessibile per isolare l'RNA da frazioni nucleari e citoplasmatiche utilizzando cellule in coltura e quindi convalidare utilizzando qPCR. Questo serve efficacemente come sostituto per altri kit di preparazione dell'RNA.
Abstract
La separazione dei componenti intracellulari è stata uno strumento chiave nella biologia cellulare per molti anni ed è stata in grado di fornire informazioni utili su come la loro posizione può influire sulla loro funzione. In particolare, la separazione dell'RNA nucleare e citoplasmatico è diventata importante nel contesto delle cellule tumorali e nella ricerca di nuovi bersagli per i farmaci. L'acquisto di kit per l'estrazione dell'RNA nucleare-citoplasmatico può essere costoso quando molti dei materiali richiesti possono essere trovati all'interno di un tipico ambiente di laboratorio. Utilizzando il metodo attuale, che può sostituire kit più costosi o altri processi che richiedono tempo, sono necessari solo un tampone di lisi fatto in casa, una centrifuga da banco e colonne di purificazione dell'isolamento dell'RNA per isolare l'RNA nucleare e citoplasmatico. Il tampone di lisi viene utilizzato per lisare delicatamente la membrana esterna della cellula senza compromettere l'integrità dell'involucro nucleare, consentendo il rilascio dei suoi componenti intracellulari. Quindi, i nuclei possono essere isolati con una semplice fase di centrifugazione poiché possiedono una densità maggiore rispetto alla soluzione di lisi. La centrifugazione viene utilizzata per separare queste aree in base alle loro differenze di densità per isolare gli elementi subcellulari nel nucleo da quelli nel citoplasma. Una volta che la centrifugazione ha isolato i diversi componenti, viene utilizzato un kit di pulizia dell'RNA per purificare il contenuto di RNA e viene eseguita la qPCR per convalidare la qualità della separazione, quantificata dalla quantità di RNA nucleare e citoplasmatico nelle diverse frazioni. Sono stati raggiunti livelli di separazione statisticamente significativi, che illustrano l'efficacia del protocollo. Inoltre, questo sistema può essere adattato per l'isolamento di diversi tipi di RNA (RNA totale, piccolo, ecc.), Il che consente uno studio mirato delle interazioni citoplasma-nucleo e aiuta a comprendere le differenze nella funzione dell'RNA che risiedono nel nucleo e nel citoplasma.
Introduction
Il frazionamento cellulare in componenti subcellulari consente l'isolamento e lo studio di domini biochimici definiti e aiuta a determinare la localizzazione di specifici processi cellulari e come questo può influire sulla loro funzione1. L'isolamento dell'RNA da diverse posizioni intracellulari può consentire una migliore accuratezza dell'analisi genetica e biochimica degli eventi a livello di trascrizione e di altre interazioni tra il nucleo e il citoplasma, che funge da scopo primario dell'attuale protocollo2. Questo protocollo è stato sviluppato per garantire l'isolamento degli RNA citoplasmatici e nucleari per determinare i loro rispettivi ruoli nell'esportazione nucleare e per capire come la localizzazione subcellulare degli RNA nel nucleo e nel citoplasma possa influire sulla loro funzione nei processi cellulari. Utilizzando materiali provenienti da un tipico ambiente di laboratorio, è stato possibile ottenere il frazionamento nucleare e citoplasmatico in modo più efficace e meno costoso rispetto ai protocolli precedentemente stabiliti senza compromettere la qualità dei risultati3.
Inoltre, lo scambio di molecole tra il citoplasma e il nucleo può essere studiato direttamente separando queste regioni. Più specificamente, la comprensione del trascrittoma è essenziale per comprendere lo sviluppo e la malattia. Tuttavia, gli RNA possono essere a diversi livelli di maturazione in un dato momento e possono complicare l'analisi a valle. Questo protocollo consente la capacità di isolare l'RNA da frazioni subcellulari nucleari e citoplasmatiche, che possono aiutare negli studi dell'RNA e consentire una migliore comprensione di un particolare RNA di interesse, come la localizzazione di RNA non codificanti o l'analisi delle giunzioni di giunzione all'interno del nucleo.
Questo protocollo è stato ottimizzato per isolare RNA lunghi citoplasmatici e nucleari, inclusi mRNA, rRNA e RNA lunghi non codificanti (lncRNA), a causa della selettività dimensionale della colonna di purificazione dell'RNA utilizzata, che può essere modificata per isolare altri RNA di interesse. In precedenza, la funzione degli RNA lunghi, come mRNA e lncRNA, dipendeva fortemente dalla loro rispettiva localizzazione all'interno della cellula 4,5. Pertanto, lo studio dell'esportazione dal nucleo ai domini subcellulari è diventato più mirato verso la comprensione del ruolo che l'esportazione di RNA o altri componenti cellulari può avere sulla cellula. Gli lncRNA servono come primo esempio di questo, poiché la loro traduzione e i successivi effetti si basano in gran parte sulla vicinanza e sulle interazioni con altre forme di RNA6. Inoltre, lo scambio di elementi cellulari tra regioni nucleari e citoplasmatiche è legato a meccanismi di resistenza a vari trattamenti antitumorali7. L'isolamento dei compartimenti intracellulari ha permesso lo sviluppo di inibitori nucleari dell'esportazione, che ha ridotto gli effetti dei meccanismi di resistenza a diverse terapie8.
Dopo aver separato l'RNA nucleare e citoplasmatico, vengono eseguiti passaggi per purificare l'RNA di interesse. Poiché i kit di purificazione dell'RNA si trovano comunemente all'interno dei laboratori e funzionano per purificare e isolare gli RNA lunghi, servono bene allo scopo di questo protocollo. Per la purificazione dell'RNA, generare rapporti 260:280 superiori a 1,8 è fondamentale per garantire la qualità dei campioni per il sequenziamento dell'RNA o altre procedure simili che richiedono alti livelli di purezza e isolamento. Valori irregolari di 260:280 indicano contaminazione da fenolo, dimostrando uno scarso isolamento e producendo risultati imprecisi9.
Una volta completata la purificazione dell'RNA e confermati valori 260:280 al di sopra di un intervallo accettabile, la qPCR è stata utilizzata per convalidare i risultati di isolamento delle frazioni nucleari e citoplasmatiche. In tal modo, sono stati utilizzati primer specifici per la regione di interesse per dimostrare i livelli di frazionamento nucleare e citoplasmatico. In questo protocollo, MALAT1 e TUG1 sono stati utilizzati come marcatori nucleari e citoplasmatici, rispettivamente10. Insieme, consentono la dimostrazione di alti livelli di frazionamento nucleare con MALAT1, mentre il frazionamento citoplasmatico dovrebbe essere basso. Al contrario, quando viene utilizzato TUG1, i livelli di frazionamento citoplasmatico dovrebbero essere superiori ai livelli di frazionamento nucleare.
Utilizzando questo protocollo, è stato possibile isolare gli RNA in base alla loro posizione di azione all'interno della cellula. A causa dell'ampio accesso a molti materiali e dell'utilizzo del solo tampone di lisi e delle tecniche di centrifugazione basate sulla densità durante questo esperimento, l'applicabilità ad altri tipi di RNA e ad altri componenti cellulari è diffusa. Questo può fornire informazioni importanti facendo luce su eventi di espressione specifici della posizione che altrimenti sarebbero indistinguibili senza separazione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Le cellule K562 sono utilizzate per il presente studio. Questo protocollo è stato ottimizzato per funzionare per 1 x 10 6-5 x 106 milioni di celle. Tuttavia, la procedura può essere scalata per quantità di celle maggiori aumentando i volumi in modo appropriato.
1. Preparazione del tampone di lisi 0,25x
- Preparare un tampone di lisi 0,25x miscelando i seguenti componenti forniti nella Tabella 1A.
NOTA: I campioni richiedono circa 300 μL di tampone di lisi 0,25x. Volume consigliato = numero di campioni x 300 μL.
2. Separazione delle frazioni nucleari e citoplasmatiche
- Pellettare le celle utilizzando tubi da 1,5 ml tramite centrifugazione per 5 minuti a 2000 x g (temperatura ambiente). Eliminare il surnatante utilizzando una pipetta aspirante.
NOTA: durante questo protocollo sono state utilizzate cellule K562. Tuttavia, il protocollo può essere adattato a varie linee cellulari. - Risospendere il pellet in 300 μL di tampone di lisi 0,25x ghiacciato.
NOTA: Tenere in ghiaccio per 2 minuti e ruotare il tubo ogni 45 s per garantire una corretta lisi delle cellule. - Ruotare i tubi alla massima velocità (12.000 x g) a 4 °C per 2 minuti.
- Dopo la centrifugazione, rimuovere con cautela il surnatante e metterlo in un nuovo tubo da 1,5 ml. Questa sarà la frazione citoplasmatica. Saranno raggiunti circa 300 μL della frazione citoplasmatica.
- Il pellet rimanente sarà la frazione nucleare. Aggiungere 500 μL di PBS ghiacciato al pellet e centrifugare a 2.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: Durante questa fase, il DNA in eccesso viene rimosso.
3. Pulizia dell'RNA utilizzando un kit di purificazione dell'RNA
NOTA: Questo protocollo è stato realizzato utilizzando un kit di purificazione dell'RNA disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali).
- Separare i campioni di RNA citoplasmatico e i campioni citoplasmatici nucleari (poiché le fasi di frazionamento variano tra di loro).
- Per separare la frazione citoplasmatica, aggiungere 1.050 μL di tampone di lisi RLT 3,5x (vedere la tabella dei materiali) e vortice brevemente. Quindi, aggiungere 750 μL di etanolo al 90% e caricarlo sulla colonna dal kit di pulizia dell'RNA.
NOTA: la soluzione deve essere ben miscelata prima di caricarla sulla colonna. - Per separare la frazione nucleare, aggiungere 600 μL di tampone di lisi 3,5x e vortice. Quindi, aggiungere 600 μL di etanolo al 70%.
- Per separare la frazione citoplasmatica, aggiungere 1.050 μL di tampone di lisi RLT 3,5x (vedere la tabella dei materiali) e vortice brevemente. Quindi, aggiungere 750 μL di etanolo al 90% e caricarlo sulla colonna dal kit di pulizia dell'RNA.
- Caricare sia le frazioni citoplasmatiche che quelle nucleari su colonne di RNA (vedi Tabella dei materiali).
NOTA: Per il resto della fase 3, sia i campioni citoplasmatici che quelli nucleari seguono la stessa procedura. Tuttavia, assicurarsi che questi campioni rimangano indipendenti l'uno dall'altro.- Caricare sia le frazioni citoplasmatiche che nucleari su colonne di RNA e ruotare per 30 s a 8.000 x g a temperatura ambiente. Scartare il flusso in eccesso attraverso.
- Aggiungere 350 μL di tampone di lavaggio da un kit di purificazione disponibile in commercio (tampone RW1, vedere la tabella dei materiali), centrifugare di nuovo ed eliminare il flusso attraverso.
- Aggiungere la soluzione di DNAse (1U/uL) per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere 350 μL di tampone di lavaggio, girare di nuovo e scartare il flusso attraverso.
- Aggiungere 500 μL di tampone di lavaggio delicato (RPE; vedere la tabella dei materiali), centrifugare di nuovo ed eliminare il flusso attraverso. Aggiungere 500 μL di tampone di lavaggio delicato, centrifugare di nuovo, ma solo per 2 minuti.
- Spostare la colonna in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 ml e aggiungere 30 μL di acqua alla colonna di rotazione. Lasciare riposare la colonna per 1 minuto prima di girare.
4. Validazione della separazione nucleare-citoplasmatica
- Eseguire la sintesi del cDNA
- Una volta estratti e purificati i compartimenti subcellulari di RNA, confermare la separazione dei compartimenti mediante qPCR. Per fare ciò, in primo luogo, convertire l'RNA in cDNA utilizzando un kit disponibile in commercio seguendo le istruzioni del produttore (vedi Tabella dei materiali).
- Preparare il mastermix di trascrittasi inversa. Aggiungi modello di RNA. Incubare le reazioni in un termociclatore.
NOTA: per gli esameri casuali, i parametri ciclici utilizzati sono riportati nella tabella 2A. Usare immediatamente la reazione della trascrittasi inversa o conservare a -20 °C (Tabella 1B).
- Eseguire la reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) e l'analisi.
- Diluire la sintesi del cDNA con acqua DEPC (vedere Tabella dei Materiali) per ottenere una concentrazione finale di 20 ng/mL.
- Utilizzando una miscela master PCR, preparare la reazione per ciascun campione utilizzando le istruzioni manuali elencate di seguito.
- Acquisire sonde commerciali necessarie per rilevare il frazionamento citoplasmatico e nucleare. Utilizzare MALAT1 come marcatore nucleare e TUG1 come marcatore citoplasmatico (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: le sequenze per MALAT1 e TUG1 sono fornite nella Tabella 3. - Calcolare il volume di ciascun componente moltiplicando ciascun componente per 3 per ciascuna delle repliche tecniche per il singolo campione.
- Per ciascun campione nucleare e citoplasmatico, acquisire le seguenti miscele per ciascuno: (a) frazione nucleare con MALAT1, (b) frazione citoplasmatica con MALAT1, (c) frazione nucleare con TUG1 e (d) frazione citoplasmatica con TUG1 (tabella 1C).
- Vortice per miscelare brevemente le soluzioni e trasferire 20 μL della miscela in ciascun pozzetto di una piastra di reazione ottica (vedi tabella dei materiali).
- Coprire la piastra con una pellicola adesiva trasparente utilizzata per qPCR (vedere Tabella dei materiali) e centrifugare brevemente la piastra per eliminare le bolle d'aria, quindi ruotare il campione a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Utilizzando un software di progettazione e analisi (vedi Tabella dei materiali), selezionare la curva standard per i parametri ciclici (Tabella 2B).
- Utilizzando il software qPCR, selezionare Imposta esecuzione (Figura supplementare 1).
- Nella pagina Proprietà file di dati selezionare Metodo e parametri del ciclo di input dalla tabella 2B (figura supplementare 2).
- Dopo aver inserito i parametri del ciclo, selezionare la scheda Piastra e immettere i campioni da eseguire (Figura 3 supplementare). Seleziona Avvia esecuzione.
NOTA: I passaggi descritti sono stati eseguiti in una macchina qPCR utilizzando un master mix disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali).
- Eseguire l'analisi dei dati
- Al termine dell'esecuzione, creare un foglio di calcolo dei dati con il nome dell'esempio, il nome della destinazione e il ciclo di quantificazione (Cq) (tabella supplementare 1).
- Inizia con i campioni MALAT1 per calcolare la frazione nucleare. Sottrarre la frazione citoplasmatica MALAT1 dalla frazione nucleare MALAT1 (Tabella 4).
- Quindi, calcolare il ΔCq (2^(-valore)) (Tabella 5).
- Continuare con i campioni MALAT1 per calcolare la frazione citoplasmatica, sottrarre la frazione nucleare MALAT1 dalla frazione citoplasmatica MALAT1 e quindi calcolare il ΔCq (2^(-valore)) (Tabella 6).
NOTA: Osservando il ΔCq, si osserva che la frazione nucleare MALAT1 (evidenziazione verde) ha un marcatore MALAT1 maggiore rispetto al citoplasma (evidenziazione rossa), ma ora è necessaria la conferma per garantire che la frazione citoplasmatica sia prevalentemente citoplasma e che la frazione nucleare non contenga contaminazione citoplasmatica. - Con i campioni TUG1, eseguire lo stesso calcolo di cui sopra (passaggi 4.3.2-4.3.4) (Tabella 7).
NOTA: Osservando il ΔCq, si osserva che la frazione citoplasmatica TUG1 (evidenziazione verde) ha un marcatore TUG1 maggiore rispetto alla frazione nucleare (evidenziazione rossa), confermando così una buona separazione delle frazioni citoplasmatiche e nucleari (Tabella 8, Figura 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Per garantire che l'isolamento nucleare e citoplasmatico fosse stato raggiunto, è stata eseguita una qPCR per convalidare i risultati. In tal modo, sono stati utilizzati primer specifici per la regione di interesse per dimostrare i livelli di frazionamento nucleare e citoplasmatico. In questo studio, MALAT1 e TUG1 sono stati utilizzati rispettivamente come primer nucleari e citoplasmatici. Insieme, consentono la dimostrazione di alti livelli di frazionamento nucleare con MALAT1 come controllo positivo per gli elementi nucleari, mentre il frazionamento citoplasmatico dovrebbe essere basso. Al contrario, quando TUG1 è presente come controllo positivo per gli elementi citoplasmatici, allora i livelli di frazionamento citoplasmatico dovrebbero essere superiori ai livelli di frazionamento nucleare. Questo può essere visto nella Figura 2, un esempio di un risultato positivo che conferma la separazione dell'RNA nucleare e citoplasmatico.
Un risultato negativo può essere visto nella Figura 3, in cui si osservano livelli di frazionamento citoplasmatico nel campione con MALAT1. Ciò indica la contaminazione dell'RNA isolato dalla frazione nucleare, potenzialmente dovuta a concentrazioni di lisi troppo basse o troppo alte. Questo studio ha sperimentato anche altri primer, ma MALAT1 e TUG1 hanno mostrato la più alta correlazione con la separazione nucleare e citoplasmatica, come confermato attraverso un western blot e l'elettroforesi dell'RNA, che ha confermato la purezza e la qualità dei campioni (Figura 4 e Figura 5).
Inoltre, la purezza degli estratti nucleari e citoplasmatici può essere dimostrata da un western blot che utilizza la lamina come marcatore per la frazione nucleare e l'alfa-tubulina come marcatore positivo per la frazione citoplasmatica10, come mostrato nella Figura 4. C'è una chiara espressione di lamina solo all'interno della frazione nucleare, con una chiara espressione di alfa-tubulina all'interno della frazione citoplasmatica, indicando una purezza relativa all'interno di ciascun campione.
A causa della tendenza dell'RNA a degradarsi durante il processo di qPCR, è necessario confermare la qualità della resa dell'RNA utilizzando l'elettroforesi dell'RNA. L'elettroforesi dell'RNA è stata eseguita e ha dimostrato un'alta qualità dell'RNA dovuta alla presenza di un picco nella subunità di rRNA 32S, che è una caratteristica presente solo nelle frazioni nucleari. La presenza di questo picco indica purezza nucleare e frazionamento sufficiente. Al contrario, non è stato osservato alcun picco nell'elettroforesi dell'RNA citoplasmatico, dimostrando alta qualità e poca o nessuna contaminazione nel campione di RNA citoplasmatico11 (Figura 5).
Figura 1: Schema dei passaggi del protocollo. Dopo che le cellule sono state trattate, vengono lisate e centrifugate per l'isolamento. Successivamente, viene eseguito l'isolamento dell'RNA e il cDNA viene generato prima della convalida dell'isolamento utilizzando la qPCR. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Dati di risultato positivi. La figura evidenzia il successo del protocollo esibito dagli alti livelli di separazione dei componenti nucleari e citoplasmatici. MALAT1, un primer di RNA nucleare, ha mostrato livelli statisticamente significativi più elevati della frazione nucleare. In TUG1, un primer dell'RNA citoplasmatico, sono stati osservati livelli più elevati statisticamente significativi di frazione citoplasmatica. Un'elevata significatività statistica è stata osservata in entrambi i campioni tramite t-test. p < 0,0001. Le barre di errore indicano una deviazione standard. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Dati sui risultati negativi. La figura evidenzia un esempio di risultati negativi utilizzando il protocollo esibito da alti livelli di separazione delle componenti nucleari e citoplasmatiche. MALAT1, un primer di RNA nucleare, ha mostrato livelli di frazione citoplasmatica causati dalla contaminazione nucleare. Non si osservano differenze nella significatività statistica tra le frazioni tramite t-test. Le barre di errore indicano una deviazione standard. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Western Blot che dimostra la purezza delle frazioni citoplasmatiche e nucleari. La figura evidenzia una macchia occidentale delle frazioni nucleari e citoplasmatiche. Lamin è stato utilizzato per verificare la purezza del campione nucleare, mentre l'alfa-tubulina è stata utilizzata per dimostrare la purezza della frazione citoplasmatica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Conferma della purezza dell'RNA delle frazioni citoplasmatiche e nucleari tramite elettroforesi dell'RNA. (A) Elettroforesi dell'RNA della frazione nucleare. Arrow dimostra l'rRNA 32S, che si osserva solo nelle frazioni nucleari. (B) Elettroforesi dell'RNA della frazione citoplasmatica. L'assenza di un picco 32S indica la purezza dell'RNA della frazione citoplasmatica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella 1: Composizione del tampone di lisi, delle miscele di reazione e dei campioni. (A) Composizione del tampone di lisi 0,25x. (B) Composizione del mix di trascrittasi inversa utilizzato durante la trascrizione di RNA in cDNA. (C) Composizione di campioni nucleari e citoplasmatici utilizzando un kit di trascrittasi inversa. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Parametri ciclici. (A) I parametri di ciclo per il termociclatore. Questi parametri sono stati utilizzati durante la qPCR per l'amplificazione della sequenza target. (B) I parametri ciclici per i campioni nucleari e citoplasmatici. Questi parametri sono stati utilizzati durante la qPCR per l'amplificazione della sequenza target. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 3: Sequenze di marcatori nucleari e citoplasmatici. La tabella include le sequenze dei marcatori utilizzati per confermare la separazione nucleare e citoplasmatica. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 4: Procedura per sottrarre le frazioni nucleari e citoplasmatiche MALAT1. Un esempio di scheda tecnica utilizzata per sottrarre la frazione nucleare MALAT1 - la frazione citoplasmatica MALAT1. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 5: Procedura per il calcolo di ΔCq (2^(-valore). Un esempio della scheda tecnica utilizzata per calcolare il ΔCq (2^(-valore)). Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 6: Procedura per il calcolo della frazione citoplasmatica. Un esempio della scheda tecnica utilizzata per calcolare la frazione citoplasmatica. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 7: Procedura per il calcolo della frazione nucleare. Un esempio della scheda tecnica utilizzata per calcolare la frazione nucleare. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 8: Procedura per confermare il successo del risultato del frazionamento. Un esempio di scheda tecnica utilizzata per verificare il corretto frazionamento. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Figura supplementare 1: Immagine del software di progettazione e analisi della macchina qPCR. Un'immagine che dimostra il funzionamento della macchina qPCR. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: Immagine di qPCR "Proprietà del file di dati". Un'immagine che illustra la procedura per l'impostazione dei parametri per l'esecuzione della qPCR. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 3: Immagine del caricamento dei campioni nella macchina qPCR. Un'immagine che illustra la procedura per l'aggiunta di campioni al software qPCR per l'analisi. Clicca qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare 1: scheda tecnica del nome di esempio. Esempio di foglio dati con il nome dell'esempio, il nome della destinazione e il valore Cq. Clicca qui per scaricare questo file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Durante tutto il protocollo, sono stati presi alcuni passaggi per ottimizzare gli elementi per essere più efficaci per la linea cellulare di interesse. Mentre i passaggi all'interno del protocollo sono relativamente semplici, possono essere necessarie analisi e piccoli aggiustamenti durante gli aspetti critici del protocollo. Il passo più critico nel protocollo è modificare la concentrazione del tampone di lisi in una concentrazione appropriata basata sulla linea cellulare di interesse e sul bersaglio cellulare. Poiché l'utilizzo del tampone di lisi dipende in gran parte dalla rottura delle membrane cellulari, vi è una varianza naturale nell'efficacia del tampone di lisi su diverse linee cellulari in quanto vi sono lievi differenze nella fragilità cellulare e nella permeabilità della membrana tra le diverse linee cellulari12. A partire da un basale di 1x tampone di lisi, le fasi del protocollo sono state eseguite riducendo gradualmente la concentrazione del tampone di lisi a 0,25x, il che ha garantito risultati più efficaci. Poiché l'esperimento mira a isolare in definitiva un gran numero di componenti subcellulari, garantire che la concentrazione del tampone di lisi sia ottimizzata per la linea cellulare di interesse è fondamentale per ottenere la massima resa e i migliori risultati.
Oltre alla regolazione delle concentrazioni tampone di lisi, è importante notare la fragilità dell'RNA e la cautela dello stress durante l'isolamento dell'RNA. L'RNA è più vulnerabile alla degradazione rispetto al DNA e a molti altri elementi cellulari, poiché il suo gruppo ossidrile 2' può servire come punto di legame per le RNasi, una famiglia di enzimi che possono degradare l'RNA e portare a scarsi risultati. Le RNasi sono altamente capaci di degradazione dell'RNA, anche se presentate in quantità minori13. Poiché le RNasi vengono rilasciate dalle cellule durante e dopo le fasi di lisi, è necessario prestare attenzione per prevenire la contaminazione, che può portare a una degradazione indesiderata dell'RNA14. I passaggi includono indossare guanti durante l'esperimento e cambiarli spesso per evitare di trasmettere RNasi dall'ambiente o dalle superfici ai campioni. Inoltre, dovrebbero essere utilizzate soluzioni prive di RNasi e uno spazio di lavoro separato dovrebbe essere utilizzato durante la gestione dell'RNA. Infine, poiché la RNasi può essere molto resistente al tampone di lisi e alla denaturazione, gli inibitori della RNasi possono essere utilizzati per mitigare i loro effetti negativi sull'isolamento dell'RNA15.
Mentre i passaggi durante il protocollo hanno prodotto risultati di grande successo, ci sono alcune limitazioni. Per cominciare, mentre l'RNA e i componenti citoplasmatici possono essere in gran parte isolati l'uno dall'altro, i due non possono essere completamente separati senza compromettere la qualità dell'RNA per lo studio. A causa di ciò, qualsiasi conclusione basata su differenze nell'attività o nella funzione delle molecole di queste regioni separate può essere leggermente distorta dall'incapacità di derivare campioni completamente isolati. È anche importante notare che se il protocollo è adattato ad altre molecole cellulari, come le proteine, alcune proteine o altri elementi cellulari possono essere degradati durante la separazione degli estratti nucleari, portando a una perdita di attività e influenzando i risultati16. È anche importante notare che durante questo protocollo, la qPCR delle frazioni nucleari e citoplasmatiche utilizzando MALAT1 e TUG1 è stata eseguita semplicemente come convalida della purezza e della qualità dei campioni. Per espandere questa idea, le proporzioni relative di RNA nucleare e citoplasmatico non sono state analizzate o confrontate durante questo protocollo, poiché è stato utilizzato esclusivamente a scopo di convalida. Questo protocollo può essere adattato, tuttavia, ad altri usi, come confrontare le proporzioni relative delle frazioni nucleari e citoplasmatiche, ma questi valori devono essere normalizzati alla quantità di RNA totale per un'analisi o un confronto accurato. I passaggi per normalizzare le frazioni citoplasmatiche e nucleari ai livelli totali di RNA sono stati precedentemente descritti in altri protocolli11.
Tuttavia, come accennato in precedenza, questo metodo utilizza materiali di laboratorio comuni per generare estratti di RNA di alta qualità in modo economico. Inoltre, questo metodo di studio delle interazioni nucleari e citoplasmatiche si rivela tra le procedure più efficaci in termini di tempo. L'uso di kit di purezza dell'RNA porta a una pulizia dell'RNA molto efficace e aiuta a garantire alti livelli di isolamento dell'RNA da diverse regioni cellulari, portando a campioni più efficaci da studiare. Infine, l'adattabilità di questo protocollo si presenta come un vantaggio chiave, in quanto la modifica della concentrazione del tampone di lisi può dare accesso allo studio di molte linee cellulari diverse e una tecnica di separazione della densità come la centrifugazione può portare all'isolamento di diversi elementi cellulari. Man mano che gli studi sulle interazioni citoplasmatiche e nucleari diventano più diffusi, l'impatto della localizzazione sui componenti cellulari può essere meglio compreso. Lo scambio tra il citoplasma e il nucleo può essere analizzato, indicando se alcune molecole durante questi scambi possono portare allo sviluppo del cancro, come hanno indicato studi su proteine nucleari come XPO117.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Sostenuto da sovvenzioni dell'American Society of Hematology, della Robert Wood Johnson Foundation, della Doris Duke Charitable Foundation, della Edward P. Evans Foundation e del National Cancer Institute (1K08CA230319).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent Tapestation | Agilent | G2991BA | The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples. |
| 0.5% Nonidet P-40 | Thermo-Fischer | 28324 | Used in the making of lysis buffer |
| 50 mM Tris-Cl pH 8.0 | Thermo-Fischer | 15568025 | Used in the making of lysis buffer |
| MALAT1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00273907_s1 | Utilized for confirmation of Nuclear fraction. |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode | Thermo-Fischer | 4326659 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers. |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo-Fischer | 4311971 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR |
| PBS | Gibco | 20012-023 | Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents. |
| Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol. |
| QuantStudio 6 | Thermo-Fischer | A43180 | qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | Lysis Buffer from RNA clean-up kit |
| RPE Buffer | Qiagen | 1018013 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
| RW1 Buffer | Qiagen | 1053394 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
| Taqman Gene Expression Assays | Thermo-Fischer | 4331182 | Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves. |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo-Fischer | 4305719 | TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time. |
| TUG1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00215501_m1 | Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction. |
| UltraPure DEPC-Treated Water | Thermo-Fischer | 750024 | UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered. |
References
- Conrad, T., Orom, U. A. Cellular fractionation and isolation of chromatin-associated RNA. Methods in Molecular Biology. 1468, 1-9 (2017).
- Bashirullah, A., Cooperstock, R. L., Lipshitz, H. D.
- Liu, X., Fagotto, F. A method to separate nuclear, cytosolic, and membrane-associated signaling molecules in cultured cells. Science Signaling. 4 (203), (2011).
- Jansen, R. P. mRNA localization: message on the move. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (4), 247-256 (2001).
- Carlevaro-Fita, J., Johnson, R. Global positioning system: Understanding long noncoding RNAs through subcellular localization. Molecular Cell. 73 (5), 869-883 (2019).
- Voit, E. O., Martens, H. A., Omholt, S. W. 150 years of the mass action law. PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004012 (2015).
- El-Tanani, M., Dakir el, H., Raynor, B., Morgan, R. Mechanisms of nuclear export in cancer and resistance to chemotherapy. Cancers (Basel). 8 (3), 35 (2016).
- Turner, J. G., Dawson, J., Sullivan, D. M. Nuclear export of proteins and drug resistance in cancer). Biochemical Pharmacology. 83 (8), 1021-1032 (2012).
- Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. Assessment of DNA yield and purity: an overlooked detail of PCR troubleshooting. Clinical Microbiology Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).
- Taylor, J., et al. Altered nuclear export signal recognition as a driver of oncogenesis altered nuclear export signal recognition drives oncogenesis. Cancer Discovery. 9 (10), 1452-1467 (2019).
- Ayupe, A. C., et al. Global analysis of biogenesis, stability and sub-cellular localization of lncRNAs mapping to intragenic regions of the human genome. RNA Biology. 12 (8), 877-892 (2015).
- Ghuysen, J. -M., Hakenbeck, R. Bacterial Cell Wall. , Elsevier. (1994).
- Fersht, A. Enzyme Structure and Mechanism. , (1985).
- Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. 2019 (2), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).
- Blumberg, D. D.
- Abmayr, S. M., Yao, T., Parmely, T., Workman, J. L. Preparation of nuclear and cytoplasmic extracts from mammalian cells. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 12, Unit 12.1 (2006).
- Taylor, J., et al. Selinexor, a first-in-class XPO1 inhibitor, is efficacious and tolerable in patients with myelodysplastic syndromes refractory to hypomethylating agents. Blood. 132, Supplement 1 233 (2018).
