Summary
本プロトコルは、培養細胞を用いて核および細胞質画分からRNAを単離し、qPCRを用いて検証するための効率的で柔軟な方法を提供します。これは、他のRNA調製キットの代替品として効果的に機能します。
Abstract
細胞内成分の分離は、長年にわたって細胞生物学の重要なツールであり、それらの位置がそれらの機能にどのように影響するかについての有用な洞察を提供することができました。特に、核RNAと細胞質RNAの分離は、癌細胞の文脈や薬物の新しい標的の探求において重要になっています。核細胞質RNA抽出用のキットの購入は、必要な材料の多くが一般的なラボ環境で見つかる場合、コストがかかる可能性があります。より高価なキットやその他の時間のかかるプロセスを置き換えることができる現在の方法を使用する場合、核および細胞質RNAを単離するために必要なのは、自家製の溶解バッファー、ベンチトップ遠心分離機、およびRNA単離精製カラムのみです。溶解バッファーは、核膜の完全性に影響を与えることなく細胞の外膜を穏やかに溶解するために使用され、細胞内成分を放出することができます。次いで、核は溶解溶液よりも高い密度を有するので、単純な遠心分離工程によって単離することができる。遠心分離を利用して、密度の違いに基づいてこれらの領域を分離し、核内の細胞内要素を細胞質内の細胞内要素から分離します。遠心分離でさまざまな成分が単離されたら、RNAクリーンアップキットを使用してRNA含有量を精製し、qPCRを実行して分離品質を検証し、さまざまな画分中の核および細胞質RNAの量で定量します。統計的に有意なレベルの分離が達成され、プロトコルの有効性が示されました。さらに、このシステムは、さまざまな種類のRNA(総RNA、低分子RNAなど)の単離に適応できるため、細胞質と核の相互作用を標的に研究することができ、核と細胞質に存在するRNAの機能の違いを理解するのに役立ちます。
Introduction
細胞内成分への細胞分画は、定義された生化学的ドメインの単離と研究を可能にし、特定の細胞プロセスの局在とこれがそれらの機能にどのように影響するかを決定するのに役立ちます1。異なる細胞内位置からのRNAの単離は、転写レベルイベントおよび核と細胞質間の他の相互作用の遺伝的および生化学的分析の精度を向上させることができ、これは現在のプロトコル2の主な目的として機能します。このプロトコルは、細胞質RNAと核RNAを確実に分離して、核輸送におけるそれぞれの役割を決定し、核および細胞質内のRNAの細胞内局在が細胞プロセスにおけるそれらの機能にどのように影響するかを理解するために開発されました。典型的な実験室環境からの材料を使用して、結果の質を損なうことなく、以前に確立されたプロトコルよりも効果的かつ安価に核および細胞質分画を達成することができました3。
さらに、細胞質と核との間の分子の交換は、これらの領域を分離することによって直接研究することができる。具体的には、トランスクリプトームの理解は、発生や疾患を理解するために不可欠です。ただし、RNAはいつでも異なる成熟レベルにある可能性があり、ダウンストリーム分析を複雑にする可能性があります。このプロトコルにより、核および細胞質細胞内画分からRNAを単離することができ、RNAの研究に役立ち、ノンコーディングRNAの局在化や核内のスプライス接合部の分析など、関心のある特定のRNAをよりよく理解することができます。
このプロトコルは、mRNA、rRNA、および長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)を含む細胞質および核長鎖RNAの単離に最適化されており、利用されるRNA精製カラムのサイズ選択性により、目的の他のRNAを単離するために変更することができます。以前は、mRNAやlncRNAなどの長鎖RNAの機能は、細胞内でのそれぞれの局在に大きく依存していました4,5。したがって、核から細胞内ドメインへの輸出の研究は、RNAまたは他の細胞成分の輸出が細胞に与えることができる役割を理解することに向けられています。lncRNAは、その翻訳とその後の効果が他の形態のRNA6との近接性と相互作用に大きく依存するため、この代表的な例として機能します。さらに、核領域と細胞質領域間の細胞要素の交換は、さまざまな癌治療に対する耐性メカニズムに関連しています7。細胞内コンパートメントの単離により、核輸送阻害剤の開発が可能になり、さまざまな治療法に対する耐性メカニズムの影響が減少しました8。
核RNAおよび細胞質RNAを分離した後、目的のRNAを精製するステップが実行される。RNA精製キットは実験室で一般的に見られ、長いRNAを精製および分離するために機能するため、このプロトコルの目的を十分に果たします。RNA精製では、1.8を超える260:280の比率を生成することが、RNAシーケンシングまたは高レベルの純度と単離を必要とするその他の同様の手順のサンプルの品質を確保するために重要です。不規則な260:280の値はフェノール汚染を示し、分離性が不十分で不正確な結果をもたらします9。
RNA精製が完了し、260:280の値が許容範囲を超えていることが確認されたら、qPCRを利用して核画分と細胞質画分の単離結果を検証しました。その際、関心領域に特異的なプライマーを使用して、核および細胞質分画レベルを実証しました。このプロトコルでは、MALAT1およびTUG1がそれぞれ核マーカーおよび細胞質マーカーとして使用された10。これらを組み合わせることで、MALAT1による高レベルの核分画の実証が可能になりますが、細胞質分画は低いと予想されます。逆に、TUG1を使用した場合、細胞質分画レベルは核分画レベルよりも高くなると予想されます。
このプロトコルを利用することで、細胞内での作用位置に基づいてRNAを単離することが可能であった。この実験では、多くの材料への広範なアクセスと溶解バッファーおよび密度ベースの遠心分離技術のみの利用により、他のRNAタイプおよび他の細胞成分への適用性が広まっています。これは、分離しなければ区別できない場所固有の発現イベントに光を当てることによって重要な情報を提供することができます。
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Protocol
K562細胞は本研究に使用されます。このプロトコルは、1 x 106-5 x 10600 万セルで動作するように最適化されています。ただし、この手順は、容量を適切に増やすことで、より大きなセル量に合わせてスケールアップできます。
1. 0.25倍溶解バッファーの調製
- 表1Aに示す以下の成分を混合することにより、0.25倍の溶解バッファーを調製した。
注:サンプルには約300 μLの0.25倍溶解バッファーが必要です。推奨容量 = サンプル数 x 300 μL。
2.核画分と細胞質画分の分離
- 1.5 mLチューブを使用して、2000 x g(室温)で5分間遠心分離して細胞をペレット化します。吸引ピペットを使用して上清を廃棄する。
注:K562細胞は、このプロトコル中に利用されました。しかしながら、このプロトコルは様々な細胞株に適合させることができる。 - ペレットを300 μLの氷冷0.25倍溶解バッファーに再懸濁します。
注意: 氷上で2分間保ち、45秒ごとにチューブを回転させて、細胞が適切に溶解するようにします。 - チューブを最高速度(12,000 x g)で4°Cで2分間回転させます。
- 遠心分離後、上清を注意深く取り出し、新しい1.5 mLチューブに入れます。これが細胞質画分になります。約300μLの細胞質画分が得られます。
- 残りのペレットは核画分になります。500 μLの氷冷PBSをペレットに加え、室温で2,000 x g で5分間遠心分離します。
注:このステップでは、余分なDNAが除去されます。
3. RNA精製キットを用いたRNAクリーンアップ
注:このプロトコルは、市販のRNA精製キットを使用して達成されました( 材料の表を参照)。
- 細胞質RNAサンプルと核細胞質サンプルを分離します(分画ステップはそれらの間で異なるため)。
- 細胞質画分を分離するには、1,050 μLの3.5x RLT溶解バッファー( 材料表を参照)を加え、短時間ボルテックスします。次に、750 μLの90%エタノールを加え、RNAクリーンアップキットからカラムにロードします。
注:カラムにロードする前に、溶液を十分に混合する必要があります。 - 核画分を分離するには、600 μLの3.5倍溶解バッファーとボルテックスを加えます。次に、600μLの70%エタノールを加える。
- 細胞質画分を分離するには、1,050 μLの3.5x RLT溶解バッファー( 材料表を参照)を加え、短時間ボルテックスします。次に、750 μLの90%エタノールを加え、RNAクリーンアップキットからカラムにロードします。
- 細胞質画分と核画分の両方をRNAカラムにロードします(材料表を参照)。
注:ステップ3の残りの部分では、細胞質サンプルと核サンプルの両方が同じ手順に従います。ただし、これらのサンプルが互いに独立していることを確認してください。- 細胞質画分と核画分の両方をRNAカラムにロードし、室温で8,000 x g で30秒間スピンします。余分な流れを捨てます。
- 市販の精製キットから350 μLの洗浄バッファー(RW1バッファー、 材料表を参照)を加え、再度スピンさせて、フロースルーを破棄します。
- DNAse溶液(1U/uL)を室温で15分間加えます。次に、350 μLの洗浄バッファーを追加し、再度回転させて、フロースルーを破棄します。
- 500 μLのマイルドな洗浄バッファー(RPE、 材料表を参照)を加え、再度回転させて、フロースルーを破棄します。500 μLのマイルドな洗浄バッファーを加え、再度スピンさせますが、2分間のみです。
- カラムを新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移動し、30 μLの水をスピンカラムに加えます。スピンダウンする前に、カラムを1分間放置します。
4. 核-細胞質分離の検証
- cDNA合成を行う
- RNAの細胞内コンパートメントが抽出および精製されたら、qPCRを使用してコンパートメントの分離を確認します。これを行うには、まず、製造元の指示に従って市販のキットを使用してRNAをcDNAに変換します( 材料表を参照)。
- 逆転写酵素マスターミックスを調製します。テンプレートRNAを追加します。サーモサイクラーで反応をインキュベートします。
注:ランダムヘキサマーの場合、使用されるサイクリングパラメータを 表2Aに示します。逆転写酵素反応を直ちに使用するか、-20°Cで保存してください(表1B)。
- 定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)および分析を行う。
- cDNA合成をDEPC水( 材料の表を参照)で希釈して、最終濃度を20 ng/mLにします。
- PCRマスターミックスを使用して、以下にリストされている手動の指示を使用して各サンプルの反応を準備します。
- 細胞質および核分画の検出に必要な市販のプローブを入手します。核マーカーとしてMALAT1を使用し、細胞質マーカーとしてTUG1を使用します( 材料の表を参照)。
注: MALAT1 および TUG1 の配列を 表 3 に示します。 - 個々のサンプルのテクニカル反復ごとに各成分に3を掛けて、各成分の体積を計算します。
- 核および細胞質サンプルごとに、それぞれについて次のミックスを取得します:(a)MALAT1を含む核画分、(b)MALAT1を含む細胞質画分、(c)TUG1を含む核画分、および(d)TUG1を含む細胞質画分(表1C)。
- 溶液を短時間ボルテックスして混合し、20 μLの混合物を光学反応プレートの各ウェルに移します( 材料の表を参照)。
- qPCRに使用される透明な接着フィルム( 材料の表を参照)でプレートを覆い、プレートを短時間遠心分離して気泡を除去してから、サンプルを300 x g で室温で5分間回転させます。
- 設計および解析ソフトウェア(材料表を参照 )を使用して、サイクルパラメータの検量線を選択します(表2B)。
- qPCRソフトウェアを使用して、 実行のセットアップ を選択します(補足図1)。
- [データ ファイルのプロパティ] ページで、表 2B から [メソッドと入力サイクルのパラメーター] を選択します (補足図 2)。
- サイクルパラメータを入力したら、 プレート タブを選択し、実行するサンプルを入力します(補足図3)。[ 実行の開始] を選択します。
注:記載されている手順は、市販のマスターミックスを使用してqPCRマシンで実行されました(材料の表を参照)。
- データ分析の実行
- 実行が完了したら、サンプル名、ターゲット名、定量化サイクル(Cq)を含むデータスプレッドシートを作成します(補足表1)。
- MALAT1サンプルから始めて、核分率を計算します。MALAT1核画分からMALAT1細胞質画分を差し引く(表4)。
- 次に、ΔCq(2^(-値))を計算します(表5)。
- MALAT1サンプルを続けて細胞質画分を計算し、MALAT1細胞質画分からMALAT1核画分を差し引いてから、ΔCq(2^(-値))を計算します(表6)。
注:ΔCqを見ると、核MALAT1画分(緑色ハイライト)は細胞質(赤色ハイライト)よりもMALAT1マーカーが大きいことが観察されていますが、細胞質画分が主に細胞質であり、核画分に細胞質汚染が含まれていないことを確認するために確認が必要です。 - TUG1サンプルを使用して、上記と同じ計算を実行します(ステップ4.3.2〜4.3.4)(表7)。
注:ΔCqを見ると、細胞質TUG1画分(緑色ハイライト)は核画分(赤色ハイライト)よりもTUG1マーカーが大きく、細胞質画分と核画分の良好な分離が確認されています(表8、 図1)。
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Representative Results
核および細胞質の単離が達成されたことを確認するために、qPCRを実施して結果を検証しました。その際、関心領域に特異的なプライマーを利用して、核および細胞質分画レベルを実証しました。本研究では、MALAT1およびTUG1をそれぞれ核および細胞質プライマーとして使用した。これらを組み合わせることで、核元素のポジティブコントロールとしてMALAT1を用いた高レベルの核分画の実証が可能になりますが、細胞質分画は低いと予想されます。逆に、TUG1が細胞質要素のポジティブコントロールとして存在する場合、細胞質分画レベルは核分画レベルよりも高いと予想されます。これは、核および細胞質RNA分離を確認する陽性結果の例である 図2に見ることができる。
図3では、MALAT1を含むサンプルで細胞質分画のレベルが観察される否定的な結果が見られます。これは、核画分から単離されたRNAの汚染を示しており、溶解濃度が低すぎたり高すぎたりすることが原因である可能性があります。この研究では他のプライマーも試しましたが、MALAT1とTUG1は、ウェスタンブロットとRNA電気泳動によって確認されたように、核および細胞質の分離と最も高い相関を示し、サンプルの純度と品質を確認しました(図4および図5)。
さらに、核および細胞質抽出物の純度は、図4に示すように、核画分のマーカーとしてラミンを使用し、細胞質画分の陽性マーカーとしてα-チューブリンを使用するウェスタンブロットによって実証できます10。核画分内にのみラミンが明確に発現し、細胞質画分内にα-チューブリンが明確に発現しており、各サンプル内の相対的な純度を示しています。
qPCRの過程でRNAが分解する傾向があるため、RNA電気泳動を使用してRNA収量の品質を確認する必要があります。RNA電気泳動を実施し、核画分にのみ存在する特徴である32S rRNAサブユニットにピークが存在するため、高品質のRNAを示しました。このピークの存在は、核純度と十分な分画を示しています。逆に、細胞質RNA電気泳動ではピークは観察されず、細胞質RNAサンプル11 の高品質と汚染がほとんどまたはまったくないことを示しています(図5)。
図1:プロトコルステップの概略図。 細胞が処理された後、それらは単離のために溶解および遠心分離される。次に、RNA単離を行い、cDNAを生成してからqPCRを用いた単離の検証を行います。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:肯定的な結果データ。 この図は、核成分と細胞質成分の高レベルの分離によって示されるプロトコルの成功を強調しています。核RNAプライマーであるMALAT1は、統計的に有意に高いレベルの核画分を示した。細胞質RNAプライマーであるTUG1では、統計的に有意に高いレベルの細胞質画分が観察された。 t検定を介して両方のサンプルで高い統計的有意性が観察されました。p < 0.0001エラーバーは標準偏差を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:否定的な結果データ。 この図は、核成分と細胞質成分の高レベルの分離によって示されるプロトコルを使用した陰性結果の例を示しています。核RNAプライマーであるMALAT1は、核汚染によって引き起こされる細胞質画分レベルを示した。 t検定による分数間の統計的有意性に差は見られなかった。エラーバーは標準偏差を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:細胞質および核画分の純度を示すウェスタンブロット。 この図は、核画分と細胞質画分のウェスタンブロットを強調しています。ラミンは核サンプルの純度を検証するために使用され、α-チューブリンは細胞質画分の純度を実証するために使用されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:RNA電気泳動 による 細胞質および核画分のRNA純度の確認。 (a)核画分のRNA電気泳動。矢印は、核画分でのみ観察される32S rRNAを示しています。(b)細胞質画分のRNA電気泳動。32Sピークの不在は、細胞質画分のRNA純度を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:溶解バッファー、反応混合物、およびサンプルの組成。 (a)0.25倍の溶解バッファーの組成。(B)RNAのcDNAへの転写時に利用される逆転写酵素ミックスの組成物。(C)逆転写酵素キットを用いた核および細胞質サンプルの組成。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:周期パラメータ。 (A)サーモサイクラーのサイクリングパラメータ。これらのパラメータは、標的配列の増幅のためにqPCR中に利用されました。(B)核および細胞質サンプルのサイクリングパラメータ。これらのパラメータは、標的配列の増幅のためにqPCR中に利用されました。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:核マーカーおよび細胞質マーカーの配列。 この表には、核および細胞質の分離を確認するために利用されたマーカーの配列が含まれています。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表4:MALAT1核および細胞質画分を差し引く手順。 MALAT1核画分を差し引くために利用されるデータシートの一例-MALAT1細胞質画分。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表5:ΔCq(2^(-値))を計算する手順。 ΔCq(2^(-値))の計算に使用したデータシートの例。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表6:細胞質画分を計算するための手順。 細胞質画分を計算するために利用されるデータシートの一例。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表7:核分率の計算手順。 核分率の計算に利用されるデータシートの一例。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表8:分画成功結果の確認手順。 分画の成功を検証するために利用されたデータシートの例。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図1:qPCRマシン設計および解析ソフトウェアのイメージ。 qPCRマシンの操作を示す画像。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:qPCRのイメージ「データファイルプロパティ」。 qPCR実行のパラメータを設定する手順を示す画像。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:qPCR装置にサンプルをロードするイメージ。 分析のためにサンプルをqPCRソフトウェアに追加する手順を示す画像。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表1:サンプル名データシート。 サンプル名、ターゲット名、およびCq値を含むデータシートの例。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
プロトコル全体を通して、目的の細胞株に最も効果的になるように要素を最適化するためにいくつかのステップが取られました。プロトコル内の手順は比較的簡単ですが、プロトコルの重要な側面で分析と微調整が必要になる場合があります。このプロトコルの最も重要なステップは、目的の細胞株と細胞標的に基づいて、溶解バッファーの濃度を適切な濃度に変更することです。溶解バッファーの利用は細胞膜の破壊に大きく依存するため、異なる細胞株間で細胞の脆弱性と膜透過性にわずかな違いがあるため、異なる細胞株での溶解バッファーの有効性には自然なばらつきがあります12。1倍の溶解バッファーのベースラインから始めて、プロトコルのステップは、溶解バッファーの濃度を徐々に0.25倍に減らしながら実行され、より効果的な結果が保証されました。この実験は最終的に多数の細胞内成分を単離することを目的としているため、溶解バッファーの濃度が目的の細胞株に最適化されていることを確認することは、最高の収量と最良の結果を達成するために重要です。
溶解バッファー濃度の調整に加えて、RNAの脆弱性とRNAの単離中のストレス注意に注意することが重要です。RNAは、その2'ヒドロキシル基がRNAを分解して悪い結果をもたらす可能性のある酵素ファミリーであるRNaseの結合点として機能する可能性があるため、DNAや他の多くの細胞要素よりも分解に対して脆弱です。RNaseは、少量で提示された場合でも、RNA分解の能力が高い13。RNaseは溶解ステップ中および溶解ステップ後に細胞から放出されるため、不要なRNA分解につながる可能性のある汚染を防ぐために注意する必要があります14。手順には、実験中に手袋を着用し、RNaseが環境または表面からサンプルに伝達されないようにこれらを頻繁に変更することが含まれます。さらに、RNaseフリーの溶液を利用する必要があり、RNAを取り扱うときは別のワークスペースを使用する必要があります。最後に、RNaseは溶解バッファーおよび変性に対して非常に耐性があるため、RNase阻害剤を使用してRNA単離に対する悪影響を軽減することができます15。
プロトコル中のステップは非常に成功した結果を生み出しましたが、いくつかの制限があります。まず、RNAと細胞質成分は互いに大部分が分離できますが、研究用のRNAの品質を危険にさらすことなく、2つを完全に分離することはできません。このため、これらの別々の領域からの分子の活性または機能の違いに基づく結論は、完全に単離されたサンプルを導き出すことができないことによってわずかに歪められる可能性があります。プロトコルがタンパク質などの他の細胞分子に適応している場合、核抽出物の分離中に一部のタンパク質または他の細胞要素が分解され、活性が失われ、結果に影響を与える可能性があることに注意することも重要です16。このプロトコルの間、MALAT1およびTUG1を使用した核および細胞質画分のqPCRは、サンプルの純度と品質の検証として単に実行されたことに注意することも重要です。この考えを拡張するために、核RNAと細胞質RNAの相対的な比率は、検証の目的でのみ使用されたため、このプロトコルでは分析または比較されませんでした。ただし、このプロトコルは、核画分と細胞質画分の相対的な比率を比較するなど、他の用途にも適用できますが、正確な分析または比較を行うには、これらの値を総RNAの量に正規化する必要があります。細胞質および核画分を総RNAレベルに正規化するためのステップは、他のプロトコル11において以前に記載されている。
ただし、前述のように、この方法は一般的なラボ材料を利用して、高品質のRNA抽出物を費用効果の高い方法で生成します。また、核および細胞質相互作用を研究するこの方法は、最も時間効率の高い手順の一つであることが証明されています。RNA純度キットを使用すると、非常に効果的なRNAクリーンアップが可能になり、さまざまな細胞領域からの高レベルのRNA分離が保証され、より効果的なサンプルの研究につながります。最後に、溶解バッファー濃度を変更することで多くの異なる細胞株の研究にアクセスでき、遠心分離などの密度分離技術がいくつかの異なる細胞要素の単離につながる可能性があるため、このプロトコルの適応性は重要な利点として現れます。細胞質と核の相互作用に関する研究が広まるにつれて、細胞成分に対する局在の影響をよりよく理解できるようになります。XPO1などの核タンパク質に関する研究が示しているように、細胞質と核の間の交換を分析することができ、これらの交換中の特定の分子が癌の発生につながる可能性があるかどうかを示します17。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
米国血液学会、ロバートウッドジョンソン財団、ドリスデューク慈善財団、エドワードP.エバンス財団、および国立がん研究所(1K08CA230319)からの助成金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent Tapestation | Agilent | G2991BA | The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples. |
| 0.5% Nonidet P-40 | Thermo-Fischer | 28324 | Used in the making of lysis buffer |
| 50 mM Tris-Cl pH 8.0 | Thermo-Fischer | 15568025 | Used in the making of lysis buffer |
| MALAT1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00273907_s1 | Utilized for confirmation of Nuclear fraction. |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode | Thermo-Fischer | 4326659 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers. |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo-Fischer | 4311971 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR |
| PBS | Gibco | 20012-023 | Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents. |
| Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol. |
| QuantStudio 6 | Thermo-Fischer | A43180 | qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | Lysis Buffer from RNA clean-up kit |
| RPE Buffer | Qiagen | 1018013 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
| RW1 Buffer | Qiagen | 1053394 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
| Taqman Gene Expression Assays | Thermo-Fischer | 4331182 | Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves. |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo-Fischer | 4305719 | TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time. |
| TUG1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00215501_m1 | Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction. |
| UltraPure DEPC-Treated Water | Thermo-Fischer | 750024 | UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered. |
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