Summary
Présenté ici est une procédure chirurgicale pour la ligature permanente de l’artère coronaire gauche chez la souris. Ce modèle peut être utilisé pour étudier la physiopathologie et la réponse inflammatoire associée après un infarctus du myocarde.
Abstract
La cardiopathie ischémique et l’infarctus du myocarde (IM) subséquent sont l’une des principales causes de mortalité aux États-Unis et dans le monde. Afin d’explorer les changements physiopathologiques après un infarctus du myocarde et de concevoir de futurs traitements, des modèles de recherche de l’IM sont nécessaires. La ligature permanente de l’artère coronaire gauche (ACL) chez la souris est un modèle populaire pour étudier la fonction cardiaque et le remodelage ventriculaire après l’IM. Nous décrivons ici un modèle chirurgical d’IM murin moins invasif, fiable et reproductible par ligature permanente de l’ACL. Notre modèle chirurgical comprend une anesthésie générale facilement réversible, une intubation endotrachéale qui ne nécessite pas de trachéotomie et une thoracotomie. L’électrocardiographie et la mesure de la troponine doivent être effectuées pour assurer l’IM. L’échocardiographie au jour 28 après l’IM permettra de discerner la fonction cardiaque et les paramètres d’insuffisance cardiaque. Le degré de fibrose cardiaque peut être évalué par la coloration trichrome de Masson et l’IRM cardiaque. Ce modèle d’IM est utile pour étudier les altérations physiopathologiques et immunologiques après un IM.
Introduction
Les maladies cardiovasculaires sont un problème majeur de santé publique qui fait 17,9 millions de victimes chaque année, soit 31 % de la mortalité mondiale1. Le type d’anomalie cardiovasculaire le plus répandu est la maladie coronarienne, et l’infarctus du myocarde (IM) est l’une des principales manifestations de la maladie coronarienne2. L’IM est généralement causée par une occlusion thrombotique d’une artère coronaire due à la rupture d’une plaque vulnérable3. L’ischémie qui en résulte provoque de profonds changements ioniques et métaboliques dans le myocarde affecté, ainsi qu’une diminution rapide de la fonction systolique. L’IM entraîne la mort des cardiomyocytes, ce qui peut entraîner un dysfonctionnement ventriculaire et une insuffisance cardiaque4.
La recherche sur l’IM chez les patients est limitée en raison de la rareté des tissus obtenus chez les patients atteints d’IM5. En tant que tels, les modèles murins de l’IM sont utiles à la fois pour étudier les mécanismes de la maladie et pour développer des cibles thérapeutiques potentielles. Les modèles murins actuellement disponibles d’IM comprennent des modèles d’ischémie irréversible (ACV et méthodes d’ablation) et des modèles de reperfusion (ischémie/reperfusion, I/R)6. La ligature permanente de l’artère coronaire gauche (ACL) chez la souris est la méthode la plus utilisée, et elle imite la physiopathologie et l’immunologie de l’IM chez les patients 7,8,9. L’IM permanent peut également être induit par des méthodes d’ablation, qui impliquent des dommages électriques ou des cryoblessures. Les méthodes d’ablation sont capables de générer un infarctus de taille uniforme à l’endroit précis10. D’autre part, la formation de cicatrices, la morphologie de l’infarctus et les mécanismes de signalisation moléculaire peuvent varier selon les méthodes d’ablation10,11. La méthode I/R murine est un autre modèle important d’IM car elle représente le scénario clinique de la thérapie de reperfusion12. Le modèle I/R est associé à des défis tels qu’une taille variable de l’infarctus, la difficulté à distinguer les réponses de la blessure initiale et la reperfusion6.
Bien que largement utilisées, les méthodes de ligature de l’ACL sont associées à de faibles taux de survie et à des douleurs postopératoires13. Ce protocole démontre le modèle chirurgical murin de ligature de l’ACL qui implique la préparation et l’intubation de souris, la ligature de l’ACL, les soins postopératoires et la validation de l’IM. Plutôt que d’utiliser une trachéotomieinvasive 14, cette méthode utilise l’intubation endotrachéale. L’animal est intubé en éclairant l’oropharynx à l’aide d’un laryngoscope, ce qui rend la procédure plus facile, plus sûre et moins traumatisante15. La souris est maintenue sous assistance respiratoire et sous anesthésie à l’isoflurane tout au long de la procédure. De plus, l’échocardiographie et la coloration trichrome de Masson sont effectuées pour évaluer la fonction cardiaque et la fibrose cardiaque après un IM, respectivement. Dans l’ensemble, cette méthode fournit un modèle murin chirurgical fiable et reproductible de l’IM qui peut être utilisé pour étudier la physiopathologie et l’inflammation après un IM.
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Protocol
Le présent protocole d’étude a été examiné et approuvé par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Pittsburgh. Huit souris C57BL/6J femelles (simulé n = 4 et MI n = 4) âgées de 1 an pesant entre 24 et 30 g ont été utilisées pour ces expériences. Environ 100% et au moins 80% des souris ont survécu au cours des premières 24 heures et 28 jours, respectivement.
1. Préparation et intubation endotrachéale des souris
- Préchauffez un stérilisateur à billes (voir le tableau des matériaux) à 250 °C et placez-y des instruments chirurgicaux autoclavés pendant quelques minutes.
- Anesthésier la souris dans une chambre d’induction avec 3% d’isoflurane et 1 L/min d’oxygène pendant 5 min.
- Assurez-vous de la profondeur de l’anesthésie chez la souris en vérifiant la réponse à un pincement ferme des orteils.
- Peser la souris pour estimer la posologie de l’analgésique préopératoire, la buprénorphine (0,1 mg/kg). Injectez le médicament par voie intrapéritonique.
- Coupez la fourrure sur le côté gauche du thorax à l’aide d’un rasoir électrique.
- Désinfectez le site chirurgical avec de la povidone iodée et de l’éthanol à 70% trois fois.
- Placez la souris en décubitus dorsal sur une planche inclinée. Fixez la tête et les membres de la souris à l’aide d’une bande élastique fixée aux incisives supérieures et au ruban adhésif, respectivement. Appliquez un lubrifiant ophtalmique stérile sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
- Ouvrez la mâchoire et retirez doucement la langue de la cavité buccale.
- Identifier l’ouverture du larynx en éclairant l’oropharynx à l’aide d’un laryngoscope (voir le tableau des matériaux).
- Coupez environ 0,5 cm d’une aiguille de cathéter de 24 G et insérez l’aiguille émoussée dans le bouclier en plastique. Dirigez l’aiguille émoussée avec le bouclier en plastique dans la trachée. Sortez l’aiguille en laissant le bouclier en plastique dans la trachée.
- Réglez le ventilateur (voir le tableau des matériaux) à une fréquence respiratoire de 137 battements par minute (optimisée pour les souris utilisées dans cette étude) et un volume courant de 0,18 cc. Connectez les tubes du respirateur au bouclier du cathéter et confirmez l’intubation correcte en recherchant un mouvement thoracique synchronisé avec le ventilateur.
- Débranchez le tube respiratoire de l’écran du cathéter et placez l’animal en décubitus dorsal sur une planche chirurgicale préchauffée à température contrôlée. Reconnectez la souris au ventilateur.
2. Ligature permanente de l’artère coronaire gauche
- Désinfectez le site chirurgical avec de la povidone iodée et de l’alcool à 70%. Appliquez un champ stérile ayant un trou de la taille d’un quart au centre pour sécuriser le site chirurgical. Soulevez doucement la peau à l’aide d’une paire de pinces et faites une petite incision transversale cutanée (1,5-2 cm) le long de la ligne entre le grand pectoral gauche et les muscles mineurs à l’aide d’une paire de ciseaux chirurgicaux.
REMARQUE: Des ciseaux ont été utilisés pour faire l’incision car ils fournissent le contrôle requis sur la profondeur et la direction de la coupe. - Séparez les muscles pectoraux sous-jacents avec des pinces et des ciseaux à dissectionner. Les muscles ont été séparés à l’aide de rétracteurs attachés à des bandes élastiques.
- Faites une incision dans le troisième espace intercostal avec une paire de micro-ciseaux en suivant l’angle naturel de la cage thoracique. À ce stade, une extrême prudence doit être exercée pour éviter les blessures au cœur et aux poumons.
- Étirez doucement les côtes à l’aide de rétracteurs pour exposer le ventricule gauche. Déplacez la graisse péricardique de côté et localisez l’ACV, qui s’étend du bord de l’oreillette gauche vers l’apex du cœur.
- Passer un 8-0 suture en nylon sous l’ACV à l’aide d’un porte-aiguille. Libellez l’ACV avec un double nœud suivi d’un deuxième nœud (un nœud de chirurgien modifié).
REMARQUE: Le blanchiment du ventricule inférieur gauche confirme une ligature ACL réussie. En plus de cela, la mesure de la troponine, la surveillance de l’ECG (élévation du ST), l’écho / IRM cardiaque in vivo ou les images micro-CT sont également conseillées pour confirmer les lésions MI comparables. - Retirez les rétracteurs et insérez une aiguille de cathéter de 22 G dans la cavité thoracique. Retirez l’aiguille en laissant l’extrémité du bouclier en plastique dans la cavité thoracique. Fermez la cage thoracique à l’aide d’une suture en nylon 4-0.
- Connectez une seringue au bouclier en plastique de 22 G et retirez lentement l’excès d’air emprisonné dans la cavité thoracique en appuyant doucement sur la poitrine pour établir une pression d’air négative. Retirez le bouclier en plastique.
- Fermez la peau avec une suture en nylon 4-0.
- Coupez l’alimentation en isoflurane. À ce stade, la souris est sur le ventilateur fournissant de l’oxygène.
3. Soins postopératoires
- Éteignez le ventilateur une fois que la respiration spontanée commence.
REMARQUE: La procédure prend environ 30-35 minutes par animal de la préparation des souris jusqu’à cette étape. - Gardez la souris sous une lampe chauffante et surveillez-la jusqu’à ce qu’elle soit réveillée. L’animal ne doit pas être laissé sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait recouvré suffisamment de conscience pour maintenir une position couchée sternale.
- Après la chirurgie, placez l’animal dans une cage séparée et remettez-le dans la cage d’origine avec d’autres animaux seulement après son rétablissement complet.
- Surveillez la souris quotidiennement pour tout signe de douleur ou d’inconfort.
- Poursuivre l’injection intrapéritonéale de buprénorphine (0,1 mg / kg) toutes les 6-8 heures pendant 2 jours supplémentaires après la chirurgie.
4. Évaluation échocardiographique
REMARQUE: Une échocardiographie a été réalisée pour évaluer les paramètres de l’insuffisance cardiaque le jour 28 après l’IM.
- Après 28 jours après la chirurgie, anesthésiez les souris avec 3% d’isoflurane et 1 L / min d’oxygène, appliquez un lubrifiant ophtalmique stérile sur les yeux et enlevez les poils de la poitrine à l’aide d’une crème dépilatoire. Désinfectez la poitrine avec de la povidone iodée et de l’éthanol à 70% trois fois.
- Fixez les souris anesthésiées au sommet de la plateforme d’imagerie (voir le tableau des matériaux) en décubitus dorsal et maintenez un niveau constant d’anesthésie tout au long de la procédure à l’aide d’un cône nasal relié au système anesthésique (1 % à 2 % d’isoflurane et 1 L/min d’oxygène).
- Collez les quatre pattes aux électrodes ECG avec du gel d’électrode (voir le tableau des matériaux). Surveillez la température de l’animal en insérant une sonde rectale (voir le tableau des matériaux).
- Appliquez le gel de balayage (voir le tableau des matériaux) sur la poitrine, placez le transducteur verticalement, abaissez-le jusqu’à la ligne parasternale (parallèle au thorax) et faites pivoter de 35° dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour obtenir la vue parasternale à grand axe du ventricule gauche.
- Appuyez sur le bouton d’imagerie en mode B du logiciel d’imagerie (voir Tableau des matériaux) pour obtenir une vue complète du cœur sur l’axe long. Ajustez la taille et la luminosité de la porte et enregistrez les images à l’aide de Save Clip ou Save Frame pour des mesures ultérieures16.
- Passez en mode M (mode mouvement) et placez l’axe du mode M au niveau du muscle papillaire. Ajustez la taille de la porte et appuyez sur le bouton Démarrer en mode M. Enregistrez les images à l’aide de Save Clip ou Save Frame 16,17.
- Comme le processus d’acquisition d’images en mode 4D est automatisé, vérifiez que les signaux ECG et respiratoire sont actifs (Figure 1) avant d’acquérir les données.
- Commencez à acquérir les données en mode B. Ouvrez le panneau de numérisation 4D et lancez le moteur 3D. Définissez les paramètres de l’image dans le panneau de numérisation 4D et appuyez sur le bouton Numérisation pour commencer la numérisation. Après avoir examiné les images dans la vue 2D, chargez-les en mode 4D à l’aide du bouton Charger dans 4D .
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Representative Results
La figure 1 montre les signaux ECG et respiratoires actifs représentatifs lors de l’évaluation échocardiographique de souris simulées (Figure 1A) et MI (Figure 1B). La vérification de l’ECG actif et des signaux respiratoires est importante avant d’acquérir les données échocardiographiques. La figure 2 montre la mesure échocardiographique des paramètres fonctionnels cardiaques 28 jours après la ligature de l’ACL. La figure 2 montre des images en mode M de la vue para sternale à axe court des cœurs simulés (Figure 2A) et MI (Figure 2B). La figure 2B montre un mouvement défectueux de la paroi cardiaque après une ligature de l’ACL. Des indicateurs d’insuffisance cardiaque, tels qu’une augmentation de la masse du VG (Figure 2C), une diminution de la fraction d’éjection (Figure 2D) et une diminution du débit cardiaque (Figure 2E), ont été observés dans le groupe IM par rapport au groupe simulé.
Tous les animaux ont été euthanasiés selon les protocoles standard en utilisant une dose excessive de gaz CO2 . Les cœurs ont été fixés et congelés dans un composé à température de coupe optimale (OCT). La coloration trichrome18 de Masson a été réalisée pour trois sections de ventricules différentes (inférieure, moyenne et supérieure) et des images ont été prises à l’aide d’un scanner de diapositives de recherche avec un grossissement de 10x pour examiner le degré de fibrose cardiaque. La figure 3 montre une coloration accrue du collagène (bleu) dans le cœur infarctus, indiquant une fibrose augmentée.
Figure 1 : ECG actif et signaux respiratoires pendant l’évaluation échocardiographique. Signaux ECG et respiratoires actifs représentatifs lors de l’évaluation échocardiographique des souris (A) simulées et (B) MI. Vert = signaux ECG, jaune = signaux respiratoires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Évaluation échocardiographique des paramètres fonctionnels cardiaques après la ligature de l’ACL le jour 28 après la chirurgie. Images échocardiographiques parasternales à axe court (PSAX) en mode M représentatives de souris (A) fictives et (B) MI. Évaluation (C) de la masse ventriculaire gauche (mg), (D) de la fraction d’éjection (%) et (E) du débit cardiaque (mL/min) de souris fictives et de souris atteintes d’IM. LVAW;d = épaisseur de la paroi antérieure ventriculaire gauche dans la diastole; LVAW;s = épaisseur de la paroi antérieure ventriculaire gauche dans la systole; LVPW;d = épaisseur de la paroi postérieure ventriculaire gauche en diastole; LVPW;s = épaisseur de la paroi postérieure ventriculaire gauche dans la systole; LVID;d = diamètre interne du ventricule gauche en diastole; LVID;s = diamètre interne du ventricule gauche dans la systole. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type. * P < 0,05, ** P < 0,01, **** P < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Évaluation de la fibrose après la ligature de l’ACL au jour 28 après la chirurgie. Images représentatives montrant la coloration trichrome de Masson sur les cœurs factices et (B) MI 28 jours après la chirurgie. Les régions fibrotiques du cœur infarctus sont caractérisées par un dépôt de collagène et une coloration bleue après la coloration trichrome de Masson. Barre d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le modèle murin de l’IM gagne en popularité dans les laboratoires de recherche cardiovasculaire, et cette étude décrit un modèle d’IM reproductible et cliniquement pertinent. Ce protocole améliore le processus de ligature de l’ACV de plusieurs façons. Pour commencer, l’utilisation d’anesthésiques préopératoires injectables tels que la xylazine/kétamine ou le pentobarbitalsodique 14,15 est évitée. Seule l’anesthésie à l’isoflurane a été utilisée, ce qui aide à améliorer les taux de survie des animaux (>80% de survie 28 jours après la chirurgie), à minimiser les complications induites par les médicaments et à avoir des effets cardiaques minimes par rapport aux autres agents19. Cependant, l’isoflurane ralentit également le cœur, bien qu’à un degré inférieur à celui d’autres agents anesthésiques20. Ce protocole implique une intubation endotrachéale moins invasive évitant la trachéotomie21, ce qui réduit la douleur et l’inconfort postopératoires. Des études antérieures sur la ligature de l’ACL murine ont recommandé de pratiquer une incision au milieu du cou pour améliorer la visualisation de l’intubation endotrachéale; Cependant, le protocole actuel utilise plutôt un laryngoscope pour éclairer l’oropharynx15. Lugrin et coll. ont récemment démontré un modèle murin d’ACL IM sans thoracentèse14; Cependant, le protocole actuel comprend une thoracentèse efficace, qui aidera à éliminer l’excès de sang et d’air de la cavité thoracique, prévenant ainsi le pneumothorax19. En outre, cette méthode utilise de la gaze stérile pour la gestion des saignements à la place d’un cautériseur, car l’utilisation d’un cautériseur pour réduire les saignements peut entraîner des brûlures iatrogènes et peut modifier les lectures inflammatoires21.
L’une des étapes critiques de ce modèle chirurgical est l’identification et la ligature de l’ACL. L’emplacement de l’artère coronaire peut varier en fonction des souches de souris et des génotypes9. Dans la plupart des cas, l’artère n’est pas visible au microscope. Par expérience, la ligature du tissu myocardique à 2-4 mm sous le bord de l’oreillette gauche entraîne un blanchiment efficace de la paroi ventriculaire gauche. De plus, la procédure peut être simplement modifiée pour induire une ischémie myocardique temporaire suivie d’une reperfusion (I/R) en retirant la ligature22. Ce modèle animal imite la restauration du flux sanguin coronaire chez les patients atteints d’IM après une intervention coronarienne percutanée23,24. Étant donné que le modèle d’occlusion permanente de l’ACL diffère du modèle I/R sur plusieurs aspects, tels que la taille de la zone infarctue, l’emplacement de l’infarctus et l’infiltration des cellules inflammatoires, les chercheurs doivent être prudents lors de la sélection du modèle pertinent en fonction de l’étude 7,14,25.
Il existe de multiples approches pour assurer une ligature réussie de l’ACL et le développement ultérieur de l’IM. L’observation d’un blanchiment immédiat du ventricule inférieur gauche est la première confirmation d’une ligature réussie de l’ACL. En dehors de cela, l’étendue et l’emplacement de l’infarctus du myocarde peuvent être visualisés en colorant tout le cœur avec du bleu d’Evan ou du chlorure de 2,3,5-triphényle tétrazolium (TTC)26. La mesure de la troponine cardiaque circulante peut valider davantage la lésion du tissu myocardique21. L’électrocardiographie peut être utilisée comme méthode non invasive pour confirmer l’élévation du segment ST après MI17. Le degré de fibrose cardiaque associé à l’IM peut être évalué par la coloration trichrome de Masson et l’IRM cardiaque27,28,29. L’échocardiographie peut être utilisée pour évaluer les paramètres de l’insuffisance cardiaque aux jours 1 et 28 après l’IM. Pour examiner le remodelage cardiaque après l’IM, la coloration et l’échocardiographie des trichomes de Masson peuvent être utilisées17. Il est également possible d’utiliser la qPCR et l’immunoblot pour étudier et confirmer l’expression des gènes et des protéines impliqués dans la fibrose, l’inflammation et l’insuffisance cardiaque après l’IM14.
La principale limitation de la ligature de l’ACL est l’incidence élevée de la mortalité, qui pourrait être due à des arythmies cardiaques postopératoires, à une rupture ventriculaire, à une hémorragie, à un pneumothorax et à un inconfort postopératoire19,30. Cependant, une thoracentèse réussie, la minimisation des lésions tissulaires non ciblées et une bonne gestion de la douleur et de la température postopératoires peuvent aider à réduire la mort de l’animal. Comme pour tout autre modèle chirurgical, la reproductibilité exacte est une autre limitation de ce modèle chirurgical. Les chercheurs peuvent toutefois reproduire l’IM, contrôler la taille de l’infarctus et améliorer la survie postopératoire grâce à une pratique et une expérience rigoureuses.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Institut national de la santé (R01HL143967, R01HL142629, R01AG069399 et R01DK129339), AHA Transformational Project Award (19TPA34910142), AHA Innovative Project Award (19IPLOI34760566) et ALA Innovation Project Award (IA-629694) (à).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G catheter needle | Exel INT | 26741 | Thoracentesis |
| 24 G catheter needle | Exel INT | 26746 | Endotracheal intubation |
| 4-0 nylon suture | Covetrus | 29263 | Suturing of muscles and skin |
| 8-0 nylon suture | S&T | 3192 | Ligation of LAD |
| Anesthetic Vaporizers | Vet equip | VE-6047 | Anesthetic support |
| Animal physiology monitor | Fujifilm | VEVO 3100 | Monitor heart rate,respiration rate and body temperature |
| Betadine solution | PBS animal health | 11205 | Antispetic |
| Buprenorphine | Covetrus | 55175 | Analgesic |
| Disecting microscope | OMANO | OM2300S-V7 | Binocular |
| Electric razor | Wahl | 79300-1001M | Shaving |
| Electrode gel | Parker Laboratories | W60698L | Electrically conductive gel |
| Ethanol | Decon Laboratories | 22-032-601 | Disinfectant |
| Forceps | FST | 11065-07 | Stainless Steel |
| Gauze | Curity | CAR-6339-PK | Sterile |
| Heat lamp | Satco | S4998 | Post surgery care |
| Heating pad | Kent scientific | Surgi-M | Temperature control |
| Hot Bead sterilizer | Germinator 500 | 11503 | Sterilization of surgical instrument |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | Anesthesia |
| Masson’s trichrome staining kit | Thermoscientific | 87019 | Measurement of cardiac Fibrosis |
| Micro Needle Holder | FST | 12500-12 | Stainless Steel |
| Micro scissors | FST | 15000-02 | Stainless Steel |
| Ophthalmic ointment | Dechra | Puralube Vet | Sterile occular lubricant |
| Scanning Gel | Parker Laboratories | Aquasonic 100 | Aqueous ultrasound transmission gel |
| Scissors | FST | 14060-11 | Stainless Steel |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | Model LS-2-M | Illuminating the oropharynx |
| Small animal ventilator | Harvard apparatus | 557058 | Ventilator support |
| Surgical light | Cole parmer | 41723 | Illuminator Width (in): 7 |
| Vevo 3100 preclinical imaging platform | Fujifilm | VEVO 3100 | Echocardiography |
| VevoLAB software | Fujifilm | VevoLAB 3.2.6 | Echocardiography data analysis |
References
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