Summary
Aquí se presenta un procedimiento quirúrgico para la ligadura permanente de la arteria coronaria izquierda en ratones. Este modelo se puede utilizar para investigar la fisiopatología y la respuesta inflamatoria asociada después del infarto de miocardio.
Abstract
La cardiopatía isquémica y el posterior infarto de miocardio (IM) es una de las principales causas de mortalidad en los Estados Unidos y en todo el mundo. Para explorar los cambios fisiopatológicos después del infarto de miocardio y diseñar futuros tratamientos, se requieren modelos de investigación de IM. La ligadura permanente de la arteria coronaria izquierda (LCA) en ratones es un modelo popular para investigar la función cardíaca y la remodelación ventricular después del IM. Aquí describimos un modelo de IM murino quirúrgico menos invasivo, confiable y reproducible mediante ligadura permanente del LCA. Nuestro modelo quirúrgico comprende una anestesia general fácilmente reversible, intubación endotraqueal que no requiere una traqueotomía y una toracotomía. Se debe realizar electrocardiografía y medición de troponina para asegurar el IM. La ecocardiografía en el día 28 después del IM discernirá la función cardíaca y los parámetros de insuficiencia cardíaca. El grado de fibrosis cardíaca se puede evaluar mediante la tinción tricrómica de Masson y la resonancia magnética cardíaca. Este modelo de IM es útil para estudiar las alteraciones fisiopatológicas e inmunológicas después del IM.
Introduction
Las enfermedades cardiovasculares son un importante problema de salud pública que se cobra 17,9 millones de vidas cada año, lo que representa el 31 por ciento de la mortalidad mundial1. El tipo más prevalente de anomalía cardiovascular es la enfermedad coronaria, y el infarto de miocardio (IM) es una de las principales manifestaciones de la enfermedad coronaria2. El IM suele ser causado por la oclusión trombótica de una arteria coronaria debido a la ruptura de una placa vulnerable3. La isquemia resultante causa cambios iónicos y metabólicos profundos en el miocardio afectado, así como una rápida disminución de la función sistólica. El IM resulta en la muerte de los cardiomiocitos, lo que puede conducir aún más a la disfunción ventricular y la insuficiencia cardíaca4.
La investigación sobre IM en pacientes es limitada debido a la escasez de tejidos obtenidos de pacientes con IM5. Como tal, los modelos murinos de IM son útiles tanto para estudiar los mecanismos de la enfermedad como para desarrollar posibles objetivos terapéuticos. Los modelos murinos de IM actualmente disponibles incluyen modelos de isquemia irreversible (ACV y métodos de ablación) y modelos de reperfusión (isquemia/reperfusión, I/R)6. La ligadura permanente de la arteria coronaria izquierda (ACV) en ratones es el método más utilizado, e imita la fisiopatología e inmunología del IM en pacientes 7,8,9. El IM permanente también puede ser inducido por métodos de ablación, que implican daño eléctrico o criolesión. Los métodos de ablación son capaces de generar un infarto de tamaño uniforme en la ubicación precisa10. Por otro lado, la formación de cicatrices, la morfología del infarto y los mecanismos de señalización molecular pueden variar entre los métodos de ablación10,11. El método I/R murino es otro modelo importante de IM, ya que representa el escenario clínico de la terapia de reperfusión12. El modelo I/R está asociado con desafíos como un tamaño variable del infarto, dificultad para distinguir las respuestas de la lesión inicial y reperfusión6.
Aunque ampliamente utilizados, los métodos de ligadura LCA están asociados a bajas tasas de supervivencia y dolor postoperatorio13. Este protocolo demuestra el modelo quirúrgico murino de IM de ligadura LCA que implica la preparación e intubación de ratones, ligadura LCA, cuidado postoperatorio y validación de IM. En lugar de utilizar una traqueotomía invasiva14, este método emplea la intubación endotraqueal. El animal es intubado iluminando la orofaringe con un laringoscopio, haciendo el procedimiento más fácil, más seguro y menos traumático15. El ratón se mantiene en el soporte del ventilador y bajo anestesia con isoflurano durante todo el procedimiento. Además, la ecocardiografía y la tinción tricrómica de Masson se realizan para evaluar la función cardíaca y la fibrosis cardíaca después del IM, respectivamente. En general, este método proporciona un modelo murino quirúrgico confiable y reproducible de IM que se puede usar para estudiar la fisiopatología y la inflamación después del IM.
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Protocol
El presente protocolo de estudio fue revisado y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Pittsburgh. Para estos experimentos se utilizaron ocho (falsos n = 4 y MI n = 4) ratones hembra C57BL/6J de 1 año de edad que pesaban entre 24 y 30 g. Aproximadamente el 100% y al menos el 80% de los ratones sobrevivieron en las primeras 24 h y 28 días, respectivamente.
1. Preparación e intubación endotraqueal de los ratones
- Precaliente un esterilizador de cuentas (consulte la Tabla de materiales) a 250 °C y coloque instrumentos quirúrgicos esterilizados en autoclave durante unos minutos.
- Anestesiar al ratón en una cámara de inducción con isoflurano al 3% y oxígeno 1 L/min durante 5 min.
- Asegure la profundidad de la anestesia en el ratón comprobando la respuesta a un pellizco firme del dedo del pie.
- Pesar el ratón para estimar la dosis del fármaco analgésico preoperatorio, buprenorfina (0,1 mg/kg). Inyecte el medicamento por vía intraperitonial.
- Recorte el pelaje en el lado izquierdo del tórax con una máquina de afeitar eléctrica.
- Desinfecte el sitio quirúrgico con povidona yodada y etanol al 70% a partir de entonces tres veces.
- Coloque el ratón en posición supina sobre una tabla inclinada. Asegure la cabeza y las extremidades del ratón con una banda elástica unida a los incisivos superiores y cinta adhesiva, respectivamente. Aplique lubricante oftálmico estéril en los ojos para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia.
- Abra la mandíbula y saque suavemente la lengua de la cavidad oral.
- Identifique la abertura de la laringe iluminando la orofaringe con un laringoscopio (consulte la Tabla de materiales).
- Corte aproximadamente 0,5 cm de una aguja de catéter de 24 G e inserte la aguja roma en el protector de plástico. Dirija la aguja roma con el protector de plástico hacia la tráquea. Saque la aguja, dejando el escudo de plástico en la tráquea.
- Ajuste el ventilador (consulte la Tabla de materiales) a una frecuencia respiratoria de 137 latidos por minuto (optimizado para los ratones utilizados en este estudio) y un volumen corriente de 0,18 cc. Conecte los tubos del respirador al protector del catéter y confirme la intubación correcta buscando un movimiento torácico sincronizado con el ventilador.
- Desconecte el tubo del respirador del protector del catéter y coloque al animal en posición supina en una placa quirúrgica precalentada con temperatura controlada. Vuelva a conectar el ratón al ventilador.
2. Ligadura permanente de la arteria coronaria izquierda
- Desinfecte el sitio quirúrgico con povidona yodada y alcohol al 70%. Aplique una cortina estéril que tenga un orificio de un cuarto de tamaño en el centro para asegurar el sitio quirúrgico. Levante suavemente la piel con un par de fórceps y haga una pequeña incisión transversal cutánea (1.5-2 cm) a lo largo de la línea entre los músculos pectorales mayores izquierdos y menores con un par de tijeras quirúrgicas.
NOTA: Se utilizaron tijeras para hacer la incisión, ya que proporciona el control requerido sobre la profundidad y la dirección del corte. - Separe los músculos pectorales subyacentes con fórceps y tijeras de disección. Los músculos se separaron usando retractores unidos a bandas elásticas.
- Haga una incisión en el tercer espacio intercostal con un par de micro tijeras siguiendo el ángulo natural de la caja torácica. En esta fase, se debe tener extrema precaución para evitar lesiones en el corazón y los pulmones.
- Estire suavemente las costillas con retractores para exponer el ventrículo izquierdo. Mueva la grasa pericárdica a un lado y localice el LCA, que se extiende desde el borde de la aurícula izquierda hacia el ápice del corazón.
- Pase un 8-0 sutura de nylon debajo del LCA con la ayuda de un soporte de aguja. Ligue el LCA con un nudo doble seguido de un segundo nudo (un nudo de cirujano modificado).
NOTA: El escaldado del ventrículo inferior izquierdo confirma una ligadura exitosa de LCA. Además de esto, también se recomienda la medición de troponina, la monitorización del ECG (elevación del segmento ST), la resonancia magnética cardíaca con eco / in vivo o las imágenes de micro-TC para confirmar las lesiones comparables de IM. - Retire los retractores e inserte una aguja de catéter de 22 G en la cavidad torácica. Retire la aguja, dejando la punta del protector de plástico en la cavidad torácica. Cierre la caja torácica con una sutura de nylon 4-0.
- Conecte una jeringa al protector de plástico de 22 G y elimine lentamente el exceso de aire atrapado en la cavidad torácica presionando suavemente el tórax para establecer una presión de aire negativa. Retire el protector de plástico.
- Cierre la piel con una sutura de nylon 4-0.
- Apague el suministro de isoflurano. En esta etapa, el ratón está en el ventilador suministrando oxígeno.
3. Cuidados postoperatorios
- Apague el ventilador una vez que comience la respiración espontánea.
NOTA: El procedimiento dura unos 30-35 minutos por animal desde la preparación de los ratones hasta este paso. - Mantenga el ratón bajo una lámpara de calor y contrólelo hasta que esté despierto. El animal no debe dejarse desatendido hasta que haya recuperado suficiente conciencia para mantener la decúbito esternal.
- Después de la cirugía, coloque al animal en una jaula separada y devuélvalo a la jaula original con otros animales solo después de que se recupere por completo.
- Controle el ratón diariamente para detectar cualquier signo de dolor o molestia.
- Continuar la inyección intraperitoneal de buprenorfina (0,1 mg/kg) cada 6-8 horas durante 2 días adicionales después de la cirugía.
4. Evaluación ecocardiográfica
NOTA: Se realizó ecocardiografía para evaluar los parámetros de insuficiencia cardíaca el día 28 después del IM.
- Después de 28 días después de la cirugía, anestesiar a los ratones con isoflurano al 3% y oxígeno 1 L / min, aplicar lubricante oftálmico estéril en los ojos y eliminar el vello del pecho con crema depilatoria. Desinfecte el área del pecho con povidona yodada y etanol al 70% tres veces.
- Asegure los ratones anestesiados encima de la plataforma de imágenes (ver Tabla de materiales) en posición supina y mantenga un nivel constante de anestesia durante todo el procedimiento utilizando un cono nasal conectado al sistema anestésico (1% -2% isoflurano y 1 L / min de oxígeno).
- Pegue las cuatro patas a los electrodos de ECG con gel de electrodo (consulte la Tabla de materiales). Controle la temperatura del animal insertando una sonda rectal (ver Tabla de materiales).
- Aplique el gel de exploración (consulte la Tabla de materiales) en el tórax, coloque el transductor verticalmente, bájelo hasta la línea paraesternal (paralelo al tórax) y gire 35° en sentido contrario a las agujas del reloj para obtener la vista del eje largo paraesternal del ventrículo izquierdo.
- Toque el botón de imágenes en modo B en el software de imágenes (consulte Tabla de materiales) para obtener una vista completa del eje largo del corazón. Ajuste el tamaño y el brillo de la puerta y guarde las imágenes con Guardar clip o Guardar fotograma para mediciones posteriores16.
- Cambie al modo M (modo de movimiento) y coloque el eje del modo M al nivel del músculo papilar. Ajuste el tamaño de la puerta y toque el botón Inicio de modo M. Guarde las imágenes usando Guardar clip o Guardar fotograma16,17.
- Como el proceso de adquisición de imágenes en modo 4D está automatizado, verifique que el ECG y las señales de respiración estén activas (Figura 1) antes de adquirir los datos.
- Comience a adquirir los datos en modo B. Abra el panel de escaneo 4D e inicie el motor 3D. Establezca los parámetros de imagen en el panel de escaneo 4D y toque el botón Escanear para comenzar el escaneo. Después de revisar las imágenes en la vista 2D, cargue las imágenes en modo 4D usando el botón Cargar en 4D .
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Representative Results
La Figura 1 muestra el ECG activo representativo y las señales de respiración durante la evaluación ecocardiográfica de ratones simulados (Figura 1A) e IM (Figura 1B). La verificación del ECG activo y las señales de respiración son importantes antes de adquirir los datos ecocardiográficos. La figura 2 muestra la medición ecocardiográfica de los parámetros funcionales cardíacos después de 28 días después de la ligadura LCA. La Figura 2 muestra imágenes en modo M de la vista del eje corto paraesternal de corazones simulados (Figura 2A) e IM (Figura 2B). La figura 2B muestra el movimiento defectuoso de la pared cardíaca después de la ligadura LCA. Los indicadores de insuficiencia cardíaca, como el aumento de la masa del VI (Figura 2C), la disminución de la fracción de eyección (Figura 2D) y la disminución del gasto cardíaco (Figura 2E), se observaron en el grupo de IM en comparación con el grupo simulado.
Todos los animales fueron sacrificados de acuerdo con los protocolos estándar utilizando una dosis excesiva de gasCO2 . Los corazones se fijaron y congelaron en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT). La tinción tricrómica18 de Masson se realizó para tres secciones diferentes del ventrículo (inferior, media y superior) y las imágenes se tomaron utilizando un escáner de diapositivas de investigación con un aumento de 10x para examinar el grado de fibrosis cardíaca. La Figura 3 muestra un aumento de la tinción de colágeno (azul) en el corazón infartado, lo que indica un aumento de la fibrosis.
Figura 1: ECG activo y señales respiratorias durante la evaluación ecocardiográfica. ECG activo representativo y señales de respiración durante la evaluación ecocardiográfica de (A) ratones simulados y (B) IM. Verde = señales de ECG, amarillo = señales de respiración. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Evaluación ecocardiográfica de los parámetros funcionales cardíacos tras la ligadura de LCA el día 28 después de la cirugía. Imágenes ecocardiográficas representativas en modo M de eje corto paraesternal (PSAX) de ratones (A) simulados y (B) IM. Evaluación de (C) masa ventricular izquierda (mg), (D) fracción de eyección (%), y (E) gasto cardíaco (ml/min) de ratones simulados y con IM. VAW;d = grosor de la pared anterior del ventrículo izquierdo en diástole; LVAW;s = grosor de la pared anterior del ventrículo izquierdo en sístole; LVPW;d = grosor de la pared posterior del ventrículo izquierdo en la diástole; LVPW;s = espesor de la pared posterior del ventrículo izquierdo en sístole; LVID;d = diámetro interno del ventrículo izquierdo en la diástole; LVID;s = diámetro interno del ventrículo izquierdo en sístole. Los datos se muestran como Media ± DE. * P < 0,05, ** P < 0,01, **** P < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Evaluación de la fibrosis después de la ligadura de LCA el día 28 después de la cirugía. Imágenes representativas que muestran la tinción tricrómica de Masson de (A) simulacro y (B) corazones con MI 28 días después de la cirugía. Las regiones fibróticas en el corazón infartado se caracterizan por la deposición de colágeno y se tiñen de azul después de la tinción tricrómica de Masson. Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El modelo murino de IM está ganando popularidad en los laboratorios de investigación cardiovascular, y este estudio describe un modelo de IM reproducible y clínicamente relevante. Este protocolo mejora el proceso de ligadura de LCA de varias maneras. Para empezar, se evita el uso de anestésicos preoperatorios inyectables como xilazina/ketamina o pentobarbitalsódico 14,15. Sólo se utilizó anestesia con isoflurano, que ayuda a mejorar las tasas de supervivencia animal (>80% de supervivencia 28 días después de la cirugía), minimizar las complicaciones inducidas por fármacos y tiene efectos cardíacos mínimos en comparación con otros agentes19. Sin embargo, el isoflurano también ralentiza el corazón, aunque en menor grado en comparación con otros agentes anestésicos20. Este protocolo implica una intubación endotraqueal menos invasiva evitando la traqueotomía21, lo que reduce el dolor y las molestias postoperatorias. Estudios previos de ligadura murina de LCA han recomendado hacer una incisión en la mitad del cuello para mejorar la visualización de la intubación endotraqueal; Sin embargo, el protocolo actual utiliza un laringoscopio para iluminar la orofaringe15. Lugrin et al. demostraron recientemente un modelo murino de LCA IM sin toracocentesis14; Sin embargo, el protocolo actual incluye una toracocentesis efectiva, que ayudará a eliminar el exceso de sangre y aire de la cavidad torácica, previniendo el neumotórax19. Además, este método utiliza gasas estériles para el manejo del sangrado en lugar de un cauterizador, ya que el uso de un cauterizador para reducir el sangrado puede resultar en quemaduras iatrogénicas y puede alterar las lecturas inflamatorias21.
Uno de los pasos críticos en este modelo quirúrgico es la identificación y ligadura del LCA. La localización de la arteria coronaria puede variar dependiendo de las cepas de ratón y los genotipos9. En la mayoría de los casos, la arteria no es visible bajo un microscopio. Por experiencia, ligar el tejido miocárdico 2-4 mm por debajo del borde de la aurícula izquierda da como resultado un blanqueamiento eficiente de la pared ventricular izquierda. Además, el procedimiento puede ser simplemente modificado para inducir isquemia miocárdica temporal seguida de reperfusión (I/R) mediante la eliminación de la ligadura22. Este modelo animal imita la restauración del flujo sanguíneo coronario en pacientes con IM después de la intervención coronaria percutánea23,24. Dado que el modelo de oclusión permanente de LCA difiere del modelo I/R en varios aspectos, como el tamaño del área infartada, la ubicación del infarto y la infiltración de células inflamatorias, los investigadores deben ser cautelosos al seleccionar el modelo relevante dependiendo del estudio 7,14,25.
Existen múltiples enfoques para garantizar la ligadura exitosa del LCA y el posterior desarrollo de IM. La observación del escaldado inmediato del ventrículo inferior izquierdo es la confirmación más temprana de la ligadura exitosa del LCA. Aparte de esto, la extensión y localización del infarto de miocardio se puede visualizar tiñendo todo el corazón con azul de Evan o cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio (TTC)26. La medición de la troponina cardíaca circulante puede validar aún más la lesión del tejido miocárdico21. La electrocardiografía se puede utilizar como un método no invasivo para confirmar la elevación del segmento ST después de MI17. El grado de fibrosis cardíaca asociado con IM puede ser evaluado por tinción tricrómica de Masson y resonancia magnética cardíaca27,28,29. La ecocardiografía se puede utilizar para evaluar los parámetros de insuficiencia cardíaca en los días 1 y 28 después del IM. Para examinar la remodelación cardíaca después del IM, se puede utilizar la tinción de tricomas y la ecocardiografía de Masson17. También es posible utilizar qPCR e immunoblot para investigar más a fondo y confirmar la expresión de los genes y proteínas implicados en la fibrosis, la inflamación y la insuficiencia cardíaca después de IM14.
La principal limitación de la ligadura de LCA es la alta incidencia de mortalidad, que podría deberse a arritmias cardíacas postoperatorias, rotura ventricular, hemorragia, neumotórax y molestias postoperatorias19,30. Sin embargo, una toracocentesis exitosa, minimizando el daño tisular no objetivo, y el manejo adecuado del dolor postoperatorio y la temperatura pueden ayudar a reducir la muerte del animal. Al igual que con cualquier otro modelo quirúrgico, la reproducibilidad exacta es otra limitación de este modelo quirúrgico. Sin embargo, los investigadores pueden reproducir el IM, controlar el tamaño del infarto y mejorar la supervivencia después de la cirugía mediante una práctica y experiencia rigurosas.
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Disclosures
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Salud (R01HL143967, R01HL142629, R01AG069399 y R01DK129339), Premio al Proyecto Transformacional de la AHA (19TPA34910142), Premio al Proyecto Innovador de la AHA (19IPLOI34760566) y Premio al Proyecto de Innovación ALA (IA-629694) (a PD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G catheter needle | Exel INT | 26741 | Thoracentesis |
| 24 G catheter needle | Exel INT | 26746 | Endotracheal intubation |
| 4-0 nylon suture | Covetrus | 29263 | Suturing of muscles and skin |
| 8-0 nylon suture | S&T | 3192 | Ligation of LAD |
| Anesthetic Vaporizers | Vet equip | VE-6047 | Anesthetic support |
| Animal physiology monitor | Fujifilm | VEVO 3100 | Monitor heart rate,respiration rate and body temperature |
| Betadine solution | PBS animal health | 11205 | Antispetic |
| Buprenorphine | Covetrus | 55175 | Analgesic |
| Disecting microscope | OMANO | OM2300S-V7 | Binocular |
| Electric razor | Wahl | 79300-1001M | Shaving |
| Electrode gel | Parker Laboratories | W60698L | Electrically conductive gel |
| Ethanol | Decon Laboratories | 22-032-601 | Disinfectant |
| Forceps | FST | 11065-07 | Stainless Steel |
| Gauze | Curity | CAR-6339-PK | Sterile |
| Heat lamp | Satco | S4998 | Post surgery care |
| Heating pad | Kent scientific | Surgi-M | Temperature control |
| Hot Bead sterilizer | Germinator 500 | 11503 | Sterilization of surgical instrument |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | Anesthesia |
| Masson’s trichrome staining kit | Thermoscientific | 87019 | Measurement of cardiac Fibrosis |
| Micro Needle Holder | FST | 12500-12 | Stainless Steel |
| Micro scissors | FST | 15000-02 | Stainless Steel |
| Ophthalmic ointment | Dechra | Puralube Vet | Sterile occular lubricant |
| Scanning Gel | Parker Laboratories | Aquasonic 100 | Aqueous ultrasound transmission gel |
| Scissors | FST | 14060-11 | Stainless Steel |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | Model LS-2-M | Illuminating the oropharynx |
| Small animal ventilator | Harvard apparatus | 557058 | Ventilator support |
| Surgical light | Cole parmer | 41723 | Illuminator Width (in): 7 |
| Vevo 3100 preclinical imaging platform | Fujifilm | VEVO 3100 | Echocardiography |
| VevoLAB software | Fujifilm | VevoLAB 3.2.6 | Echocardiography data analysis |
References
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